1. 菌 种 : 在 一 边 已 长 成 一 直 线 状 菌 落 的 产 黄 青 霉 链 霉 菌 平 板 各 1 个, 培 养 18 小 时 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 杆 菌 枯 草 杆 菌 菌 液 粘 质 赛 氏 杆 菌 的 平 板 2. 仪 器 : 无 菌 的 小 圆 滤 纸 片

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1 环 境 因 素 对 微 生 物 的 影 响 和 紫 外 诱 变 效 应 生 93 沈 睿 同 组 成 员 : 赵 磊 徐 鲁 斌 实 验 日 期 : 一. 实 验 目 的 1. 了 解 物 理 因 素 化 学 因 素 及 生 物 因 素 抑 制 或 杀 死 微 生 物 的 作 用 及 其 试 验 方 法 2. 了 解 紫 外 线 诱 变 原 理, 并 初 步 掌 握 紫 外 线 诱 变 育 种 的 方 法 3. 练 习 单 菌 落 划 线 分 离 微 生 物 二. 实 验 原 理 在 自 然 界 中, 微 生 物 分 布 极 其 广 泛, 几 乎 无 处 不 在, 微 生 物 的 生 长 发 育 受 着 环 境 因 素 的 影 响 而 不 同 的 微 生 物 及 微 生 物 不 同 的 生 理 状 态 受 环 境 因 素 影 响 的 程 度 也 不 同, 有 的 环 境 因 素 是 微 生 物 生 长 繁 殖 所 必 需 的 条 件, 有 的 表 现 为 抑 制 作 用, 有 的 表 现 为 杀 菌 作 用 1. 温 度 对 微 生 物 的 影 响 温 度 通 过 影 响 蛋 白 质 核 酸 等 生 物 大 分 子 的 结 构 与 功 能 以 及 细 胞 结 构 来 影 响 微 生 物 的 生 长 繁 殖 和 新 陈 代 谢 微 生 物 群 体 生 长 繁 殖 最 快 的 温 度 为 其 最 适 生 长 温 度, 但 它 并 不 等 于 积 累 某 一 代 谢 产 物 的 最 适 温 度 粘 质 沙 雷 氏 菌 能 产 生 红 色 或 紫 红 色 色 素, 菌 落 表 面 颜 色 随 着 色 素 量 的 增 加 呈 现 出 由 橙 黄 到 深 红 色 逐 渐 加 深 的 变 化 趋 势 2. 化 学 因 素 对 微 生 物 的 影 响 常 用 的 化 学 消 毒 剂 主 要 包 括 重 金 属 及 其 盐 类 有 机 溶 剂 ( 酚 醇 醛 等 ) 卤 族 元 素 及 其 化 合 物 和 表 面 活 性 剂 等 根 据 是 杀 死 还 是 抑 制 微 生 物, 可 分 为 致 死 剂 和 抑 制 剂 常 用 的 3 个 指 标 : 最 低 抑 制 浓 度 (MIC) 半 致 死 剂 量 和 最 低 致 死 剂 量 3. 生 物 因 素 对 微 生 物 的 影 响 生 物 之 间 的 关 系 从 总 体 上 可 分 为 互 生 共 生 寄 生 拮 抗 等, 微 生 物 之 间 的 拮 抗 现 象 是 普 遍 存 在 于 自 然 界 的 许 多 微 生 物 在 其 生 命 活 动 过 程 中 能 产 生 某 种 特 殊 代 谢 产 物 如 抗 生 素, 具 有 选 择 性 地 抑 制 或 杀 死 其 他 微 生 物 的 作 用 不 同 抗 生 素 的 抗 菌 谱 是 不 同 的, 某 些 抗 生 素 只 对 少 数 细 菌 有 抗 菌 作 用 产 黄 青 霉 分 泌 青 霉 素 抑 制 细 菌 细 胞 壁 的 合 成 青 霉 素 主 要 抗 G + 细 菌 链 霉 素 作 用 于 核 糖 核 酸 30S 亚 基, 所 以 链 霉 素 只 作 用 原 核 生 物 链 霉 素 以 抗 G - 细 菌 为 主 4. 紫 外 线 对 微 生 物 的 影 响 及 诱 变 效 应 紫 外 线 具 有 杀 菌 作 用 主 要 是 因 为 它 诱 导 形 成 胸 腺 嘧 啶 二 聚 体 来 破 坏 DNA 的 结 构, 使 其 不 能 正 常 行 使 功 能 另 外, 空 气 在 紫 外 线 照 射 下 产 生 臭 氧 (O 3 ), 也 有 一 定 杀 菌 作 用 紫 外 线 杀 菌 力 最 强 的 波 长 是 nm 部 分 紫 外 线 透 过 物 质 能 力 很 差, 所 以 只 适 用 于 空 气 及 物 体 表 面 的 灭 菌, 它 距 离 照 射 物 以 不 超 过 1.2 米 为 宜 紫 外 线 对 于 人 体 也 有 伤 害 作 用 紫 外 线 对 细 菌 生 长 的 影 响 是 随 着 紫 外 线 对 微 生 物 照 射 剂 量 时 间 及 距 离 的 不 同, 对 微 生 物 的 生 理 活 动 也 相 应 地 产 生 不 同 的 效 果 : 剂 量 高 时 间 长 距 离 短 就 易 杀 死 它 们, 剂 量 低 时 间 短 距 离 长 时 就 会 有 少 量 个 体 残 存 下 来, 其 中 一 些 个 体 的 遗 传 特 性 发 生 了 变 异 我 们 可 以 利 用 这 种 特 性 来 进 行 灭 菌 或 菌 种 选 育 工 作 紫 外 诱 变 最 有 效 的 波 长 仅 仅 是 在 253~265nm, 一 般 紫 外 线 杀 菌 灯 所 发 射 的 紫 外 线 大 约 有 80% 是 254nm 三. 实 验 器 材

2 1. 菌 种 : 在 一 边 已 长 成 一 直 线 状 菌 落 的 产 黄 青 霉 链 霉 菌 平 板 各 1 个, 培 养 18 小 时 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 大 肠 杆 菌 枯 草 杆 菌 菌 液 粘 质 赛 氏 杆 菌 的 平 板 2. 仪 器 : 无 菌 的 小 圆 滤 纸 片 接 种 环 黑 纸 标 签 纸 酒 精 灯 记 号 笔 试 管 架 紫 外 照 射 箱 37 培 养 箱 25 培 养 箱 3. 试 剂 :0.1% 甲 紫, 5% 甲 酚 皂,1% 稀 释 的 84 消 毒 液,1% 甲 醛,75% 乙 醇,95% 乙 醇, 1% 过 氧 化 氢 四. 实 验 步 骤 1. 温 度 对 黏 质 赛 氏 杆 菌 菌 落 色 素 形 成 的 影 响 用 接 种 环 取 培 养 好 的 粘 质 赛 氏 杆 菌 单 菌 落, 在 两 个 肉 汤 蛋 白 胨 平 板 上 分 区 划 线 接 种, 要 保 证 能 得 到 单 一 菌 落 做 好 标 记, 将 第 一 个 平 板 在 25 o C, 第 二 个 在 30 o C 进 行 培 养, 第 三 个 在 37 o C 进 行 培 养 24h 后 取 出, 观 察 不 同 温 度 下 培 养 粘 质 赛 氏 杆 菌 生 长 状 况 和 产 生 色 素 情 况 2. 化 学 因 素 对 微 生 物 生 长 的 影 响 用 无 菌 吸 头 吸 取 100μl 培 养 18h 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌 液 于 肉 汤 蛋 白 胨 培 养 基 上, 用 无 菌 涂 布 棒 涂 布 均 匀 将 上 述 培 养 皿 用 记 号 笔 分 成 八 等 份, 每 一 等 份 内 标 明 一 种 药 物 名 称 用 无 菌 镊 子 将 小 滤 纸 片 分 别 浸 入 各 种 药 剂 中, 然 后 对 号 放 入 培 养 皿 的 小 区 内 注 意 不 要 造 成 药 品 交 叉 污 染 置 37 o C 温 室 培 养 24h 后, 观 察 比 较 抑 菌 圈 大 小 3. 生 物 因 素 对 微 生 物 生 长 的 影 响 取 已 接 种 产 黄 青 霉 和 灰 色 链 球 菌 并 培 养 48h 的 平 板 各 一 支, 在 菌 苔 边 缘 5 毫 米 处 垂 直 向 外 划 直 线 接 种 大 肠 杆 菌, 枯 草 杆 菌, 金 黄 色 葡 萄 球 菌 37 o C 培 养 24h, 观 察 结 果 4. 紫 外 线 杀 菌 效 果 的 观 察 用 无 菌 吸 头 吸 取 100μ1 培 养 18h 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 液 于 肉 汤 蛋 白 胨 培 养 基 平 板 上, 以 无 菌 涂 棒 涂 布 均 匀 ; 用 一 张 三 角 形 或 任 意 形 状 的 报 纸 条 遮 住 部 分 平 板 培 养 基, 打 开 皿 盖, 置 紫 外 灯 下 照 射 3min 后 取 出 纸, 盖 上 皿 盖 在 黑 暗 中 ( 或 红 灯 下 ) 用 双 层 报 纸 包 裹, 倒 置 于 37 o C 培 养 24h 后 观 察 结 果 5. 紫 外 线 对 微 生 物 的 诱 变 效 应 取 摇 瓶 培 养 至 对 数 生 长 期 的 枯 草 杆 菌 菌 液 0.1ml 加 入 0.9ml 生 理 盐 水 中, 进 行 10 倍 稀 释, 依 次 做 10-1 ~10-8 稀 释 取 各 100μl 菌 液 涂 平 板, 每 稀 释 度 涂 2-3 只 紫 外 线 (30W,30cm) 处 理 :10-5 照 射 20s,10-4 照 射 30s,10-3 照 射 40s,10-2 照 射 50s,10-1 照 射 60s 以 和 10-8 平 板 作 对 照 处 理 后 的 培 养 皿 在 黑 暗 中 ( 或 红 灯 下 ) 用 双 层 报 纸 纸 包 好, 倒 置 37 o C 培 养,24h 后 观 察 并 记 录 结 果 观 察 诱 变 效 应 : 分 别 向 菌 落 分 散 开 的 平 板 内 加 革 氏 碘 液 数 滴, 在 菌 落 周 围 将 出 现 透 明 圈, 分 别 测 量 透 明 圈 直 径 与 菌 落 直 径 并 计 算 其 比 值 (HC 值 ) 五. 实 验 结 果 与 讨 论 1. 温 度 对 黏 质 赛 氏 杆 菌 的 影 响

3 培 养 温 度 结 果 照 片 实 验 现 象 25 o C 桔 红 30 o C 鲜 红 37 o C 粉 红 表 1 不 同 温 度 下 黏 质 赛 氏 杆 菌 实 验 现 象 表 ( 照 片 中 颜 色 和 直 接 用 眼 观 察 可 能 有 出 入 ) 从 颜 色 看, 实 验 所 观 察 到 的 不 同 温 度 下 黏 质 赛 氏 杆 菌 生 长 情 况 基 本 相 同, 同 为 红 色, 只 是 红 的 程 度 不 同 菌 落 呈 现 红 色 的 原 因 是 黏 质 赛 氏 杆 菌 在 代 谢 过 程 中 产 生 灵 菌 红 素, 在 细 胞 内 积 累 从 结 果 判 断,37 o C 时, 单 菌 落 最 大, 说 明 黏 质 赛 氏 杆 菌 在 这 个 温 度 下 生 长 最 好, 而 此 时 红 色 偏 淡, 说 明 色 素 在 这 个 温 度 下 不 易 聚 集 或 稳 定 存 在 相 比 较 之 下, 灵 菌 红 素 在 30 o C 最 易 积 累 2. 化 学 试 剂 对 微 生 物 的 影 响 化 学 试 剂 抑 菌 圈 半 径 (mm) 抑 菌 能 力 排 序 化 学 试 剂 抑 菌 圈 半 径 (mm) 抑 菌 能 力 排 序 2.5% 碘 酊 % 甲 醛 溶 液 % 乙 醇 % 甲 紫 % 苯 酚 % 乙 醇 %84 消 毒 液 % 双 氧 水 表 2 化 学 试 剂 的 抑 菌 实 验 结 果 表 ( 抑 菌 圈 半 径 含 纸 片 半 径 3mm; 抑 菌 能 力 排 序 一 列 中 数 字 越 小, 抑 菌 能 力 越 强 )

4 图 1 化 学 试 剂 抑 菌 实 验 图 ( 蓝 圈 的 1/8 圆 区 域 是 扇 形, 顺 时 针 依 次 为 甲 醛 84 消 毒 液 苯 酚 75% 乙 醇 碘 酊 双 氧 水 和 95% 乙 醇 ) 根 据 抑 菌 圈 半 径 排 出 以 上 化 学 试 剂 的 抑 菌 能 力 由 强 到 弱 为 :0.05% 甲 紫,5% 苯 酚, 75% 乙 醇,2.5% 碘 酊,95% 乙 醇, 以 及 1% 稀 释 的 84 消 毒 液 1% 甲 醛 溶 液 3% 双 氧 水 基 本 不 抑 菌 它 们 的 抑 菌 原 理 分 别 是 : 甲 紫 结 合 蛋 白 质 羧 基, 对 G + 菌 选 择 性 抑 制 ; 苯 酚 使 蛋 白 质 变 性, 损 伤 细 胞 膜 ; 乙 醇 使 蛋 白 质 变 性, 脱 水, 溶 解 类 脂 ; 碘 酊 使 蛋 白 质 变 性 ;84 消 毒 液 利 用 次 氯 酸, 破 坏 细 胞 膜 酶 蛋 白 质 ; 甲 醛 溶 液 破 坏 蛋 白 质 的 氢 键 或 氨 基 ; 双 氧 水 则 具 有 强 氧 化 作 用 甲 紫 作 为 医 用 消 毒 剂 确 实 有 很 好 的 抑 菌 效 果, 查 得 碘 酊 的 杀 菌 能 力 比 甲 紫 强, 实 验 中 可 能 因 为 滤 纸 蘸 取 量 和 酒 精 易 挥 发 的 缘 故, 造 成 碘 酊 的 抑 菌 圈 半 径 较 小 苯 酚 可 作 为 外 科 消 毒 剂 消 毒 能 力 大 小 的 标 准, 即 石 炭 酸 系 数, 所 以 它 的 抑 菌 能 力 不 弱 75% 乙 醇 和 95% 乙 醇 相 比, 由 于 配 比 不 同, 所 以 抑 菌 能 力 不 同, 一 般 来 说,75% 的 乙 醇 抑 菌 能 力 在 所 有 浓 度 乙 醇 中 是 最 强 的 之 一 1% 稀 释 的 84 消 毒 液 1% 甲 醛 溶 液 和 3% 双 氧 水 应 该 有 相 当 的 抑 菌 能 力, 实 验 中 可 能 由 于 一 些 人 为 因 素 导 致 它 们 的 抑 菌 能 力 没 有 表 现 出 来 3. 生 物 因 素 对 微 生 物 的 影 响 金 黄 色 枯 草 芽 大 肠 葡 萄 球 菌 孢 杆 菌 杆 菌 金 黄 色 枯 草 芽 大 肠 葡 萄 球 菌 孢 杆 菌 杆 菌 a 图 2 生 物 因 素 对 微 生 物 影 响 实 验 结 果 图 ( 图 a 为 产 黄 青 霉 所 在 平 板, 图 b 为 泾 阳 链 霉 菌 所 在 平 板 ) b

5 从 图 中 可 以 看 出, 产 黄 青 霉 所 在 平 板 大 肠 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 生 长 情 况 与 到 青 霉 的 距 离 无 明 显 关 联, 而 金 黄 色 葡 萄 球 菌 则 越 靠 近 青 霉, 生 长 情 况 越 不 好 泾 阳 链 霉 菌 所 在 平 板 上, 情 况 相 反, 大 肠 杆 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 出 现 了 生 长 情 况 与 到 菌 苔 距 离 的 关 联 性, 而 金 黄 色 葡 萄 球 菌 没 有 青 霉 素 通 过 抑 制 细 菌 细 胞 壁 四 肽 侧 链 和 五 肽 交 连 桥 的 结 合 而 阻 碍 细 胞 壁 合 成 而 发 挥 杀 菌 作 用 对 革 兰 阳 性 菌 有 效, 由 于 革 兰 阴 性 菌 缺 乏 五 肽 交 连 桥 而 青 霉 素 对 其 作 用 不 大 链 霉 素 能 够 与 细 菌 核 糖 核 酸 蛋 白 复 合 体 的 30s 亚 基 结 合, 从 而 抑 制 细 菌 的 蛋 白 质 合 成, 因 而 其 抑 菌 效 果 与 细 菌 的 革 兰 氏 染 色 属 性 无 明 显 联 系 有 一 些 规 律 如 它 对 许 多 革 兰 氏 阴 性 菌 具 有 抗 菌 作 用, 而 对 葡 萄 球 菌 属 及 其 他 革 兰 阳 性 球 菌 的 作 用 差 把 以 上 原 理 和 实 验 结 果 结 合 发 现, 在 产 黄 青 霉 所 在 平 板 上, 同 为 革 兰 氏 阳 性 菌 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 应 当 受 到 抑 制 作 用, 可 能 由 于 接 种 环 在 接 种 时 沿 线 划 的 菌 量 不 均 匀 所 致 4. 紫 外 线 的 杀 菌 效 果 图 3 紫 外 线 杀 菌 实 验 结 果 图 从 实 验 结 果 看, 被 纸 片 覆 盖 的 区 域 细 菌 生 长 情 况 颇 好, 菌 落 连 接 成 片, 而 未 覆 盖 区 域, 只 有 少 量 菌 落 存 在, 说 明 细 菌 生 长 受 到 紫 外 线 抑 制, 紫 外 线 确 实 有 一 定 的 抑 菌 能 力, 而 那 些 少 量 的 存 活 的 菌 落 是 有 一 定 抗 紫 外 线 能 力 的 突 变 体 5. 紫 外 线 对 微 生 物 的 诱 变 效 应 稀 释 度 照 射 时 间 (s) 处 理 后 的 活 菌 数 平 均 值 存 活 率 致 死 率 无 法 计 数 N/A N/A N/A 无 法 计 数 N/A N/A N/A 没 长 菌 % 99.97% 无 法 计 数 % 98.3% % 89.5% % 长 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 N/A N/A N/A 长 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 大 肠 杆 菌 N/A N/A N/A 表 3 紫 外 线 对 各 浓 度 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 诱 变 情 况 表 ( 浅 绿 色 背 景 为 或 无 法 计 数, 或 没 长 菌, 或 长 出 杂 菌 而 无 法 统 计 数 据, 浅 蓝 色 背 景 为 无 法 计 算 或 无 效 数 据 )

6 附 上 每 个 稀 释 度 各 一 张 结 果 图 如 下 : 图 4 紫 外 线 诱 变 实 验 图 ( 稀 释 度 已 分 别 标 在 每 幅 图 下 方 ) 诱 变 实 验 中 的 对 照 组 为 组, 因 为 10-7 和 10-8 组 没 有 有 效 数 据, 所 以 用 10-6 组 来 计 算,

7 菌 落 总 数 = 个 存 活 率 =( 平 均 值 / 稀 释 度 )/ 菌 落 总 数 致 死 率 =1- 存 活 率 由 表 中 的 存 活 率 和 致 死 率 得 随 着 稀 释 倍 数 的 增 加, 细 菌 的 存 活 率 也 越 高, 这 有 两 方 面 原 因, 一 是 稀 释 倍 数 增 加, 所 以 细 菌 更 为 分 散, 紫 外 线 杀 伤 作 用 就 随 之 减 弱, 二 是 紫 外 线 照 射 时 间 随 稀 释 倍 数 增 加 而 减 少, 所 以 灭 菌 效 果 减 弱 以 下 为 滴 加 碘 液 后 菌 落 直 径 及 菌 落 周 边 透 明 圈 直 径 的 统 计 表 : 稀 释 度 照 射 时 间 (s) ( 透 明 圈 直 径, 菌 落 直 径 )(mm,mm) HC 值 (3.7,1.8)( 5.0,2.0) (2.6,1.2) (4.0,2.0) (5.6,2.1) (3.2,2.2) 1.45 表 4 紫 外 线 对 各 浓 度 枯 草 芽 孢 杆 菌 诱 变 后 透 明 圈 直 径 与 菌 落 直 径 及 HC 值 表 从 HC 值 的 计 算 结 果 来 看, 总 体 上, 经 过 紫 外 线 照 射 后,HC 值 增 大, 说 明 紫 外 线 的 照 射 导 致 了 细 菌 的 突 变, 细 菌 分 解 淀 粉 的 能 力 增 强 而 随 着 稀 释 倍 数 的 增 加 和 照 射 时 间 的 减 少,HC 值 也 较 小, 说 明 在 菌 落 更 分 散, 照 射 时 间 更 短 的 情 况 下, 突 变 体 的 突 变 程 度 也 相 应 减 弱 我 们 还 可 以 发 现,10-6 组 的 HC 值 意 外 较 高, 可 能 是 因 为 我 们 在 采 集 数 据 时 各 浓 度 只 收 集 一 组 数 据, 不 一 定 具 有 代 表 性, 恰 好 在 10-6 组 中 采 集 了 一 个 特 例 数 据 总 的 来 说, 我 们 采 集 的 数 据 样 本 数 太 少, 一 组 只 有 1 到 2 个, 所 以 在 统 计 学 上 没 有 什 么 意 义 导 致 采 集 样 本 数 很 少 的 原 因 是, 我 们 滴 加 的 碘 液 量 不 多, 而 且 在 滴 加 碘 液 后 未 及 时 采 集 数 据, 等 到 采 集 数 据 时, 颜 色 已 褪 去 很 多, 可 供 测 量 的 圈 变 得 很 少, 碘 液 又 用 完 了, 所 以 采 集 了 极 少 数 据 以 后 要 注 意 这 个 问 题 六. 致 谢 非 常 感 谢 陈 老 师 李 老 师 以 及 几 位 助 教, 是 你 们 的 帮 助 和 指 导 让 我 们 顺 利 地 完 成 了 本 次 实 验 还 有 要 感 谢 同 组 的 两 位 同 学, 共 享 了 资 源 并 进 行 了 一 些 交 流, 对 实 验 反 思 很 有 促 进 作 用 七. 参 考 资 料 1. 微 生 物 学 实 验 指 导, 清 华 大 学 出 版 社, 陈 金 春 陈 国 强 主 编,2005 年 8 月 百 度 百 科

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