食品与发酵工业 Z;:ZIY]I:7;7::a[7YI[ 司'`9 $ 离心机[ J公司电子恒温水浴锅天津 `W9 f下甲酯化 ' J -每隔 J -振 市泰斯特 仪 器 有 限 公 司 7E J7Y;OI$'9 [V =7 荡 $ 次冷却后加入去离子水 J=在 5 J -离 型 HO9

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1 分析与检测 $ $( + - $$ 0$12 2$2' 运用 I1R 2X \I技术分析马克思克鲁维 酵母对发酵乳中游离脂肪酸的影响 李路 $ 2 ' 刘敬兰 $ 2 ' 姜铁民 2 ' 闵伟红 $ 刘继超 2 陈历俊 2 ' $ 吉林农业大学 食品科学与工程学院吉林 长春$'$$1$ 2 北京三元食品股份有限公司北京$$X'$ ' 北京市乳品工程技术研究中心北京$$X'$ 摘要利用固相萃取及气 相 色 谱 质 谱 联 用 仪 N9?E g -9 E J?EQJ? J Q [I9 HO ][ 技术分析以马克思克鲁维酵母菌 U 'E C :E (:5 Q 5+ 和乳酸菌 D : [7G5 < 5 ' 05 =< 为混合发酵剂的发酵乳中游离脂肪酸含量变化并对整个发酵过程进行跟踪监测$ 结果 发现使用 [I9 HO ][ 共检测出 $2 种游离脂肪酸其中短链及中链脂肪 酸 O5 0O$2 有 种长 链 饱 和 脂 肪 酸 O$5 0O$1@ 种不饱和脂肪酸 2 种$ 2 种发酵乳中主要的游离脂 肪 酸 为 棕 榈 酸'硬 脂 酸'肉 豆 蔻 酸'油 酸且 随 关键词混菌发酵乳固相萃取游离脂肪酸马克思克鲁维酵母 着发酵时间的延长混菌发酵乳中的含量显著高于双菌发酵乳 rc$ $ 在发酵 $ ix E 范围 内马 克 思 克 鲁 维酵母菌的添加显著增加了双菌发酵乳中游离脂肪酸的含量 rc$ $ 乳中的脂肪进 行 分 级并 采 用 气 相 色 谱9 质谱法进行 以 $p $的比例混合作为发酵剂制备 的以 前 研 究 者 认 检测 根据质谱特征离子结合色谱保留时间确定游 为酸奶中的酵母菌为腐败菌是引起酸奶变质的主要 但是 随 着 研 究 的 深 入 酵 母 菌 已 成 为 益 生 菌广泛应用于食品 工 业 '2( 离脂肪酸的组成并 采 用 外 标 法 定 量分 析 比 较 混 菌 发酵乳与双菌发酵 乳 中 游 离 脂 肪 酸 在 整 个 发 酵 过 程 原因 '$( 双菌发酵乳是 由 保 加 利 亚 乳 杆 菌 和 嗜 热 链 球 菌 益 生 菌 作 为 膳 食 添 加 到 : w 食品中帮 助 维 持 身 体 健 康 维 持 肠 道 菌 群 平 衡 ' 酵母菌发酵产酸产 气给 发 酵 乳 增 加 质 地 和 香 气同 中的变化为混菌发酵乳的研发提供支持 $实验材料及方法 时酵母菌在生长代谢过程中能够分泌脂肪酶这对发 实验材料和仪器 酵乳中脂 肪 的 降 解 有 着 重 要 的 影 响 ' 5 ( 因 此 酵 母 $C$C$实验材料 菌作为发酵剂制备发酵乳同时研究酵母菌对发酵乳 中游离脂肪酸的变化已经收到了高度的重视 采用一种准确快 速 的 方 法 研 究 以 马 克 思 克 鲁 维 酵母菌和乳酸菌为 混 菌 发 酵 剂 的 发 酵 乳 中 游 离 脂 肪 菌种保加利亚乳杆菌 G5 5 ' 05 $ 嗜 热 链 球 菌 D : $丹尼斯克菌 种有限公司马克思 克 鲁 维 酵 母 U 'E C :E (:5 Q < 5+ $ 由北京三元食品股份有限公司保藏 酸的含量有着重 要 的 意 义 发 酵 乳 中 游 离 脂 肪 酸 的 培养基全 脂 奶 粉 新 西 兰 西 部 乳 业 有 限 公 司 含量较少所以对样品前处理是测定的关键 传统分 ]Y[ 液体培养 基 和 固 体 培 养 基 ;液 体 培 养 基 和 离游离脂肪酸的方法主要是薄层层析 7=O$ 溶剂分 固体培养基来自北京路桥技术有限公司 馏萃取高 效 液 相 色 谱 法 W=O$ 这 些 方 法 操 作 繁 $C$C2主要试剂和仪器 ' 0X ( 而固相萃取方法解决了传 `W冰 乙 酸 异 丙 醇 乙 醚 分 析 纯 北 京 化 工 统方法的弊端同时 更 能 准 确 的 将 中 性 脂游 离 脂 肪 厂正己烷甲 醇 色 谱 纯 Z E 公 司 '@ 种 混 合 脂 重耗时准确 性 差 酸极性脂质分离 01 ( 本文采用固相萃取柱对发酵 肪酸甲酯 $1($(9 $;]型[ J公 司 O - [I 氨丙基硅胶固相萃取柱 天津 ; $ 第一作者在读硕士 研 究 生 陈 历 俊 教 授 级 高 级 工 程 师 为 通 讯 作者I9 J E - + G-M -Q G -C JC -$ 十二五- 科 技 支 撑 计 划 2$' <;$1 <5 $ 奶 牛 产 业 技 术 体 系 北京市创新团队 收稿日期2$5 0$$ 0@ 改回日期2$5 0$2 0' 自动 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅北 京 发 恩 科 贸 有 限 公 司 =YW9 2 型 生 化 培 养 箱 上 海 一 恒 科 技 有 限 公 司 7E J[ - e Z J((5 超低温 冰 箱赛 默 飞 世 尔 科技公 司 ;=W;$ 02 冷 冻 干 燥 机 ] - OE 公 $年第 卷第 期 总第 '期 ($

2 食品与发酵工业 Z;:ZIY]I:7;7::a[7YI[ 司'`9 $ 离心机[ J公司电子恒温水浴锅天津 `W9 甲醇溶液@ f下甲酯化 ' J -每隔 J -振 市泰斯特 仪 器 有 限 公 司 7E J7Y;OI$'9 [V =7 荡 $ 次冷却后加入去离子水 J=在 5 J -离 型 HO9 ][ 气质联用仪美 国 7E J公 司`V9 I 心 ' J -上清液过 C22 -J的膜之后进 HO9 ][ 分 超声 波 清 洗 仪 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 ] 9 ;N9 析 c - 超纯水系统默克密理博公司 $C2C5脂肪酸甲酯标准曲线的绘制 '(实验方法 实验 采 用 [ J公 司 的 $1($( 0$;]型 '@ 种 $C2C$种子液的制备 混合脂肪酸甲酯标准品标准品中脂肪酸甲酯总量为 将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌分别接种到 $ J使 用 正 己 烷 配 置 成 $ J J=的 母 液 将 标 $2D的全脂还原乳中放 置 到 '@ f 的 培 养 箱 中 直 至 =2 d$ X =' d$ X 准品分 别 稀 释 成 $ d$ X 凝乳以 2D 的 接 种 量 重 复 培 养 2 i' 次 直 到 凝 乳 时 =5 d$ X = d$ X =溶液将不同浓度的 间大致相同再按照活菌计数法计算出种子液的活菌 标准品 过 C22 -J 的 膜使 用 HO9 ][ 检 测 绘 制 标 准 数 马克思克鲁维酵 母 种 子 液 活 化 即 将 菌 种 接 种 到 曲线 ;液 体 培 养 基 中$1 J - 摇 床 $X i$1 E 再 以 $C2CHO9 ][ 分析条件的选择 脂肪 酸 的 测 定 选 用 W9 11 柱 子 $ J I ;k 2D接种量重复活化 $ 次进行活菌计数 发酵过程中 样 品 的 制 备 配 置 $2D 的 全 脂 还 原 X C2 JJ$ 载气 为 高 纯 度 的 氦 气 ((C((D$ 进 样 口 $C2C2发酵乳的制备 温度为 2 f流速为 $C2 J= J -分流比为 $p $ 柱温X f J - 01 f J - 升到 $X f再以 5 f J=;瓶中以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为 $ p$ 的 J - 升温到 2$ f保温 J -再以 ' f J - 升温到 比例接种即为双菌发酵乳 <瓶中以乳酸菌浓度的 25 f 并 保 温 J - ][ 条 件 质 谱 传 输 线 温 度 为 ;与 <2 瓶 放 置 到 ' f 下 培 养 直 到 凝 乳同 时 每 隔 25 f质谱离子 源 温 度 为 2' f 离 子 扫 描 为 全 扫 描方式范围 ' i' a $C2CX数据的处理 一段时间取样 $ 次 再将各样品倾倒于培养皿中用 $ ' 接种马 克 思 克 鲁 维 酵 母 即 为 混 菌 发 酵 乳 将 乳 ;和 <两 瓶2 瓶 发 酵 乳 总 的 菌 浓 度 为 $ OZa 利用 Ig 2$ 进 行 数 据 处 理 后 试 验 数 据 采 用 01 f$ 中预冻 5 ix E 冷 冻 干 燥先 将 冷 冻 干 燥 [[[ $'C 软 件 进 行 结 果 分 析 试 验 数 据 用 平 均 值 : w 封口膜封住扎数个 孔 以 保 证 通 气放 入 超 低 温 冰 箱 机启动并预热 ' J -之 后将 上 述 样 品 从 超 低 温 冰 s标 准 差 表 示采 用 [[[$'C 统 计 软 件 进 行 独 立 样 箱中取出放进冷冻干燥机中进行干燥约 51 E 后样 品 检验rC 为差异显著rC$ 为差异极显 品即可全部冻干成粉末状即可 著qC 为差异不显著 $C2C'脂肪的提取与游离脂肪酸的分离测定 脂肪 的 提 取 将 干 粉 样 品 置 于 离 心 管 中 加 入 乙醇$ p 乙 醚 $ k$ p2c 的 混 合 物 ' J= 振 摇 $ J -加入 2C J=石油醚离心或静止使醚层水层分 开重复 2 i' 次合并萃取液并用氮气吹干 游 离 脂 肪 酸 的 分 离称 取 一 定 质 量 脂 质制 成 ( 2结果与讨论 发酵乳中游离脂肪酸的定性分析 一般脂肪酸成分 的 定 量 分 析 都 采 用 面 积 归 一 化 法计算其相对百 分 含 量 我 们 用 脂 肪 酸 甲 酯 混 合 标 准溶液质谱法分析 测 定 出 各 脂 肪 酸 甲 酯 峰 面 积 并 进 2 J J=的 脂 质 OWO y 的方法 ' 溶 液 按 照 H 行定量分析 使用气相色谱质谱联用仪对 '@ 种脂肪 并做相应的调整对 游 离 脂 肪 酸 进 行 分 离 测 定 先 酸甲酯标准品进行全扫描图 $ 为标准品的总离子流 WO 用 2C J=OWO ' 活 化 小 柱 将 $ J=脂 质 O ' 溶 图 从图 $表 $ 可以看出脂肪酸 O2'-' 与 O22 液 移 入 氨 丙 基 硅 胶 小 柱 中 用 5C J=三 氯 甲 烷 9 异 $-( 未能分开这是由于色谱柱本身的原因由于这 2 丙醇 体 积 比 2 p$ $ 洗 脱 小 柱 然 后 用 XC J=的 种脂肪酸 出 峰 时 间 太 接 近 未 能 区 分 开 最 终 只 绘 制 2D乙酸9 乙醚洗出 游 离 脂 肪 酸收 集 并 用 氮 气 吹 干 'X 条 标 准 曲 线 而 这 'X 条 标 准 曲 线 的 Y2 均 大 于 备用 C((因此这 'X 种标准曲线的可信度很高可以用于 游离脂肪酸的甲酯化在含有游离脂肪酸的具塞 试管中加 入 $ J=的 正 己 烷 和 $ J=的 C J =的 ( $( ++ '$ 后续的实验分析

3 分析与检测 图 $( 种脂肪酸甲酯标准品的总离子流色谱图 +$( - - 表 种脂肪酸甲酯标准曲线 $ ' +$ $' $' $ 脂肪酸 标准曲线 : : ( + +( : : ( (+ + : : ( + + : + + : : : + + : : :( + : ( + +: : + +: : : (:+ + : : +( + : : +: + : : : + : : : :(+: + : : ( + + ( : : + + : ( : : +: + : : ( : + + : :+ + : ( : ::+( + : : : (+( + : : ( ( +( + : ( : + +( : : (: + + : : : +( +( : ( + + : ( +( : : : ( + +: : ( ( + +( : : (+ + : : : :: +: + : : + + : + +: : : + + : + : +: + : : :+ +( : : ( :+: + $$ 用 0 ' 对脂肪酸甲酯混合标准溶液和种发 酵乳试样进行全扫描分析 其总离子流色谱图如图 和图所示 利用美国 标准谱库对样品 质谱图进行检索 并结合与脂肪酸甲酯混合标准溶液 色谱保留时间对照 确定双菌发酵乳及混菌发酵乳试 样中的脂肪酸成分 0 ' 检测发现 种发酵乳中 共检测到 种游离脂肪酸 短链及中链脂肪酸 有 种 长链饱和脂肪酸 ( 种 不 饱和脂肪酸种 结果见表 表 双菌发酵乳和混菌发酵乳中游离脂肪酸的组成 $ $ $ $+$ $ + +$ $ +( ' $$ ' $+$ $ + 色谱峰 序列号 保留时间 代号 脂肪酸 名称 分子式 甲酯 +( 丁酸 9 +( : 己酸 ( 9 +: 辛酸 9 +: 葵酸 9 +( 月桂酸 9 : : (+( 肉豆蔻酸 9 ( + 十五烷酸 : 9 + : 棕榈酸 ( 9 + ( 十七烷酸 9 : + 硬脂酸 9 + 顺式油酸 9 : :+( : 亚油酸 9 :w 发酵乳中游离脂肪酸的定量分析根据脂肪酸甲酯化的标准品以及普库搜索对种发酵乳中游离脂肪酸进行定量分析 同时使用 对混菌发酵乳和双菌发酵乳中游离脂肪酸的显著性分析 结果如下 年第 卷第 期 总第 期

4 食品与发酵工业 Z;:ZIY]I:7;7::a[7YI[ 图 2混菌发酵乳 <$ 和双菌发酵乳 ;$ 中游离脂肪酸的色谱图 Z C27E E J J ee e Q N - EJ g N L e J - N J <$ -N N GL L e J - N J ;$ 表 (两种发酵乳中游离脂肪酸的含量变化 $ $2 $5 $ $X $@ $1 O$1$-( O$12-X C C sc sc C C sc sc C C C' C1@ $ C($ C$@ C555 CX5 ( 1 C C@X C$5 C2X(5 sc2x C5X C@ 2 $ C15' C$$2 sc$@ C C sc sc 乳 J 乳 J C C C(' CX( sc$ C(@ C11 C$$' C2$@ sc$5 CX22 sc$$ C$XX C$$@ sc$5 C25 C$@'@ sc$x C11 CX C@ $ C1(2 C' C'' sc2' sc$' C C sc sc 发酵 5E 乳 J 乳 J C C C$' sc$ C11 C1' 2 C$1 1 C$'X X C$@ C2'X ( C$( C$1X1 sc2@ C11 C1 sc$@ C'52' C5@(2 sc$ X C( C( C$2X C$'@ sc$ sc$( C' CX52 sc$ ( C52 CXX 发酵 E 乳 J 乳 J C C$$ 1 : w X 乳 J 5 乳 J 发酵 'E C$ C$( $ sc$2 C( C$ $ ( C$ C2@' C25 C5$X X C$X(( C2$'@ sc$' sc' C(@ C2' CX2( C@5X@ X C$ C$'$ 2 2 C2'5' C2@(@ sc$2 C1' C11' sc$1 sc2 C(X C$$ $ ( 发酵 XE 发酵 2E 发酵 $E 57 (= <J <JD J <??? J J M = <J J O L <9?? C <J C 7 L 乳 J 乳 J C$'$ C$5' C$1$ C25 ( sc21 C$X C$($ C'55 C552 sc$$ C5$ CX15 C255 C'$ sc$$ C2(X C'1 sc$ C@((' $C2$$ sc$@ sc' C$@' C2 $ C21'5 C'($ sc$ ( C$'@ C$'XX sc$2 sc'' C$2( C$ 2 2 乳 J 乳 J C$5' C$5X C$(X sc'5 C$(2 C2$ 2 C'X' C51 CX@ CX1$ sc$5 C'21@ C$1@ X C$ C'1$ 2 $C15X $C' sc($ scx5 C2$2 C25' 2 CX( C5(' sc$2 scx$ C$5$X C$X1@ 1 sc$$ C$1 C$(( sc$ 注为 + k' 次结果的平均值 表示差异不显著rC rc$rc$ 从 表 ' 可 以 看 出在 整 个 发 酵 过 程 中2 种 发 酵 硬脂酸的含 量 $C' J C5( ' J 显著高于 乳中主要的游离脂肪酸为棕榈酸硬脂酸肉豆蔻酸 双 菌 发 酵 乳 $C15 X J CX ( J r 油酸 这一点与 l : - 研 究 相 似 酵 母 菌 代 谢 C$$ 在整个发酵过 程 中这 2 种 脂 肪 酸 在 混 菌 发 脂肪酸主要是这 5 种同时再通过各种途径产生其它 酵乳与双菌发酵乳中有着极显著的差异 rc$ $ 的脂肪酸 (' ' $ ( 在发酵终点时混菌发酵乳中棕榈酸 $( ++ '$ 且随着发酵时间的延长脂肪酸的含量逐渐增加 在

5 分析与检测 整个发酵期间肉豆 蔻 酸油 酸 为 含 量 为 第 二 多 的 脂 C$$ 但是在发酵结 束 时混 菌 发 酵 乳 和 双 菌 发 酵 肪酸混菌 发 酵 乳 中 其 含 量 都 显 著 高 于 双 菌 发 酵 乳 乳之间没有显 著 的 差 异 性 qc $ 而 两 种 发 酵 rc$$ 这 大 部 分 是 由 于 游 离 的 棕 榈 酸 和 硬 脂 乳中己 酸 只 有 在 发 酵 ix E rc 水 平 上 有 差 ' $$ ( 牛乳中棕榈酸和硬脂酸主要 异性 亚油酸人体所需的必须脂肪酸是维持人体生 位于甘 油 三 酯 的 - 0$ 位 而 肉 豆 蔻 酸 位 于 - 02 长发育和健康的必须脂肪酸 ' $' ( 在发酵终点时混菌 位而酯酶在 - 0$ 水解 能 力 较 强 ' $2 ( 这 就 解 释 为 什 发酵 乳 与 双 菌 发 酵 乳 存 在 着 极 显 著 的 关 系 r 么棕榈酸与硬脂酸含量较高而肉豆蔻酸次之 从发 C$$ 这表 明 马 克 思 克 鲁 维 酵 母 为 发 酵 剂 的 发 酵 酵 $ i' E2 种发 酵 乳 中 都 未 检 测 到 丁 酸在 5 i E 乳更有益于人体健康 酸被依次水解产生 : w 之间马克思克鲁维酵母显著影响了 丁 酸 的 含 量 r 图 ' $ 是 2 种发酵乳中总的游离脂肪酸的含量 其中硬脂酸与棕榈酸是长链脂肪酸的主要成分而乳 变化从 $ 可知在整个发酵过程中混菌发酵乳中 酸菌及酵母菌优先降解棕榈酸从而硬脂酸与亚油酸 的总 的 游 离 脂 肪 酸 显 著 高 于 双 菌 发 酵 乳 r 也相应增加所以混菌发酵乳中长链的游离脂肪酸较 C$$ 这表 明 酵 母 菌 与 乳 酸 菌 同 为 发 酵 剂 降 解 脂 多 ' $X ( 图 '发酵过程中游离脂肪酸的变化 Z C'7E E - e Ee e Q N - Ee J - -? 肪的能力强于乳酸菌这 一 现 象 与 Y ' $5 ( 研 究 结 果相似 从 ;$ 中我们可以得出短链脂肪酸在发酵 '结论 X E在 rc$ 的 水 平 上 2 种 发 酵 乳 之 间 有 显 著 性 本实验是向双菌 发 酵 乳 中 添 加 一 定 量 马 克 思 克 差异在 2 i' E2 者不存在差异性在发酵 5 E 时混 鲁维酵母制备混菌发酵乳研究酵母菌的添加对双菌 菌发酵乳 与 双 菌 发 酵 乳 存 在 着 极 显 著 的 关 系 r 发酵乳中游离脂肪酸的影 响 实 验 使 用 [I9 HO ][ C$$ 图 ' <$ 是 2 种发酵乳中链脂肪酸随着发酵 技术分离发酵乳中 游 离 脂 肪 酸 并 对 其 采 用 外 标 法 进 时间的变化从图 中 可 以 看 出 只 有 在 发 酵 2 E2 种 行定量分析该方法 减 少 了 样 品 的 消 耗缩 短 了 操 作 发酵乳之间没有差异性 qc其他时间混菌发酵 时间从而提高了实验的准确性 实验结果发现 2 种 乳中 的 中 链 脂 肪 酸 均 显 著 高 于 双 菌 发 酵 乳 r 发酵乳中主要的游离脂肪酸为硬脂酸棕榈酸油酸 C$$ 而短链和中链 的 游 离 脂 肪 酸 与 发 酵 乳 的 风 肉豆蔻酸且混菌发 酵 乳 中 显 著 高 于 双 菌 发 酵 乳 中 味直接相关 ' $ ( 在 整 个 发 酵 过 程 中 混 菌 发 酵 乳 中 在整个发酵期间混菌发酵乳中链脂肪酸和中长链脂 的长链脂肪酸 都 显 著 高 于 双 菌 发 酵 乳 rc$ $ 肪酸的含量随着发酵时间的延长逐渐增多其含量显 $年第 卷第 期 总第 '期 ((

6 食品与发酵工业 1; 1 = ;1 著高于双菌发酵乳 在发酵 E: - 内 对于总的游离 脂肪酸马克思克鲁维酵母菌的添加显著增加了双菌发酵乳中的含量 这为探讨马克思克鲁维酵母与乳酸菌对脂肪的水解程度的研究及开发新型发酵乳提供了理论支持 参考文献 $ 09+? ' : + $ 赵龙飞 徐亚军 周红杰 + 酵母菌的综合利用和研究进展 食品研究与开发 + $ ' ?? ; - ' ( (:+ $?- + - '? -D :: ( (:+ $ <<? ' :( (+ : $ ; 0 < -? + - ' - :( : + ( $< C ; + $<5 +; ' ; : + $0 O; 0 5 ' D ' - ::( $ '0 - ;+ -?? C ' - ((+ $ 9 ' ; + -? - ( (+ $ - ; +? (+ $ 袁书林 经荣斌 王宵燕 + 必需脂肪酸营养研究进展 养殖与饲料 + $; ; ' - : + $7 9< ; + '? -? :( ( (+ : $ ' + :+ 1 : 1 '' $ $ ( ( $$ ' $ $+$ $ + = ' 0 ' = ' - 7 '- 91 ' :w 1 =? : ; - : - 1 $ C C ' 5 - -C '0 - ' - ' - ' ( - ' ' +- - ' - -C - - C H E: H++ $ '$ C -C

<4D6963726F736F667420576F7264202D20CAB3C6B7D6D0CFF5CBE1D1CEBACDD1C7CFF5CBE1D1CEB5C4B2E2B6A82E646F63>

<4D6963726F736F667420576F7264202D20CAB3C6B7D6D0CFF5CBE1D1CEBACDD1C7CFF5CBE1D1CEB5C4B2E2B6A82E646F63> 一 果 酱 中 亚 硝 酸 盐 的 测 定 : 亚 硝 酸 盐 广 泛 存 在 于 自 然 界, 在 果 酱 中 也 有 一 定 的 含 量 现 已 证 明, 亚 硝 酸 盐 与 食 品 中 固 有 的 胺 类 化 合 物 是 产 生 致 癌 物 质 - 亚 硝 胺 的 前 体 物 质 因 此, 对 果 酱 中 亚 硝 酸 盐 含 量 的 检 测 和 控 制 是 非 常 有 必 要 的 在 果 酱

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