642 上海海洋大学学报 25 卷本研究中我们利用 RACE 技术获得了克氏原螯虾 UBE2r 基因的序列全长, 结合 qrt PCR 技术和原位杂交技术, 对克氏原螯虾 UBE2r 基因在不同组织及性腺发育过程中的表达情况进行研究通过 Fmoc 法合成多肽 C SDNDIDDGDDSGNGES

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1 文章编号 : (2016) DOI: /jsou 克氏原螯虾泛素结合酶 E2r 基因的克隆及表达分析钱照君, 祝天谅, 姜虎成, 石宝通, 李家乐 (1. 上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 ;2. 江苏省淡水水产研究所, 江苏南京 ) 摘要 : 为了解泛素结合酶 E2r 基因在克氏原螯虾性腺发育中的作用, 利用 RACE 技术得到了 cdna 全序列, 命名为 Pc UBE2r 该基因序列全长为 3671bp, 包含泛素结合酶的特有结构域, 以及半胱氨酸残基活化位点开放阅读框为 729bp, 编码 242 个氨基酸, 预测蛋白分子量约为 27.6ku BLAST 比对发现, 克氏原螯虾 UBE2r 基因与节肢动物 UBE2r 基因具有较高的同源性系统进化分析表明,Pc UBE2r 基因与日本囊对虾聚为一枝 qrt PCR 研究表明,Pc UBE2r 基因在性腺中的表达量显著高于其他组织 (P<0.05) 在卵巢中,Pc UBE2r 基因的表达量在未发育期最低, 在卵黄发生前期表达量快速增长, 随后表达量逐渐降低在精巢中, Pc UBE2r 基因的表达量在精母细胞发生期达到最高水平组织原位杂交结果显示,Pc UBE2r 基因在卵巢中均匀分布在未发育期的卵母细胞细胞质中, 随后逐渐迁移到卵母细胞细胞核以及滤泡细胞周围在精巢中, Pc UBE2r 基因主要分布在精母细胞的周围组织总蛋白 Westernblot 检测发现,UBE2r 蛋白在精巢和卵巢中的表达量也显著高于其他组织 (P<0.05) 综上所述, 我们推测 Pc UBE2r 基因在克氏原螯虾配子发生和性腺发育方面发挥了重要作用, 本研究将为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据关键词 : 泛素结合酶 E2r; 性腺 ; 原位杂交 ;Westernblot; 克氏原螯虾中图分类号 :S917 文献标志码 :A 克氏原螯虾 (Procambarusclarki) 又名小龙虾, 原产于美国中南部以及墨西哥东北部 [1], 因其味道鲜美和营养丰富, 已成为我国重要的水产养殖物种之一 [2-3] 近年来, 国内外克氏原螯虾的消费需求量快速增长 [4-6], 优质苗种的缺乏在一定程度上约束了克氏原螯虾养殖产业的发展性腺发育是甲壳动物进行有性生殖的基础, 对于克氏原螯虾性腺发育的研究, 将有助于推动克氏原螯虾养殖产业的发展目前, 有关克氏原螯虾性腺发育的研究, 主要集中在性腺组织结构及发育分期方面, 在分子水平上研究性腺发育机制尚显不足因此, 在分子水平上研究其参与性腺发育机制的调节具有重要意义泛素化途径是生物体内一种高效率和高选择性的蛋白降解途径泛素化途径参与许多细胞过程, 如细胞周期的调控细胞信号转导发育与分化和物质代谢等 [7-9] 泛素结合酶 UBE2r (ubiquitin conjugatinge2r,ube2r) 是泛素化途径中重要的泛素结合酶之一, 由蛋白激酶 Ck2 磷酸化形成近年来,UBE2r 已先后从酵母爪蟾和人类等生物中被成功分离出来研究发现 UBE2r 在酿酒酵母细胞 G1 S 过渡期的调节中是必不可少的, 是细胞周期的一种抑制剂 [10] [11] YEW 等研究发现 UBE2r 基因在非洲爪蟾的卵中具有调节 Cdk2 cycline 启动的功能 [12] REYMOND 等研究显示,UBE2r 基因在人类细胞周期中, 参与细胞核和细胞质的迁移, 同时也 [13] 在有丝分裂后期发挥作用 PATI 等报道, 无论在减数分裂还是有丝分裂细胞周期中,UBE2r 基因可能对 camp 诱导基因调控具有影响沈冰 [14] 玲等对日本囊对虾的研究发现,UBE2r 基因在性腺中高表达, 且在性腺发育各时期表达存在显著差异, 推测其在精子和卵子发生中发挥了重要作用收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 上海工程技术中心能力提升项目 (13DZ ); 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心项目 (ZF1206) 作者简介 : 钱照君 (1986 ), 男, 硕士研究生, 研究方向为水产动物种质资源与遗传育种 E mail:zhaojunqian1216@163.com 通信作者 : 李家乐,E mail:jli@shou.edu.cn

2 642 上海海洋大学学报 25 卷本研究中我们利用 RACE 技术获得了克氏原螯虾 UBE2r 基因的序列全长, 结合 qrt PCR 技术和原位杂交技术, 对克氏原螯虾 UBE2r 基因在不同组织及性腺发育过程中的表达情况进行研究通过 Fmoc 法合成多肽 C SDNDIDDGDDSGNGES NH2, 制备人工抗体, 并利用 Westernblot 技术进一步验证其在蛋白层面的表达情况本研究旨在为进一步探讨克氏原螯虾 UBE2r 基因的功能提供基础资料 1 材料与方法 1.1 实验材料实验用克氏原螯虾于 2015 年采自江苏盱眙满江红龙虾产业园有限公司克氏原螯虾于实验室暂养 72h, 经低温麻醉后, 活体解剖收集眼柄鳃肝胰腺心脏肠肌肉精巢和卵巢组织样品基于克氏原螯虾卵巢的外部形态颜色和组织学特征 [15] [16], 参照李胜等对克氏原螯虾卵巢的分期方法, 将卵巢分为 6 个时期 : 未发育期 (O1) 发育早期 (O2) 卵黄发生前期 (O3) 卵黄发生期 (O4) 成熟期 (O5) 和恢复期 (O6) 参 [17] 照黄文虎等对精巢的分期方法, 将克氏原螯虾精巢分为 3 个时期 : 精原细胞增殖期 (T1) 精母细胞发生期 (T2) 和精子细胞生成期 (T3) 从 9 个不同个体中分别取出各组织, 等量混匀后液氮速冻,-80 超低温保存, 以备后续实验使用用于原位杂交和组织学观察的组织, 用 4% 多聚甲醛处理后, 再经甲醇处理,-20 保存用于 Westernblot 检测的组织经 DEPC 处理水清洗后立即投入液氮中,-80 保存 1.2 实验方法使用 TRIzol 法提取各组织的总 mrna, 经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop2000 分光光度计检测合格后, 置于 -80 冰箱保存备用基 [18] 于已构建的克氏原螯虾性腺转录组文库中 UBE2r 基因的部分序列, 利用 Primers5.0 [19] 设计短片段引物 F1 R1( 表 1) 进行目的片段扩增按照 SMARTer TM RACEcDNAAmplification 试剂盒 (Clontech, 美国 ) 说明书进行反转录, 以 SMART cdna 为扩增模板, 使用试剂盒自带的 UPM 引物与基因特异性引物, 分别进行 3 RACE 和 5 RACE 扩增反应体系为 :41.5μLMasterMix;2.5μL cdna 模板 ;5μL10 UniversalPrimerAMix;1 μlgsp F2( 或 GSP R2) 扩增程序为:94 变性 30s;72 退火 3min,5 个循环 ;94 变性 30 s 70 退火 30s 72 延伸 3min,5 个循环 ;94 变性 30s 68 退火 30s 72 延伸 3min,25 个循环采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 天根, 中国 ) 切胶回收 3 RACE 产物及 5 RACE 产物, 将 PCR 产物纯化后连接到 Pgem TEasy 载体上, 转化到感受态细胞 E.coliDH5α 中, 经蓝白斑筛选后挑选阳性克隆进行测序, 实验中所用的引物及测序均由上海生工工程有限公司完成引物名称 primername F1 R1 表 1 实验引物及序列 Tab.1 Theprimersandsequencesusedinthisexperiments GGACAAAAAAGGATGGCTA CGTGGGTGCGTGAGAGTTA 引物序列 sequence(5-3 ) 短片段扩增 GSP F2 TGGCGACGACAGTGGTAATG 3 RACE GSP R2 CGTGGGTGCGTGAGAGTTA 5 RACE RT F3 RT R3 UPM(long) UPM(short) EIF F EIF R AGAGGGACAAAAAAGGATGGC GTTGAGGAGCTTGACGCAGA CTAATACGACTCACTATAGGGCAAG CAGTGGTATCAACGCAGAGT CTAATACGACTCACTATAGGGC GGAATAAGGGGACGAAGACC GCAAACACACGCTGGGAT 荧光定量扩增用途 amplificationtarget 3 RACE 及 5 RACE 荧光定量 1.3 生物信息学分析与系统进化树构建采用 NCBI 在线分析工具 ORF Finder (htp:// 对所得到的序列进行开放阅读框和氨基酸预测, 并对编码蛋白的各种基本理化特性进行预测在

3 5 期钱照君, 等 : 克氏原螯虾泛素结合酶 E2r 基因的克隆及表达分析 643 线 BLAST 其他物种的 UBE2r 基因序列, 结合 BioEdit [20] 软件对基因序列进行多重比对, 用 MEGA4.0 [21] 软件构建 NJ 系统进化树 1.4 Pc UBE2r 基因的表达分析分别以克氏原螯虾眼柄鳃肝胰腺心脏肠道肌肉精巢和卵巢 8 个组织总 RNA 为模板, 以及精巢发育的 3 个时期和卵巢发育的 6 个时期的组织总 RNA 为模板, 使用 PrimeScriptRT reagentkit 试剂盒 (TaKaRa, 日本 ) 合成用于 RT PCR 反应的 cdna, 定量引物为 :RT F3 RT R3 ( 表 1) 选择在克氏原螯虾各组织中可稳定表达的内参基因 EIF 来校正基因的表达量 [22] 实时定量 PCR 反应按照 SYBR PremixExTaq TM Ⅱ(Tli RnaseH Plus) 试剂盒 (TaKaRa, 日本 ) 说明书进行,PCR 反应体系 :12.5μL2 SYBRGreenqRT PCRtimePCRMasterMix;0.5μLRT F3;0.5μL RT R3;2μL cdna;9.5μl RNzse/DNasefree ddh 2 O 其中每个样品的目的基因和内参基因分别进行 4 次技术重复 PCR 反应的扩增程序为 : 95 30s;95 10s,60 30s,40 个循环采用 2 ΔΔCt [23] 法计算 Pc UBE2r 基因在不同组织以及性腺发育不同时期的相对表达量应用 SPSS [24] 18.0 软件对各数据进行单因素方差分析 (ANOVA), 并进行显著性分析 (P<0.01) 所有图片采用 SigmaPlot12.5 [25] 软件绘制 1.5 原位杂交石蜡切片经常规脱蜡, 经 3%H 2 O 2 室温处理 10min 以灭活内源性过氧化物酶, 蒸馏水洗涤 2 次切片上滴加 3% 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37 或室温消化 3~30min,0.5mol/LPBS 洗 3 次 5min, 蒸馏水洗 1 次按每张切片 20 μl 加预杂交液, 恒温箱 37~40 放置 2~4h 用杂交液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针, 每张切片上加 20μL 杂交液, 恒温箱 37~40 杂交过夜 30~37 左右 2 SSC 洗涤 2 次, 每次 5 min;0.5 SSC 洗涤 15min;0.2 SSC 洗涤 15 min 恒温箱 37 放置 30min 后, 滴加生物素化鼠抗地高辛, 于恒温箱 37 放置 60min 后, 用 0.5mol/L 的 PBS 清洗 4 次, 每次 5min 滴加 SABC, 室温放置 30min 后, 用 0.5mol/L 的 PBS 清洗 3 次, 每次 5min 使用 DAB 显色试剂盒进行显色后, 显微镜下观察并拍照 1.6 Westernblot 检测对提取的各组织蛋白进行 SDS PAGE 电泳, 用制备的 UBE2r 多克隆抗体作为一抗, 对克氏原螯虾各组织蛋白进行 Westernblot 检测电泳时每个上样孔加变性后的上样液 40μg, 留一孔加 10μL 预染的 Marker 先用 70V 恒压电泳, 约 30 min, 后改用 90V 恒压电泳转印蛋白及免疫检测 :200mA 恒流转膜 70min 转膜结束后, 快速取出 PVDF 膜, 放入 5%BSA 室温封闭 2h 取出膜, 于摇床上用 TBST 洗膜 5min 3 次孵育袋中加入封闭液稀释的 UBE2r 抗体 (1 1000),β actin(boster1 2000),4 孵育过夜 TBST 洗膜 5min 3 次, 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗兔二抗 (Jackson1 2000) 和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗小鼠二抗 (Jackson1 2000) 室温孵育 2h 膜于化学发光检测试剂( 试剂 A 试剂 B=1 1) 反应 2min, 取出膜, 用保鲜膜包好 PVDF 膜, 暗室中用 X 胶片感光显影定影 2 结果 2.1 Pc UBE2r 基因序列分析 Pc UBE2r 基因序列全长 3671bp(GenBank 登录号 :KX091172), 包括 554bp 的 5 端非编码区 (5 UTR) 729bp 的开放阅读框 (openreading frame,orf) 和 2389bp 的 3 端非编码区 (3 UTR), 在 3 UTR 有典型的加尾信号 AATAA 该序列可编码 242 个氨基酸, 预测分子量大小为 27.6ku, 等电点为 4.17 UBE2r 蛋白的 82~97 位氨基酸序列为泛素结合酶家族特有的一个结构域, 且在该区域存在一个半胱氨酸残基 (Cys94) 活化位点 2.2 多序列比对及系统进化分析经 BLAST 比对发现,Pc UBE2r 与节肢动物 UBE2r 的序列同源性较高 ( 图 1), 与日本囊对虾 (Marsupenaeusjaponicus,ACA )UBE2r 基因的同源性为 97%, 与二疣犀甲 (Oryctes borbonicus, KRT ) 美洲鲎 (Limulus polyphemus, XP ) 和黄翅菜叶蜂 (Athaliarosae,XP ) 的一致性分别为 85% 76% 和 78% 采用邻接法 (Neighbor joining,nj) 构建系统进化树,Pc UBE2r 先与日本囊对虾聚为一枝, 再与其他节肢动物聚为一大枝

上６４４海海洋图２鸟类两栖类和哺乳类等脊椎动物单独聚大学学报２５卷为一枝结果与各物种的进化关系保持一致图ＰＵＢＥ２和其他物种ＵＢＥ２氨基酸序列多重比较ＦＡｍｆｈｍｄｑｆｄｆｆＵＢＥ２Ａ黄翅菜叶蜂Ｃ杜鹃Ｌｈｍ美洲鲎Ｍｊ日本囊对虾Ｍｈ草原田鼠Ｏ二疣犀甲Ｈ人类Ｘ非洲爪蟾Ｐｋ克氏原螯虾Ｂ

4 上６４４海海洋图２鸟类两栖类和哺乳类等脊椎动物单独聚大学学报２５卷为一枝结果与各物种的进化关系保持一致图ＰＵＢＥ２和其他物种ＵＢＥ２氨基酸序列多重比较ＦＡｍｆｈｍｄｑｆｄｆｆＵＢＥ２Ａ黄翅菜叶蜂Ｃ杜鹃Ｌｈｍ美洲鲎Ｍｊ日本囊对虾Ｍｈ草原田鼠Ｏ二疣犀甲Ｈ人类Ｘ非洲爪蟾Ｐｋ克氏原螯虾Ｂｋ登录号ＴｈＧＢｋｌｍｆｍｄｑ黄翅菜叶蜂ＡｈＸＰ０２２５３７４３杜鹃所有氨基酸序列ＧＣＸＰ０４３９４４６美洲鲎ＬｍｈｍＸＰ０３７８３７５７日本囊对虾ＭｊＡＣＡ０９７７草原田鼠ＭｈＸＰ００５３６２０６３二疣犀甲ＯＫＲＴ８２３９５人类ＨｍＮＰ００４３５０非洲爪蟾ＸＡＡＩ２４０４７２３ＰＵＢＥ２基因的表达特征ｑｒｔＰＣＲ结果显示ＰＵＢＥ２基因在克氏原螯虾各组织中均有表达图３其中眼鳃肝胰腺心脏肠和肌肉组织中的表达量较低在性腺中显著高于其他组织Ｐ００５如图４所示ＰＵＢＥ２基因在克氏原螯虾卵黄发生前期Ｏ３表达量最高在未发育时期表达量最低在图２ＰＵＢＥ２和其他物种ＵＢＥ２氨基酸序列系统进化分析Ｆ２Ｐｈｆｈｕｂｅ２ｍｄｑｗＰｋｄｈＵＢＥ２的表达量开始逐渐减卵黄发生期以后Ｐ少在精巢发育的不同时期中在精母细胞发生期Ｔ２期中的表达量开始升高且显著高于其他时期Ｐ００５在精子细胞生成期阶段Ｔ３期表达量显著降低图４

5 5 期钱照君, 等 : 克氏原螯虾泛素结合酶 E2r 基因的克隆及表达分析 645 图 3 Pc UBE2r 基因在不同组织间的表达特征 Fig.3 DistributionpaternofPc UBE2rinvarioustisues 柱状图上标注的星号表示 Pc UBE2r 的表达量在精巢和卵巢中显著高于其他组织 (P<0.05) TheasteriskonthehistogramindicatesthattheexpresionofPc UBE2rintestesandovariesweresignificantlyhigherthanothertisues(P< 0.05). 2.4 原位杂交检测原位杂交结果显示, 卵巢未发育期 (O1 期 ), Pc UBE2r 的阳性信号均匀地分散在细胞质中随着卵巢的逐渐发育, 在卵巢发育早期 (O2 期 ) 中, 阳性信号逐渐迁移到细胞核的周围在卵黄发生前期 (O3 期 ) 和卵黄发生期 (O4 期 ), 阳性信号始终集中在细胞核的周围在卵母发育成熟期 (O5 期 ) 的细胞中, 阳性信号逐渐迁移到滤泡细胞周围当亲虾排完卵, 卵巢进入恢复期 (O6 期 ), 阳性信号也逐渐消失 ( 图版 Ⅰ) 在精原细胞增殖期 (T1) 和精子形成期 (T3),Pc UBE2r 的阳性信号在精原细胞精子细胞中分布很少或者没有分布而在精母细胞发生期 (T2), 阳性信号主要分布在初级精母细胞的周围 ( 图版 Ⅱ) 图 4 Pc UBE2r 基因在性腺不同发育时期的表达 Fig.4 TheexpresionofPc UBE2rduringgonaddevelopmentalstage O1. 未发育期 ;O2. 发育早期 ;O3. 卵黄发生前期 ;O4. 卵黄发生期 ;O5. 成熟期 ;O6. 恢复期 ;T1. 精原细胞增殖期 ;T2. 精母细胞发生期 ;T3. 精子细胞生成期不同字母和星号表示有显著差异 (P<0.05) O1.nodevelopmentalstage;O2.earlydevelopmentalstage;O3.previtelogenicstage;O4.vitelogenicstage;O5.maturestage;O6.post spawning;t1.spermatagonialcelsproliferationstag;t2.spermatocytegenerationstage;t3.spermgenerationstage.diferentletersand theasteriskrepresentsignificantdiference(p<0.05).

6 646 上海海洋大学学报 25 卷 2.5 组织总蛋白 Westernblot 检测利用 Westernblot 技术检测 UBE2r 蛋白在克氏原螯虾眼柄鳃肝胰腺心脏肠肌肉精巢及卵巢中的表达情况, 发现其在眼柄心脏肠肌肉精巢和卵巢中均有表达, 大小约为 27.6 ku, 与预测分子量大小一致检测各组织的表达量, 发现 UBE2r 蛋白在克氏原螯各组织中的表达量存在极显著差异 (P<0.01), 在精巢和卵巢中高表达, 在眼柄鳃肝胰腺心脏肠肌肉等组织中低表达 ( 图 5) 3 讨论泛素结合酶 E2 主要通过与泛素形成硫酯键作用使其与底物蛋白结合, 从而使其转移到泛素连接酶 E3 上作为泛素途径中重要的组成部分, 其在结构上高度保守, 在 30% ~40% 的泛素结合酶中都有一个 16kuUBC 保守区域在该结构域中还存在一个硫酯形成所需的特异性半胱氨酸残基活化位点 [26] [27] 在酵母的研究中发现,UBE2r 基因特异性的 C 末端的缺失会造成一些酶不能进入酵母细胞 S 期同样在人类的 UBE2r 基因中也发现, 其通过特异性的 C 末端与细胞内其他蛋白发生特异性的相互作用以及介导其在细胞内的定位 [28] 同源性比对发现,Pc UBE2r 基因序列与其他节肢动物 UBE2r 基因序列同源性较高, 其中与日本囊对虾的同源性高达 97% 系统进化分析表明,UBE2r 在进化过程中保守性很高据此可以推测 Pc UBE2r 基因可能具有与日本囊对虾 UBE2r 基因同样的功能图 5 Pc UBE2r 在克氏原螯虾各组织中的 Westernblot 检测 Fig.5 WesternblotdetectionofPc UBE2rin diferenttisuesofp.clarki eyestalk. 眼柄 ;gil. 鳃 ;he. 肝胰腺 ;ht. 心脏 ;in. 肠 ;mu. 肌肉 ;te. 精巢 ;ov. 卵巢实时定量 PCR 结果显示,Pc UBE2r 基因在克氏原螯虾不同组织中广泛表达, 这与凡纳滨对虾 (Litopenaeusvannamei) 和斑节对虾 (Penaeus monodon) 中 E2 基因的表达模式较为一致 [29-30], 而且在精巢和卵巢中的表达量相对较高同时 Westernblot 检测结果也显示,Pc UBE2r 蛋白在精巢和卵巢的表达水平显著高于其他组织这些结果可能表明,Pc UBE2r 基因在克氏原螯虾性腺中具有重要作用 MICHAEL 和 NEWPORT [31] 在非洲爪蟾蜍的卵子提取物中发现,UBE2r 基因负责介导负调节因子蛋白激酶 Wee 的降解, 而 Wee 在细胞周期 S 期对有丝分裂有关键性的作用精子和卵子在分裂过程中, 需要发生蛋白质的合成和降解 [32-33], 而 UBE2r 介导一些细胞周期过程中蛋白激酶的降解, 来参与调控精子和卵子的发生本研究中 Pc UBE2r 基因在精巢和卵巢的发育过程中表达量有明显的变化在卵巢中,Pc UBE2r 基因的表达量在 O1 期最低, 在 O3 期表达量快速增长并到达最高值, 随后表达量逐渐降低 ; 在精巢中,Pc UBE2r 基因的表达量在 T2 期达到最高水平在细胞周期过程中, 各时相的过渡都需要细胞周期蛋白的降解, 而大多数细胞周期蛋白都是通过泛素化途径降解的由于卵巢和精巢中一些细胞周期所必需的蛋白质聚集, Pc UBE2r 的表达量在 O1 期和 T1 期都不高随着细胞周期的进行, 这些蛋白通过 Pc UBE2r 介导的泛素蛋白酶途径降解细胞内的蛋白, 在卵巢发育 O3 期和精巢发育 T2 期的表达量达到最高随着降解蛋白达到一个平衡状态,Pc UBE2r 的表达量开始逐渐降低, 分别在卵巢发育 O4 期和精巢发育 T3 期出现下降的趋势这些结果表明, 克氏原螯虾精子和卵子的发生过程中, 生殖细胞内蛋白的降解可能和 UBE2r 基因的活动有关已经有许多研究表明泛素及泛素相关基因在性腺发育和配子发生过程中发挥着重要作用 [34-35] 在尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus) 中泛素 C 末端水解酶 L1 被定位在卵黄发生前期的卵母细胞上 [36] 戴燕彬等研究发现泛素(Ub) 在拟穴青蟹 (Scyla paramamosain) 卵巢中高表达 [37] [14] 沈冰玲等对日本囊对虾的研究发现, UBE2r 基因在性腺中高表达, 且在性腺发育各时期表达存在显著差异在雄性果蝇精巢中, UbcD1 基因突变会引起雄性减数分裂的破坏, 导致雄性不育 [38] ROEST 等对小鼠 HR6B 基因在精巢中的研究发现, 该基因在染色体构建中有一定的作用, 在精子发生时由于其突变, 从而导致雄性小鼠不育 [39] 本研究通过 Pc UBE2rmRNA 在卵巢中的定位显示,Pc UBE2rmRNA 在未发育的卵母细胞中均有分布, 随着卵母细胞的发育,

7 5 期钱照君, 等 : 克氏原螯虾泛素结合酶 E2r 基因的克隆及表达分析 647 逐渐迁移到卵黄发生前期中期和后期卵母细胞的细胞核周围, 最后分布在成熟卵母细胞的滤泡细胞中这些结果与 REYMOND 等研究 UBE2r 基因在人类细胞周期中参与细胞核和细胞质迁移的结果一致结合这些结果, 我们推测 Pc UBE2r 基因可能通过调控生殖细胞分裂和分化过程中的胞质重组而调节克氏原螯虾配子的发生过程通过 Pc UBE2rmRNA 在精巢中的定位显示,Pc UBE2r 的阳性信号主要在 T2 期精巢的次级精母细胞中高度表达, 在其他时期的精细胞中阳性信号很弱或者没有在 T2 期的精巢中, 精母细胞大多处于第一次和第二次减数分裂时期, 染色体出现分裂和重组,Pc UBE2r 在该时期精巢中高度表达而这一研究结果和 UBE2r 在哺乳动物精子发生的减数分裂后期达到最高表达水平结果相似 [40] 从这些研究来看, 推测 Pc UBE2r 基因可能在染色体构建过程中起着重要作用本研究从克氏原螯虾中获得了 UBE2r 基因的 cdna 全长, 通过对其进行生物信息学和同源进化分析, 以及在性腺发育过程中的差异表达与定位, 证明了 UBE2r 基因在克氏原螯虾的性腺发育和配子发生过程中起着重要的作用, 从而为虾蟹类性腺发育调控的分子机制奠定基础和提供依据参考文献 : [1] HUNERJV.ProcambarusinNorthAmericaandelsewhere [M]//HOLDICH D M, LOWERY R S. Freshwater Crayfish:Biology,ManagementandExploitation.London: CroomHelmLtd,1988: [2] 丁建英, 康, 徐建荣. 克氏原螯虾肌肉营养成分分析与评价 [J]. 水产科技情报,2010,37(6): DINGJY,KANG J,XU JR.Nutritionalcompositionof analysisandevaluationofprocambarusclarki[j].fisheries Science& TechnologyInformation,2010,37(6): [3] 姚根娣, 孙振中, 郭履骥, 等. 克氏原螯虾 (Cambarus clarki) 含肉率和营养成份分析 [J]. 水产科技情报, 1993,20(4): YAOG D,SUN ZZ,GUO LY,etal.Meatrateand nutrientcompositionanalysisinthecambarusclarki[j]. FisheriesScience&TechnologyInformation,1993,20(4): [4] FAO.Fisheryandaquaculturestatistics2012[M].Rome: Foodand AgricultureDepartmentoftheUnited Nations, [5] 陈昌福, 贺中华, 孟小亮, 等. 湖北省克氏原螯虾养殖现状与产业发展中的技术问题 [J]. 养殖与饲料,2008 (11): CHEN C F, HE Z H, MENG X L, etal. Statusof aquacultureandtechnicalproblemsinthedevelopmentof industryintheprocambarusclarkifromhubeiprovince[j]. AnimalsBreedingandFeed,2008(11): [6] 沈勤, 谢荣林, 张汉民, 等. 浙北地区小龙虾养殖情况的调查与分析 [J]. 齐鲁渔业,2010,27(12): SHENQ,XIERL,ZHANGHM,etal.Investigationand analysisofcrayfish farmingin North Region ofzhejiang Province[J].ShandongFisheries,2010,27(12): [7] CIECHANOVERA,ORIANA,SCHWARTZAL.Ubiquitin mediated proteolysis: biologicalregulation viadestruction [J].BioEsays,2000,22(5): [8] WILKINSONKD.Regulationofubiquitin dependentproceses bydeubiquitinating enzymes[j]. The FASEB Journal, 1997,11(14): [9] GOEBLM G,YOCHEM J,JENTSCH S,etal.Theyeast celcycle gene CDC34 encodes a ubiquitin conjugating enzyme[j].science,1988,241(4871): [10] SCHWOBE,B?HMT,MENDENHALLMD,etal.TheB typecyclinkinaseinhibitorp40sic1controlstheg1tos transitionins.cerevisiae[j].cel,1994,79(2): [11] YEW P R, KIRSCHNER M W. Proteolysisand DNA replication:thecdc34requirementinthexenopuseggcel cycle[j].science,1997,277(5332): [12] REYMONDF,WIRBELAUERC,KREKW.Asociationof humanubiquitin conjugatingenzymecdc34withthemitotic spindleinanaphase[j].journalofcelscience,2000,113 (10): [13] PATID,MEISTRICHML,PLONSE.HumanCDC34and Rad6B ubiquitin conjugating enzymestargetrepresorsof cyclic AMP induced transcription for proteolysis[j]. MolecularandCelularBiology,1999,19(7): [14] SHENBL,ZHANGZP,WANGYL,etal.Diferential expresion of ubiquitin conjugating enzyme E2r in the developingovaryandtestisofpenaeidshrimpmarsupenaeus japonicus[j].molecularbiologyreports,2009,36(5): [15] 郭风英. 克氏原螯虾卵巢发育的周年变化及组织切片观察 [D]. 上海 : 上海海洋大学,2011. GUOFY.Studyontheovarydevelopmentbyannualchanges andtisuesectionoftheredswampcrayfish,procambarus clarki[d].shanghai:shanghaioceanuniversity,2011. [16] 李胜, 赵维信. 克氏原螫虾大颚器在卵巢发育周期中的组织结构变化 [J]. 上海水产大学学报,1999,8(1): LIS,ZHAO W X.Structuralchangesofmandibularorgan

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9 5 期钱照君, 等 : 克氏原螯虾泛素结合酶 E2r 基因的克隆及表达分析 649 Molecularcloningandexpresionanalysisofubiquitin conjugatingenzyme E2rinProcambarusclarki QIANZhaojun 1,ZHUTianliang 1,JIANGHucheng 2,SHIBaotong 1,LIJiale 1 (1.KeyLaboratoryofExplorationandUtilizationofAquaticGeneticResources,MinistryofEducation,ShanghaiOcean University,Shanghai ,China;2.FreshwaterFisheriesResearchInstituteofJiangsuProvince,Nanjing , Jiangsu,China) Abstract:Inourstudy,forabeterunderstandingoftheroleregardingUBE2rinthedevelopmentofgonadin crawfish,the fullength cdna ofprocambarusclarkiube2rgene (Pc UBE2r) were cloned and characterized.theful lengthpc UBE2rcDNAsequenceobtainedwas3671basepairs(bp)including554 bpof5 UTRand2389bpin3 UTR,whilecontaininganopenreadingframeof729bpencodingaprotein of242aminoacidswithapredictedmolecularweightof27.6ku.bioinformaticsanalysisindicatedthatthe Pc UBE2rgenehadaconserveddomainspecifiedinubiquitinproteasomefamilyandCys94sites.The homologyandphylogeneticanalysisshowedthatthededucedaminoacidsequenceofube2rsharedhigh homologyindiferentspeciesandthehighestconservationwithmarsupenaeusjaponicus.quantitativereal time PCRanalysisrevealedthatPc UBE2rwasdistributedinvarioustisues,whileitsexpresionintheovaryand testiswassignificantlyhigherthanothertisues(p<0.05).inthedevelopmentofovary,theexpresionof Pc UBE2rwasthelowestinthenon developmentalstage,andincreasedrapidlyintheprevitelogenicstage. Withthematurityoftheovary,theexpresionofPc UBE2rdecreasedgradualy.Meanwhile,duringthe developmentoftestis,theexpresionofpc UBE2rwasprovenhighestinthespermatocytegenerationstage.In ourinsituhybridizationexperimentalprocedure,thepositivesignalofpc UBE2rwasobserveduniformly distributedintheoocytecytoplasminthenon developmentalstageoftheovary.withthedevelopmentofthe ovary,thepositivesignalsofpc UBE2rsuroundedtheoocytenucleusandfoliclecelscanbefound.Inthe testis,thepositivesignalsweremainlydistributedinthesecondaryspermatocytes.besides,westernbloting analysisexhibitedthattheexpresiondistributionsofube2rintisuesweresignificantlydiferent,but remainedhighlinovaryandtestis(p<0.05).overal,theexperimentalresultsdemonstratedthatpc UBE2r mayplayanimportantroleinthegametogenesisandgonadaldevelopmentofcrawfish. Keywords:ubiquitin conjugatinge2r;gonad;insituhybridization;westernblot;procambarusclarki

上６５０图版 Ⅰ Ｐ Ⅰ 海海洋大学学报２５卷ＰＵＢＥ２基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中的定位ＬｚｆｐＵＢＥ２ｄｆｆｄｍｆＰｍｋ４７０３和６的组织切片为ＨＥ染色的结果２５８４和７为地高辛标记的正义ＲＮＡ探针杂交结果３６９２５和８为反义ＲＮＡ探针杂交结果Ｏ卵原细胞Ｏ卵母细胞Ｃ细胞质Ｎ细胞核Ｎ

10 上６５０图版 Ⅰ Ｐ Ⅰ 海海洋大学学报２５卷ＰＵＢＥ２基因在克氏原螯虾卵巢发育过程中的定位ＬｚｆｐＵＢＥ２ｄｆｆｄｍｆＰｍｋ４７０３和６的组织切片为ＨＥ染色的结果２５８４和７为地高辛标记的正义ＲＮＡ探针杂交结果３６９２５和８为反义ＲＮＡ探针杂交结果Ｏ卵原细胞Ｏ卵母细胞Ｃ细胞质Ｎ细胞核Ｎ核仁Ｙ卵黄颗粒Ｆ滤泡细胞２３未发育５６发育早期７８９卵黄发生前期０２卵黄发生期３４５成熟期６７８恢复期期４Ｒｈｗｄｗｈｈｍｘｄ４７０３６ＴｈｆｉｈｄｚｗｈｄｉＧｄＲＮＡ２５８４ｄ７ｆＰＵＢＥ２ｄ３６９２５ｄ８ｆＰＵＢＥ２ｗｈｗＯｍＯＣｍＮＮＹｋｄｆｆ２３ｄｍ４５６ｄｍ７８９０２３４５ｍ６７８ｗ

５期钱照君等克氏原螯虾泛素结合酶Ｅ２基因的克隆及表达分析图版Ⅱ Ｐ Ⅱ ６５ＰＵＢＥ２在克氏原螯虾精巢中的定位ＬｚｆｐＵＢＥ２ｆｍＰｍｋ４和７的组织切片为ＨＥ染色的结果２５和８为地高辛标记的正义ＲＮＡ探针杂交结果３６和９为反义ＲＮＡ探针杂交结果ＳＰ精原细胞ＰＳＰ初级精母细胞Ｓ

11 ５期钱照君等克氏原螯虾泛素结合酶Ｅ２基因的克隆及表达分析图版Ⅱ Ｐ Ⅱ ６５ＰＵＢＥ２在克氏原螯虾精巢中的定位ＬｚｆｐＵＢＥ２ｆｍＰｍｋ４和７的组织切片为ＨＥ染色的结果２５和８为地高辛标记的正义ＲＮＡ探针杂交结果３６和９为反义ＲＮＡ探针杂交结果ＳＰ精原细胞ＰＳＰ初级精母细胞Ｓ精子细胞２３精原细胞增殖期４５６精母细胞发生期７８９精子细胞生成期Ｒｈｗｄｗｈｈｍｘｄ４７ＴｈｆｉｈｄｚｗｈｄｉＧｄＲＮＡ２５８ｆＰＵＢＥ２ｄ３６９ｆＰＵＢＥ２ｗｈｗＳＰｍｍＰＳＰｍＳｍ２３Ｓｍｆ４５６ｍ７８９ｍｍ

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽