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1 Molecular diagnostics for cancer target therapy Biochips & bioinformatics for molecular diagnosis Lin, Yu-Chun

2 癌症 已連續 33 年蟬聯國人死因首位 每 3 位死亡國人中就有 1 人死於癌症, 台灣每年花在治療癌症的健保支出更高 達 2 3 百億元

3 衛生福利部國民健康署

4 圖 年兩性十大死因死亡率 女性 男性 惡性腫瘤 惡性腫瘤 心臟疾病 ( 高血壓性疾病除外 ) 心臟疾病 ( 高血壓性疾病除外 ) 糖尿病 腦血管疾病 腦血管疾病 肺炎 女性所有死因死亡率 肺炎 34.6 高血壓性疾病 事故傷害 糖尿病 男性所有死因死亡率 腎炎 腎病症候群及腎病變 慢性下呼吸道疾病 事故傷害 慢性肝病及肝硬化 慢性下呼吸道疾病 高血壓性疾病 敗血症 腎炎 腎病症候群及腎病變 每十萬人口

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6 圖 年兩性十大癌症死亡率 女性 男性 氣管 支氣管和肺癌 氣管 支氣管和肺癌 肝和肝內膽管癌 肝和肝內膽管癌 結腸 直腸和肛門癌 結腸 直腸和肛門癌 女性乳房癌 口腔癌女性癌症死亡率男性癌症死亡率胰臟癌 食道癌 胃癌 胃癌 子宮頸及部位未明示子宮癌 前列腺 ( 攝護腺 ) 癌 卵巢癌 胰臟癌 非何杰金氏淋巴瘤 非何杰金氏淋巴瘤 白血病 膀胱癌

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8 癌變四部曲 誘發期 : 基因改變 促進期 : 效應擴大 正常細胞 病變因子 : 遺傳 化學物質放射線 病毒 病變因子 : 發炎 內分泌 營養 變化期 : 癌前病變 惡性病變 進展期 : 侵入或轉移其他器官 癌組織形成

9 癌症的分期 癌症大約分為四期 : 第一期 : 腫瘤侷限一處, 沒有擴散跡象 第二期 : 腫瘤已擴散到鄰近的淋巴結, 但沒有波及其他器官或組織 第三期 : 腫瘤除了擴散到鄰近淋巴結外, 還波及附近器官或組織 第四期 : 腫瘤已擴散到遠處的部位 第一 二期屬 早期, 治療後痊癒機會高 第三 四期屬 晚期, 復原及活存的機會較差

10 致癌因素 農藥 肝癌 惡性淋巴瘤 化學製品 肝癌 膀胱癌 胃癌 ( 醃製 鹽漬.. 含硝化氨類 ) 幅射線 皮膚癌 毒素. 尼古丁 肺癌 膀胱癌 遺傳因素 乳癌 卵巢癌 大腸直腸癌 荷爾蒙 乳癌 子宮內膜癌 人工植入物 (ex: 矽膠 ) 乳癌

11 致癌因素 微生物 細菌 ex: 胃幽門桿菌 胃癌 病毒 EB 病毒 鼻咽癌 淋巴癌 B 型肝炎病毒 肝癌 C 型肝炎病毒 肝癌人類乳突病毒 (HPV) 子宮頸癌

12 常見各種癌症症狀 不正常之出血或分泌物 子宮頸癌 2. 乳房發生腫瘤或硬塊 乳癌 3. 大便習慣改變 大腸直腸癌 4. 皮膚潰爛 長久不癒 痣或疣之大小顏色改變 皮膚癌 5. 聲音嘶啞長久不癒 喉癌

13 常見各種癌症症狀 消化不良 腸癌 7. 吞嚥困難 食道癌或喉癌 8. 不明原因之久咳 痰中血絲或血塊 肺癌 9. 胃部不適 食慾減退 對食物之嗜好改變 胃癌 10. 體重急遽下降 容易疲勞 肝癌 血 癌等

14 癌症相關檢查 - 1 每年定期子宮頸抹片 + 人類乳突瘤病毒 (HPV) 每月經期過後 : 定期乳房自我檢查 40 歲以下乳房超音波.40 歲以上乳房攝影 大腸直腸癌高危險群 : 糞便潛血檢查腸胃道癌非特異性篩檢 (CEA) 和乙狀結腸鏡 肝癌高危險群 : 肝功能 血清甲型胎兒蛋白 (AFP) 及腹部超音波檢查

15 癌症相關檢查 歲以上男性 : 攝護腺癌非特異性篩檢 (PSA) 配合攝護腺超音波 女性 : 卵巢癌非特異性篩檢 (CA-125) 配合婦科陰道超音波 空氣污染環境工作者 : 肺癌非特異性篩檢 (NSE) 配合胸腔正面及側面 X 光 鼻咽癌高危險群 : 鼻咽癌非特異性篩檢 (EBIgA) 配合鼻咽內視鏡檢查

16 癌症分為二大類 : 實體性癌症 : 肝癌 肺癌 大腸癌 胃癌 血液性癌症 : 血癌 淋巴癌 骨髓瘤

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18 最常見的療法 -- 化學治療 早期的實體性癌症治療主要以開刀為主, 再輔以化學治療及放射線治療 ; 血液性癌症, 則是化學治療為主, 必要時再輔以放射線治療, 以及骨髓移植, 但化療的副作用很大, 因為它不論正常細胞 癌症細胞皆殲滅, 也因此有了標靶藥物的問世

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21 化療常見的副作用 1. 骨髓破壞 血球細胞的製造處 : 貧血 白血球減少 血小板減少 2. 消化道 口腔 胃腸道黏膜 : 噁心 嘔吐 腹瀉 口腔炎 3. 毛髮濾泡 毛髮生長的地方 4. 過敏 起紅疹 皮膚癢

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25 目前臨床上使用的標靶治療藥物依作用機制大約可分成 3 大類 : 第 1 類 : 抑制血管新生 (Anti-angiogenesis): 即所謂 餓死癌細胞 的標靶治療, 例如用於結腸癌的藥物 Avastin 用於治療晚期腎細胞癌及惡性胃腸道基質瘤的藥物 Sutent, 以及用於治療腎癌及可能用於治療肝癌的藥物 Nexavar 第 2 類 : 阻斷癌細胞訊息傳遞路徑的標靶治療, 包括治療非小細胞肺癌的 Iressa 和 Tarceva 治療慢性骨髓性白血病的 Glivec 和 Sprycel 以及治療乳 癌的 Tykerb 第 3 類 : 針對細胞表面抗原的標靶治療, 例如治療惡性淋巴瘤的 MabThera 乳癌的 Herceptin, 以及結腸癌的 Erbitux 和 Vectibix

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34 案例 : 乳癌標靶藥物費用 使用新型抗乳癌的標靶藥物注射到體內, 可以抑制局部癌細胞的增生, 每次治療只須住院 1 天, 第一階段必須進行 6 次療程, 每次療程的費用為 6 萬元, 合計需要 40 萬元左右

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41 1. 基因定序 (DNA sequencing) 2. 即時聚合酶連鎖反應 (Real-timr PCR)

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45 即時聚合酶連鎖反應 (Real-timr PCR) 檢測技術

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50 Targeted Therapies and Molecular Diagnostics of Gastrointestinal Cancers Molecular Pathology of Neoplastic Gastrointestinal Diseases, Molecular Pathology Library 7, 2013

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54 REVIEW ARTICLE Front. Oncol., 23 September 2013 doi: /fonc Targeted therapy for breast cancer prevention Petra den Hollander, Michelle I. Savage and Powel H. Brown* Department of Clinical Cancer Prevention, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA

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69 Automated DNA sequencing by capillary electrophoresis

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72 The Human Genome Project was proposed and funded by the US government; planning started in 1984, the project got underway in 1990, and was declared complete in 2003.

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75 Billion = 十億 = 10 9, human genome sequence = 3 billion bases

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78 Next Generation Sequencing (NGS) (Second Generation) Pyrosequencing Illumina SOLiD 1st, 2nd, and 3rd Generation Genome Sequencing Technologies

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80 Genome Sequencer FLX System Workflow

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96 1st, 2nd, and 3rd Generation Genome Sequencing Technologies 3rd Generation Sequencing Technologies: Helicos tsms and Pacific SMRT Technology Single Molecule Real Time Sequencing - Pacific Biosciences Introduction to SMRT Sequencing

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105 生物晶片 (Biochip) 生物晶片的簡介 主要概念 : 將生物有關的大分子 (macromolecules), 如去氧核糖核苷酸構成之寡核酸 (DNA oligonucleotide) 聚胜肽(polypeptide) 抗體 (antibody), 甚至將整個細胞或組織切片, 用高精密度之化學工業 電子工業技術, 精確的點製 (micro-fabrication) 或直接導引合成在面積極小的固體材料上 ( 玻璃片 矽晶片 尼龍膜 聚合性高分子等 ), 或整合微流體 (microfluidic) 技術以及微電極 微型加熱器等, 製成可多方面應用的薄片型產品 因其類似電子業的矽晶片具有強大功能且輕薄短小的特質, 故稱為 生物晶片

106 生物晶片的種類微陣列晶片基因晶片 (gene chip, DNA chip) 蛋白質晶片 (protein chip) 醣類晶片 (carbohydrate chip) 微流體晶片樣品前處理晶片製備型晶片分析型晶片

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116 生物晶片的應用 生物晶片在醫療檢驗上的應用 病原體的快速檢測 亞型分析及抗藥性檢測 癌症的分類 分期及篩檢 快速預先篩檢重大疾病的高危險群

117 生物晶片在生物醫學研究上的應用 基因定序 單一核苷酸多形性的檢定 新基因的發現和鑑定 新藥品的研發 細胞組織反應機制及細胞週期的研究 發育生物學的研究 毒理學上的研究

118 生物晶片在其他方面的應用 法醫學及刑事案件上的應用 生物武器的偵測 新型電子記憶體的發展

119 Microarrays vs RNA Sequencing

120 Microarrays vs RNA Sequencing

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124 生物資訊學與基因體計畫資料庫 生物資訊為結合了生命科學與資訊科學而興起的一個新興 研究領域, 其特性為橫跨了兩個不同的領域 ( 生物 數理 ) The NCBI defines bioinformatics as: "Bioinformatics is the field of science in which biology, computer science, and information technology merge into a single discipline

125 Why do we need the Internet? omics projects and the information associated with involve a huge amount of data that is stored on computers all over the world. Because it is impossible to maintain up-to-date copies of all relevant databases within the lab. Access to the data is via the internet.

126 目前最常被使用的基因序列資料庫 美國衛生總署的美國國家生物科技資訊中心 (National Center for Biotechnology Information;NCBI) 下的 GenBank 資料庫 歐洲的 European Binformatics Institute 下的 EMBL 日本國家遺傳研究所的 DDBJ(DNA Data Bank of Japan)

127 You are here Database storage

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129 資訊搜尋與序列比對在一般使用文字關鍵字字串之外, 我們需要比對實驗中產生的序列資訊, 不論序列是來自去氧核糖核酸 核糖核酸或蛋白質 因此在分子檢驗及分子生物學上另有一項不可或缺的資料比對工具, 便是序列相似度辨識 (Sequence alignment) 及查尋工具 由於基因或蛋白質序列在演化上或功能上, 均有相當程度的保留, 因此需要一個不同於一般字串比對的搜尋方法 有許多序列比對的生物資訊軟體應運而生 例如 :BLAST, FASTA 基因序列比對 : 整體排列比對 (global alignment) 區域排列比對 (local alignment)

130 Database search methods: Sequence Alignment Two broad classes of sequence alignments exist: Global alignment: 整體排列比對 QKESGPSSSYC VQQESGLVRTTC not sensitive Local alignment: 區域排列比對 ESG ESG faster The most widely used local similarity algorithms are: Smith-Waterman ( Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, Fast Alignment (FASTA,

131 序列比對生物資訊工具之分子檢驗實例以 H1N1 流感病毒檢測為例, 在進行檢體採樣後, 通常會以多重聚合酶反應放大所要偵測的序列 而為了要直接確認病毒的特徵, 核酸定序是必要的步驟 在完成定序以後, 我們可以將定序的結果利用如 BLAST 等的資訊工具和已知病毒序列資料庫做比對, 以便了解是何種病原菌 再者序列資料可進一步提供分子流行病學的研究, 以便了解病毒的突變與演化, 以及相關傳染途徑分析, 完成定序後的病毒序列, 直接利用 BLAST 介面, 將序列和 GenBank 資料庫中的所有序列做比對

132 Yu-Chun s preferred websites

133 arch&blast_spec=&link_loc=blasttab&last_page=blastn

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136 次世代定序基本概念 (Basic Concepts of NGS) 只要談論到定序 (Sequencing), 大家第一時間一定會想到 Frederick Sanger 這位有名的英國科學家! 全世界到目前為止個人獲過兩次諾貝爾獎的僅有四人,Frederick Sanger 正是其中之一, 而同時榮獲兩次諾貝爾化學獎這份殊榮更只有他一人 Sanger 於 1975 年發展出 Dideoxy Termination Method 也就是廣為人知 Sanger 定序法, 這不僅只是他個人獲得諾貝爾獎的成就, 對於人類基因體解碼計畫更是扮演著關鍵性的角色及地位 進行 Sanger 定序必須要先將欲分析的目標分別一段一段的放大出來, 若目標區域較長或較多就必須進行多次的放大, 定序完後再進行比對或組裝, 整個實驗步驟勢必繁瑣而費時 ; 倘若有一種技術可不需額外先行放大目標, 直接將整個區域進行定序後再分析, 透過比對或組裝就可以找出研究者感興趣的區域或完整的序列資訊, 相對來說絕對更有效率而快速, per base 的定序成本也大為降低, 而次世代定序 (Next Generation Sequencing, NGS) 正好就是這技術的最佳代言人, 而目前市面上應用比較廣泛的還是屬於二代定序, 常見的有 Illumina (Solexa) Roche (454) ABI (SOLiD) 相對於 Sanger 是目標區域放大後進行較長讀長定序 ( 約 1000bp),NGS 是將核酸全面片段化後進行短讀長的定序, 讀長依各家平台技術差異而略為不同, 但整個概念就是以同時進行高通量的定序, 因此也常聽到其他別名如 Highthroughput Sequencing (HTS or HT-Seq) Massively Parallel Sequencing (MPS) Deep Sequencing Next-gen Sequencing 等, 這些名稱也無疑透露出 NGS 的特色 NGS 主要實驗流程包含核酸片段化 (Fragmentation) 建庫(Library Construction) 高通量定序(High-throughput Sequencing) 分析 (Analysis) 共四個步驟 定序的方式分成單端定序 (Single Read or Single End) 雙端定序(Paired-End & Mate Pair) 實驗步驟的流程隨著各平台與應用項目而略有差異及不同,Single End 及 Paired-End 的選擇也依實驗目的而有彈性的選擇, 至於該如何選擇將在之後的文章更進一步的說明 總結來說,NGS 的基本概念就是將核酸片段化後同時進行大規模的定序分析, 實驗目的不外乎為了找已知或未知的序列資訊, 找已知的前提就是該實驗樣品之物種必須有參考序列 (Reference Sequence), 根據其相似度進行比對 (Mapping) 及記數 (Counting) 的分析, 若今天該物種無參考序列, 就必須透過組裝 (Assembling) 的方式, 進一步預測與驗證就可以獲得序列資訊 因此, 熟記 NGS 的基本實驗流程 定序方式及其概念後, 對 NGS 在各種項目的應用將更容易了解與切入!

137 諾貝爾獎二次得主居里夫人 (Marie Curie) 波蘭裔法國女物理學家 化學家居里夫人 (Marie Skłodowska Curie,1867 年 11 月 7 日 1934 年 7 月 4 日 ), 榮獲 1903 年諾貝爾物理學獎和 1911 年的化學獎 她也是法國巴黎大學 (University of Paris) 的第一位女教授 1903: 瑪麗 居裡 皮埃爾 居裡和亨利 貝克勒而共同獲得諾貝爾物理學獎, 他們共同對貝克勒而發現的放射現象作出了傑出工作 1911: 瑪麗 居裡獲得諾貝爾化學獎, 她發現了放射性元素鐳 (Ra) 和釙 (Po), 分離出鐳, 同時研究這些標誌性元素的化學本質及其化合物 約翰 巴丁 (John Bardeen) 美國物理學家約翰 巴丁 (John Bardeen,1908 年 5 月 23 日 1991 年 1 月 30 日 ), 榮獲 1956 年和 1972 年諾貝爾物理學獎 他是第一位在同一領域兩次獲得諾貝爾獎的人 1956: 約翰 巴丁 沃爾特 布拉頓和威廉 肖克萊共同榮獲 1956 年諾貝爾物理學獎 他們的貢獻在於 :1947 年巴丁和布拉頓共同發明第一個半導體三極管, 此後一個月, 肖克萊發明 PN 結晶體管 獲獎理由 : 對半導體的研究和對電晶體效應的研究 1972: 約翰 巴丁 列儂 庫珀 約翰 R 施裡弗共同榮獲 1972 年諾貝爾物理學獎 他們的獲獎理由是 :1957 年共同提出低溫超導理論, 即通常所說的 BCS 理論 (BCS 分別為他們的姓的第一個字母 ) 萊納斯 鮑林 (Linus Pauling) 美國化學家萊納斯 鮑林 (Linus Pauling,1901 年 2 月 28 日 1994 年 8 月 19 日 ), 分別榮獲 1954 年諾貝爾化學獎和 1962 年諾貝爾和平獎 他是目前為止 (2008) 唯一一個兩次單獨獲得諾貝爾獎的人 1954: 萊納斯 鮑林獨享諾貝爾化學獎 他的貢獻在於闡釋化學鍵的本質, 並將其應用於解釋複雜物質的結構 1962: 萊納斯 鮑林獨享諾貝爾和平獎 他的事蹟是, 不僅反對核武器實驗, 核武器擴散, 核武器使用 諾貝爾獎委員會評價為 :"Linus Carl Pauling, who ever since 1946 has campaigned ceaselessly, not only against nuclear weapons tests, not only against the spread of these armaments, not only against their very use, but against all warfare as a means of solving international conflicts."( 即 萊納斯 鮑林, 曾自 1946 以來不斷奔走, 不僅反對核武器試驗, 反對傳播這些武器, 反對他們的使用, 還反對一切把戰爭作為一種解決國際衝突手段 ) 弗雷德 桑格爾 (Fred Sanger) 英國生物化學家弗雷德 桑格爾 (Fred(Frederick) Sanger,1918 年 8 月 13 日 2013 年 11 月 19 日 ), 分別獲得 1958 年和 1980 年諾貝爾化學獎 他是同一領域內兩次獲獎的第二人, 更關鍵的是, 兩次獲獎理由都可歸結為 : 測序 1958: 弗雷德 桑格爾發明酶法測定人胰島素序列, 從而確定胰島素的分子結構, 開創了蛋白質測序的領域 1980: 弗雷德 桑格爾 沃爾特 吉伯特共同榮獲諾貝爾化學獎 他們的貢獻在於 : 分別使用不同的方法測定 DNA 的序列 Sanger 法後來成為主流, 並用於人類基因組計畫 (HGP) 的測序

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38 嬰兒猝死症候群 (SIDS) 急性支氣管炎及急性細支 其他 9, 臺灣地區 總計 0 歲 死亡數 名 原因 Number Crude 名 原因 Number of Deaths Death Rate of Deaths 所有死亡原因 64,

38 嬰兒猝死症候群 (SIDS) 急性支氣管炎及急性細支 其他 9, 臺灣地區 總計 0 歲 死亡數 名 原因 Number Crude 名 原因 Number of Deaths Death Rate of Deaths 所有死亡原因 64, 臺灣地區 總計 0 歲 死亡數 名 原因 Number Crude 名 原因 Number of Deaths Death Rate of Deaths 所有死亡原因 97,979 838.0 所有死亡原因 446 1 惡性腫瘤 28,476 243.6 1 源於周產期的特定病況 195 2 心臟疾病 ( 高血壓性疾病 11,484 98.2 2 先天性畸形變形及染色體 99 3 腦血管疾病 6,980

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