1. 前 言 抗 体 药 物 中 使 用 的 单 克 隆 抗 体, 在 生 产 贮 藏 或 运 输 过 程 中 可 能 会 形 成 二 聚 体 等 凝 聚 物, 存 在 引 发 不 良 反 应 的 风 险 因 素, 故 在 质 量 控 制 中 采 用 体 积 排 阻 色 谱 法 (SEC) 对 单
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1 高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 页 码 1. 前 言 1 2.TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 填 料 的 特 点 标 准 曲 线 和 分 离 性 能 洗 脱 液 盐 浓 度 对 蛋 白 质 出 峰 结 果 的 影 响 测 定 流 速 的 影 响 样 品 载 量 及 样 品 进 样 量 的 影 响 色 谱 柱 外 ( 管 路 中 ) 扩 散 作 用 的 影 响 色 谱 柱 的 耐 用 性 填 料 的 批 间 差 异 与 TSKgel G3000SW XL 的 对 比 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 的 对 比 分 离 实 例 抗 体 类 药 物 的 精 密 分 析 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 实 例 总 结 16
2 1. 前 言 抗 体 药 物 中 使 用 的 单 克 隆 抗 体, 在 生 产 贮 藏 或 运 输 过 程 中 可 能 会 形 成 二 聚 体 等 凝 聚 物, 存 在 引 发 不 良 反 应 的 风 险 因 素, 故 在 质 量 控 制 中 采 用 体 积 排 阻 色 谱 法 (SEC) 对 单 克 隆 抗 体 进 行 分 离 分 析 现 有 的 TSKgel G3000SW XL 色 谱 柱 常 用 于 此 用 途, 但 仍 需 要 更 高 分 离 度 以 及 更 短 分 析 时 间 的 SEC 分 析 技 术 现 在 2μm 粒 径 的 高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 已 实 现 了 商 品 化 在 本 报 告 中, 介 绍 了 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 及 其 分 离 实 例 2.TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 基 本 特 性 2-1. 填 料 的 特 性 表 1 所 示 为 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 填 料 特 性 色 谱 柱 规 格, 以 及 与 常 用 于 抗 体 分 离 的 现 有 SW 型 色 谱 柱 的 性 能 对 比 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 是 以 25nm 孔 径 硅 胶 表 面 导 入 二 醇 基 后 形 成 的 2μm 微 粒 为 填 料 的 色 谱 柱 与 现 有 SW 型 色 谱 柱 相 比, 具 有 更 高 的 分 离 性 能, 适 用 于 抗 体 二 聚 体 及 单 体 的 分 离 表 1: 填 料 特 性 色 谱 柱 规 格 色 谱 柱 尺 寸 4.6 mm I.D. 30 cm 本 色 谱 柱 TSKgel UP-SW mm I.D. 15 cm TSKgel UltraSW Aggregate 7.8 mm I.D. 30 cm 现 有 色 谱 柱 TSKgel SuperSW mab HR 7.8 mm I.D. 30 cm TSKgel G3000SW XL 7.8 mm I.D. 30 cm 基 可 质 硅 胶 硅 胶 硅 胶 硅 胶 官 能 团 二 醇 基 二 醇 基 二 醇 基 二 醇 基 粒 径 2 μm 3 μm 4 μm 5 μm 孔 径 25 nm 30 nm 25 nm 25 nm 分 子 量 排 阻 界 限 800 kda 2,500 kda( 推 算 值 ) 800 kda 800 kda 分 子 量 测 定 范 围 10 ~500 kda 10 ~2,000 kda 10 ~500 kda 10 ~500 kda 用 途 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 ) 的 高 效 分 离 分 析 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 快 速 分 析 抗 体 ( 多 聚 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 一 般 蛋 白 质 抗 体 ( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 高 效 分 离 分 析 2-2. 标 准 曲 线 和 分 离 性 能 使 用 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000(4 μm) 及 TSKgel G3000SW XL(5 μm) 测 定 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 如 图 1 所 示, 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 对 比 如 图 2 所 示 具 有 相 同 孔 径 特 性 的 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000 及 TSKgel G3000SW XL 中, 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 及 多 聚 体 不 会 渗 入 小 孔 内 而 排 出, 进 入 间 隙 所 示 为 样 品 的 理 论 塔 板 数 粒 径 较 小 的 TSKgel UP-SW3000 比 其 他 色 谱 柱 的 理 论 塔 板 数 更 高 图 3 所 示 为 使 用 TSKgel UP-SW3000 TSKgel SuperSW3000 及 TSKgel G3000SW XL 分 离 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 对 比, 表 3 所 示 为 各 溶 出 峰 分 离 度 (R) 的 对 比 粒 径 较 小 的 TSKgel UP-SW3000 比 其 他 色 谱 柱 的 分 离 度 更 高 体 积 (V 0)( 图 1), 校 正 曲 线 的 斜 率 相 同 ( 图 2) 表 2-1 -
3 图 1 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B)TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) C)TSKgel G3000SW XL, (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 温 度 : 25 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ - 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ - 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 表 2 色 谱 柱 性 能 对 比 ( 理 论 塔 板 数 ) 色 谱 柱 粒 径 理 论 塔 板 数 ( ) A)TSKgel UP-SW μm 45,625 B)TSKgel SuperSW μm 24,419 C)TSKgel G3000SW XL 5 μm 18,325 洗 脱 体 积 [ml] 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) TSKgel G3000SW XL, (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 2 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 对 比 - 2 -
4 图 3 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B)TSKgel SuperSW3000 (4 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) C)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A,B)0.35 ml/min,c)1.0 ml/min 检 测 波 长 : UV 280 nm A,B) 微 型 比 色 皿,C) 标 准 比 色 皿 进 样 量 : 10 μl 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体 4. 片 段 表 3 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 对 比 色 谱 柱 粒 径 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel UP-SW μm B)TSKgel SuperSW μm C)TSKgel G3000SW XL 5 μm 洗 脱 液 盐 浓 度 对 蛋 白 质 出 峰 结 果 的 影 响 采 用 合 理 的 SEC 进 行 测 定 时, 必 须 抑 制 填 料 与 测 定 物 质 之 间 的 相 互 作 用 ( 静 电 相 互 作 用 疏 水 相 互 作 用 等 ) 以 硅 胶 为 基 质 的 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱, 填 料 表 面 残 留 的 硅 烷 醇 基 和 蛋 白 质 之 间 发 生 静 电 相 互 作 用 ( 离 子 排 斥 离 子 吸 附 ), 因 此 采 用 合 适 盐 浓 度 的 洗 脱 液 抑 制 该 作 用 非 常 重 要 图 4 所 示 为 通 过 改 变 磷 酸 缓 冲 液 (ph6.7) 的 浓 度 后, 标 准 蛋 白 质 的 洗 脱 效 果 等 电 点 (pi) 低 于 洗 脱 液 ph 的 甲 状 腺 蛋 白 (pi 4.5) γ - 球 蛋 白 (pi 5.1) 及 卵 黄 蛋 白 (pi 4.6), 由 于 在 洗 脱 液 中 会 带 有 负 电 荷, 因 此 在 较 低 的 盐 浓 度 中, 会 由 于 与 残 留 的 硅 烷 醇 基 之 间 的 离 子 排 斥 而 快 速 洗 脱 一 般 情 况 下, 盐 浓 度 越 高 粒 子 排 斥 效 果 越 受 到 抑 制, 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 洗 脱 时 间 减 缓, 当 洗 脱 液 中 盐 浓 度 高 于 100 mmol/l 时, 洗 脱 时 间 即 可 保 持 稳 定 DNP-L- 丙 氨 酸 等 具 有 疏 水 部 的 化 合 物, 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 疏 水 吸 附 作 用 导 致 洗 脱 时 间 减 缓 另 外, 等 电 点 (pl) 高 于 洗 脱 液 ph 的 细 胞 色 素 C(pl 10.1) 和 溶 菌 酶 (pl 11.2) 在 洗 脱 液 中 带 有 正 电 荷, 由 于 与 残 留 硅 烷 醇 基 产 生 静 电 相 互 作 用, 会 吸 附 于 填 料 图 5 所 示 为 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 与 碱 性 蛋 白 质 峰 面 积 的 相 关 性 碱 性 蛋 白 质 细 胞 色 素 C 和 溶 菌 酶, 在 盐 浓 度 较 低 的 情 况 下 会 吸 附 于 填 料, 因 此 峰 面 积 下 降 随 着 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 的 升 高, 峰 面 积 增 大, 当 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 高 于 150mmol/L 时, 峰 面 积 几 乎 可 以 保 持 稳 定 磷 酸 缓 冲 液 的 浓 度 越 高, 越 抑 制 静 电 吸 附 作 用, 因 此 可 以 改 善 吸 收 峰 拖 尾 现 象, 显 示 良 好 的 吸 收 峰 形 故 在 检 测 碱 性 蛋 白 质 时, 必 须 使 用 恒 定 离 子 强 度 的 洗 脱 液 图 6 所 示 为, 通 过 采 用 磷 酸 缓 冲 液 和 在 磷 酸 缓 冲 液 中 添 加 硫 酸 钠 的 洗 脱 液, 按 照 上 述 内 容 调 节 洗 脱 液 的 盐 浓 度 使 溶 液 的 离 子 强 度 维 持 恒 定, 从 而 抑 制 静 电 吸 收 相 互 作 用, 可 以 得 到 恒 定 的 峰 面 积 200mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 即 可 得 到 恒 定 的 峰 面 积, 在 磷 酸 缓 冲 液 中 添 加 硫 酸 钠 的 洗 脱 液, 由 于 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 不 一 致, 一 般 添 加 100 mmol/l~150 mmol/l 的 硫 酸 钠 后 可 得 到 恒 定 的 峰 面 积 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 越 高, 越 能 在 低 浓 度 硫 酸 钠 的 洗 脱 条 件 下, 获 得 恒 定 的 峰 面 积 - 3 -
5 峰 面 积 (mv 秒 ) 峰 面 积 (mv 秒 ) 峰 面 积 (mv 秒 ) 洗 脱 时 间 [min] 甲 状 腺 球 蛋 白 γ - 球 蛋 白 牛 血 清 白 蛋 白 β- 乳 球 蛋 白 细 胞 色 素 C 溶 菌 酶 DNA-L- 丙 氨 酸 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 按 表 中 记 录 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 (mmol/l) 图 4 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 对 洗 脱 时 间 的 影 响 细 胞 色 素 C 溶 菌 酶 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 检 测 波 长 : UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 按 表 中 记 录 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 (mmol/l) 图 5 磷 酸 缓 冲 液 浓 度 对 峰 面 积 的 影 响 xmmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) xmmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 20mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 100mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 20mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 100mmol/L 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ x mmol/l Na 2SO 4 盐 浓 度 (mmol/l) 盐 浓 度 (mmol/l) 图 6 洗 脱 液 盐 浓 度 对 峰 面 积 的 影 响 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : X mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) + X mmol/l Na 2SO 4 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : A) 细 胞 色 素 C B) 溶 菌 酶 - 4 -
6 理 论 塔 板 数 2-4. 测 定 流 速 的 影 响 通 过 采 用 不 同 分 子 量 的 两 种 蛋 白 质 ( 牛 血 清 白 蛋 白 ; :Mw 66,500 :Mw 13,700) 及 低 分 子 化 合 物 (Mw 137), 确 认 了 测 定 时 流 速 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 ( 图 7) 测 定 时 流 速 越 高, 理 论 塔 板 数 也 越 高 扩 散 系 数 较 高, 测 定 时 流 速 减 缓 后 因 扩 散 导 致 理 论 塔 板 数 减 小 但 是, 分 子 量 较 大 的 蛋 白 质 则 随 着 流 速 减 缓 而 呈 现 理 论 塔 板 数 增 大 的 趋 势, 分 子 量 越 大, 越 可 以 通 过 较 低 流 速 取 得 较 高 的 理 论 塔 板 数 因 此, 在 分 离 蛋 白 质 时, 通 过 减 缓 测 定 时 流 速, 可 以 提 高 色 谱 柱 的 柱 效, 得 到 更 好 的 分 离 效 果 图 8 所 示 为 流 速 减 缓 后 γ- 球 蛋 白 二 聚 体 和 单 体 的 分 离 效 果 也 得 以 提 升 图 9 所 示 为 TSKgel UP-SW3000( 粒 径 2 μm) 和 TSKgel SuperSW mab( 粒 径 4 μm) 的 流 速 与 HETP(Height equivalent to a theoretical plate: 理 论 塔 板 高 度 ) 的 相 关 性 对 氨 基 苯 甲 酸 的 任 何 粒 径 均 随 测 定 时 流 速 加 快, 而 呈 现 HETP 减 小, 色 谱 柱 的 柱 效 也 随 之 提 高 相 反, 蛋 白 质 随 着 测 定 流 速 加 快 而 呈 现 HETP 增 大 的 趋 势, 分 子 量 越 大 ( 分 子 尺 寸 较 大 ) 的 蛋 白 质, 色 谱 柱 的 柱 效 降 低 越 明 显 在 填 充 了 小 粒 径 填 料 的 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 中, 测 定 时 流 速 对 HEPT 的 影 响 较 小, 提 升 测 定 时 流 速 后 可 以 抑 制 柱 效 降 低, 与 填 充 大 粒 径 的 填 料 相 比, 可 以 说 填 充 了 小 粒 径 填 料 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 对 高 速 分 析 非 常 有 利 图 10 所 示 为 提 高 流 速 后 测 定 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 通 过 将 测 定 时 流 速 调 整 为 0.50 ml/min, 可 在 5min 的 分 析 时 间 内 获 得 良 好 的 分 离 效 果 而 且, 图 11 还 揭 示 了 流 速 与 压 力 之 间 的 相 关 性 TSKgel UP-SW3000(30 cm 色 谱 柱 ) 可 在 标 准 流 速 (0.35 ml/min) 35 MPa 以 下 的 较 低 操 作 压 强 下 使 用 (66,500 Da) (13,700 Da) (137 Da) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : 0.02~0.38 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 :,66,500 Da,13,700 Da,137 Da 流 速 [ml/min] 图 7 流 速 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 - 5 -
7 R( 二 聚 体 / 单 体 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) % 叠 氮 化 钠 流 速 : 0.02~0.38 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 :, 人 γ- 球 蛋 白 ( 多 克 隆 ) γ - 球 蛋 白 流 速 [ml/min] 图 8 流 速 与 分 离 度 R( 二 聚 体 / 单 体 ) 的 相 关 性 流 速 [ml/min] 流 速 [ml/min] 图 9 不 同 粒 径 的 SEC 色 谱 柱 流 速 与 HETP 的 相 关 性 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) 流 速 : A)0.35 ml/min,b)0.50 ml/min 进 样 量 : 5 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 卵 白 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 10 高 流 速 条 件 下 标 准 蛋 白 质 的 分 离 - 6 -
![[ml/min] 流 速 [ml/min] 图 9 不 同 粒 径 的 SEC 色 谱 柱 流 速 与 HETP 的 相 关 性 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) 流 速 : A)0.35 ml/min,b)0.](/docs-images/51/20131673/images/page_7.jpg "50 ml/min 进 样 量 : 5 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3.")
8 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 压 力 损 失 [MPa] 色 谱 柱 :TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm,4.6 mm I.D. 15 cm) 洗 脱 液 :100 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 流 速 : ml/min 温 度 :25 流 速 [ml/min] 图 11 流 速 与 压 力 的 相 关 性 2-5. 样 品 载 量 及 样 品 进 样 量 的 影 响 采 用 牛 血 清 白 蛋 白 (), 和 对 氨 基 苯 甲 酸, 确 认 了 4.6 mm I.D. 15 cm 色 谱 柱 及 4.6 mm I.D. 30 cm 色 谱 柱 的 样 品 载 量 测 定 15 cm 色 谱 柱 的 样 品 进 样 量 为 5 μl,30 cm 色 谱 柱 的 样 品 进 样 量 为 10 μl, 图 12 所 示 为 各 色 谱 柱 的 样 品 载 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 如 为 15 cm 色 谱 柱, 载 量 为 50 μg 以 上, 载 量 为 37.5 μg 以 上 时, 观 察 到 理 论 塔 板 数 下 降 如 为 30 cm 色 谱 柱, 载 量 为 100 μg 以 上, 载 量 为 70 μg 以 上 时, 观 察 到 理 论 塔 板 数 严 重 下 降 据 此 认 为, 标 准 蛋 白 质 的 载 量 为 色 谱 柱 每 15cm 负 载 35~50 μg,(30 cm 色 谱 柱 则 负 载 70~100 μg) 分 别 制 备 及 样 品, 使 其 上 样 量 分 别 达 到 2 μg 1.5 μg 及 0.01 μg, 并 确 认 进 样 量 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 图 13 所 示 为 各 色 谱 柱 的 进 样 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 15cm 色 谱 柱 30cm 色 谱 柱 在 2μL 进 样 量 内 未 见 理 论 塔 板 数 下 降, 但 在 2μL 以 上 进 样 量 时, 随 着 进 样 量 增 加 理 论 塔 板 数 不 断 下 降 而 且,15cm 色 谱 柱 在 5μL 进 样 量,30cm 色 谱 柱 在 10 μl 进 样 量 下, 理 论 塔 板 数 下 降 10~15 % 左 右 建 议 TSKgel UP-SW3000 的 15cm 色 谱 柱 采 用 5μL 以 下 的 进 样 量,30cm 色 谱 柱 采 用 10μL 以 下 的 进 样 量 载 量 (μg) 载 量 (μg) 图 12 样 品 载 量 与 理 论 塔 板 数 的 相 关 性 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000( 4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000( 4.6 mm I.D. 30 cm) 检 测 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 温 度 :25 进 样 量 : A)5 μl,b)10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) - 7 -
9 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 进 样 量 (μl) 进 样 量 (μl) 图 13 样 品 上 样 量 的 影 响 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 检 测 波 长 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 2-6. 色 谱 柱 外 ( 管 路 ) 扩 散 的 影 响 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 由 于 填 料 粒 径 变 小, 管 路 等 色 谱 柱 外 扩 散 作 用 可 能 导 致 色 谱 柱 原 来 的 性 能 无 法 充 分 发 挥 我 们 确 认 了 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 以 及 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 中 样 品 扩 散 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 将 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 或 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路, 分 别 改 为 内 径 0.13mm 及 内 径 0.25mm 的 PEEK 管 路 长 度, 测 定 了 蛋 白 质 低 分 子 化 合 物 的 理 论 塔 板 数 图 14 所 示 为 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 长 度 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 图 15 所 示 为 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 对 理 论 塔 板 数 的 影 响 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 采 用 内 径 0.13mm 的 管 路 时 ( 图 的,, ), 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 理 论 塔 板 数 逐 渐 下 降, 使 用 25cm 长 度 ( 约 3.32 μl) 的 管 路 时, 理 论 塔 板 数 下 降 约 10% 更 改 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 时, 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 理 论 塔 板 数 逐 渐 下 降, 使 用 40 cm 长 度 ( 约 5.31 μl) 的 管 路 时, 理 论 塔 板 数 下 降 约 10% 另 一 方 面, 使 用 内 径 0.25 mm 的 管 路 时 ( 图 的,, ), 随 着 管 路 的 长 度 增 加, 与 内 径 0.13 mm 管 路 均 显 示 出 理 论 塔 板 数 下 降 的 趋 势 与 使 用 内 径 0.13 mm 管 路 相 比, 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 直 径 不 同 导 致 理 论 塔 板 数 下 降 约 5 10%, 色 谱 柱 UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 直 径 不 同 导 致 理 论 塔 板 数 下 降 约 15 ~ 20% 为 获 得 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 良 好 性 能, 建 议 仪 器 的 管 路 直 径 低 于 0.13 mm, 进 样 阀 色 谱 柱 之 间 的 管 路 长 度 小 于 20 cm, 色 谱 柱 -UV 比 色 皿 之 间 的 管 路 长 度 小 于 30 cm - 8 -
10 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 理 论 塔 板 数 15 cm 色 谱 柱 30 cm 色 谱 柱 管 路 长 度 (cm) 管 路 长 度 (cm) 图 14 色 谱 柱 外 死 体 积 的 影 响 ( 色 谱 柱 入 口 侧 管 路 ) 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : A)5 μl B)10 μl 色 谱 柱 出 口 侧 管 路 :0.13 mm I.D. 30 cm 15 cm 色 谱 柱 30 cm 色 谱 柱 管 路 长 度 (cm) 管 路 长 度 (cm) 图 15 色 谱 柱 外 死 体 积 的 影 响 ( 色 谱 柱 出 口 侧 管 路 ) 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) B)TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : A)5 μl B)10 μl 色 谱 柱 入 口 侧 管 路 :0.13 mm I.D. 15 cm - 9 -
11 洗 脱 时 间 维 持 率 (%) 理 论 塔 板 数 维 持 率 (%) 2-7. 色 谱 柱 的 耐 用 性 我 们 实 施 了 一 项 在 TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm, 4.6 mmi.d. 30 cm) 上 连 续 进 样 时 的 色 谱 柱 耐 用 性 试 验 经 过 标 准 蛋 白 质 混 合 样 品 连 续 100 次 进 样 后, 中 止 进 样, 每 次 中 止 6 小 时 以 上, 反 复 实 验 5 次, 使 用 对 氨 基 苯 甲 酸 确 认 了 色 谱 柱 性 能 ( 洗 脱 时 间 理 论 塔 板 数 ) 采 用 各 色 谱 柱 的 最 大 使 用 流 速 (15 cm 色 谱 柱 为 0.50 ml/min,30 cm 色 谱 柱 为 0.35 ml/min) 实 施 本 试 验 结 果 如 图 所 示 通 过 各 色 谱 柱 尺 寸 确 认 了 3 批 次 的 填 料, 结 果 显 示, 在 任 一 情 况 下, 经 过 500 次 进 样 后 均 未 见 色 谱 柱 性 能 有 显 著 变 化 TSKgel UP-SW3000 比 原 有 色 谱 柱 填 料 的 粒 径 小, 因 此 洗 脱 液 中 含 有 的 不 溶 性 物 质 以 及 样 品 中 的 夹 杂 物 易 在 色 谱 柱 入 口 蓄 积, 可 能 导 致 色 谱 柱 性 能 下 降 通 过 在 分 析 柱 的 入 口 侧 安 装 保 护 柱, 适 时 进 行 更 换, 可 以 防 止 分 析 柱 老 化, 长 时 间 稳 定 地 进 行 测 定 进 样 次 数 进 样 次 数 图 16 色 谱 柱 的 连 续 进 样 试 验 (15cm 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 15 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7) 流 速 : 0.50 ml/min 温 度 : 25 进 样 量 : 5 μl 进 样 间 隔 时 间 : 10 min( 样 品 )(100 次 进 样 后, 中 止 进 样 6 小 时 以 上 ) 进 样 次 数 : 500 次 (100 次 连 续 进 样, 共 进 样 5 次 ) 样 品 : 1 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),γ - 球 蛋 白 (1.5 g/l), 卵 清 蛋 白 (1.5 g/l), (1.5 g/l), (10 mg/l) 2 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),β - 乳 球 蛋 白 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 3γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 细 胞 色 素 C(1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 4 牛 血 清 白 蛋 白 (1.5 g/l), 溶 菌 酶 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l)
12 洗 脱 时 间 维 持 率 (%) 理 论 塔 板 数 维 持 率 (%) 进 样 次 数 进 样 次 数 图 17 色 谱 柱 的 连 续 进 样 试 验 (30cm 色 谱 柱 ) 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.7)+ 0.05% 叠 氮 化 钠 检 测 波 长 :UV 280 nm( 微 型 比 色 皿 ) 进 样 量 :10 μl 进 样 间 隔 时 间 : 15 min ( 样 品 )(100 次 进 样 后, 中 止 进 样 6 小 时 以 上 ) 进 样 次 数 : 500 次 (100 次 连 续 进 样, 共 进 样 5 次 ) 样 品 : 1 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 蛋 清 蛋 白 (1.5 g/l), (1.5 g/l), (10 mg/l) 2 甲 状 腺 球 蛋 白 (1.5 g/l),β - 乳 球 蛋 白 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 3γ- 球 蛋 白 (1.5 g/l), 细 胞 色 素 C(1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 4 牛 血 清 白 蛋 白 (1.5 g/l), 溶 菌 酶 (1.5 g/l),dnp-l- 丙 氨 酸 (20 mg/l) 2-8. 填 料 的 批 间 差 异 图 示 18 所 示 为 采 用 不 同 批 次 的 填 料 测 定 标 准 蛋 白 质 混 合 样 品 的 色 谱 图 可 见 不 同 批 次 的 样 品 之 间 未 见 峰 形 状 洗 脱 位 置 有 大 的 差 异, 批 间 差 异 较 小, 生 产 的 填 料 稳 定 性 很 高 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 18 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 ( 填 料 的 批 间 差 异 )
13 2-9. 与 TSKgel G3000SW XL 的 对 比 在 抗 体 药 物 的 SEC 法 测 定 中, 要 求 色 谱 柱 不 仅 对 抗 体 二 聚 体 和 单 体 的 分 离, 对 单 体 和 片 段 的 分 离 也 有 更 高 的 分 离 度 采 用 2 根 串 联 的 TSKgel G3000SW XL 的 色 谱 柱 以 及 TSKgel UP-SW3000(30 cm 色 谱 柱 1 根 ), 对 比 了 二 者 对 丙 种 球 蛋 白 制 剂 及 单 克 隆 抗 体 的 分 离 性 能 图 19 所 示 为 丙 种 球 蛋 白 制 剂 的 色 谱 图 与 TSKgel G3000SW XL 相 比, TSKgel UP-SW3000 可 在 其 1/2 的 测 定 时 间 即 可 获 得 同 等 以 上 的 分 离 度 (R) 图 20 所 示 为 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图, 不 仅 可 使 二 聚 体 和 单 体 得 到 良 好 的 分 离, 还 显 示 单 体 及 片 段 也 得 到 良 好 的 分 离 表 4 所 示 为 各 峰 的 分 离 度 TSKgel UP-SW3000 只 要 现 有 (TSKgel G3000SW XL) 色 谱 柱 1/2 的 测 定 时 间 即 可 获 得 蛋 白 质 的 高 分 离 分 析 效 果 ( 为 获 得 TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 良 好 性 能, 必 须 减 小 样 品 在 管 路 或 进 样 阀 中 的 扩 散 ) 单 体 单 体 二 聚 体 二 聚 体 图 19 丙 种 球 蛋 白 制 剂 的 分 离 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm 2) B)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)1.0 ml/min,b)0.35 ml/min 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 10 μl 样 品 : 人 γ- 球 蛋 白 多 克 隆 表 20 单 克 隆 抗 体 的 分 离 效 果 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel G3000SW XL (5 μm,7.8 mm I.D. 30 cm 2) B)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)1.0 ml/min,b)0.35 ml/min 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 10 μl 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体,4. 片 段 表 4 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 色 谱 柱 色 谱 柱 尺 寸 (mm I.D. cm) R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel G3000SW XL B)TSKgel UP-SW
14 2-10. 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 的 对 比 为 获 得 SEC 色 谱 柱 的 高 分 离 性 能, 使 用 的 填 料 必 须 满 足 以 下 两 个 条 件 图 21 所 示 为 1. 填 料 的 粒 径 2. 填 料 的 细 孔 特 性 减 小 填 料 粒 径, 可 以 增 加 理 论 塔 板 数 提 高 分 离 度, 但 由 于 色 谱 柱 柱 压 升 高, 必 须 采 用 高 耐 压 系 统 进 行 测 定 另 一 方 面, 通 过 扩 大 填 料 的 细 孔 容 积, 使 校 正 曲 线 的 斜 率 更 平 缓, 可 以 扩 大 不 同 分 子 量 物 质 的 洗 脱 时 间 差 异, 提 高 分 离 度 但 在 一 般 情 况 下, 填 料 的 细 孔 容 积 越 大, 填 料 的 强 度 越 低, 操 作 压 强 随 之 上 升 TSKgel UP-SW3000 通 过 优 化 填 料 的 粒 径 和 细 孔 容 积, 实 现 了 色 谱 柱 性 能 的 提 升 和 色 谱 柱 操 作 压 强 的 降 低 图 22 为 采 用 TSKgel UP-SW3000 和 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 制 成 的 标 准 蛋 白 质 的 校 正 曲 线 在 甲 状 腺 球 蛋 白 (Mw 640,000) 至 卵 清 蛋 白 (Mw 47,000) 的 分 子 量 范 围 内,TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 的 校 正 曲 线 斜 率 更 为 平 缓 已 知 在 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 中, 如 图 23 所 示,γ- 球 蛋 白 ( 峰 2 ) 附 近 的 峰 间 隔 扩 大,TSKgel UP-SW3000 更 适 合 抗 体 的 分 离 采 用 TSKgel UP-SW3000 和 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱, 分 离 单 克 隆 抗 体 的 色 谱 图 如 图 24 所 示, 洗 脱 峰 的 分 离 性 能 如 表 5 所 示 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 相 比,TSKgel UP-SW3000 色 谱 柱 对 单 克 隆 抗 体 三 聚 体 / 二 聚 体 / 单 体 的 分 离 性 能 更 高 对 单 体 及 片 段 也 有 良 好 的 分 离 效 果 1. 填 料 的 粒 径 2. 填 料 的 细 孔 特 性 减 小 粒 径 扩 大 细 孔 容 积 (= 使 校 正 曲 线 的 斜 率 更 平 缓 ) 增 加 理 论 塔 板 数 增 大 色 谱 柱 柱 压 峰 间 隔 扩 大 填 料 强 度 下 降 分 子 量 分 子 量 标 准 曲 线 标 准 曲 线 溶 出 量 溶 出 量 粒 径 : 大 分 离 度 : 小 细 孔 容 积 : 小 分 离 度 : 小 粒 径 : 小 分 离 度 : 大 细 孔 容 积 : 大 分 离 度 : 大 图 21 SEC 色 谱 柱 分 离 性 能 的 两 个 决 定 性 因 素
15 TSKgel UP-SW3000 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 15 cm) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 15 cm) 检 测 : UV 280 nm 进 样 量 : 5 μl 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 图 22 采 用 标 准 蛋 白 质 制 成 的 校 正 曲 线 的 对 比 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm, 4.6 mm I.D. 30 cm) 图 23 标 准 蛋 白 质 的 色 谱 图 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 1. 甲 状 腺 球 蛋 白,640,000 Da (1' 甲 状 腺 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 2.γ- 球 蛋 白,155,000 Da (2'γ- 球 蛋 白 的 二 聚 体 ) 3. 蛋 清 蛋 白,47,000 Da 4.,13,700 Da 5.,137 Da 表 24 单 克 隆 抗 体 的 分 离 效 果 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : IgG 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 三 聚 体,2. 二 聚 体,3. 单 体,4. 片 段
16 表 5 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 (R) 对 比 色 谱 柱 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) A)TSKgel UP-SW B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 分 离 实 例 3-1. 抗 体 类 药 物 的 精 密 分 析 图 25 所 示 为 使 用 长 30 cm 色 谱 柱, 减 缓 测 定 时 流 速, 对 单 克 隆 抗 体 进 行 的 精 密 分 析 实 例 测 定 时 流 速 为 0.35 ml/min 时, 仅 观 察 到 1 个 二 聚 体 的 吸 收 峰, 通 过 将 测 定 时 流 速 减 缓 至 0.05 ml/min, 可 以 分 离 出 二 聚 体 的 吸 收 峰 前 后 洗 脱 的 杂 质 峰 表 6 所 示 为 抗 体 四 聚 体 至 单 体 以 及 片 段 的 各 峰 的 分 离 度 已 知 低 流 速 测 定 可 提 高 分 离 度, 对 抗 体 进 行 精 密 分 析 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000 (4.6 mm I.D. 30 cm) 流 速 : A)0.35 ml/min,b)0.05 ml/min 进 样 量 : 10 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : IgG 型 人 鼠 嵌 合 单 克 隆 抗 体 峰 : 1. 四 聚 体,2. 三 聚 体,3. 二 聚 体 4. 单 体,5. 片 段 图 25 低 流 速 条 件 下 的 高 分 离 分 析 表 6 单 克 隆 抗 体 峰 的 分 离 度 流 速 R( 峰 1/2) R( 峰 2/3) R( 峰 3/4) R( 峰 4/5) A)0.35 ml/min B)0.05 ml/min
17 3-2. 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 实 例 使 用 TSKgel UP-SW3000 与 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 对 IgG 抗 体 ( 小 鼠 ) 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 进 行 了 测 定, 获 得 的 色 谱 图 对 比 如 图 26 所 示 TSKgel UP-SW3000 可 以 分 离 分 子 量 接 近 的 Fc 和 Fab 片 段 使 用 TSKgel UP-SW3000 的 色 谱 图 分 析 了 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 过 程, 如 图 27 所 示 IgG 抗 体 单 体 的 吸 收 峰 随 消 化 时 间 推 移 而 逐 渐 变 小, F(ab') 2 Fc 及 Fab 片 段 的 吸 收 峰 随 消 化 时 间 推 移 而 逐 渐 变 大 消 化 时 间 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 图 26 抗 体 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 物 的 分 离 对 比 色 谱 柱 : A)TSKgel UP-SW3000 (2 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) B) 市 售 UHPLC 用 SEC 色 谱 柱 (1.7 μm,4.6 mm I.D. 30 cm) 洗 脱 液 : 200 mmol/l 磷 酸 缓 冲 液 (ph 6.5) 进 样 量 : 5 μl(rheodyne 公 司 8125 型 ) 样 品 : 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 小 鼠 IgG 类 单 克 隆 抗 体 得 到 的 样 品 ( 消 化 时 间 30 分 钟 ) 图 27 木 瓜 蛋 白 酶 对 IgG 抗 体 消 化 过 程 的 色 谱 图 色 谱 柱 : TSKgel UP-SW3000(4.6 mm I.D. 30 cm) 样 品 : 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 小 鼠 IgG 类 单 克 隆 抗 体 得 到 的 样 品 ( 消 化 时 间 0~120 分 钟 ) 其 他 测 定 条 件 与 图 23 相 同 4. 总 结 综 上 所 述, 对 2μm 粒 径 的 高 性 能 SEC 色 谱 柱 TSKgel UP-SW3000 进 行 了 简 要 说 明 使 用 中 要 注 意 检 测 系 统 中 的 柱 外 死 体 积 的 影 响, 与 现 有 色 谱 柱 相 比, 通 过 使 用 TSKgel UP-SW3000, 可 在 短 时 间 内 实 现 抗 体 二 聚 体 / 单 体 / 片 段 的 高 速 分 离 而 且 减 小 粒 径 加 快 测 定 时 流 速 后, 理 论 塔 板 数 下 降 幅 度 较 小, 加 快 测 定 时 流 速 后 可 进 行 高 通 量 分 析
18 TSKgel 系 东 曹 株 式 会 社 的 注 册 商 标 东 曹 ( 上 海 ) 生 物 科 技 有 限 公 司 地 址 : 上 海 市 徐 汇 区 宜 山 路 1289 号 B 座 3F,301 室 电 话 : 传 真 : 电 子 邮 箱 :info@tosoh.com.cn 网 址 :
为 了 改 进 SEC 色 谱 柱 的 分 离 表 现 - 色 谱 填 料 - 1. 更 小 的 粒 径 更 高 的 理 论 塔 板 数 更 高 的 反 压, 更 小 的 孔 隙 容 量. 更 大 的 孔 隙 容 量 ( 校 准 曲 线 的 斜 率 更 为 平 缓 ) 分 离 系 数 ; 需 要 被
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人 工 抗 原 的 鉴 定
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用 于 聚 集 体 分 析 的 Agilent AdvanceBio SEC 色 谱 柱 : 仪 器 兼 容 性 技 术 概 述 前 言 Agilent AdvanceBio SEC 色 谱 柱 是 体 积 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 产 品 系 列 中 的 最 新 成 员, 填 充 有.7 µm 的 独 特 低 结 合 性 聚 合 物 涂 层 硅 胶 颗 粒 固 定 相 此 项 技 术 可 最
导 数 和 微 分 的 概 念 导 数 的 几 何 意 义 和 物 理 意 义 函 数 的 可 导 性 与 连 续 性 之 间 的 关 系 平 面 曲 线 的 切 线 和 法 线 导 数 和 微 分 的 四 则 运 算 基 本 初 等 函 数 的 导 数 复 合 函 数 反 函 数 隐 函 数 以
2015 年 考 研 数 学 二 考 试 大 纲 考 试 科 目 : 高 等 数 学 线 性 代 数 考 试 形 式 和 试 卷 结 构 一 试 卷 满 分 及 考 试 时 间 试 卷 满 分 为 150 分, 考 试 时 间 为 180 分 钟. 二 答 题 方 式 答 题 方 式 为 闭 卷 笔 试. 三 试 卷 内 容 结 构 高 等 教 学 约 78% 线 性 代 数 约 22% 四 试 卷
工 程 勘 察 资 质 标 准 根 据 建 设 工 程 勘 察 设 计 管 理 条 例 和 建 设 工 程 勘 察 设 计 资 质 管 理 规 定, 制 定 本 标 准 一 总 则 ( 一 ) 本 标 准 包 括 工 程 勘 察 相 应 专 业 类 型 主 要 专 业 技 术 人 员 配 备 技 术
住 房 和 城 乡 建 设 部 关 于 印 发 工 程 勘 察 资 质 标 准 的 通 知 建 市 [2013]9 号 各 省 自 治 区 住 房 和 城 乡 建 设 厅, 北 京 市 规 划 委, 天 津 上 海 市 建 设 交 通 委, 重 庆 市 城 乡 建 设 委, 新 疆 生 产 建 设 兵 团 建 设 局, 总 后 基 建 营 房 部 工 程 局, 国 务 院 有 关 部 门 建 设 司,
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( 一 ) 系 统 整 体 操 作 流 程 简 述 3 ( 二 ) 系 统 中 各 角 色 操 作 功 能 说 明 5 1. 学 院 管 理 员 5 2. 教 学 院 长 8 3. 指 导 教 师 10 4. 答 辩 组 组 长 12 5. 学 生 12 6. 系 统 管 理 员 15 ( 一 ) 论 文 系 统 常 见 问 题 16 ( 二 ) 论 文 查 重 常 见 问 题 22 1 2 主
说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度, 对 2015 年 春 季 期 教 运 行 基
内 部 资 料 东 北 师 范 大 教 运 行 基 本 状 态 据 报 告 2015 年 春 季 期 教 务 处 2015 年 10 月 27 日 说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度,
黄 金 原 油 总 持 仓 增 长, 同 比 增 幅 分 别 为 4.2% 和 4.1% 而 铜 白 银 以 及 玉 米 则 出 现 减 持, 减 持 同 比 减 少 分 别 为 9.4%,9.4% 以 及 6.5% 大 豆, 豆 粕 结 束 连 续 4 周 总 持 仓 量 增 长, 出 现 小 幅
小 麦 净 多 持 仓 增 加, 豆 油 豆 粕 净 多 持 仓 减 少 美 国 CFTC 持 仓 报 告 部 门 : 市 场 研 究 与 开 发 部 类 型 : 量 化 策 略 周 报 日 期 :212 年 5 月 7 日 电 话 :592-5678753 网 址 :www.jinyouqh.com 主 要 内 容 : 根 据 美 国 CFTC 公 布 的 数 据, 本 报 告 中 的 11 个
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工 程 硕 士 数 学 考 试 大 纲 与 要 求 ( 包 括 高 等 数 学 和 线 性 代 数 ) 一 函 数 极 限 与 连 续 第 一 部 分 : 高 等 数 学 考 试 内 容 函 数 的 概 念 及 表 示 法 函 数 的 有 界 性 单 调 性 周 期 性 和 奇 偶 性 复 合 函 数 反 函 数 分 段 函 数 和 隐 函 数 基 本 初 等 函 数 的 性 质 及 其 图 形 初
随着执业中医师资格考试制度的不断完善，本着为我校中医学专业认证服务的目的，本文通过对我校中医类毕业生参加2012年和2013年的中医执业医师考试成绩及通过率、掌握率进行分析，并与全国的平均水平进行差异比较分析，以此了解我校执业中医师考试的现状，进而反映我校中医类课程总体教学水平，发现考核知识模块教学中存在的不足，反馈给相关学院和教学管理部门，以此提高教学和管理水平。
2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 教 务 处 二 零 一 三 年 三 月 1 目 录 1 前 言 3 2 2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 4 附 件 1:2012 年 中 医 类 别 医 师 资 格 综 合 笔 试 院 校 学 科 成 绩 分 析 报 告 附 件 2:2013
金 不 少 于 800 万 元, 净 资 产 不 少 于 960 万 元 ; (3) 近 五 年 独 立 承 担 过 单 项 合 同 额 不 少 于 1000 万 元 的 智 能 化 工 程 ( 设 计 或 施 工 或 设 计 施 工 一 体 ) 不 少 于 2 项 ; (4) 近 三 年 每 年
工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 一 总 则 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 ( 一 ) 为 了 加 强 对 从 事 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 企 业 的 管 理, 维 护 建 筑 市 场 秩 序, 保 证 工 程 质 量 和 安 全, 促 进 行 业 健 康 发 展, 结 合 建 筑 智 能 化 工 程 的 特 点, 制 定 本 标
龚 亚 夫 在 重 新 思 考 基 础 教 育 英 语 教 学 的 理 念 一 文 中 援 引 的 观 点 认 为 当 跳 出 本 族 语 主 义 的 思 维 定 式 后 需 要 重 新 思 考 许 多 相 连 带 的 问 题 比 如 许 多 发 音 的 细 微 区 别 并 不 影 响 理 解 和
语 音 语 篇 语 感 语 域 林 大 津 毛 浩 然 改 革 开 放 以 来 的 英 语 热 引 发 了 大 中 小 学 英 语 教 育 整 体 规 划 问 题 在 充 分 考 虑 地 区 学 校 和 个 体 差 异 以 及 各 家 观 点 的 基 础 上 遵 循 实 事 求 是 逐 级 定 位 逐 层 分 流 因 材 施 教 的 原 则 本 研 究 所 倡 导 的 语 音 语 篇 语 感 语 域
Microsoft Word - 第7章 图表反转形态.doc
第 七 章 图 表 反 转 形 态 我 们 知 道 市 场 趋 势 共 有 三 种 : 上 升 趋 势 下 降 趋 势 和 横 向 整 理 市 场 的 价 格 波 动 都 是 运 行 在 这 三 种 趋 势 中, 所 有 的 走 势 都 是 这 三 种 趋 势 的 排 列 组 合 如 图 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 所 示 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 图 市 场 趋
3. 稀 释 样 本 通 常 在 送 检 的 样 本 中, 各 种 细 胞 相 互 重 叠 分 析 仪 无 法 在 此 情 况 下 准 确 地 计 算 血 细 胞 的 数 目 或 统 计 血 细 胞 的 体 积 分 布 因 此, 在 分 析 仪 计 数 或 统 计 体 积 分 布 之 前, 需 要
1. 概 述 本 分 析 仪 采 用 电 阻 抗 法 检 测 红 细 胞 白 细 胞 和 血 小 板 的 数 目 以 及 体 积 分 布, 采 用 比 色 法 测 量 血 红 蛋 白 浓 度 在 此 基 础 之 上, 分 析 仪 计 算 出 其 余 参 数 的 结 果 2. 吸 取 样 本 在 全 血 工 作 模 式 下, 操 作 者 可 直 接 将 全 血 样 本 送 至 分 析 仪 进 行 采
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机 电 一 级 注 册 建 造 师 继 续 教 育 培 训 广 东 培 训 点 网 上 报 名 操 作 使 用 手 册 (2013 年 1 月, 第 一 版 ) 第 一 章 个 人 注 册 与 个 人 信 息 管 理 1. 个 人 注 册 ( 请 每 人 只 申 请 一 个 注 册 号, 如 果 单 位 批 量 报 班 单 位 帮 申 请 注 册, 不 需 个 人 再 注 册 ) 首 次 报 班,
第 六 章 债 券 股 票 价 值 评 估 1 考 点 一 : 债 券 价 值 的 影 响 因 素 2
Professional Accounting Education Provided by Academy of Professional Accounting (APA) CPA 财 务 管 理 习 题 班 第 八 讲 债 券 股 票 价 值 评 估 IreneGao ACCAspace 中 国 ACCA 国 际 注 册 会 计 师 教 育 平 台 Copyright ACCAspace.com
国债回购交易业务指引
附 件 1 上 海 证 券 交 易 所 新 质 押 式 国 债 回 购 交 易 业 务 指 引 一 总 述 根 据 上 海 证 券 交 易 所 债 券 交 易 实 施 细 则, 上 证 所 将 于 2006 年 5 月 8 日 起 推 出 新 质 押 式 国 债 回 购 新 质 押 式 回 购 与 现 行 质 押 式 回 购 相 比 区 别 主 要 在 以 下 几 个 方 面 :1 新 质 押 式
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: 周 晓 虹 : - -., - - - -. :( ), -,.( ),,, -. - ( ).( ) ', -,,,,, ( ).( ),,, -., '.,, :,,,, :,,,, ,,,,, :,, (.,, );, (, : ), (.., ;. &., ;.. &.., ;, ;, ),,,,,,, ( ) ( ),,,,.,,,,,, : ;, ;,.,,,,, (., : - ),,,,
1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路 2
简 略 版 本 :2015 3 10 2016 2021 全 球 卫 生 部 门 病 毒 性 肝 炎 战 略 2016 2021 2015 3 12 2012 2010 2014 2015 2016 2021 140 55% 35% 5 15% 5 20% 2.4 1.3 1.5 1 1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路
一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创 新 能 力, 综 合 运 用 所 学 知 识 发 现 问 题, 分 析 问 题 和 解 决
上 海 市 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 基 本 要 求 和 评 价 指 标 体 系 ( 试 行 ) 上 海 市 学 位 委 员 会 办 公 室 二 O 一 二 年 三 月 一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创
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- 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - 做 四 个 全 面 的 宣 传 者 实 践 者 - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 20 - 创 新 调 处 新 机 制 构 筑 稳 定 防 火 墙 - 21 - - 22 - - 23
公 路 交 通 科 技 黄 文 元 王 旭 东 刘 瀚 飚 周 朝 毅 公 路 货 运 超 载 呈 现 愈 演 愈 烈 的 态 势 各 种 危 害 显 现 已 经 引 起 相 关 的 技 术 和 行 业 主 管 层 面 的 广 泛 关 注 建 立 在 充 分 统 计 数 据 上 的 定 量 危 害 分 析 一 直 非 常 欠 缺 使 得 公 路 基 础 设 施 建 设 和 维 护 与 交 通 现 状
编号：
编 号 : 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 实 施 方 案 ( 仅 适 用 于 企 业 特 有 行 业 特 有 工 种 ) 实 施 单 位 ( 公 章 ) 申 报 日 期 年 _ 月 日 1 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 项 目 实 施 方 案 申 报 表 项 目 名 称 等 级 项 目 性 质 课 时 申 报 单 位 联 系 人 通 讯 地 址 电 话 手 机 电
何 秋 琳 张 立 春 视 觉 学 习 研 究 进 展 视 觉 注 意 视 觉 感 知
第 卷 第 期 年 月 开 放 教 育 研 究 何 秋 琳 张 立 春 华 南 师 范 大 学 未 来 教 育 研 究 中 心 广 东 广 州 随 着 图 像 化 技 术 和 电 子 媒 体 的 发 展 视 觉 学 习 也 逐 步 发 展 为 学 习 科 学 的 一 个 研 究 分 支 得 到 研 究 人 员 和 教 育 工 作 者 的 广 泛 关 注 基 于 此 作 者 试 图 对 视 觉 学 习
第 期 王 兴 涛 等 猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 种 猪 精 液 分 离 株 的 鉴 定 及 进 化 分 析 病 料 毒 株 及 细 胞 试 剂 引 物 设 计 提 取 及 基 因 克 隆 及 测 序
河 南 农 业 科 学 王 兴 涛 罗 俊 滕 蔓 樊 剑 鸣 鄂 巍 禹 斌 刘 力 张 改 平 利 用 技 术 对 河 南 省 某 规 模 化 猪 场 乙 脑 疑 似 病 例 的 种 猪 精 液 进 行 分 析 从 部 分 样 本 中 扩 增 出 与 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 基 因 和 基 因 具 有 高 度 同 源 性 的 预 期 产 物 在 日 龄 乳 鼠 脑 内 接 种 种 猪
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中 国 应 对 气 候 变 化 的 政 策 与 行 动 2013 年 度 报 告 国 家 发 展 和 改 革 委 员 会 二 〇 一 三 年 十 一 月 100% 再 生 纸 资 源 目 录 前 言... 1 一 应 对 气 候 变 化 面 临 的 形 势... 3 二 完 善 顶 层 设 计 和 体 制 机 制... 4 三 减 缓 气 候 变 化... 8 四 适 应 气 候 变 化... 20
第三章 作业
- 在 题 图 - 中, 若 电 压 源 U V, 电 阻, 试 在 图 示 参 考 方 向 下 求 支 路 电 流 I Us I 题 图 - 以 电 压 源 为 参 考 方 向,I=-A - 求 图 - 各 支 路 中 未 知 量 的 值 4V V =? A U=? V A U=? A V a b c a =(-4)/=Ω b U=+ =4V c U=4V 题 图 - - 在 题 图 -a b 所
浙 江 大 学 化 学 工 程 与 生 物 工 程 学 系 硕 士 学 位 论 文 混 合 模 式 吸 附 层 析 分 离 猪 血 免 疫 球 蛋 白 研 究 姓 名 : 庄 甜 甜 申 请 学 位 级 别 : 硕 士 专 业 : 化 学 工 程 指 导 教 师 : 林 东 强 20100101 混
抗 战 时 期 国 民 政 府 的 银 行 监 理 体 制 探 析 % # % % % ) % % # # + #, ) +, % % % % % % % %
抗 战 时 期 国 民 政 府 的 银 行 监 理 体 制 探 析 王 红 曼 抗 战 时 期 国 民 政 府 为 适 应 战 时 经 济 金 融 的 需 要 实 行 由 财 政 部 四 联 总 处 中 央 银 行 等 多 家 机 构 先 后 共 同 参 与 的 多 元 化 银 行 监 理 体 制 对 战 时 状 态 下 的 银 行 发 展 与 经 营 安 全 进 行 了 大 规 模 的 设 计 与
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上 海 德 载 中 怡 律 师 事 务 所 关 于 昂 华 ( 上 海 ) 自 动 化 工 程 股 份 有 限 公 司 二 〇 一 二 年 年 度 股 东 大 会 法 律 意 见 书 上 海 德 载 中 怡 律 师 事 务 所 上 海 市 银 城 中 路 168 号 上 海 银 行 大 厦 1705 室 (200120) 电 话 :8621-5012 2258 传 真 :8621-5012 2257
生 物 技 术 通 报 相 关 载 体 及 试 剂 动 物 组 织 及 细 胞 培 养 总 的 提 取 及 反 转 录 内 蒙 古 白 绒 山 羊 基 因 的 分 子 克 隆 生 物 信 息 学 分 析
生 物 技 术 通 报 鲍 文 蕾 杨 娇 馥 李 彬 刘 俊 娥 王 潇 郭 旭 东 王 志 钢 侯 鑫 刘 东 军 旨 在 克 隆 内 蒙 古 白 绒 山 羊 血 管 内 皮 生 长 因 子 基 因 并 分 析 其 基 本 表 达 模 式 采 用 技 术 克 隆 基 因 将 得 到 的 基 因 序 列 及 其 编 码 的 氨 基 酸 序 列 进 行 生 物 信 息 学 分 析 利 用 半 定 量
(2015-2016-2)-0004186-04205-1 140242 信 号 与 系 统 Ⅰ 学 科 基 础 必 修 课 37 37 1 教 203 17 周 2016 年 06 月 13 日 (08:00-09:35) (2015-2016-2)-0004186-04205-1 141011
关 于 2015-2016 学 年 第 二 学 期 期 末 周 内 考 试 时 间 地 点 安 排 选 课 课 号 班 级 名 称 课 程 名 称 课 程 性 质 合 考 人 数 实 际 人 数 考 试 教 室 考 试 段 考 试 时 间 (2015-2016-2)-0006178-04247-1 130101 测 试 技 术 基 础 学 科 基 础 必 修 课 35 35 1 教 401 17 周
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附 件 4: 药 品 补 充 申 请 注 册 事 项 及 申 报 资 料 要 求 一 注 册 事 项 ( 一 ) 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 审 批 的 补 充 申 请 事 项 : 1. 持 有 新 药 证 书 的 药 品 生 产 企 业 申 请 该 药 品 的 批 准 文 号 2. 使 用 药 品 商 品 名 称 3. 增 加 中 药 的 功 能 主 治 天 然 药 物 适 应 症
修改版-操作手册.doc
职 称 信 息 系 统 升 级 指 南 须 使 用 IE9 及 其 以 上 版 本 浏 览 器 或 谷 歌 浏 览 器 登 录 www.njrs.gov.cn 南 京 市 职 称 ( 职 业 资 格 ) 工 作 领 导 小 组 办 公 室 2016 年 5 月 目 录 一 申 报 人 员 操 作 指 南...1 1.1 职 称 初 定 申 报...1 1.1.1 职 称 初 定 基 础 信 息 填
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国 内 各 期 货 交 易 所 关 于 合 约 限 仓 方 面 的 规 定 上 海 期 货 交 易 所 经 纪 会 员 非 经 纪 会 员 和 客 户 的 期 货 合 约 在 不 同 时 期 限 仓 的 具 体 比 例 和 数 额 如 下 : ( 单 位 : ) 合 约 挂 牌 至 交 割 月 前 第 二 月 的 最 后 一 个 交 易 日 交 割 月 前 第 一 月 交 割 月 份 某 一 期 货
全国建筑市场注册执业人员不良行为记录认定标准（试行）.doc
- 1 - - 2 - 附 件 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 不 良 记 录 认 定 标 准 ( 试 行 ) 说 明 为 了 完 善 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 诚 信 体 系 建 设, 规 范 执 业 和 市 场 秩 序, 依 据 相 关 法 律 法 规 和 部 门 规 章, 根 据 各 行 业 特 点, 我 部 制 订 了 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人
第二讲 数列
Togisu XueD Persolized Eduio Developme Ceer 高 考 中 不 等 式 问 题 的 解 决 方 法 通 润 达 久 王 力 前 言 : 近 年 来 不 等 式 问 题 正 越 来 越 多 的 出 现 在 调 研 题 和 高 考 试 题 中 而 且 大 多 出 现 在 江 苏 高 考 的 填 空 压 轴 题 中 是 高 考 考 察 的 重 点 和 难 点 由 于
科 学 出 版 社 科 学 出 版 社 前 言 本 书 是 针 对 普 通 高 等 院 校 经 济 类 和 工 商 管 理 类 本 科 专 业 财 务 管 理 学 的 教 学 需 求, 结 合 教 育 部 经 济 管 理 类 本 科 财 务 管 理 学 课 程 教 学 大 纲 编 写 而 成 的 本 书 执 笔 者 都 是 长 期 工 作 在 财 务 管 理 教 学 一 线 的 专 业 教 师,
证券代码：000066 证券简称：长城电脑 公告编号：2014-000
证 券 代 码 :000066 证 券 简 称 : 长 城 电 脑 公 告 编 号 :2016-092 中 国 长 城 计 算 机 深 圳 股 份 有 限 公 司 2016 年 度 第 三 次 临 时 股 东 大 会 决 议 公 告 本 公 司 及 其 董 事 会 全 体 成 员 保 证 信 息 披 露 内 容 的 真 实 准 确 完 整, 没 有 虚 假 记 载 误 导 性 陈 述 或 重 大 遗
2 2015 年 8 月 11 日, 公 司 召 开 2015 年 第 五 次 临 时 股 东 大 会, 审 议 通 过 了 关 于 公 司 <2015 年 股 票 期 权 激 励 计 划 ( 草 案 )> 及 其 摘 要 的 议 案 关 于 提 请 股 东 大 会 授 权 董 事 会 办 理 公
证 券 代 码 :300017 证 券 简 称 : 网 宿 科 技 公 告 编 号 :2016-053 网 宿 科 技 股 份 有 限 公 司 关 于 调 整 公 司 2015 年 股 票 期 权 激 励 计 划 激 励 对 象 股 票 期 权 数 量 和 行 权 价 格 的 公 告 本 公 司 及 董 事 会 全 体 成 员 保 证 公 告 内 容 真 实 准 确 和 完 整, 没 有 虚 假 记
上海证券交易所会议纪要
附 件 上 海 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 实 施 细 则 第 一 章 总 则 第 一 条 为 规 范 拟 在 上 海 证 券 交 易 所 ( 以 下 简 称 上 交 所 ) 上 市 的 公 司 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 业 务, 提 高 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 申 购 及 资 金 结 算 效 率, 根 据 证 券 发 行 与 承 销
第 期 马 海 燕 等 臭 氧 水 和 超 声 波 协 同 作 用 在 速 冻 西 兰 花 中 的 应 用 研 究 材 料 与 方 法 臭 氧 水 的 制 取 臭 氧 水 处 理 超 声 波 处 理 超 声 波 和 臭 氧 水 协 同 处 理 对 照 处 理 邻 苯 二 胺 分 光 光 度 法 测
第 卷 第 期 年 月 食 品 与 生 物 技 术 学 报 臭 氧 水 和 超 声 波 协 同 作 用 在 速 冻 西 兰 花 中 的 应 用 研 究 马 海 燕 张 慜 孙 金 才 食 品 科 学 与 技 术 国 家 重 点 实 验 室 江 南 大 学 江 苏 无 锡 海 通 食 品 集 团 股 份 有 限 公 司 浙 江 慈 溪 由 于 速 冻 蔬 菜 加 工 过 程 中 的 热 烫 处 理 对
激 励 计 划 设 定 的 第 三 个 解 锁 期 解 锁 条 件 是 否 达 到 解 锁 条 件 的 说 明 1 公 司 未 发 生 如 下 任 一 情 形 : 1 公 司 最 近 一 个 会 计 年 度 财 务 会 计 报 告 被 注 册 会 计 师 出 具 否 定 意 见 或 者 无 法 表
证 券 代 码 :300170 证 券 简 称 : 汉 得 信 息 公 告 编 号 :2016-032 上 海 汉 得 信 息 技 术 股 份 有 限 公 司 关 于 2012 年 股 权 激 励 计 划 第 三 期 解 锁 股 份 上 市 流 通 的 提 示 性 公 告 本 公 司 及 董 事 会 全 体 成 员 保 证 信 息 披 露 内 容 的 真 实 准 确 和 完 整, 没 有 虚 假 记
附件1：
附 件 5 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 申 请 表 硕 士 专 业 学 位 类 别 ( 工 程 领 域 ): 工 程 硕 士 ( 控 制 工 程 领 域 ) 申 报 单 位 名 称 : 上 海 工 程 技 术 大 学 一 申 请 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 论 证 报 告 申 请 增 列 硕 士 专 业 学 位 授 权 点 论 证 报 告 一 专 业 人 才 需 求
教师上报成绩流程图
教 务 管 理 系 统 使 用 说 明 学 生 端 用 户 1 在 校 内 任 何 一 台 连 接 校 园 网 的 计 算 机 上 登 录 教 务 处 主 页 教 务 处 主 页 地 址 : http://jw.stdu.edu.cn/homepage 随 后 点 击 按 钮 ( 见 下 图 所 示 ), 即 可 进 入 综 合 教 务 管 理 系 统 2 在 综 合 教 务 管 理 区 域 内 键
附件1：
附 件 : 商 品 期 货 套 期 业 务 会 计 处 理 暂 行 规 定 为 规 范 企 业 商 品 期 货 套 期 业 务 的 会 计 处 理, 使 财 务 报 表 更 好 地 反 映 企 业 商 品 价 格 风 险 管 理 活 动 的 目 标 过 程 和 结 果, 促 进 企 业 利 用 商 品 期 货 进 行 风 险 管 理, 根 据 中 华 人 民 共 和 国 会 计 法 和 企 业 会
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有 限 理 性 动 物 精 神 及 市 场 崩 溃 对 情 绪 波 动 与 交 易 行 为 的 实 验 研 究 林 树 俞 乔 资 本 市 场 的 经 验 表 明 市 场 参 与 主 体 投 资 者 的 情 绪 波 动 对 资 产 交 易 与 价 格 决 定 产 生 了 不 可 忽 视 的 影 响 但 是 现 有 文 献 尚 缺 乏 对 这 一 重 要 因 素 的 研 究 因 此 本 文 的 目 的
类 似 地, 又 可 定 义 变 下 限 的 定 积 分 : ( ). 与 ψ 统 称 为 变 限 积 分. f ( ) d f ( t) dt,, 注 在 变 限 积 分 (1) 与 () 中, 不 可 再 把 积 分 变 量 写 成 的 形 式 ( 例 如 ) 以 免 与 积 分 上 下 限 的
5 ( 一 ) 微 积 分 学 基 本 定 理 当 函 数 的 可 积 性 问 题 告 一 段 落, 并 对 定 积 分 的 性 质 有 了 足 够 的 认 识 之 后, 接 着 要 来 解 决 一 个 以 前 多 次 提 到 过 的 问 题 在 定 积 分 形 式 下 证 明 连 续 函 数 必 定 存 在 原 函 数. 一 变 限 积 分 与 原 函 数 的 存 在 性 设 f 在 [,] 上
曹 学 丽 王 尉 裴 海 闰 北 京 工 商 大 学 化 学 与 环 境 工 程 学 院 北 京 市 植 物 资 源 研 究 开 发 重 点 实 验 室 北 京 逆 流 色 谱 是 一 种 新 型 高 效 的 液 液 分 配 色 谱 分 离 技 术 由 于 它 不 需 要 固 体 分 离 介 质 因 而 具 有 传 统 的 液 固 色 谱 所 不 具 备 的 独 特 优 势 本 文 在 简 介 分
第 四 条 建 设 单 位 对 可 能 产 生 职 业 病 危 害 的 建 设 项 目, 应 当 依 照 本 办 法 向 安 全 生 产 监 督 管 理 部 门 申 请 职 业 卫 生 三 同 时 的 备 案 审 核 审 查 和 竣 工 验 收 建 设 项 目 职 业 卫 生 三 同 时 工 作 可
第 51 号 建 设 项 目 职 业 卫 生 三 同 时 监 督 管 理 暂 行 办 法 已 经 2012 年 3 月 6 日 国 家 安 全 生 产 监 督 管 理 总 局 局 长 办 公 会 议 审 议 通 过, 现 予 公 布, 自 2012 年 6 月 1 日 起 施 行 国 家 安 全 生 产 监 督 管 理 总 局 骆 琳 二 一 二 年 四 月 二 十 七 日 建 设 项 目 职 业
国际财务报告准则第13号——公允价值计量
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Cybozu Garoon 3 管理员手册
附 录 D 数 据 的 输 入 样 式 数 据 的 种 类 和 输 入 字 符 的 值 等, 在 Garoon3 的 页 面 输 入 的 数 据 样 式 如 下 所 示 基 本 系 统 客 户 信 息 法 人 姓 名 字 符 串 ( 00 法 人 姓 名 ( 拼 音 ) 字 符 串 ( 00 图 标 (URL) 字 符 串 ( 255 应 用 程 序 新 名 称 字 符 串 ( 00 用 户 姓 名
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朱 丽 明 柯 美 云 周 丽 雅 袁 耀 宗 罗 金 燕 候 晓 华 陈 旻 湖 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 据 美 国 科 技 新 闻 网 报 道 根 据 纽 约 路 透 社 报 道 一 份 新 的 研 究 显 示 青 年 及 成 年 人 若 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 美 国 德 州 大 学 西 南 医 学 中 心
总站水字[2007]2号
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附 件 1: 全 国 近 岸 海 域 环 境 监 测 网 质 量 保 证 和 质 量 控 制 工 作 规 定 ( 试 行 ) 一 目 的 及 要 求 为 进 一 步 加 强 和 规 范 近 岸 海 域 环 境 监 测 ( 包 括 近 岸 海 域 环 境 质 量 监 测 入 海 河 流 监 测 和 直 排 海 污 染 源 监 测 等 ) 的 质 量 保 证 和 质 量 控 制 工 作, 完 善 质 量
精 勤 求 学 自 强 不 息 Born to win! 解 析 : 由 极 限 的 保 号 性 知 存 在 U ( a) 当 a 时 f ( ) f ( a) 故 f ( ) 在 点 a 不 取 极 值 f ( ) f ( a) f ( ) f ( a) lim lim a a a a ( a)
年 考 研 数 学 二 模 拟 题 ( 二 ) 参 考 答 案 本 试 卷 满 分 5 考 试 时 间 8 分 钟 一 选 择 题 :~8 小 题 每 小 题 分 共 分 下 列 每 小 题 给 出 的 四 个 选 项 中 只 有 一 项 符 合 题 目 要 求 的 请 将 所 选 项 前 的 字 母 填 在 答 题 纸 指 定 位 置 上 () 在 点 处 不 存 在 极 限 的 函 数 是 (
珠江钢琴股东大会
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( ) ( )... 李 雪 岩, 龙 耀 (. 广 西 民 族 大 学 商 学 院, 广 西 南 宁 ;. 中 山 大 学 教 育 学 院, 广 东 广 州 ) : 高 等 教 育 是 专 业 教 育 高 考 是 为 高 等 教 育 服 务 的, 是 为 高 等 专 业 教 育 选 拔 有 专 业 培 养 潜 质 的 人 才 现 行 高 考 制 度 忽 略 专 业 潜 质 的 因 素, 过 份 强
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一、资质申请
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第 2 期 ( 总 第 13 期 ) 浙 江 出 入 境 检 验 检 疫 局 政 策 研 究 室 (WTO 研 究 室 ) 2010 年 01 月 22 日 目 录 工 作 动 态 帮 扶 企 业 应 对 壁 垒 嘉 兴 对 美 出 口 茶 叶 实 现 大 幅 增 长 1 早 部 署 建 体 系 积 极 应 对 韩 国 对 进 口 水 产 品 的 特 别 检 查 计 划 2 温 州 检 验 检 疫
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关 于 修 订 沪 市 股 票 上 网 发 行 资 金 申 购 实 施 办 法 的 通 知 各 有 关 单 位 : 沪 市 股 票 上 网 发 行 资 金 申 购 实 施 办 法 ( 修 订 稿 ) ( 见 附 件 ) 已 经 中 国 证 券 监 督 管 理 委 员 会 批 准, 现 将 修 订 所 涉 主 要 内 容 公 布 如 下 一 第 二 条 ( 二 ) 申 购 单 位 及 上 限 修 改
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广 西 科 技 大 学 文 件 校 发 2015 115 号 关 于 组 织 开 展 全 校 教 职 工 岗 位 聘 用 变 动 工 作 的 通 知 校 属 各 单 位 : 我 校 首 次 岗 位 聘 用 聘 期 已 满, 根 据 上 级 有 关 岗 位 设 置 与 聘 用 管 理 文 件 精 神, 为 进 一 步 促 进 学 校 人 才 资 源 的 科 学 合 理 配 置, 深 化 岗 位 聘 用
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