### ""' 水 # 产 # 学 # 报 卷 环水系统中暂养两周 暂养水族箱体积为 " 长 + 宽 + 高为 & ' +& ' +'& ' 加水至 "&! 箱底部放置无毒 $ 管 直径 " ' 长 & ' 作为隐蔽物 每箱放只蟹 暂养期间每日下午 "!! 按照蟹体质量的 &"! 投喂鱿鱼 次日上午

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1 第 卷第 期!" 年 月 # 水 # 产 # 学 # 报!!" 文章编号 "!!! $!%"&!"! $"" $"! ""! ' #$" "!"& 三疣梭子蟹卵巢发育期间孕激素受体的免疫识别与分布 陈 # 浩 " # 吴旭干 " # 刘智俊 " " # 成永旭 " 上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 #!"!% 上海海洋大学上海高校知识服务平台 上海 #!"!% 摘要 为探讨三疣梭子蟹卵巢发育过程中孕激素受体 *,!+(0,++*(,$ 的调控作用 采用免疫印迹和免疫组化方法 首次对三疣梭子蟹卵巢 肝胰腺 大颚器 ; 器官 视神经节和胸神经团中的 $ 进行免疫识别和定位 并系统研究了卵巢发育期间 $ 在这些器官中的分布和变化 结果表明 " 三疣梭子蟹视神经节中存在 $ 阳性条带 分子量为 "!! 3 $ 仅在早期 期 生殖细胞胞质和后期 期 细胞核呈强阳性 但在各期滤泡细胞中始终呈强阳性 $ 阳性主要存在于 期肝胰腺 细胞和 期 细胞核中 其余肝胰腺细胞中均无 $ 阳性 ' 大颚器腺细胞中的 $ 阳性仅发现于 期腺细胞胞质中 各期 ; 器官腺细胞中均呈 $ 阴性 & 就视神经节而言 $ 主要存在于 期的神经细胞 就胸神经团而言 期神经细胞中的 $ 阳性呈增强趋势 而 期神经髓质中 $ 始终呈 $ 强阳性 结果表明 孕酮不仅可以通过与卵巢和肝胰腺中 $ 结合直接调控三疣梭子蟹的卵黄发生和卵巢发育 还可能通过影响其它内分泌激素的合成和分泌来间接调控其卵巢发育 关键词 三疣梭子蟹 孕激素受体 免疫印迹 免疫组织化学 卵巢发育中图分类号 & "'######## 文献标志码 ## 孕酮 *,!+(+,0+ 是甲壳动物体内一种重 " $ 要性类固醇激素 在其卵巢发育过程中起着十分重要的调控作用 因此甲壳动物体内孕酮含量变化与其卵巢发育阶段具有一定的相关 性 $& 进一步研究表明 一定量的外源孕酮对甲壳动物雌体的卵巢发育 卵母细胞发育 卵黄发 % 生和产卵具有促进作用 $ 但是有关其作用机 制所知甚少 因此 孕酮对甲壳动物卵巢发育的调控机制已成为无脊椎动物生殖生物学研究的 热点和难点之一 $"! 通过免疫组化方法已经确认拟穴青蟹 +#! 和欧洲淡水螯虾 & % 等甲壳动物卵 "! $" 巢 肝胰腺和神经组织中存在孕激素受体 故推测孕酮对甲壳动物卵巢发育的调控主要是通过孕激素受体进行 " 三疣梭子蟹! % 是一种重要的大型经济蟹类 "' 其体内的孕酮含量与卵巢发育阶段密切相关 "& 实验采用免疫印迹和免疫组化方法对三疣梭子蟹雌体的孕激素受体进行了免疫识别和定位 并系统研究了卵巢发育周期内卵巢 肝胰腺 大颚器 ; 器官 视神经节和胸神经团中 $ 的分布与变化 旨在进一步认识三疣梭子蟹的生殖生理规律 为探讨甲壳动物性类固醇激素的调控机制提供基础资料 "# 材料与方法 实验动物与暂养实验用蟹于!"! 年 月至!"" 年 & 月购自浙江象山渔港捕捞船 每月挑选肢体健全的雌体 "!! 只用于实验 体质量为 % '%! 甲壳宽为 &" "!& ' 所有实验用蟹活体运输到上海海洋大学水产动物营养繁殖研究室 在室内循 收稿日期!"%! %!&### 修回日期!"%!'%! 资助项目 国家自然科学基金项目 '" %"& 上海市自然科学基金项目 " 8"'"!!! 上海高校创新团队项目 沪教科!! $ % 上海高校知识服务平台 8"!% 通信作者 成永旭 %'.9+0!9 +- 0

2 ### ""' 水 # 产 # 学 # 报 卷 环水系统中暂养两周 暂养水族箱体积为 " 长 + 宽 + 高为 & ' +& ' +'& ' 加水至 "&! 箱底部放置无毒 $ 管 直径 " ' 长 & ' 作为隐蔽物 每箱放只蟹 暂养期间每日下午 "!! 按照蟹体质量的 &"! 投喂鱿鱼 次日上午 "! 点清理残饵和粪便 自然光照 盐度为 ' 水温! ' *!! 溶氧 *& '! # 氨氮 (!& '! # 亚硝酸盐 (!"! '! # 实验用成年雌性小鼠卵巢由复旦大学生命科学学院赠与 实验取样与卵巢分期 实验用蟹暂养后进行活体解剖 解剖前先用电子天平对蟹称重 解剖时分离出所有卵巢组织 准确称量并记录卵巢颜色 计算卵巢指数 1# "!! + 卵巢质量 # 蟹质量 同时取小块卵巢 肝胰腺 大颚器 ; 器官 视神经节 胸神经团和肌肉 在 $& 中漂洗后放入 & 0 氏液固 "' 定 根据吴旭干等的方法将三疣梭子蟹卵巢发育分为 & 期 各卵巢发育期均重复固定 & 个体的组织进行免疫组化研究 样品在 & 0 氏液中固定 ' 9 后进行酒精梯度脱水 二甲苯透明 石蜡包埋后常规切片 厚度 & ' 用于免疫组化分析 同时取卵巢处于 期雌体的视神经节和肌肉组织以及成年雌性小鼠卵巢!"! 左右 加入 " ' 蛋白提取液 产品编号!"!"%! 武汉博士德生物工程有限公司 提取蛋白 提取方法按照试剂盒说明书进行 蛋白提取液离心后采用微量紫外分光光度计 型号 &!!! 美国 + 公司生产 测定蛋白浓度 样品于 $! 保存 用于免疫印记分析 主要试剂 免疫印迹试剂 ## 一抗为兔抗人 $ 多克隆抗体 抗 % 末端 产品编号 %& 购于美国 0(,2 生物公司 全蛋白提取试剂盒!"!"%! 彩色预染标准蛋白 """ $ "" &!" 二抗 $ 标记的羊抗兔!1 抗体 &"!&' 上样缓冲液 """ "& 显色试剂盒 "! " 均购于武汉博士德生物工程有限公司 免疫组化试剂 # # 一抗同免疫印迹 二抗 $ 标记的羊抗兔!1 抗体工作液 $%!!" 和一抗稀释液 8%! 购于北京中杉金桥生物技术公司 双氧水 ""! "& 显色试剂盒 "!!!" '# 枸橼酸盐缓冲液 * %! 产品编号!! ' 以及!!" '#$& 缓冲液 * % 产品编号!!! 购于武汉博士德生物工程有限公司 ( 免疫印迹将蛋白提取物与上样缓冲液按 '," 体积比 混合后沸水变性 "! '0 分别取样品和标准蛋白! 及 & 进行 "%$1 电泳 浓缩胶浓度为 & 电压为 "!! 分离胶浓度为 "! 电压为 ""! 电泳后分离胶用转膜仪 型号 &1%%0 北京百晶生物技术有限公司生产 在 "&! ' 电流下转膜! "!! '0 然后将膜用 & 浸洗后置于 & 的脱脂奶粉溶液中 在室温下用脱色摇床上摇动封闭 " 9 用 & 浸洗后 加入一抗 体积比 ",!! ' 下摇床孵育 " 9 & 浸洗 二抗 体积比 ",&!! 室温下孵育 9& 浸洗 "& 显色 数码相机拍照后采用 &- '!+)! 软件计算 $ 分子量 9 免疫组织化学石蜡切片常规脱蜡至水后 浸入枸橼酸盐缓冲液中用电磁炉加热 ' 进行抗原修复 "& '0 自然冷却至室温后取出切片用 $& 洗涤 次 & '0 # 次 再用 双氧水室温处理! '0 以抑制内源性过氧化物酶的活性 $& 洗涤 次 & '0 # 次 后滴加 $ 抗体 稀释体积比 ",&! ' 孵育过夜 " 9 $& 洗 次后 & '0 # 次 滴加二抗工作液 条件下孵育! '0 "& 显色 "& '0 蒸馏水洗涤后采用酒精梯度脱水 二甲苯透明 中性树胶封片后在 +" &!! 显微镜下观察和拍照 根据染色的深浅 将阳性强弱分为强阳性 中等阳性 弱阳性和阴性 分别记为 和 $ # 结果 的免疫印迹采用兔抗人的孕激素受体 $ 多克隆抗体进行三疣梭子蟹雌体 $ 的免疫印迹实验 图 " 在分子量约为 "!! 3 处得到一条免疫阳性条带 采用牛血清蛋白和梭子蟹肌肉作为同步对照 结果为阴性 采用成年雌性小鼠卵巢作为阳性对照 在大约! 3 处得到一条免疫阳性条带

3 期陈 # 浩 等 三疣梭子蟹卵巢发育期间孕激素受体的免疫识别与分布 ""& ## 图 三疣梭子蟹视神经节和肌肉的 免疫印迹分析 ',3!2& '!, &%'",!,&'!# $ "&'!*'!, ( 在卵巢中分布和变化 $ 主要分布于三疣梭子蟹卵巢中的滤泡细胞 早期卵母细胞细胞质 期 和后期卵母细胞核 期 不同卵巢发育期卵巢中的 $ 分布和阳性强度也有所不同 表 " 期卵巢中以卵原细胞为主 生发区间可见大量滤泡细胞 此时滤泡细胞和卵原细胞质均呈 $ 强阳性 卵原细胞核呈 $ 弱阳性 图版 %" 期卵巢中以内源性卵黄合成期卵母细胞 和卵黄合成前卵母细胞 $ 为主 生发区间的滤泡细胞 已开始向生发区内迁移 部分已分布于卵母细胞周围 此时 $ 的阳性反应定位于卵母细胞的胞质及滤泡细胞 图版 % 卵母细胞核 $ 阳性较弱 表 " 期卵巢中以外源性卵母细胞 为主 此时滤泡细胞已完成对卵母细胞的包裹 有时生发区中心仍可见少量 此阶段 $ 阳性物质主要分布于 细胞质 核仁及 的核仁 图版 %' 此阶段的滤泡细胞仍呈 $ 强阳性 图版 %') 但 的细胞质 $ 阳性较弱 期卵巢中以近成熟期卵母细胞 为主 滤泡细胞紧贴在 周围 此时卵母细胞的胞核 图版 %& 以及胞膜中的滤泡细胞均呈 $ 强阳性 图版 %& 期卵巢中主要为成熟的卵母细胞 此时 $ 免疫阳性反应主要在成熟卵母细胞的胞核 此外胞膜也有较弱的 $ 阳性反应 图版 % 用卵巢发育 期的三疣梭子蟹肌肉作为阴性对照 没有发现任何 $ 阳性反应 图版 % 在肝胰腺中分布和变化三疣梭子蟹雌体肝胰腺由许多具有盲端的肝小管组成 肝小管主要由胚细胞 泡状细胞 & 吸收细胞 和纤维细胞 这 ' 种上皮细胞构成 $ 免疫阳性反应主要分布于 细胞胞质 细胞核及 细胞核 表 " 图版 中 "% & 期肝胰腺中仅 细胞呈 $ 强阳性 图版 %" 期肝胰腺 细胞为 $ 强阳性 其余细胞均为 $ 阴性 图版 % 期肝胰腺 细胞和 细胞核均为 $ 中等阳性 图版 % 期肝胰腺仅 细胞呈 $ 中等阳性 图版 %' 期肝胰腺也仅 细胞呈 $ 中等阳性 图版 % & 卵巢分期 7,0 (!+ 表 三疣梭子蟹卵巢发育期间卵巢和肝胰腺细胞中的 分布和变化 *#'' '!!#"*!, '!*+!#*%%!" # '!, *'!#&%$!( 细胞类型 +,(.*+ 滤泡细胞 5 ++ 生殖细胞细胞质.(*' 5!+,' 生殖细胞核 0 +5!+,' 细胞核 0 +5,+,*(7++ 细胞细胞质和核.(*' ),,+ $ $ $ $ $ $ 注 表示强阳性 表示中等阳性 表示弱阳性 $ 表示阴性 以下注释同此 (+ '+0(,0!. *(7+ '+0'-+,(+. *(7+ '+0+3. *(7+ $ '+00+!(7+9+'+(9+ 5 0!

4 ### ""% 水 # 产 # 学 # 报 卷 ( 在大颚器和 器官中的分布和变化大颚器和 ; 器官是三疣梭子蟹两种重要的生殖内分泌器官 其细胞中的 $ 阳性在不同卵巢发育阶段也有一定程度的变化 大颚器由许多小叶组成 小叶内大颚器腺细胞排列紧密 细胞核大而圆 卵巢发育过程中 $ 阳性物质仅出现在 期大颚器腺细胞胞核周围的胞质 图版 % 为 $ 强阳性 ; 器官由许多不规则的小叶组成 在小叶间隙和小叶内部均有血管 血窦 和血细胞 + ; 器官腺细胞排列紧密 核呈卵圆形 核仁不明显 $ 阳性仅见 ; 器官内的血细胞 表 图版 % 表 三疣梭子蟹卵巢发育期间大颚器 器官和神经组织中的 分布和变化 *#'' '!!#"*!, '!*$!#' &,!2,!!#! '# '!, *'!#&%$!( 器官类型,!0(.*+ 卵巢分期 7,0 (!+ 大颚器腺细胞!0- +5 '0-),,!0 ; 器官 ;%,!0 腺细胞血细胞! '.(+ 视神经节 *(!0! 神经细胞 0+,7++ 胸神经团 (9,!0!0 ' 神经细胞神经髓质 0+,7++ 0+,7+'+- $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ $ 9 在视神经节和胸神经团中的分布和变化 三疣梭子蟹视神经节由视神经层 视外髓 视内髓和视端髓组成 $ 免疫阳性物质主要出现于卵巢 期的神经细胞的细胞核中 图版 % """ " 而 期神经细胞没有 $ 阳性反应 表 图版 %"! 胸神经团由食道下神经节 胸神经节和腹神经节愈合而成 卵巢发育 期 胸神经团的细胞质和神经髓质均呈 $ 阳性 图版 "'%" 其中神经细胞胞质的 $ 阳性在卵巢 期呈增强趋势 而在 期胸神经团的神经髓质中始终呈 $ 强阳性 表 # 讨论 的种类及分子量 实验采用兔抗人的 $ 多克隆抗体进行免疫印迹 +(+,0%) (0! 实验 在三疣梭子蟹视神经节内仅发现一个 $ 免疫条带 这与拟穴青蟹 "! 欧洲淡水螯虾 & % "" 和章鱼 1$ "% 等无脊椎动物的研究结果基本一致 在人类和鸡等脊椎动物中通常存在 个 $ 是由于同一基因可变剪切后转录和翻译生成的不同分子量的 $ " $" 这些 $ 的生理功能也有所不同 " 实验结果表明 三疣梭子蟹视神经节中 $ 的分子量为 "!! 3 左右 这高于拟穴青蟹和欧洲淡水 螯虾的 $ 分子量 前后两者分别是! 与! 3 "! $"" 分布及变化与卵巢发育的关系研究表明 三疣梭子蟹卵巢发育过程中卵巢 肝胰腺和血淋巴中均存在孕酮 且在卵巢发育早期 期 肝胰腺和卵巢中的孕酮含量较高 "& 由于孕酮只有与其受体结合才能发挥生理 调控作用! 这暗示三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中可能存在孕激素受体来调控卵巢发育及卵黄发生 实验结果表明 三疣梭子蟹卵巢发育过程中滤泡细胞和生殖细胞核中始终存在孕激素受体 且卵母细胞核中的 $ 阳性在卵巢发育中后期 期 呈增强趋势 但卵母细胞细胞质中后期 和 期 不存在 $ 而滤泡细胞中的 $ 阳性始终较强 没有随着卵巢发育而发生变化 造成这种变化的原因有 " 滤泡细胞可能是甲壳 动物孕激素的主要合成场所之一 " 由于孕激素的诱导导致滤泡细胞中大量表达产生 $ 卵巢发育早期卵巢中的孕激素和 $ 结合后促进卵原细胞到卵母细胞分化和早期卵黄合成 '"" 三疣梭子蟹雌体后期卵巢中的孕酮含量相对较低是由于卵母细胞体积增大所致 实际上卵巢发育后期滤泡细胞仍然需要大量合成孕酮来促进卵母细胞最 % 终成熟和排卵 因此 三疣梭子蟹卵巢发育过程中雌体滤泡细胞中均存在较高含量的孕酮和

5 期陈 # 浩 等 三疣梭子蟹卵巢发育期间孕激素受体的免疫识别与分布 "" ## $ 卵巢发育后期 期 卵母细胞质中的孕酮已经和 $ 结合后从卵母细胞细胞质迁 $ 移到细胞核上 & 因此三疣梭子蟹卵巢发育后期卵母细胞核上存在较强的 $ 阳性 三疣梭子蟹卵巢发育后期卵黄蛋白原! 主要是由肝胰腺合成 最后在卵巢中加工成卵黄磷蛋白 0 % $ 因此 三疣梭子蟹卵巢发育后期卵母细胞质中的 $ 阳性较弱 因此孕酮和 $ 主要作 " 用于甲壳动物早期卵黄合成 肝胰腺不仅是甲壳动物营养物质的消化吸收和储存器官 且对甲壳动物生殖内分泌具有极其 重要的作用 % 三疣梭子蟹卵巢发育期间 肝胰腺中一直具有较高含量的孕酮 "& 且卵巢发育中后期 期 肝胰腺是卵黄蛋白原! 的重 要合成场所 实验结果表明 各期肝胰腺 细胞胞质和细胞核中均存在 $ 阳性物质 这可能 与肝胰腺是孕酮的合成部位之一有关 孕酮与 $ 结合后不仅可以调控卵原细胞分化和卵黄合 " 成 % 且可以促进生发泡破裂和产卵 大颚器是甲壳动物特有的内分泌器官 在卵巢发育过程中的主要功能是合成和分泌甲基法尼酯 '+(9.5,0+(+ 调节卵巢发育 实验首次发现三疣梭子蟹大颚器中存在 $ 这暗示孕酮可能通过影响 的合成来调控甲壳动物卵巢发育 有研究表明过量的孕酮会抑制克氏原螯虾大颚器中的 合成! 先前对甲壳动物大颚器的研究表明 大颚器具有粗面内质网结构 可能可以分泌孕酮等类固醇激素 这些类固醇激素和! 可能存在反馈机制 $" 三疣梭子蟹卵巢 发育期间 ; 器官呈退化的非分泌状态 故 ; 器官腺细胞中没有发现 $ 阳性物质 这暗示 ; 器官可能不是孕酮的作用靶器官 视神经节与胸神经团都是甲壳动物重要的神经内分泌器官 它们可以分泌多种神经激素调控甲壳动物性腺发 育 $' 三疣梭子蟹视神经节与胸神经团中均存在 $ 阳性反应 这暗示 $ 可能参与三疣梭子蟹雌体卵巢发育的神经内分泌的生理调控 孕激素及 对卵巢发育的作用机制大量研究表明 孕激素对脊椎动物的卵巢发育和卵黄发生存在两种作用模式 基因组模式 和非基因组模式 所谓基因组作用模式就是孕激素与细胞内孕激素受体蛋白结合形成复合体转移至细胞核 通过与细胞核中靶基因上游的孕 激素反应元件 $ 结合直接调控肝胰腺和卵巢中! 基因或其它相关基因的表达 从而影响卵细胞发生和卵巢发育 这种孕激素受体称之为核受体 0$ & 非基因组作用模式也称为膜受体作用模式 是指孕激素通过与细胞膜上孕激素受体蛋白结合后 在几分甚至几秒内直接激活细胞内的信号通路 如改变细胞内的 $ $ 和 等第二信使的浓度 从而改变细胞内蛋白功能和调控基因表达 最终影响卵巢发育 这种孕激素受体称之为膜受体 '$ % 孕酮是一种生物活性较强的天然孕激素 在动物体类固醇代谢中起着关键的呈上启下作用 因此 孕酮对动物生殖的调控引起了广泛的关注 $'" 有关孕酮对甲壳动物卵巢发育的调控研究主要集中于外源孕酮对其卵巢发育和卵黄发生的影 " ' 响 有关其作用机理的研究极少 近年来 采用免疫组化方法已经确认拟穴青蟹和淡水螯虾等甲壳动物体卵巢和肝胰腺中存在孕激素核受体蛋白 0$ "" " 实验结果表明 0$ 在三疣梭子蟹卵巢 肝胰腺 大颚器 ; 器官和神经组织中广泛存在 且随着卵巢发育 0$ 的阳性强弱发生一定的变化 这暗示三疣梭子蟹卵巢发育过程中 0$ 起着重要的调节作用 最近 斑节对虾 %!%!! 的孕激素膜受体基因 $'% * 已经被克隆 且该蛋白在卵巢发育二期表达水平最高 " 因此 推测孕激素对甲壳动物的卵巢发育的调控也存在基因组作用模式和非基因组作用模式两种方式 实验结果表明 三疣梭子蟹孕激素核受体也存在于大颚器和神经组织中 这暗示三疣梭子蟹 0$ 可能通过调控神经多肽和甲基法尼酯等激素的合成与释放来间接调控卵巢发育 类似的现象在鱼类中已经被证实 ' 参考文献 " #50( (9+ (+,- 0 6 ( 07+,(+),(+ (!.!! "% " "! $"! #<9+, /9,0! %+ (+,-,++*(, +7(0 0-!00! 0 6 ( 07+,(+),(+ (!.!! "% " "" $"' # 0( ;'9,%$,5+5 *,!+(+,0+%0- +(,-%3+ )(0+ 0 (9+ 9+'.'*9 55+'+!/%%-,0! 0

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