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尹漂晁
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1 天津医药 6 年 6 月第 44 卷第 6 期 679 RNi 靶向沉默 DX 基因对白血病细胞生物学行为的影响及其作用机制孙维梅, 李建厂, 贾秀红, 李有杰, 唐慎华摘要 : 目的探讨小分子干扰 RN(siRN) 靶向沉默 DX 基因后对白血病细胞 K6 增殖凋亡的影响, 并检测及相关凋亡蛋白表达量的变化, 探讨其可能的作用机制方法根据前期实验结果, 成功筛选出能够特异性有效靶向沉默 DX 基因的 sirn 序列 (DX-siRN) 和相应的阴性对照序列 (DX-siRN-N), 应用罗氏 X-tremeGENE HP DN Transfection Reagent 转染 K6 细胞, 流式细胞术检测 DX 沉默表达后对 K6 细胞凋亡的影响 ;RT-PR 法和 Western lot 法分别检测 ax mrn 和蛋白表达量变化结果 MTT 及流式细胞术检测显示,DX 沉默表达后,K6 细胞增殖能力减弱, 凋亡率明显增加 ;RT-PR 和 Western lot 显示, 与正常细胞组和 DX-siRN-N 组相比,DX 沉默表达后,DX-siRN 组的 mrn 和蛋白表达量明显降低, ax mrn 和蛋白表达量明显升高 ( 均 P<.) 结论 DX-siRN 能够明显促进白血病细胞 K6 凋亡, 其机制可能与其抑制表达, 增强 ax 的活性有关关键词 : 白血病 ;RN 干扰 ; 基因沉默 ; 细胞凋亡 ; 融合蛋白质类, ;DX;RN 干扰 ; 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -9;ax 中图分类号 :R7.7 文献标志码 : DOI:.98/99 Effects of RNi targeting DX gene expression on biological characters of human leukemia cells and its relevant mechanisms bstract: Objective SUN Weimei, LI Jianchang, JI Xiuhong, LI Youjie, TNG Shenhua Department of Pediatrics, inzhou Medical University Hospital, inzhou 66, hina; Department of iochemistry and Molecular iology, inzhou Medical University orresponding uthor ax expressions, and the mechanisms thereof. Methods lijiangchang@6.com To detect the effects of sirn targeting DX gene expression on of, caspase and ccording to the earlier experiments, sirn specifically targeting DX gene (DX-siRN) and the negative control sequence (DX-siRN-N) were selected, and then were transfected into K6 cells by Roche X-tremeGENE HP DN Transfection Reagent. The flow cytometry analysis was used to detect the effects of sirn on cell apoptosis. The expressions of, caspase- 9, ax mrn and protein were tested by RT- PR and Western blot assay. Results MTT and flow cytometry analysis showed that after the silence of DX gene expression, the proliferation of K6 cells was prohibited and the apoptotic rate of K6 cells was distinctly increased compared with that of normal cell group, but the negative control group had no significant change. ccording to the RT-PR and Western blot assay, in comparison with the normal cell group and the negative control group, the expression levels of mrn and protein were obviously decreased, and the difference was statistic significance. On the other hand, the expressions of caspase- 9 and ax mrn and protein were significantly higher than those of other two groups (P<.). onclusion DX-siRN can promote apoptosis of K6 cells obviously, and the mechanism is related with the downregulation of and the up-regulation of caspase-9 and ax. Key words: leukemia; RN interference; gene silencing; apoptosis; fusion proteins, ; DX; RN interfer ence; ; ax 凋亡是常见的细胞死亡方式之一, 是不需要借助炎症反应导致的细胞形态学和生物化学发生一系列变化的过程 [] 对这种凋亡程序的回避是肿瘤的一个显著特征 [] 白血病是一组常见的起源于造血基金项目 : 山东省医药卫生科技发展计划 (4WS8); 山东省自然科学基金 (ZR4HL) 作者单位 : 山东滨州, 滨州医学院附属医院儿科 ( 邮编 66); 滨州医学院肿瘤分子生物学重点实验室作者简介 : 孙维梅 (99), 女, 硕士在读, 主要从事儿童白血病的防治与诊疗研究通讯作者 lijiangchang@6.com

2 68 Tianjin Med J, June 6, Vol. 44 No. 6 干细胞的恶性异质性疾病, 主要是由于各种因素导致的基因损伤, 引起造血干祖细胞分化受阻自我更新能力增强以及增殖失控, 进一步导致疾病发生 [] 根据白血病细胞分化程度的不同分为急性和慢性白血病, 目前对慢性髓系白血病的治疗主要是应用靶向针对融合基因的药物, 如伊马替尼, 但细胞耐药的产生是治疗该病面临的挑战 DX 作为一种重要的核转录因子, 特异性表达于小肠和结肠黏膜, 并与胃癌的预后密切相关 [4] 最近的研究发现该基因在急慢性髓系和淋巴系白血病中均存在异常表达, 并与白血病细胞过强的自我更新能力有关 [-6] 为进一步探讨 DX 与白血病发病机制之间的关系, 本实验以白血病细胞株 K6 为研究对象, 通过 RNi 干扰 (RN interference,rni) 技术沉默 DX 基因, 分析该基因沉默后对白血病细胞凋亡的影响, 并检测及相关凋亡蛋白表达量的变化, 探讨可能的作用机制, 为临床治疗白血病提供新的思路和方法材料与方法. 材料与试剂白血病细胞株 K6 由滨州医学院肿瘤分子生物学重点实验室保存 ; 胎牛血清 RPMI 64 购自美国 Hyclone 公司 ;DX- 小分子干扰 RN(siRN) 和阴性序列 DX-siRN-N 交由上海吉玛生物技术有限公司合成 ; 转染试剂 X-tremeGENE HP DN Transfection Reagent 购自美国 Roche 公司 ;nnexin V-FIT/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司 ; 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 (as pase)-9 ax 和 β-actin 引物交由上海生工设计合成 RT- PR 反转及扩增试剂盒购自日本 TaKaRa 公司 ; 单抗购自 bcam 公司,ax 和兔抗人单克隆抗体购自武汉博奥森公司 ; 辣根过氧化物酶标记的 IgG 购自杭州贤至生物技术公司其他试剂均为国产分析纯. 细胞培养和转染 K6 细胞接种于含 % 胎牛血清青 / 链霉素浓度为 % 的 RPMI 64 培养基中, 置于 7 恒温 %O 饱和湿度的培养箱中培养, 每 ~ d 换液次, 取对数生长期 K6 细胞进行实验将细胞按个 / 孔接种于 6 孔板, 每组设个复孔, 根据罗氏 X-tremeGENE HP DN Transfection Reagent 优化转染条件, 分别转染 DX- sirn(dx- sirn 组 ) 和 DX- sirn- N(DX- sirn-n 组 ), 转染条件为 : 无血清,siRN(μg) 转染试剂 (μl)=, 转染 6 h 后更换完全培养基同时设正常细胞作为对照将细胞重新放回培养箱培养. MTT 法检测细胞增殖能力取对数生长期 K6 细胞, 以 / 孔接种于 96 孔板, 每组设 6 个复孔, 分别转染 h, 每孔加入 μl g/l 的 MTT, 继续避光孵育 4 h r/min 4 离心 min, 弃上清, 每孔加入 μl DMSO, 避光低速震荡 min,49 nm 检测各孔吸光度 () 值计算各组细胞存活率 : 细胞存活率 = 实验组值 / 正常细胞组值.4 nnexin V-FIT/PI 双染法检测细胞凋亡率取对数生长期 K6 细胞, 以个 / 孔接种于 6 孔板, 按照最优化转染条件转染细胞, 实验分组同., 转染 4 h 后收集各组细胞, 冷 PS 洗遍, r/min 离心 min, 弃上清, 每组加入 μl inding uffer 重悬细胞, 分别加入 μl nnexin V-FIT 和 μl PI, 混匀, 室温条件下避光反应 ~ min, h 内上机检测. RT-PR 法检测 ax mrn 的表达取对数生长期 K6 细胞, 按个 / 孔接种于 6 孔板, 实验分组同. 转染 4 h 后收集细胞,TRIzol 法提取细胞总 RN, 按照 TaKaRa 反转录试剂盒说明书合成 cdn 条件 :4 min, 去除基因组 DN 9 s,7 min, 于 4 保存得到的 cdn 荧光定量 PR 法扩增 cdn 各基因上下游引物见表扩增条件:9 s 预变性 ;9 s, 6 s,4 个循环根据 T 值计算各组 RN 相对表达量变化, 计算公式为 : 目的基因的量 = -ΔΔt,ΔΔt=(t 目的基因 - t 内参基因 ) 实验组 -(t 目的基因 -t 内参基因 ) 对照组 T. The sequence of gene primers tested 表各检测基因引物序列基因名称 β-actin ax 引物序列 ( ) 产物大小 (bp) 上游 :TTTGGTGTGT 68 下游 :GTGTTTGTT 上游 :GGGTGGG 6 下游 :GGGTGGGGGTTGGGG 上游 :GGTGTTGGGTGG 下游 :TGGTGGGGTTTGG 上游 :TTTTGGTGTGG 下游 :TGGGGTTGGGGT.6 Western lot 检测和相关凋亡蛋白的表达收集转染 48 h 后各组细胞,Western lot 法检测各组蛋白表达量变化每组细胞加入 6 μl 蛋白裂解液 (RIP PMSF=6 ), 冰上裂解 4 min, 每 min 漩涡震荡 s; r/min 4 离心 min, 取上清, 加入 / 体积蛋白上样缓冲液, 9 煮沸 min,-8 长期保存法测定蛋白浓度配置 SDS-PGE 凝胶, 每组取 μg 蛋白上样后电泳条件为 :8 V min, 将电压调至 V, 待 Marker 完全分开时停止电泳将蛋白转至 PVDF 膜 ( 甲醇激活 ) 上, 条件 :. 恒流, min 7% 脱脂奶粉 (TST 配制 ) 室温封闭 h; 兔抗人 ( ) ( ) ax( ) 单克隆抗体 4, 摇床封闭过夜 ;TST 清洗 4 次, min/ 次 ; 辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床封闭 h; TST 洗 4 次, min/ 次 ; 经 EL 发光显色系统显色拍照 ; 以为内参, 经蛋白半定量分析软件比较各组蛋白相对表达量变化.7 统计学方法数据采用 SPSS. 软件进行统计学分析计量资料以均数 ± 标准差 ( xˉ ±s) 表示, 多组间比较采用方差分析, 组间多重比较采用 onferroni 法, 以 P<. 为差异有统计学意义

3 天津医药 6 年 6 月第 44 卷第 6 期 68 正常细胞组 DX-siRN 组..8 DX-siRNN 组作用时间 h 48 7 n= h 各组间比较对应的 F 值分别是 P. a 与正常细胞组比较 b 与 DX-siRN 组比较 P. Fig. hanges of proliferation at different time points in three groups 图各组不同时间点细胞增殖能力的变化. 各组细胞凋亡率变化组细胞凋亡率差异有统计学意义 F=4.68 n=4 P. DX-siR N 组细胞凋亡率. ±.6 较正常细胞组. ±. 和 DX-siRN-N 组.74 ±. 明显增高均 P. DX-siRN-N 组与正常细胞组无明显差异见图. 各组及相关凋亡基因 mrn 的表达量变化与正常细胞组和 DX-siRN-N 组相比 DX-siRN 组 mrn 表达量明显降低 ax aspase- 9 mrn 表达量明显增高均 P. DX-siRN-N 组与正常细胞组差异均无统计学意义见图.4 各组及相关凋亡蛋白的表达变化与正常细胞组和 DX-siRN-N 组相比 DX-siR N 组融合蛋白表达量明显降低 ax aspase- 9 蛋白表达量明显增高均 P. DX-siRN-N 组与正常细胞组差异均无统计学意义见图 4 讨论凋亡是由一系列基因精密调控多种分子参与的细胞程序性死亡方式在调节机体发育维持自稳态和抑制肿瘤发生过程中发挥关键性作用白血病作为临床常见的起源于骨髓的恶性疾病凋亡受阻是其重要的特征之一研究发现肿瘤细胞凋亡失衡的相关机制主要与凋亡抑制蛋白表达量增高而凋亡相关蛋白表达量降低有关本实验通过 RN 干扰技术靶向沉默 DX 基因通过 RT-PR 法和 Western lot 法检测及相关凋亡蛋白的 FIT- 4 DX-siRN 组 Q+Q4=.%. F=4. P=... FIT- 4 正常细胞组 Q+Q4=.% Fig. The schematic diagram of apoptosis of three groups 图 FIT- 4 P<. P=.8 F=7.6 DX-siRN-N 组正常细胞组 DX-siRN 组 a 与正常细胞组比较 b 与 DX-siRN-N 组比较 P. Fig. DX-siRN-N 组 Q+Q4=7.4% F=46.76 各处理组细胞凋亡示意图 ax 相对表达量相对表达量 PE- PE- PE- 相对表达量细胞存活率结果. 细胞增殖能力变化转染 6 h 时组细胞存活率差异无统计学意义转染 h 时 DX-siRN 组细胞存活率均明显低于正常细胞组和 DX-siRN-N 组均 P. DX-siR N-N 组与正常细胞组差异无统计学意义见图 omparion of transcription levels of apoptotics relative gene mrn between three groups 图各组相关凋亡基因 mrn 相对表达量比较

4 ax ax ax ax ax Tianjin Med J, June 6, Vol. 44 No. 6 相对表达量. F=4.88 P <..... F=6.77 P <..... 相对表达量 ax 相对表达量 68. F=9.48 P <... 正常细胞组 DX-siRN 组 DX-siRN-N 组 DX-siRN-N 组正常细胞组 DX-siRN 组 a 与正常细胞组比较 b 与 DX-siRN-N 组比较 P. Fig. 4 omparion of transcription levels of apoptotic relative gene proteins between three groups 图 4 各组相关凋亡蛋白表达量的比较表达量变化为白血病的治疗提供新的靶点和思路 DX 是尾测同源盒基因家族的成员之一研究证实 DX 在造血干祖细胞的异常表达能够打乱由 HOX 严格调控的血细胞分化过程该基因导致白血病发生的机制可能与下调下游 HOX 基因表达有关其调节作用的实现依赖于 N 端反式激活区域 7 根据本课题组前期实验已筛选出能够特异性有效沉默 DX 基因表达的 sirn 序列用于后续相关实验本实验 MTT 和流式细胞术结果显示沉默 DX 表达后 K6 细胞增殖能力显著减弱凋亡率明显增加提示 DX 基因表达水平与细胞增殖凋亡密切相关该基因有望成为临床白血病治疗的新靶点融合基因是慢性白血病的分子遗传学特异性标志物由 t 9 q4 ql 易位形成该融合基因能够表达融合蛋白该蛋白能够通过其过度活跃的酪氨酸激酶活性使多种目标蛋白磷酸化进而激活多种信号通路如 RKL 有关的信号通路 Ras/MPK 信号通路 Jak-STT 通路 Src 激酶通路等导致造血干祖细胞异常增殖引起疾病发生 8-9 已有研究证实通过 RNi 技术沉默基因表达后可能明显抑制白血病细胞增殖并促进其凋亡本研究结果显示与正常细胞组比较沉默 DX 基因表达后融合基因表达量明显降低而转染阴性序列组表达量无明显变化提示 DX 基因沉默表达后可能是通过下调融合基因表达引起白血病细胞增殖能力减弱凋亡增加凋亡是所有多细胞器官调控细胞增殖维持组织内稳态和清除伤害的重要机制之一由多种执行和调节分子共同作用完成当这些分子功能发生异常时将导致肿瘤的生长和耐药性的产生 as pase 作为内外源性凋亡通路中发挥关键作用的分子根据在凋亡信号级联通路中位置的不同分为启动性 aspase aspase-8 9 和效应性 aspase as pase- 6 和 7 作为启动性 aspase 中重要的组成者当该基因被各种内外源性因素激活时细胞凋亡即被启动 cl- 家族是调节细胞凋亡的重要成员之一根据其功能不同分为抑制凋亡蛋白如 cl- 和促凋亡蛋白如 ax ax 作为促凋亡蛋白中最主要成员在细胞凋亡方面发挥重要作用已有研究证实多数肿瘤细胞中存在二者的表达失衡即这两种蛋白的表达比例的变化与肿瘤的发生发展密切相关本研究中 DX 沉默表达后 ax 的表达量均显著升高提示沉默 DX 导致 K6 细胞凋亡增加一方面可能是通过活化而导致细胞相关凋亡通路的激活另一方面可能是因为打乱了肿瘤细胞内抑制凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间的平衡关系在两种机制共同作用下细胞增殖能力减弱凋亡增加综上所述本实验通过 RN 干扰技术有效沉默 DX 基因表达后细胞增殖能力减弱凋亡明显增加其机制可能是通过抑制蛋白表达促进促凋亡蛋白表达扰乱细胞促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白之间的平衡从而使细胞凋亡增加参考文献 Romero Novoa Figueras et al. The complexity of apoptotic cell death in mollusks n update J. Fish Shellfish Immunol doi.6/j.fsi...8. illard. poptosis inducers in chronic lymphocytic leukemia J. Oncotarget Rice KL Licht JD. HOX deregulation in acute myeloid leukemia J. J lin Invest Zhang JF Zhang JG Kuai XL et al. Reactivation of the homeotic tumor suppressor gene DX by - aza'- deoxycytidine- induced demethylation inhibits cell proliferation and induces caspase independent apoptosis in gastric cancer cells J. Exp Ther Med Shen X Tang J Hu J et al. MiR- 44 regulates monocytic differentiation of human leukemia U97 cells by directly targeting DX J. iotechnol Lett doi.7/ s Kuckenberg P uhl S Woynecki T et al. The transcription factor TFP/P-c cooperates with DX to maintain trophectoderm

5 天津医药 6 年 6 月第 44 卷第 6 期 68 干扰素 γ 增强脂肪间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用王平, 顾昕, 张娜, 张红, 师帅南 4, 王玉亮摘要 : 目的观察干扰素 (IFN)-γ 增强成人自体脂肪间充质干细胞 (DSs) 对外周血淋巴细胞免疫调节的作用及机制方法取亲体移植供体术中腹部皮下脂肪组织并留取外周血, 分离单个核细胞 (PMs); 分离培养 DSs; 将 IFN-γ 预刺激 DSs(IFN-γ 预刺激组 ) 及未刺激 DSs( 未刺激组 ) 分别与 PMs 在植物血凝素 (PH)+ 白细胞介素 (IL)- 刺激条件下共培养 d 后, 用 MTT 法检测活化 T 细胞增殖抑制率, 流式细胞术检测 D4 + D + 调节性 T 细胞 (Treg) 比例 ; 实时定量 RT-PR 法检测 DSs 内吲哚胺, 双加氧酶 (IDO)mRN 水平 ; 观察共培养细胞加入 - 甲基色氨酸 (-MT;IDO 阻断组 ) 后活化 T 细胞的增殖能力结果分离的自体 DSs 高表达 D7 D9 D; 具有分化为成脂和成骨细胞的能力 IFN-γ 预刺激组 DSs 显著增强活化 T 细胞增殖抑制率, 呈剂量依赖关系, 高于未刺激组 ;IFN-γ 预刺激组 D4 + D + Treg 比例与未刺激组相比显著升高 ;IFN-γ 预刺激组 DSs 内 IDO mrn 表达水平显著高于未刺激组 ;IDO 阻断组对活化 T 细胞增殖抑制率较 IFN-γ 预刺激组显著降低 (P <.) 结论 IFN-γ 促进 DSs 对活化 T 细胞免疫抑制能力,IDO 在 DSs 介导的免疫抑制中起重要免疫调节作用关键词 : 脂肪组织 ; 间质干细胞 ; 间质干细胞移植 ; 干扰素 Ⅱ 型 ; 干扰素 γ; 免疫调节 ; 吲哚胺, 双加氧酶中图分类号 :R9.4 文献标志码 : DOI:.98/6 4 Interferon-γ promotes immunomodulatory of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on peripheral blood lymphocytes WNG Ping, GU Xin, ZHNG Na, ZHNG Hong, SHI Shuainan 4, WNG Yuliang 4 Department of Orthopedics, People s Liberation rmy No.4 Hospital, Tianjin 4, hina; Department of Pharmacy, People s Liberation rmy ir Force General Hospital; Physical Exam enter, People s Liberation rmy No.4 Hospital; 4 Tianjin First entral Hospital bstract:objective orresponding uthor wang_yu_l@6.com To investigate the immunomodulatory effects and the mechanism of interferon (IFN)-γ-pretreated adult autologous adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (DSs) on peripheral blood lymphocytes. Methods DSs 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (84798); 国家临床重点专科建设项目资助课题作者单位 : 解放军第 4 医院骨科 ( 邮编 4); 解放军空军总医院药学部 ; 解放军第 4 医院体检中心 ;4 天津市第一中心医院作者简介 : 王平 (969), 男, 副主任医师, 硕士, 主要从事脊柱外科及骨肿瘤研究通讯作者 wang_yu_l@6.com formation[j]. Mol ell iol,,():-. doi:.8/m.-9. [7]Thoene S,Rawat VP,Heilmeier,et al. The homeobox gene DX is errantly expressed and associated with an inferior prognosis in patients with acute lymphoblastic leukemia[j]. Leukemia,9, (4): doi:.8/leu.8.. [8]Wu Y,hen RJ,Wu LX,et al. Effects of curcumin derivatives 8 on K6 cells and its mechanism[j]. hinese Pharmacological ulletin,,(6):87-87.[ 吴莺, 陈瑞家, 吴丽贤, 等. 姜黄素衍生物 8 对 K6 细胞的作用及机制研究 [J]. 中国药理学通报,,(6):87-87]. doi:.969/j.issn [9]Rumjanek VM,Vidal RS,Maia R. Multidrug resistance in chronic myeloid leukaemia:how much can we learn from MDR ML cell lines? [J]. iosci Rep,,(6): doi:.4/sr67. []Wang W,Tao K,Qi JY,et al. The inhibitory effect of RNi Shp gene on the proliferation of chronic myeloid leukemia K6 cells [J]. hinese Journal of ell iology,4,6():7-8.[ 王灿蔚, 陶崑, 齐杰玉, 等. RNi 干扰 Shp 基因对 K6 细胞增殖的抑制效应 [J]. 中国细胞生物学学报,4,6():7-8]. []Goldar S,Khaniani MS,Derakhshan SM,et al. Molecular mechanisms of apoptosis and roles in cancer development and treatment[j]. sian Pac J ancer Prev,,6(6):9-44. []Hu Q,Wu D,hen W,et al. Proteolytic processing of the caspase- 9 zymogen is required for apoptosome- mediated activation of caspase- 9[J]. J iol hem,,88():4-47. doi:.74/jbc.m []Teijido O,Dejean L. Upregulation of cl inhibits apoptosisdriven X insertion but favors X relocalization in mitochondria [J]. FES Lett,,84():-. doi:.6/j. febslet..7.. (--8 收稿 6--9 修回 ) ( 本文编辑陈丽洁 )

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲