S02.FIT)

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1 第 16 卷第 6 期 生命科学研究 灾燥造援员 6 晕燥援 6 圆园 12 年 12 月 蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Dec. 圆园 12 窑综 述窑 油茶种质遗传多样性的分子标记技术和 EST 文库构建 周兰英 1, 王湘南 2, 陈永忠 2, 姜孝成 1* (1. 湖南师范大学生命科学学院, 中国湖南长沙 ; 2. 湖南省林业科学院, 中国湖南长沙 ) 摘要 : 油茶是一类重要的经济林树种, 种质资源遗传多样性丰富. 目前我国主栽油茶品种有普通油茶尧小果油茶尧攸县油茶和浙江红花油茶等.RFLP 尧 SSR 尧 RAPD 尧 SCAR 尧 ISSR 尧 ARLP 和 SRAP 等分子标记技术在油茶种质资源研究中得到了广泛应用, 可望为有效地鉴定油茶良种的真实性提供重要技术手段. 油茶 EST 渊 expressed sequence tags 冤文库的构建, 将有助于油茶功能基因的开发和利用. 关键词 : 油茶 ; 种质资源 ; 分子标记 ;EST 文库构建中图分类号 : S722 文献标识码 : A 文章编号 : 1007 鄄 7847(2012)06 鄄 0557 鄄 08 Molecular Marker Techniques and EST Library Construction on Genetic Diversity of Camellia Germplasms ZHOU Lan 鄄 ying 1,WANG Xiang 鄄 nan 2,CHEN Yong 鄄 zhong 2,JIANG Xiao 鄄 cheng 1* (1. College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha , Hunan, China; 2. Tea Research Institute, Hunan Academy of Forestry Sciences, Changsha , Hunan, China) Abstract:Camellia is one of the important economic forest species with abundant genetic diversity in germplasm resources. At present, the main cultivars of Camellia in China are Camellia oleifera, C. meio 鄄 carpa, C. yuhsiensis and C. chekangoleosa, etc. Molecular markers such as RFLP, RAPD, SSR, SCAR, ISSR, ARLP and SRAP have been widely applied in Camellia germplasm resources research. It is expected to ef 鄄 fectively assess the authenticity of elite lines of Camellia. EST (expressed sequence tags)library construc 鄄 tion of Camellia will contribute to the exploitation and utilization of its functional genes. Key words: Camellia; germplasm resources; molecular markers; EST (expressed sequence tags)library construction (Life Science Research,2012,16(6):557 耀 564) 油茶 (oil 鄄 tea tree, Camellia) 属山茶科山茶属, 常绿大灌木或小乔木, 与油橄榄 油棕 椰子并称 [1] 为世界四大木本食用油料树种. 目前生产上的油茶是指山茶属中种子含油率较高 有栽培应用价值的一些物种的总称, 如栓壳红山茶 浙江红花 [2] 油茶 小果油茶 滇山茶 短柱茶 溆浦大红山茶等. 油茶的主要产品是茶油. 茶油是国际粮农组织重点推荐的健康型食用油之一, 被誉为 东方橄榄油, 我国南方 2 亿多人长年食用茶油. 此外, 茶 油在化工 轻工 食品 饲料工业等方面具有重要 [3] 的经济价值和社会资源价值. 油茶适应性广 耐瘠薄, 是南方低山 丘陵地区很好的经济林树种之一, 在当前退耕还林等林业重点工程项目特别是我国南方农村经济和生态建设中中, 发挥了重要作用. 随着人民生活水平的提高, 对食用油的需求也从仅仅追求数量逐渐转向优质 保健等多功能. 茶油的副产品茶枯和茶壳还可用于提取茶皂素 磨制成刨光粉和发酵 收稿日期 : 2012 鄄 07 鄄 20; 修回日期 : 2012 鄄 10 鄄 17 基金项目 : 湖南省自然科学基金重点项目 (2010KJ2010) 资助作者简介 : 周兰英 (1987 鄄 ), 女, 广西桂林人, 硕士研究生, 主要从事植物发育与分子生物学研究 ; * 通讯作者 : 姜孝成 (1964 鄄 ), 男, 湖南新化人, 湖南师范大学教授, 主要从事植物发育与分子生物学研究,Tel: 0731 鄄 , E 鄄 mail: jxclc@hunnu.edu.cn.

2 558 生命科学研究圆园 12 年 成高蛋白饲料等. 油茶果壳可生产活性碳和提取 鞣料等, 通过深加工和综合利用可大幅度提高油 茶产品的附加值. 油茶种资质源丰富, 与其遗传变异特性的多 样性密切相关. 油茶的遗传变异特性存在于形态 特征 生物学特性 经济性状 脂肪酸和抗逆性等 诸多方面. 其中形态特征包括树体性状 果实性 状 枝叶性状 ; 生物学特性包括花器官及花期变 异和果实成熟期变异等特性 ; 经济性状包括产果 量 果重 出籽率 出仁率和出油率等性状 [4]. 传统 的油茶种质资源鉴定主要依据植株的形态特征. 但油茶品种间形态上的差异往往并不十分显著, 特别是一些近缘品种, 在苗期, 许多经济性状尚 未表现, 直至成熟期才表现出来 ; 有些品种只是 果实或种子的化学成分或含量存在差异, 从果或 叶子的形态上无法鉴别 ; 此外, 形态上的差异易 受环境影响而产生变异, 往往使近缘品种的鉴定 产生错误. 由于油茶的生产周期长, 真假混杂的 苗木会给林业生产带来不堪设想的严重后果和难 以补救. 近年来, 分子标记技术在油茶种质资源 的研究中得到了广泛应用, 为快速准确地鉴定油 茶品种提供了理论基础和技术平台. 1 分子标记技术在油茶种质资源研究中的应用 20 世纪 80 年代以来, 随着分子克隆和重组 DNA 技术的发展, 出现了以 DNA 指纹图谱为鉴 定指标的 DNA 分子标记鉴定法, 具有准确 可 靠 方便的特点. 基因组中存在差异的特异性 DNA 片段是生物个体或种群间遗传多态性在 DNA 水平上的直接反映 [5]. 大多数 DNA 分子标记 从电泳谱带上反映出彼此间的 DNA 差异. 与形 态标记和生化标记相比,DNA 分子标记具有以下 优越性 :1) 鉴定指标直接以 DNA 的形式出现. 由 于环境一般只影响基因表达, 而不改变基因结构, 所以植株的任何组织在任何发育时期均可用于分 析 ;2) 多态性高.DNA 指纹图谱既能探索品种间 染色体组孟德尔遗传因子方面的差异, 又能揭示 母体细胞质方面的非孟德尔遗传因子的影响, 且 由于探针数目与内切酶种类组合方式在理论上不 可计数, 因而其潜在的鉴别能力是不可估量的 ;3) 分离出的样品 DNA 在适宜条件下可长期保存, 这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利. 因此, DNA 分子标记鉴定法可以弥补和克服形态标记 和生化标记鉴定中的许多缺陷, 是其广泛应用的 [6 耀 8] 基础. 目前生产应用中主要的分子标记技术有 SSR RAPD SCAR ISSR AFLP 和 SRAP 等. 这些技术在油茶遗传多样性 种质资源保护 遗传图谱构建 基因定位与辅助选择育种 品种鉴定等方面已得到广泛应用, 为油茶优良无性系鉴别 亲缘分析 重要农艺性状的数量性状基因座位 (quanti 鄄 tative trait locus, QTL) 研究以及种质资源利用和良种选育积累了有效的分子证据. 1.1 SSR 简单重复序列 (simple sequenee repeat, SSR) 亦称微卫星 DNA(microsatellite DNA), 是基因组中由 1~6 个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段 DNA, 广泛分布于基因组的不同位置, 长度一般在 300 bp 以下. 最早的 SSR 指纹图谱是 Ali 和 Epplen 等在 1986 年创建的. 传统的 SSR 技术操作流程与 RFLP 相似, 都是利用合适的限制性内切酶消化基因组 DNA, 然后将电泳分离后的限制性片段转移到滤膜上, 与放射性同位素或非放射性物质标记的探针杂交, 最后通过放射自显影或非放射性途径检测遗传位点的差异.SSR 与 RFLP 的区别在于 RFLP 技术所使用的探针来自基因组文库或 cdna 文库, 而 SSR 技术中所使用的探针是与 SSR 互补的寡聚核苷酸序列.1990 年后, 随着 PCR 技术的问世, 又出现了基于 PCR 的 SSR 指纹检测技术, 它以传统的用作探针的寡聚核苷酸序列为 PCR 扩增的单引物, 扩增得到相应的微卫星片段. SSR 技术操作简便, 重复性好.SSR 既可用探针获得指纹图谱, 也可通过 PCR 方法进行微卫星位点多态性分析, 而且对 DNA 的数量要求少且质量要求不高. 该方法的缺点是必须针对某个染色体座位的微卫星 DNA 两端的单拷贝序列设计探针或引物, 工作量很大, 这给 SSR 的开发和扩大应用带来一定的困难. 目前,SSR 已用于评价油茶和茶树资源的遗 [9] 传多样性和亲缘分析. 范小宁等对 SSR 鄄 PCR 反应体系的各因子进行筛选, 优化了油茶 SSR 鄄 PCR 反应体系, 为我国油茶核心种质资源和遗传多样性分析图谱构建等研究奠定了良好基础. 金基强 [10] 等采用 16 对 EST 鄄 SSR 引物对 42 份茶树品种资源进行了分析, 认为利用 EST 鄄 SSR 标记进行茶树 [11] 资源评价是有效的. 刘振等采用 31 对 EST 鄄 SSR

3 第 6 期 周兰英等 : 油茶种质遗传多样性的分子标记技术和 EST 文库构建 559 引物, 对 60 份西南茶区茶树资源进行了遗传多样性和亲缘关系分析, 结果表明, 西南茶区茶树 [12] 资源的遗传多样性非常丰富.Ohsako 等采用 6 对 SSR 引物对日本京都当地的 8 个茶树品种的遗传关系进行研究, 将 8 个茶树品种分为两大类群, 彼此间存在明显的分化, 任何一个单独的群体都不能代表京都地区茶树的全部遗传变异, 在构建当地茶树种质资源圃时, 为了使遗传多样性最大化, 应该收集尽可能多的群体样本. 1.2 RAPD 随机扩增多态 DNA (random amplified poly 鄄 morphic DNA, RAPD) 是由 Williams 等于 1990 年 [13] 创建的一种以 PCR 为基础的分子标记技术, 即以样品的基因组 DNA 为模板, 以人工合成的随机寡核苷酸序列为引物, 通过 PCR 非定点扩增 DNA 片段, 用凝胶电泳分析扩增产物 DNA 片段 [14] 的多态性. 近年来,RAPD 标记主要用于系谱分析 品种鉴定 遗传图谱构建 突变体的鉴定 特殊形状的基因标记等方面. RAPD 技术简单, 可以检测多个基因位点. 其缺点是 RAPD 为显性遗传, 存在共迁移问题 ; 重复性较差, 结果不稳定, 不能识别杂合子位点. [15 耀 17] 在油茶的应用方面 :2003 年, 张智俊等首次对油茶优良无性系进行 RAPD 分子鉴别, 以 22 个引物对 12 个油茶优良无性系进行 RAPD 标记, 得到了 141 条多态性谱带, 并通过引物将优良无性系与自然株系区别开来, 证实了 RAPD 技术用于油茶品种鉴别的可行性, 其结果的稳定性和可靠性可以通过优化反应条件和反应体系来实现. [18, 19] 张云等就油茶 RAPD 反应体系中的 dntps 浓度 Mg 2+ 浓度 模板 DNA 浓度 引物浓度以及 Taq 鄄 DNA 聚合酶用量对反应结果的影响进行研究, 建立了油茶 RAPD 分析的最适反应体系.2004 年, [20, 21] 黄永芳等用 18 条引物对 90 个油茶优良无性系进行 RAPD 标记, 得到 569 条多态性谱带, 其多态性比率达到 94.7%, 还找到了 32 条特异性谱带, 探讨了无性系间的亲缘关系, 以及果油率 抗病性和产油量 3 个数量性状与谱带的相关性.2005 [22] 年, 陈永忠等对油茶优良无性系进行了 RAPD 分析, 对无性系进行了品种鉴别.2008 年, 阙生全 [23] 等分别用改良 SDS 法和 CTAB 法从 12 个油茶品种的新鲜幼叶中提取基因组 DNA, 建立了 RAPD 分析的最佳反应体系. 1.3 SCAR [24] 1993 年,Paranl 和 Michelmore 等在以 RAPD 基础上提出的序列特异扩增区域 (sequence charaeterized amplified region, SCAR) 标记, 是基于 PCR 技术的单基因位点多态性标记, 即克隆目标 RAPD 片段并对其测序 ; 然后根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物, 以基因 DNA 为模板再进行 PCR 特异扩增, 把与原 RAPD 片段相对应的单一位点鉴别出来, 即 RAPD 标记转化为 SCAR 标 [25] 记. 近 10 年内被广泛用于分子标记辅助选择 抗病基因连锁定位 高密度遗传图谱构建 种质纯 [26] 度及品种鉴别等方面. SCAR 标记弥补了 RAPD 成本高的缺点, 结 [27] 果稳定性好, 重现性高, 但 SCAR 需要首先克隆 RAPD 标记, 测出其两端的核苷酸序列, 再根据这些核苷酸序列设计一对引物特异性扩增这个标记, 操作比较麻烦. [28] 2010 年, 郑婷婷建立和优化了油茶 SCAR 反应体系, 筛选出油茶 SCAR 分析引物, 建立了油茶的 SCAR 标记. 1.4 ISSR 内部简单重复序列 (inter 鄄 simple sequence re 鄄 peat, ISSR) 分子标记技术是 1994 年由 Zi 鄄 etkiewicz E 创建, 基于微卫星分子标记而发展起来的. 其基本原理与 SSR 相似, 利用人工合成的 16 耀 18 个核苷酸重复序列作为引物, 然后对其两侧具有反向排列的 SSR 的 DNA 序列进行 PCR 扩增. ISSR 在引物设计上比 SSR 简单得多, 并且比 RFLP RAPD SSR 提供了更多的遗传信息. 操作快捷 成本较低 安全性较高, 又不像 SSR 要预先获知序列信息, 因而 ISSR 标记是进行品种纯度和真实性鉴定的很有潜力的方法. 但 ISSR 作为一种显性标记 ( 部分共显性 ), 不能区分显性纯合基因型和杂合基因型, 造成在筛选引物上具有相 [29] 对的不随机性 ; 并且 ISSR 鄄 PCR 扩增时的最佳反应条件需要逐个确定. [30,31] ISSR 已在油茶的研究中广泛应用. 温强等对江西 25 个产量达到 750 kg/hm 2 的油茶高产无 [32] 性系进行了 ISSR 分子鉴别研究. 张国武等以 1 个普通油茶实生苗作为对照, 采用 ISSR 分子标记对我国南方 10 个油茶优良无性系进行了遗传多样性分析, 较准确地对各优良无性系的进行了 [33] 分子鉴别. 王保明等应用 ISSR 分子标记, 以 23 个油茶无性系叶片的 DNA 作为实验材料, 从 60 个随机引物中筛选出 10 个最优引物, 扩增出 102

4 560 生命科学研究圆园 12 年 条谱带, 其中多态性谱带 70 条, 多态性比率为 68.6%, 谱带大小为 200 耀 2000 bp, Shannon 遗传信息指数为 , 平均观察等位基因数和有效等位基因数分别为 和 1.519; 遗传距离为 耀 , 表明油茶无性系之间具有较高 [34] 多态性. 王渊运用形态与 ISSR 分子标记相结合的方法, 探讨了湖南油茶主要栽培品种无性系间 [35] 的亲缘关系 ; 杨翠芳等以大果油茶嫩叶片为供试材料, 对其 ISSR 反应体系条件进行了筛选及 [36] 优化. 范海艳等以博白大果油茶为材料, 通过单因素实验设计和正交设计蕴 18(35) 对影响 PCR 反应体系的主要成分及 PCR 扩增程序进行优化, 建立了稳定的 可重复的博白大果油茶 ISSR 鄄 PCR 扩增反应体系. 1.5 AFLP 随机扩增长度多态性 (amplified fragment length polymorphism, AFLP) 是 1995 年由荷兰科学家 Pieter Vos 等发明的分子标记技术. 原理是基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 限制性片段, 基因组 DNA 先用限制性内切酶切割, 然后将双链接头连接到 DNA 片段的末端, 接头序列和相邻的限制性位点序列, 作为引物结合位点. 限制性片段用两种酶切割产生, 一种是罕见切割酶, 一种是常用切割酶. 它结合了 RFLP 和 PCR 技术特点, 具有 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高效性. 由于 AFLP 扩增可使某一品种出现特定的 DNA 谱带, 因此, 通过引物诱导及 DNA 扩增后得到的 DNA 多态性可做为一种分子标记. AFLP 是在 RFLP 与 RAPD 两种指纹技术基础上建立和发展起来的, 具有检测效率高 重复性高 稳定性高 多态性高等特点,AFLP 的不足之处是操作流程比较复杂, 扩增时对模板反应迟钝, 成本较高, 对基因组 DNA 纯度和反应条件要求较高. 有关油茶 AFLP 反应体系和遗传多样性的研 [37,38] 究最近两年才见报道.2011 年, 张婷等首次对湖北省 5 个地区油茶的遗传多样性进行了 AFLP 分析, 建立了油茶 AFLP 分子标记体系.2012 年, [39] 金龙等建立了适合油茶且简便易行的 AFLP 反应体系, 筛选出 4 对能够反映多态性的有效引物, 平均每对引物扩增出 23 个具有清晰条带的位点, 其中多态性位点数为 20, 多态性位点百分率为 87.14%, 有效等位基因数为 1.54, Nei s 期望杂合度为 0.36, Shannon 多态性信息指数为 0.47, 研究 结果表明了 AFLP 标记技术在油茶遗传多样性研 [40] 究上的适用性.2012 年, 冯金玲等为了探讨油茶芽苗鄄砧嫁接体愈合过程中嫁接口和接穗是否发生基因变化, 利用 AFLP 对不同发育阶段的油茶芽苗鄄砧嫁接口, 油茶芽苗鄄砧愈伤口以及接穗母树 砧木和接穗萌发芽的基因进行分析时发现, 油茶芽苗鄄砧嫁接口发育过程中,AFLP 条带数有较大变化, 特别是在嫁接移栽后的第 d, 愈伤口条带数的变化是在移栽后第 0 耀 18 d 间 ; 接穗母树 接穗萌发芽和砧木存在 13 条特异带, 其中 5 条为接穗萌发芽特有条带, 砧木中存在 5 条特有条带. 1.6 SRAP 相关序列扩增多态性 (sequence related ampli 鄄 fied polymorphism, SRAP) 标记是基于 PCR 技术的新型分子标记技术. 其原理是利用基因外显子 G C 含量丰富, 而启动子和内含子 A T 含量丰富的特点设计两套引物, 对开放阅读框架进行扩增. SRAP 分子标记的多态性和重现性都很好, 与 AFLP 接近, 但它的操作步骤比 AFLP 简单, 少了两次酶切步骤, 仅需 PCR 反应就直接扩增. 另外,SRAP 标记的引物易于获得, 成本低廉, 优于 RFLP RAPD SSR 和 AFLP 等传统分子标记方法. [41] 在油茶研究方面,2010 年, 郑婷婷等和祝 [42] 全东等分别采用正交试验设计的方法, 对 SRAP 鄄 PCR 反应体系中模板 DNA 引物 dntps Mg 2+ 浓度及 Taq DNA 聚合酶用量和退火温度等参数进行试验, 建立和优化了油茶 SRAP 反应体系. [43] 2011 年, 彭邵锋等采用改良 CTAB 法提取的油茶叶片基因组 DNA 为模板, 利用优化的 SRAP 鄄 PCR 反应体系, 从 16 个正向引物和 20 个反向引物中筛选出扩增条带特异 多态性好 稳定性高的 8 对引物组合 ; 然后利用这些引物组合对 14 个油茶良种扩增, 获得 65 条清晰可重复的条带, 其中 22 条是多态性条带, 多态性条带百分率为 [44] 33.85%. 吴莺莺对 192 份油茶种质材料间的遗传多样性进行了 ISSR 和 SRAP 分子标记分析. 张 [45] 婷等对湖北省油茶 5 个居群的遗传多样性进行了 SRAP 标记研究, 用 11 对引物对 48 个个体进行扩增, 获得清晰的扩增条带 64 条, 其中多态性条带 60 条, 占 93.75%; 各材料间的遗传相似性系 [46] 数在 耀 之间, 平均值为 杨扬等对 6 个小果油茶群体的 180 份材料的遗传多样性进行了 SRAP 标记研究, 从 87 对 SRAP 引物中筛

5 第 6 期 周兰英等 : 油茶种质遗传多样性的分子标记技术和 EST 文库构建 561 选出 9 对多态性理想的引物组合, 共扩增出 184 条带, 其中多态性条带 184 条, 多态性位点比率高达 100%, 平均有效等位基因数为 , 180 份小果油茶总 Nei 基因多样性指数为 , 平均 Shannon 信息指数为 , 表明小果油茶群体具有较丰富的遗传多样性, 遗传变异主要分布 [47] 在群体内, 群体间变异相对较小. 范小宁等以 4 个控制授粉家系的子代共 52 个个体为研究对象, 从 105 对 SRAP 引物中筛选出 9 对条带丰富多态性高重复性好的引物, 采用优化的 SRAP 鄄 PCR 反应体系对其进行了遗传多样性研究.2012 年, 韩 [48] 欣等利用 SRAP 标记技术, 以 14 个赣南油茶良种为对象, 提取叶片基因组 DNA 作为模板, 筛选出稳定性高的引物组合, 对获得的清晰 可重复的条带进行数据转换, 建立了基于 SRAP 图谱的赣南油茶良种的分子鉴别体系. 2 油茶遗传多样性的 EST 文库构建表达序列标签 EST 是在 cdna 文库构建的基础上, 从 cdna 文库中随机挑选单克隆进行单边测序, 得到的一系列 300 耀 500 bp 的核苷酸片段. 由于这些片段都是基因表达的部分或全部序列, 把这些序列与 GenBank 等生物信息学数据库的基因序列进行比对, 就可能发现一系列新基因, 从而进一步分离和克隆这些基因, 这些片段还可以直接用于分子标记辅助选择育种或遗传图谱构建等.EST 与一般的遗传标记相比, 其优越性在于直接与一个表达基因相关, 且易于转变成序标位点 SIS (sequence tagged site). 大量 EST 可累积建立一个新的数据库, 为表达基因的鉴别等研究提供大量信息. 油茶属异交植物, 自然界杂合程度非常高, 适合利用共显性标记来作图或进行其它遗传分析. 构建油茶 EST 文库, 可将 EST 转化为 SIS 分子标记 ( 共显性标记 ), 开展油茶遗传图谱构建 重要基因定位 分离克隆及其它遗传分析研究, 并可为其他山茶属植物遗传多样性 系统学研究和 [49] 资源的开发利用提供借鉴. 油茶含有许多与抗逆性能和茶油品质等相关的优质基因, 分离和克隆这些基因, 对于油茶的 [50] 遗传改良具有重大价值. 比如, 不同油茶品系间油脂品质存在明显差异, 寻找并控制油茶油脂转化基因, 对油茶油脂品质进行改良具有重要的现 [51] 实意义. 石明旺等以湘林 1 号和湘林 4 号油茶 优良无性系近成熟的种子为材料构建了油茶种子 [52] 油脂转化高峰期的 cdna 文库 ; 胡芳名等在此基础上经过大量测序和序列分析获得了与油脂储 [53] 藏有关的 Oleosin 蛋白的基因序列. 仇健将分离的油茶蛋白基因 Co 鄄 ole IA 基因 ORF 装入载体, 并将重组质粒在大肠杆菌 BL21(DE3) 中进行了高效的表达. 为揭示近成熟时期油茶种子中储藏蛋白特异表达丰度的分子机制提供了科学依据. 在油茶种子油脂转化高峰期基因研究方面, 张党权 [54, 55] 等对油茶 EST 文库中不饱和脂肪酸合成关键酶基因进行了序列分析, 随后又通过 5 忆 RACE 技术获得油茶 SAD 基因的全长 cdna, 并进行了较为深入的生物信息学分析. 查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶. 在油茶类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶基因方面, 谭 [56, 57] 晓风等首次克隆鉴定了油茶查尔酮异构酶基因的全长 cdna, 拼接校对后的长度为 899bp, 编码 206 个氨基酸, 起始密码子为 GTG, 终止密码子为 TAG, 是查尔酮异构酶基因的全长 cdna. 发现该 cdna 序列比核酸数据库中最长的查尔酮合酶基因 cdna 序列还要多 69 个碱基, 是目前世界上发现的查尔酮合酶基因中最长的 cdna. 3 展望有效地利用油茶种质资源的遗传变异, 是保持油茶优良遗传性状的关键. 利用分子标记手段可以定位目标基因, 用与目标性状紧密连锁的分子标记追踪目标基因, 在油茶分子育种中能取得事半功倍的效果. 由于分子标记辅助选择育种不受环境等外部因素影响, 根据分子标记的遗传连锁, 找寻与主要经济性状相关的连锁标记, 不仅能提高育种效率, 还能打破时间限制, 缩短育种周期. 分子标记技术为确保油茶苗木市场的安全与稳定, 促进油茶优质种苗繁育, 加快木本粮油产业的稳定健康发展, 提高我国木本粮油产品与国外产品的竞争力提供了理论基础和技术支持. 油茶产业发展的根本是种苗, 种苗的数量与质量是制约油茶产业发展的关键. 由于油茶产业迅速发展, 良种需求量剧增, 必须确保良种的真实性. 在市场经济条件下, 经济林苗木假冒事件时有发生, 一些不法苗木商以假乱真, 以次充好, 牟取暴利, 这将给油茶产业带来重大损失, 而且不利于社会稳定. 如何准确可靠地鉴定油茶良种的真实性, 充分发挥良种的作用, 一直是油茶良

6 562 生命科学研究圆园 12 年 种生产 销售和利用过程中存在的一大问题. 分 子标记技术在油茶的品种鉴定方面有很大的应用 空间. 针对油茶新品种的选育, 未来将继续选择和 培育遗传相对稳定 变异幅度较小的优良树体和 枝叶性状 ; 对于花期及果实的成熟期, 将以培育 早花早熟的品种为主, 而果实则主要培育果形 果色的遗传相对稳定 产量和含油率都较高的品 种 ; 对于抗逆性, 将以培育抗旱 耐高温严寒 抗 病虫害 耐瘠薄的品种为主, 以扩大其适应范围, 提高产量. 以上育种目标的实现, 都需要弄清某 些相关的关键基因的功能及其表达与环境因素的 关系. 通过分子标记技术, 鉴别并分离与油茶优 良性状相关的特殊基因, 深入了解这些基因的作 用机制, 进行油茶转基因育种, 这方面的研究将 成为今后的重点. 参考文献 (References): [1] 陈永忠, 杨小胡, 彭邵锋. 我国油茶良种选育研究现状及发展策略 [J]. 林业科技开发 (CHEN Yong 鄄 zhong, YANG Xiao 鄄 hu, PENG Shao 鄄 feng. Our country Camellia oleifera breeding re 鄄 search situation and development strategies[j]. China Forestry Science and Technology), 2005, 19(4): 1 鄄 4. [2] 陈永忠, 王德斌. 湖南省油茶良种选育及推广应用概况 [J]. 湖南林业科技 (CHEN Yong 鄄 zhong, WANG De 鄄 bin. The selec 鄄 tion of fine varieties and application of Camellia oleifera in Hunan province[j]. Hunan Forestry Science and Technology), 2001, 28(3): 25 鄄 29. [3] 黎先胜. 我国油茶资源的开发利用研究 [J]. 湖南科技学院学报 (LI Xian 鄄 sheng. 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