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1 552 解放军医学杂志 2013 年 7 月 1 日第 38 卷第 7 期论著聚肌胞苷酸脂多糖及肽聚糖对人气道黏膜天然免疫功能影响的实验研究张景熙, 赵立军, 石荟, 白冲, 李强 [ 摘要 ] 目的研究聚肌胞苷酸 [Poly(I:C)] 脂多糖(LPS) 及肽聚糖 (PGN) 对人气道黏膜屏障及炎性介质表达的影响, 进而了解气道黏膜对不同 Toll 样受体配体的天然免疫应答反应方法采用 Transwell 系统培养人 16HBEs 气道上皮细胞建立人气道黏膜体外模型, 分别给予 Poly(I:C) LPS 及 PGN 顶侧刺激, 对照组仅给予 MEM+GlutaMax-Ⅰ 培养基培养通过测定跨膜电阻抗 (TER) 判断 16HBEs 细胞间的小分子通透性, 测定基底侧培养液中 FITC- 右旋糖酐浓度判断大分子细胞通透性, 用 ELISA 法检测干预 24h 后培养细胞顶侧及基底侧上清液中 IL-8 粒- 巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF) 及 TNF-α 的蛋白含量结果 10μg/ml Poly(I:C) 导致人气道上皮细胞间 TER 显著降低,FITC- 右旋糖酐通透性增加 (P<0.01),10μg/ml LPS 及 100μg/ml PGN 刺激对气道上皮细胞 TER 及 FITC- 右旋糖酐通透性无明显影响 IL-8 和 TNF-α 表达在 Poly(I:C) LPS 及 PGN 组细胞顶侧和基底侧均较对照组显著增加 (P<0.05) GM-CSF 表达在 3 组细胞顶侧均较对照组增加 (P<0.05), 仅 Poly(I:C) 组基底侧表达较对照组增加 (P<0.05),LPS 和 PGN 组基底侧与对照组比较无明显变化 Poly(I:C) 组 LPS 组和 PGN 组细胞顶侧 IL-8 和 GM-CSF 浓度增高程度高于基底侧, 形成浓度梯度结论 Poly(I:C) 可破坏气道黏膜屏障完整性, 导致小分子和大分子通透性增加, 同时刺激细胞定向向顶侧分泌炎性介质,LPS 及 PGN 对气道黏膜屏障无影响, 但能诱导细胞向顶侧定向分泌炎性介质, 提示病毒及细菌感染所致气道炎症与 Toll 样受体通路介导的气道黏膜天然免疫应答有关 [ 关键词 ] 气道上皮细胞 ; 聚肌胞苷酸 ; 脂多糖类 ; 肽聚糖 ; 免疫, 天然 ; 免疫, 黏膜 [ 中图分类号 ] R562 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2013) Effects of Poly(I:C), LPS and PGN stimulation on the innate immune function of human bronchial epithelium ZHANG Jing-xi, ZHAO Li-jun, SHI Hui, BAI Chong, LI Qiang Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai , China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( ) and Shanghai Health Bureau Foundation ( ) [Abstract] Objective To study the effect of polyinosinic:polycytidylic acid (poly(i:c)), lipolysaccharide (LPS), peptidoglycan (PGN) on the barrier function and inflammatory mediators release of bronchial epithelium, and explore the impact of different specific Toll-like receptor (TLR 2, 3, 4) ligands on airway mucosal innate immune responses. Methods Polarized human bronchial epithelial cells (16HBEs) were cultured using transwell system to establish human bronchial epithelium model in vitro. The stimulation of Poly(I:C), LPS and PGN, respectively, was given on 16HBEs apically. The permeabilities of micromolecule and macromolecule between cells were measured by detecting trans-epithelial electrical resistance (TER) and basolateral medium FITCdextran concentrations after 24h stimulation. IL-8, GM-CSF and TNF-α protein content of apical and basal supernatants released by 16HBEs were measured by ELISA after 24h stimulation. Results 10μg/ml Poly(I:C) resulted in decrease of TER and reduction of increase of FITC-dextran permeability significantly (P<0.001), while 10μg/ml LPS and 100μg/ml PGN showed no obvious effects on TER and FITC-dextran permeability. Poly(I:C), LPS and PGN induced an increase in apical and basolateral IL-8, TNF-α release and apical GM-CSF release of the cells. There was no change in basal expression of GM-CSF after being stimulated by LPS and PGN. The apical increase in IL-8 and GM-CSF was higher in Poly(I:C), LPS and PGN groups than their basal increase, thus forming the concentration gradient between two sides of the polarized cells. Conclusions Poly (I:C) can damage the barrier integrity of the bronchial epithelium, leading to an increase in micromolecular and macromolecular permeability, and induce the secretion [ 基金项目 ] 国家自然科学基金 ( ); 上海市卫生局面上项目基金 ( ) [ 作者简介 ] 张景熙, 医学博士, 副主任医师, 副教授主要从事气道黏膜屏障与免疫方面的研究 [ 作者单位 ] 上海第二军医大学长海医院呼吸内科 ( 张景熙赵立军石荟白冲李强 )

2 Med J Chin PLA, Vol. 38, No. 7, July 1, of inflammatory mediators towards the top side at the same time. LPS and PGN can only induce the secretion of inflammatory mediators towards the top side mildly, without affecting the barrier function. It is suggested that airway mucosal innate immune response through TLR signaling pathways may be involved in airway inflammation caused by virus and bacterial infection. [Key words] epithelial cells; poly I-C; lipopolysaccharides; peptidoglycan; immunity, natural; immunity, mucosal 人体呼吸道黏膜直接与外界相通, 形成一道天然屏障抵御病原微生物的入侵 [1] 作为机体防御系统的第一道防线, 黏膜免疫发挥着重要作用, 致病性病原体侵入机体后, 首先遭遇到天然免疫的抵抗, 随后产生获得性免疫, 两者共同发挥防御作用 [2] 病毒及细菌是引起下呼吸道感染的主要病原体, 也是多种慢性气道疾病急性加重的重要诱因 [3-4] 病毒或细菌进入下呼吸道后首先与气道黏膜接触, 气道黏膜上皮细胞通过自身表达的多种模式识别受体来识别不同病原体并产生应答, 参与病原体清除及气道炎症的发生 [4-5] Toll 样受体 (Toll-like receptor,tlr) 是一个重要的模式识别受体家族, 其中 TLR2 TLR3 TLR4 分别特异性识别肽聚糖 (peptidoglycan,pgn) 双链 RNA 及脂多糖 (lipopolysaccharide,lps) [6] 双链 RNA 是多种呼吸道病毒在细胞内的代谢产物, 聚肌胞苷酸 (polyinosinic:polycytidylic acid) 简称 Poly(I:C), 是一种人工合成的双链 RNA, 能特异性地与细胞内 TLR3 结合, 因其结构类似于多种病毒在细胞内代谢所产生的核糖核酸, 常被用作病毒感染的模拟物 [7] PGN 和细菌内毒素 LPS 分别是革兰阳性菌和革兰阴性菌的标志性结构, 能够被上皮细胞表达的 TLR2 和 TLR4 特异性识别 [8] 目前病毒及细菌感染相关的 TLR 特异性配体对气道黏膜天然免疫应答影响的研究较少本研究采用气道黏膜体外模型, 分别给予 Poly(I:C) LPS 和 PGN 刺激, 观察三者对气道黏膜体外模型天然免疫反应的影响 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器人支气管上皮细胞株 16HBEs 由英国南安普顿大学医学院 Davies DE 教授惠赠,Transwell 培养皿购于 Corning 公司,Ⅰ 型胶原购自 Fremont 公司,MEM+GlutaMax-I 培养基胎牛血清 (FBS) 青霉素链霉素购自 Gibco 公司, 铜绿假单胞菌内毒素 (LPS) PGN 4kD 异硫氰酸荧光素 - 右旋糖酐 (fluorescein-5-isothiocyanate dextra,fitc-dextran) 购自 Sigma 公司,ELISA 试剂盒购自 R&D 公司 Fluoroskan Ascent FL2.5 仪购自 Thermo Fisher Scientific 公司 1.2 方法细胞培养及实验分组将 16HBEs 细胞常规接种于含 10%FBS 的 MEM+GlutaMax-I 培养液 ( 青霉素 50U/ml, 链霉素 50μg/ml) 的 12 孔 Transwell 培养板中, 接种密度为 /ml, 培养瓶提前 30min 用 1:100 Ⅰ 型胶原包被, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 1 周实验分 4 组, 即对照组,Poly(I:C) 组,LPS 组, PGN 组, 各组细胞在刺激前, 顶侧和基底侧分别给予 200μl MEM+GlutaMax-I 培养液和 500μl 含 10%FBS 的 MEM+GlutaMax-I 培养液培养 24h, 然后按照分组分别给予 10μg/ml Poly(I:C),10μg/ml LPS 和 100μg/ ml PGN 刺激, 对照组给予 MEM+GlutaMa x-i 培养液实验至少重复 3 次细胞间离子通透性测定通过测量跨膜电阻抗 (trans-epithelial electrical resistance,ter) 的方法测定细胞间离子通透性, 采用 EVOM 上皮伏欧表 (WPI 公司 ) 测定 16HBEs 细胞培养 1 周后的电阻, TER 大于 260Ω cm 2 提示细胞生长融合良好细胞间连接完整分别测量刺激前及刺激后 h 的 TER 值, 记录刺激后各时间点 TER 占刺激前 ( 记时间点为 0h)TER 值的百分比 (%) 细胞间大分子通透性测定测定 FITC- 右旋糖酐的浓度 (μg/ml) 以反映细胞间大分子通透性按分组施加干预 2h 后在 16HBEs 细胞顶侧加入 2mg/ml 4kD FITC- 右旋糖酐,24h 后应用 Fluoroskan Ascent FL2.5 仪测定基底侧培养基 FITC- 右旋糖酐吸光值, 激发波长 480nm, 发射波长 530nm, 以乙二醇 - 双 -(2- 氨基乙醚 ) 四乙酸 (EGTA) 刺激作为阳性对照 ELISA 法测定白介素 8(IL-8) 粒 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 及肿瘤坏死因子 α(tnf-α) 蛋白的表达采用 ELISA 法检测刺激 24h 后顶侧及基底侧培养基中 IL-8 GM-CSF 及 TNF-α 的蛋白浓度, 操作均严格按照试剂盒说明进行先在酶谱仪上测量标准品吸光度并绘制标准曲线, 然后测量样品吸光度 (A) 值, 每个样品重复 2 孔检测, 并根据测得的 A 值在标准曲线计算出样品浓度 1.3 统计学处理应用 GraphPad Prism 5.0 软件进行资料录入整理及统计分析, 计量资料以 x±s 表示, 多组均数比较采用单因素方差分析 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 细胞间通透性检测结果 10μg/ml Poly(I:C) 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 h 后, TER 均较对照组下降, 分别为对照组相应时间点的

3 554 解放军医学杂志 2013 年 7 月 1 日第 38 卷第 7 期 89.9% 77.5% 77.1% 74.3% 73.2% 32.8%, 差异有统计学意义 ( 图 1A),10μg/ml LPS 或 100μg/ml PGN 从顶侧刺激 16HBEs 细胞后 h, TER 与对照组比较均无明显下降, 提示 Poly(I:C) 可增加 16HBEs 细胞间离子通透性, 而 LPS 及 PGN 刺激对细胞间离子通透性无明显影响 2. 2 细胞间大分子通透性检测结果 1 0μg/ml Poly(I:C) 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 24h 后, 基底侧 FITC- 右旋糖酐浓度 (295.81±45.46μg/ml) 是对照组 (75.81±5.82μg/ml) 的 3.9 倍, 差异有统计学意义 (P<0.001),10μg/ml LPS 和 100μg/ml PGN 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 24h 后, 细胞基底侧 FITC- 右旋糖酐浓度分别为 84.59±8.96μg/ml 和 90.20±16.06μg/ml, 与对照组比较无明显差异, 提示 Poly(I:C) 可增加 16HBEs 细胞间大分子的通透性, 而 LPS 及 PGN 刺激对细胞间大分子通透性并无明显影响 ( 图 1B) 2.3 细胞分泌炎性介质 IL -8 GM-CSF 及 TNF-α 蛋白的检测结果 10μg/ml Poly(I:C) 10μg/ml LPS 和 100μg/ml PGN 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 24h 后, 向顶侧分泌的 IL -8 蛋白水平均较对照组升高, 分别是对照组的倍, 差异有统计学意义 ( P < , 表 1 ), 各刺激组向基底侧分泌的 I L -8 蛋白较对照组基底侧升高, 分别是对照组的倍, 差异有统计学意义 (P<0.01 或 P<0.05, 表 1) Poly(I:C) LPS 和 PGN 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 24h 后, 向顶侧分泌的 GM-CSF 蛋白水平均较对照组升高, 分别是对照组的倍, 差异有统计学意义 (P<0.01),Poly(I:C) 刺激组向基底侧分泌的 GM-CSF 蛋白较对照组升高, 是对照组的 1.53 倍, 差异有统计学意义 (P<0.05),LPS 和 PGN 刺激组向基底侧分泌的 GM-CSF 蛋白与对照组比较无明显差异 ( 表 1) Poly(I:C) LPS 和 PGN 从顶侧刺激 16HBEs 细胞 TER(%) (1) (1) (2) (2) (2) (2) Time (h) Ctrl 800 Poly(I:C) 700 LPS 600 PGN 400 (1) Ctrl poly(i:c) LPS PGN EGTA B 图 1 Poly(I:C)(10μg/ml) LPS(10μg/ml) PGN(100μg/ ml) 经 Transwell 系统顶侧刺激对 16HBEs 细胞间通透性的影响 Fig. 1 Effect of apical stimulation of Poly(I:C)(10μg/ml), LPS(10μg/ml) and PGN(100μg/ml) on the permeability between cells via transwell system A. Changes of TER value detected in 16HBE cells; Time point 0 on the X coordinate represents baseline status before stimulation; (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with control group; B. Concentration of FITC- Dextran in the base of 16HBE cells 24 hours after stimulation, which reflects the permeabilities between macromolecules; EGTA is positive control in this experiment; (1)P<0.01 compared with control group FITC-Dextran (μg/ml) Ctrl Poly(I:C) LPS PGN 24h 后, 向顶侧分泌的 TNF-α 蛋白水平均较对照组明显升高, 分别是对照组的倍, 差异有统计学意义 (P<0.01), 各刺激组向基底侧分泌的 TNF-α 蛋白较对照组明显升高, 分别是对照组的倍, 差异有统计学意义 (P<0.01 或 P<0.05, 表 1) 3 讨论天然免疫应答是气道黏膜抵御外界病原体的 A 表 1 Poly(I:C) LPS 及 PGN 刺激后 16HBEs 细胞向顶侧及基底侧分泌 IL-8 GM-CSF 和 TNF-α 的含量 (pg/ml,x±s,n=3) Tab. 1 Apical and basal content of IL-8, GM-CSF and TNF-α in 16HBEs after stimulation by Poly(I:C), LPS and PGN(pg/ml, x±s, n=3) Index Control Poly(I:C) group LPS group PGN group IL-8 Apical ± ± (2) ± (2) ± (2) Basal ± ± (2) ± (1) ± (1) GM-CSF Apical 26.14± ±34.84 (2) 96.14±19.92 (2) 86.40±4.31 (2) Basal 20.76± ±2.20 (1) 20.95± ±0.82 TNF-α Apical ± ± (2) ± (2) ± (2) Basal ± ± (2) ±57.98 (1) ± (1) (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with control group

4 Med J Chin PLA, Vol. 38, No. 7, July 1, 一种与生俱来的防御机制气道上皮细胞通过自身表达的多种 Toll 样受体来特异性识别不同病原体的特定结构, 启动防御机制并清除入侵病原体 [9-10] 气道黏膜通过气道上皮细胞间的紧密连接构成一道天然物理屏障, 不仅具有控制细胞生长分化维持上皮细胞正常极性及通透性的作用, 还将黏膜下组织结构与外界隔绝, 避免病原体向下侵袭 [11], 维持黏膜屏障的完整性, 是发挥天然免疫功能的一个重要方面本研究发现,TLR3 特异性配体 Poly(I:C) 可导致气道上皮细胞间离子及大分子物质通透性增加, 而 LPS 及 PGN 对细胞间通透性无明显影响, 表明 TLR3 受体激活是破坏气道黏膜完整性的一个相关因素文献报道,LPS 能破坏血 - 脑脊液 [12] [13] 肠道等黏膜屏障,PGN 刺激后皮肤角质细胞通透性增加 [14], 这些差异可能与实验细胞的种系不同有关, 也反映出相同的 TLR 配体对不同黏膜的影响有所不同气道黏膜屏障破坏有可能为细菌各种抗原侵 [15] 袭深部组织创造条件 Sajjan 等报道鼻病毒 (RV) 感染后气道黏膜屏障被破坏, 流感嗜血杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌等细菌通过细胞间向下侵袭的数量相应增加, 可见维持黏膜屏障的完整性对避免黏膜下组织损伤具有一定意义气道上皮细胞在病原微生物等外界刺激下可产生多种细胞因子和趋化因子, 这种化学屏障功能具有招募并激活免疫细胞参与局部炎症的重要作用, 是气道黏膜天然免疫反应的另一组成部分 [11] [16] Ohkuni 等研究发现,Poly(I:C) 刺激人原代鼻黏膜上皮细胞后, 不仅细胞间通透性增加, 而且 IL-8 和 TNF-α 蛋白的分泌明显增加, 表明上呼吸道黏膜物理屏障破坏与炎性介质表达增加同时存在, 并都与 p38mapk 被激活有关, 提示两种反应共用同一条信号通路本研究显示,Poly(I:C) LPS 及 PGN 可不同程度地刺激气道上皮细胞表达 IL -8 GM-CSF 及 TNF-α 蛋白, 其中以 Poly(I:C) 的刺激作用最为明显 IL-8 是一种重要的中性粒细胞趋化因子, 可招募循环中的中性粒细胞向组织浸润并释放溶酶体酶, 产生活性氧, 从而损伤周围组织 [17] GM-CSF 具有调节嗜酸细胞成熟分化活化凋亡和脱颗粒等功能, 参与嗜酸细胞性炎症的形成 [18] 前炎性细胞因子 TNF-α 主要由活化的单核巨噬细胞产生 [19], 可引起血管内皮损伤, 增加微血管通透性, 诱导上皮内皮细胞表达黏附分子, 刺激血小板活化因子 (PAF) 前列腺素 (PGs) 白三烯 (LTs) 等炎性介质合成, 同时具有促进 IL-8 GM-CSF 分泌, 加重炎症细胞浸润与活化等作用 [20] 本研究结果表明, 气道上皮细胞是病原体感染后多种炎性因子产生的重要来源之一 LPS 及 PGN 刺激后炎性介质表达虽升高, 但对黏膜屏障无明显影响, 说明化学屏障的激活与物理屏障的破坏不一定会同时出现, 提示黏膜屏障及炎性介质表达可能受不同信号通路的调控, 其分子机制值得进一步深入研究黏膜屏障破坏有利于病原体向深部侵袭, 造成 [21] 黏膜下组织细胞的激活, 如 Papadopoulos 等曾在病毒感染后的气道黏膜下成纤维细胞内发现病毒颗粒, 而多种细胞的激活成为炎性介质增多的其他来 [22] 源, 如 Bedke 等发现鼻病毒感染刺激人支气管成纤 [23] 维细胞 IL-6 IL-8 RANTES 分泌增多,Baines 等发现 LPS 刺激后中性粒细胞中 IL-8 IL-1β 和 TNF-α 分泌增加, 因此我们推测气道上皮细胞是病原体进入下呼吸道后首先接触的靶器官, 气道黏膜的天然免疫应答反应可能是气道炎症的一个启动因素我们前期研究显示,Poly(I:C) 及 LPS 刺激单层培养的 16HBEs 细胞后,IL -8 和 IP-10 等炎性介质表达增高 [24] 上皮细胞生长时会产生极性, 导致顶侧与基底细胞膜的结构和受体表达有所不同 [25], 但其生物学功能方面的差异尚不得而知在本研究中, 我们采用 Transwell 系统培养的 16HBEs 具有正常细胞极性, 为研究细胞顶侧与基底侧的功能差异提供了一种可选择的体外气道黏膜模型 [26] 本实验结果显示,IL -8 及 GM-CSF 在细胞顶侧的浓度有高于基底侧的趋势, 表明气道上皮细胞具有介导部分炎性介质定向表达的能力, 炎性介质向腔面一侧释放形成浓度梯度, 部分解释了炎性细胞向气道浸润及向气道腔内聚集的分子机制同时我们发现,GM- CSF 在 Poly(I:C) 刺激后形成的浓度差异远较 IL -8 及 TNF-α 的浓度差异明显, 可能有利于嗜酸细胞向黏膜下聚集, 导致气道炎症向 Th2 型炎症方向倾斜综上,Poly(I:C) 可在导致人气道黏膜屏障破坏的同时刺激细胞向顶侧方向分泌炎性介质,LPS 及 PGN 亦可刺激气道上皮细胞分泌炎性介质, 提示病毒及细菌感染所致气道炎症与气道黏膜天然免疫应答反应有关, 进一步深入研究其分子机制将为控制气道炎症提供新的手段参考文献 [1] Swindle EJ, Collins JE, Davies DE. Breakdown in epithelial barrier function in patients with asthma: identification of novel therapeutic approaches[ J]. J Allerg y Clin Immunol, 2009, 124(1): [2] Fang MM, Wang D, Zhang B. Relationship bet ween Tolllike receptor-mediated innate immune response and common pathogens lung infection[ J]. Int J Respir, 2012, 32(14): [ 方明明, 王东, 张波. Toll 样受体介导的天然免疫应答与常见病原体肺部感染之间的关系 [ J]. 国际呼吸杂志, 2012, 32(14): ] [3] Jackson DJ, Sykes A, Mallia P, et al. Asthma exacerbations:

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600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 599 喘可治注射液联合细辛脑注射液治疗小儿毛细支气管炎的临床研究唐辉英, 佘定平, 马颐娇深圳市儿童医院呼吸科, 广东深圳 518026 摘要 : 目的探讨喘可治注射液联合