幻灯片 1

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老卞
7 years ago
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1 中国妇女 HPV 分型标准与宫颈癌防控临床干预方案制定及公共数据平台建设基于测序的高灵敏高通量全能 HPV 临床分型检测技术上海市长宁区妇幼保健院龚波

2 研究背景 HPV 与宫颈癌 HPV 分型检测的临床意义现有 HPV 检测的不足技术优势

3 宫颈癌现状宫颈癌是世界上女性癌症的第二号杀手, 仅次于乳腺癌每年全世界约有 50 万新发病例,25 万死亡病例, 其中发展中国家占 2/3 我国宫颈癌患病率和病死率均约占世界的 1/3, 每年新增宫颈癌患者万, 约有 5 万例死于宫颈癌

4 2008 诺贝尔生理医学奖获得者哈拉尔德楚尔豪森 (Harald zur Hausen) 德国人, 生于 1936 年发现 HPV 与宫颈癌的因果关系, 从而使宫颈癌成为目前唯一病因明确的癌症.

5 人乳头状瘤病毒简介人乳头瘤病毒 (human papillomavirus, HPV) 是一种感染皮肤和粘膜鳞状上皮细胞的小 DNA 病毒, 除肛门生殖器以外, 还可感染皮肤及口腔喉气管食管膀胱等粘膜部位大量研究表明, 许多上皮增生性病变及恶性肿瘤的发生与 HPV 感染有关

6 HPV 的结构 ( 外观 ) HPV 病毒颗粒直径约 55nm, 由 72 个病毒壳粒包被

7 HPV 与宫颈癌 % 的宫颈癌患者中可以检测到不同型别的 HPV DNA, 而 HPV 阴性者几乎不会发生宫颈癌 2 流行病学研究显示 HPV 感染发展至 CIN 和宫颈癌的证据, 显示 HPV 感染是宫颈癌发生的必要条件 3 HPV 感染与宫颈癌的发生有时序关系, 符合生物学现象

8 HPV 感染最终致癌的机理模式

11 HPV 的型别目前已发现了约 200 种以上的 HPV 基因型, 可分为皮肤型 HPV 和生殖道上皮型 HPV 依据与生殖道肿瘤相关与否可将生殖道上皮 HPV 分为 : 高危型 HPV 和低危型 HPV 低危型常引起外生殖道湿疣等良性病变 ; 高危型与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变 (CIN2/3) 的发生相关

12 1 高危型 15 种 :16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82 2 潜在高危型 3 种 :26, 53, 66 3 低危型 11 种 :6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, Muñoz N, (2003). "Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.". N. Engl. J. Med. 348 (6):

13 HPV 分型的临床意义 1 HPV 检测作为初筛手段可区分高风险人群, 比通常采用的细胞学检测更为有效可根据感染的 HPV 型别预测患者的发病风险, 决定其随访间隔对细胞学和 HPV 检测均为阴性者, 阴性预测值可达 99%-100%, 表明其发病风险较低, 可将筛查间隔延长到 3-5 年 ( 与后面提到的 3-5 年保持一致 ) 细胞学阴性而高危型 HPV 阳性者, 发病风险度较高, 应定期随访

14 高危 HPV 持续感染是致癌的必要条件第一次检测一个月后检测半年后检测致癌风险 HPV16 HPV16 HPV16 致癌 HPV16 HPV18 HPV31 不致癌 HPV6 HPV6 HPV6 不致癌 HPV16 HPV6 HPV16 不致癌国际癌症研究署 (International Agency for Research on Cancer,IARC), 在 2004 年明确提出, HPV 感染是宫颈癌发生的必要因素, 但是没有 HPV 持续性感染的妇女几乎没有宫颈癌的危险

15 HPV 分类存在人种差异印第安妇女高危致癌 HPV54 白人妇女低危不致癌

16 HPV 分型的临床意义 2 对于未明确诊断意义的不典型鳞状细胞/ 腺细 (ASCUS/AGUS) 和鳞状上皮内低度病变 (LSIL),HPV 分型检测是一种有效再分类方法由于高危型 HPV 感染与宫颈癌和 CIN II/III 存在着因果关系, 因此可以利用 HPV 分型检测筛查 ASCUS 或 CIN I 的妇女中的宫颈癌高危患因为部分高危型 HPV 病毒与宫颈癌的关系紧密, 研究发现宫颈病变中在 CIN I 以上中宫颈病变均有一定优势, 提示上述型别易导致高级别病变分型检测发现不同的感染型别, 可以区别此患者得宫颈癌的风险度

17 457 例细胞学诊断为 ASCUS/LSIL, 行 HPV 检测和活检 : LSIL 且高危 HPV 阳性者,22.7% 为 CIN II/III; LSIL 但高危 HPV 阴性者, 仅 1% 为 CIN II/III Lee Nak-Woo, et al., Is the Human Papillomavirus Test in Combination With the Papanicolaou Test Useful for Management of Patients With Diagnoses of Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions? Arch Pathol Lab Med, 2001, 125:1453

18 HPV 分型的临床意义 3 用于手术后的追踪, 确定是否将病灶清除干净 ; 治疗后的随访如果在术后或治疗后的 6 个月进行 HPV 分型检测结果为阴性, 则证明手术成功, 患者可以在 3 年后才复诊如果 HPV 分型结果是阳性, 则需要判别病人现在感染的 HPV 亚型与术前感染是否相同, 如果相同则说明手术并没有将病灶完全切除 ; 如果感染不同亚型, 则说明病人又有新的感染

19 CIN 治疗后随访高危型 HPV 实验 :26 例 CINIII 行宫颈锥切术术后复发对照 :22 例未复发术后 3 个月 PCR 检测宫颈细胞涂片 HPV 26 例复发者 :25 例 HPV 阳性 22 例对照组 : 阴性宫颈病变治疗后检测 HPV, 可预测残余病变估计疗效

20 HPV 分型的临床意义 4 指导 HPV 疫苗的研究及使用 HPV 分型检测可以分析不同地区 HPV 感染的流行状况, 同时根据此结果可以针对性的开发适用于此地区的 HPV 病毒基因预防性疫苗已经通过 FDA 认证的 HPV 预防性疫苗, 只能对 HPV 型的感染进行预防, 这四种类型主要是基于美国等欧美国家的研究数据, 并不符合中国实际的感染情况在中国,HPV52 58 型别感染相对较多, 总的感染率大约为 30~ 40%, 如果单纯使用美国研制的疫苗, 并不能起到预防的作用同时, 美国 FDA 认可的 HPV 预防性疫苗使用的先决条件必须是没有感染过 HPV 型别, 这就使得疫苗注射前进行 HPV 分型检测显得尤为重要

21 HPV 分型的临床意义 5 丰富的信息反馈例如 : 如果病人第一次检查是 HPV-18 型感染,6 个月后随诊还是 18 型感染, 则说明病人没有新的感染, 但是同时旧的感染持续发生这种情况需要医生及病人提高重视程度, 可以采取活检检查病变或者缩短随诊时间如果病人第一次检查是 HPV-18 型感染,6 个月后随诊是 HPV-52 型感染, 则说明病人有新的感染, 但同时提示病人的抵抗力较强, 产生了 HPV18 的抗体, 患宫颈癌的几率低, 所以对 HPV-52 型感染可采用随诊的方式观察

22 HPV 分型的临床意义 6 不同亚型的多重感染检测结果对临床的意义例如 : 一个病人的 HPV 检测结果是的多重感染, 但随访后 18 亚型被免疫清除了, 只有 52 亚型, 由于 52 亚型的风险低, 那么继续随访并给予相应的干预如果采用定量的方法, 两次结果的载量都很高, 没有型别的辅助, 很容易就会判读为高危亚型持续感染而给予过度的治疗

23 FDA 杂交捕获法 (HCII) 误诊率极高且不能分型美国哈佛大学的最新研究表明该方法的误诊率高达 95%, 致使 95% 以上的病人作了不必要的检查和治疗, 由此造成的经济浪费仅美国就有至少 100 亿美元 / 年同时也给病人带来了巨大的身心创伤 ( 活体检查甚至子宫切除 )

24 Inappropriate use indication for FDA-approved HPV DNA test promotes unnecessary cervical biopsies in US at $ 10 billion per year More than 95% of referrals to colposcopy for diagnostic workup are false positive and/or potentially excessive (unnecessary). Screening with combined cytologic and HPV testing, regardless of patient age, leads to the highest number of excessive colposopic referrals. [Stout NK et al. Trade-offs in Cervical Cancer Prevention Balancing Benefits and Risks. Arch Intern Med. 2008;168(17): ] The estimated 1992 annual cost of the overused colposcopic biopsy was at $6 billion. The number of colposcopic biopsies increased markedly since. [Lousuebsakul V et al. Is colposcopic biopsy overused among women with a cytological diagnosis of atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS)? J Women s Health (Larchmt). 2003; 12:553-9.] Since 2003, more ASCUS diagnoses have been made by pathologists after the HPV DNA test was approved for triage to 4-quadrant cervical biopsies. Now the unnecessary biopsies may cost more than $10 billion in Cost due to psychological and physical trauma to patients not counted. Cost for complications, such as excessive bleeding and infections not counted. Cost of loss of work days of the patients not counted.

25 Trade-offs in Cervical Cancer Prevention Balancing Benefits and Risks Natasha K. Stout, PhD; Jeremy D. Goldhaber-Fiebert, PhD; Jesse D. Ortendahl, BS; Sue J. Goldie, MD, MPH Arch Intern Med. 2008;168(17): doi: /archinte Results Across strategies, colposcopy referrals and diagnostic workups varied 3-fold, although diagnostic rates of CIN 2 or 3 were similar and 95% of positive screening test results were for mild abnormalities likely to resolve on their own. For a representative group of a thousand 20-year-old women undergoing triennial screening for 10 years, we expect 1038 colposcopy referrals (7 CIN 2 or 3 diagnoses) from combined cytologic and HPV DNA testing and fewer than 200 referrals (6-7 CIN 2 or 3 diagnoses) for strategies that use triage testing. Similarly, for a thousand 40-year-old women, combined cytologic and HPV DNA testing led to 489 referrals (9 CIN 2 or 3), whereas alternative strategies resulted in fewer than 150 referrals (7-8 CIN 2 or 3). Using cytologic testing followed by triage testing in younger women minimizes both diagnostic workups and positive HPV test results, whereas in older women diagnostic workups are minimized with HPV DNA testing followed by cytologic triage testing.

26 现有 HPV 分型检测技术的不足 1 样品预处理步骤繁杂操作过程中样品损耗严重, 不易获得进行后续实验所需的足够的样品量, 微量 HPV 感染测不出, 假阴性高 2 假阳性率高核酸杂交方法本身允许核酸片段有不完全匹配, 检测结果有系统误差, 容易导致假阳性 3 假阴性 ---- 目前 HPV 试剂主要检测 L1 L2 E6 E7 等区,HPV 核心传染区是 E6 E7 区, 在 HPV 整合上人基因组时 L1 L2 等区丢失, 部分 CIN 不能检测出, 市场目前提供提取 DNA 试剂都是粗提法, 杂质较多会抑制 Taq 酶的活性 4 不能准确分型杂交用的探针多种 DNA 片段混合物, 不能对 HPV 进行分型测定, 而 HPV 感染的特点要求检测结果准确给出 HPV 属于哪一类型 5 检测成本高

27 基于测序的高灵敏高通量全能 HPV 临床分型检测技术美国资深病理学家 Sin Hang Lee 根据中国科学院细胞生物所洪国藩院士的发明专利 [14] 发展出来了一种高灵敏高通量全能 HPV 分型检测技术, 该技术能够精确灵敏的测定所有已知型别的 HPV 2011 年 11 月, 美国 FDA 已制定了新的以 HPV 基因序列为分型依据的临床检测标准指导方案

28 Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff Establishing the Performance Characteristics of In Vitro Diagnostic Devices for the Detection or Detection and Differentiation of Human Papillomaviruses Document issued on: November 28, 2011 The draft of this document was issued on September A comparison against PCR followed by sequencing of the amplicon is especially important for HPV genotyping assays..

30 高灵敏高通量高覆盖率 HPV 临床分型检测技术可以检测出所有 200 多种 HPV 的技术这样便克服了当前国内外存在的对 HPV 检测的严重误诊不需对病人临床样品进行纯化的技术病人的粗样可直接用来精确检测, 使这项高新技术可立即进行临床应用并顺利地进入市场以 HPV DNA 序列出具医疗诊断报告的技术这使诊断报告达到当今最高的医学科学诊断标准, 从而避免了误诊和漏诊

31 高灵敏低温 DNA 聚合酶体系的扩增效率是 Taq 酶的倍 Medical practitioners in nine countries submitted samples of Gardasil (Merck & Co.) to be tested for the presence of human papillomavirus (HPV) DNA because they suspected that residual recombinant HPV DNA left in the vaccine might have been a contributing factor leading to some of the unexplained post-vaccination side effects. December 27, For the first time, residual HPV L1 gene DNA fragments of vaccine origin in human specimens were detected by HiFi DNA LoTemp samenested PCR and validated by DNA sequencing. December 20, HiFi DNA LoTemp PCR technology can amplify insoluble residual HPV DNA fragments bound to aluminum adjuvant for direct DNA sequencing.

32 高通量一台 PCR 仪一个周期 ( 约 3-4 小时 ) 可同时处理 96 个样本一个检测中心可以满足几千万甚至上亿人口的检测需求尤其适合大规模筛查利于质量控制, 降低成本

33 高覆盖可检测所有已知的 HPV 基因型可发现未知的 HPV 基因型以及已知 HPV 基因型的突变体动态检测 HPV 基因型致癌的发展变化 ; 解决地域人种不同类型人群的高危 HPV 基因型差异

34 低温 PCR 反应条件低温 PCR 反应条件 85ºC 30 s 40-50ºC 30 s 65ºC 1 m Total 30 cycles 65ºC 10 m 常规 PCR 反应条件 95ºC 30 s 50-60ºC 30 s 72ºC 1 m Total 30 cycles 72ºC 10 m

35 低温 PCR 和常规 PCR 低温 PCR 检测 HPV 常规 PCR 检测 HPV 灵敏度高 -- 样品无需纯化, 直接 PCR 反应特异性高 --PCR 产物直接测序, 无需纯化准确度高 -- 错配几率几乎为零重复性好 -- 可在临床使用灵敏度低 -- 样品需纯化后才能 PCR 反应, 特异性低 --PCR 产物不能直接测序, 需纯化准确度低 -- 错配率千分之三左右重复性差 -- 不可在临床使用

36 研究意义 1 建立一套宫颈癌筛查 HPV DNA 检测的新的临床分析方法, 为受检者提供一种准确敏感方便经济的宫颈癌高危人群筛查手段, 有利于提高癌症的早诊率, 降低发生率和死亡率

37 研究意义 2 从地域分布民族疾病状态 ( 健康子宫颈病变和宫颈癌 ) 等方面绘制我国妇女 HPV DNA 多态性图谱, 比较地区间民族间疾病状态间的差异, 有利于为政府部门制定区域性的公共卫生政策提供有力依据, 也有利于进一步明确我国妇女 HPV 高危基因型

38 研究意义 3 构建规范的完善的中国妇女宫颈癌高风险人群和已患病人群的跟踪随访体系, 有利于宫颈癌的早期诊断预防和治疗

39 研究意义 4 应用更灵敏更全面的 HPV 分型技术, 能够获得更准确的 HPV 型别检测结果, 并结合临床表现, 提供更精确的个性化干预指导方案通过比较本研究干预治疗前后宫颈癌的发生率变化, 以及比较本研究和其他分型技术 (HC2 和凯普 ) 的检测结果对干预措施的影响, 从而确定更细致更全面的 HPV 分型结果对应的个性化干预指导方案

40 研究意义 5 组织各相关学科专家团队, 通过整合全国合作医院的网络信息资源, 建设集 HPV 分型数据自动化处理疾病相关医学信息参比数据库医院及研究院所应用网络终端于一体的 HPV DNA 多态性公共数据平台, 为全国妇幼机构和各医院的宫颈癌的筛查预防临床诊疗和科研提供数据支持

41 工作基础上海市重大科技攻关项目低温巢 - 序新技术精确灵敏检测宫颈癌致癌病毒 HPV ( 课题编号 , 已结题 ) 的完成单位之一, 与上海嘉定区妇幼保健院共同承担了临床样本采集和比对试验的相关工作, 完成了数千例宫颈样本采集和对比检测试验为本项目的顺利实施打下了坚实的基础

42 研究目标提高宫颈癌早诊早治率, 降低死亡率 ; 完善宫颈癌个体化干预指导方案 ; 探索建立以中国疾病预防控制中心妇幼保健中心 ( 简称妇幼中心 ) 领导组织多中心合作全社会参与的妇女宫颈癌防治模式和协作机制提高医疗卫生机构的服务能力, 逐步提高广大妇女自我保健意识和健康水平

43 研究内容应用高灵敏高通量全能 HPV 临床分型检测技术, 检测中国妇女的 HPV 感染及分型情况建立适用于临床的中国 HPV 分型公共数据平台, 包括 HPV 分型数据库和生物信息学分析系统利用该平台, 分析 HPV 在中国妇女中的分型种类频度及分布特征 ; 监测中国不同亚型 HPV 感染者的宫颈癌发生率 ; 建立中国妇女的 HPV 各亚型感染对应的宫颈癌风险模型 ; 并筛选出宫颈癌高危人群 ; 确定 HPV 分型结果对应的个体化干预指导方案

44 技术路线

45 预期成果 ( 一 ) 建立健全高灵敏高通量全能 HPV 临床分型检测技术在全国范围内广泛应用的技术平台 ( 二 ) 建立完善的宫颈癌高危人群跟踪随访体系, 实现对高危人群的有效管理, 增强群众主动健康意识 ( 三 ) 结合临床表征等其他因素, 共同完善 HPV 分型结果对应的个体化干预指导方案 ( 四 ) 初步搭建完成中国 HPV 分型公共数据平台, 实现我国 HPV 分型数据库的信息化管理实时更新和及时分析, 建立风险评估模型, 为各级宫颈癌防治方案的不断完善提供决策依据及支撑

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<4D6963726F736F667420576F7264202D20ECFAD0C0D0C0C2DBCEC4CCE1BDBB6F7665722E646F63> 硕士专业学位论文论文题目鲍温病临床病理特征和几种治疗方法比较的分析研究研究生姓名指导教师姓名禚欣欣康定华专业名称皮肤性病学研究方向皮肤肿瘤与皮肤病理论文提交日期 2013 年 4 月 I 鲍温病临床病理特征和几种治疗