第 10 期薛闯等 : 锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响 2583 引言提高发酵终点乙醇的浓度可以显著节省乙醇精蛋白胨 3 发酵培养基 : 以往都使用含有酵母粉和蛋白胨等复杂成分的培养基来研究金属离子对酵母菌乙醇馏操作的能耗, 在一定程度上减少废糟液量, 进而节省废糟液处理

Size: px

Start display at page:

Download "第 10 期薛闯等 : 锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响 2583 引言提高发酵终点乙醇的浓度可以显著节省乙醇精蛋白胨 3 发酵培养基 : 以往都使用含有酵母粉和蛋白胨等复杂成分的培养基来研究金属离子对酵母菌乙醇馏操作的能耗, 在一定程度上减少废糟液量, 进而节省废糟液处理"

党毕
7 years ago
Views:

1 第 59 卷第 10 期化工学报 Vol.59 No 年 10 月 Journal of Chemical Industry and Engineering (China) October 2008 殐殐檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐研究论文殐锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响薛闯, 赵心清, 葛旭萌, 袁文杰, 白凤武 ( 大连理工大学生物科学与工程系, 辽宁大连 ) 摘要 : 研究了 6 种金属离子在合成培养基中对摇瓶培养的自絮凝酵母乙醇耐性的影响, 发现锌离子对高浓度乙醇冲击下的酵母细胞活性有保护作用, 并进一步研究了乙醇连续发酵过程中锌的添加对自絮凝酵母乙醇耐性的影响发酵培养基中分别添加和 0.1g L -1 的硫酸锌时, 自絮凝酵母颗粒平均粒度减小, 同时乙醇耐性和高温耐性都得到明显提高, 并且发现细胞活性的提高与酵母细胞内麦角固醇和海藻糖的增加密切相关对酵母细胞内锌的含量的分析表明,3 个添加组胞内锌的积累量基本相似, 比对照组均增加了 6 倍相关性分析表明, 酵母胞内锌含量与酵母细胞的胁迫耐性密切相关并显著影响其胁迫耐性各添加组的乙醇产量均有提高, 其中添加 0.05g L -1 的硫酸锌时乙醇产量最高, 比对照组高 8.4% 以上研究结果表明, 调控连续乙醇发酵过程中培养基中锌离子浓度, 是提高酵母细胞乙醇耐受性高温度耐受性和乙醇产量的有效途径关键词 : 自絮凝酵母 ; 锌离子 ; 乙醇耐性 ; 温度耐性中图分类号 :Q819 文献标识码 :A 文章编号 : (2008) 犈犳犲犮狋狅犳狕犻狀犮犻狅狀狅狀犲狋犺犪狀狅犾狋狅犾犲狉犪狀犮犲犪狀犱犳犾狅犮狊犻狕犲狅犳狊犲犾犳犳犾狅犮犮狌犾犪狋犻狀犵狔犲犪狊狋犡犝犈犆犺狌犪狀犵, 犣犎犃犗犡犻狀狇犻狀犵, 犌犈犡狌犿犲狀犵, 犢犝犃犖犠犲狀犼犻犲, 犅犃犐犉犲狀犵狑狌 ( 犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犅犻狅狊犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵, 犇犪犾犻犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔, 犇犪犾犻犪狀 , 犔犻犪狅狀犻狀犵, 犆犺犻狀犪 ) 犃犫狊狋狉犪犮狋 :Theefectsofmetalionsonethanoltoleranceofself flocculatingyeastwasstudiedbyusinga definedmediuminshakeflaskculture.theobservedimprovementofzincionsupplementationonethanol tolerancepromotedthefurtherexaminationofzincionefectoncontinuousethanolfermentation.zinc sulfatewassupplementedintothefermentation mediumattheconcentrationsof0.01,0.05and0.1g L -1,respectively.Theaverageflocsizeoftheself flocculatingyeastdecreasedinzinc additioncultures, butbothitsethanoltoleranceandthermaltolerance weresignificantlyimproved,whichcorrelated wel withtheincreasedergosterolandtrehalosecontentsintheyeastflocs.intracelularzinccontentwasfound tobeaboutsixfoldshigherthanthatofcontrol,andnosignificantdiferencewasobservedinthethree additionlevels.correlationanalysisindicatedclosecorrelationbetweenzincadditionandethanol/thermal tolerance.ethanolproductionincreasedinalthezinc supplementedcultures,withthe mostsignificant efectobservedwhen0.05g L -1 zincsulfatewassupplied.thus,zincionsupplementationwasprovedto bean eficientstrategyforenhanced ethanoltolerance,thermaltoleranceand ethanolproductionin continuousethanolfermentationoftheself flocculatingyeast. 犓犲狔狑狅狉犱狊 :self flocculatingyeast;zinc;ethanoltolerance;thermaltolerance 收到初稿, 收到修改稿联系人 : 赵心清第一作者 : 薛闯 (1982 ), 男, 博士研究生基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 国家高技术研究发展计划项目 (2007AA108358) 犚犲犮犲犻狏犲犱犱犪狋犲 : 犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉 :ZHAO Xinqing. 犈 - 犿犪犻犾 :xqzhao@ dlut.edu.cn 犉狅狌狀犱犪狋犻狅狀犻狋犲犿 :supported bythe National NaturalScience FoundationofChina ( )andthe High tech Researchand DevelopmentProgramofChina (2007AA108358).

2 第 10 期薛闯等 : 锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响 2583 引言提高发酵终点乙醇的浓度可以显著节省乙醇精蛋白胨 3 发酵培养基 : 以往都使用含有酵母粉和蛋白胨等复杂成分的培养基来研究金属离子对酵母菌乙醇馏操作的能耗, 在一定程度上减少废糟液量, 进而节省废糟液处理的能耗, 特别是对于采用全蒸发浓缩技术 (DDGS) 处理废糟液的淀粉质原料乙醇生产然而, 高浓度乙醇对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强抑制作用, 提高酵母菌株的乙醇耐性, 是提高发酵终点乙醇浓度的先决条件, 对开发高浓度乙 [1] 醇发酵技术具有重要意义本实验室选育的自絮凝酵母犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲犳犾狅已经在国家大型燃料乙醇工程中得到应用, 在研究中发现, 酵母细胞自絮凝这一明显的形态改变, 可以提高其乙醇 [2] 耐性进一步研究发现, 不同尺度的絮凝酵母群 [3] 体, 其乙醇耐性和乙醇产量都有所不同, 因此调控絮凝细胞的群体形态, 可能是提高其乙醇耐性的一个新途径酵母絮凝受遗传营养和环境等多种因素的影 [4 5] 响, 本实验室利用激光粒度仪离线检测发现一 [6] 些金属离子对酵母菌的絮凝有一定影响, 但是在连续培养过程中金属离子对酵母菌絮凝作用的影响和乙醇耐性的影响还不清楚培养基中金属离子的含量对酵母菌的生长和乙醇的产生具有重要的作用很多金属离子可作为糖 [7] 酵解途径中各种酶的辅酶参与糖的分解代谢, 同时, 一些金属离子, 如钙镁离子, 对酵母菌的絮 [8 9] 凝和乙醇耐性提高有利, 然而对其他金属离子的研究还很少本文选择 6 种与糖酵解途径密切相关的金属离子, 研究培养基中这些金属离子的含量对絮凝酵母乙醇耐性的影响, 探讨锌离子提高絮凝酵母乙醇耐性的促进作用, 并进一步研究在高浓度乙醇连续发酵过程中锌离子的添加对絮凝酵母的群体形态和乙醇耐性的影响 1 材料与方法 1 1 菌种自絮凝颗粒酵母犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲犳犾狅, 由本实验室保存 1 2 金属离子对乙醇耐性影响的摇瓶实验培养基斜面培养基 (g L -1 ): 葡萄糖 30, 酵母粉 4, 蛋白胨 3 种子培养基 (g L -1 ): 葡萄糖 30, 酵母粉 4, 耐性的影响为了增加实验的重现性, 选择了化学成分明确的合成培养基 [10] 进行实验根据预实验的结果, 将合成培养基的成分进行了修改, 所使用的对照培养基组成如下 (g L -1 ): 葡萄糖 100, (NH 4 ) 2SO 410,K 2HPO 41,CaCl 2 2H 2O 0.1, MgSO 4 7H 2O0.5,NaCl0.1, 微量金属和维生素浓度同文献 [10] 为了考察金属离子对细胞活性 [8 9,11] 的影响, 在文献报道的浓度范围基础上选择了以下金属离子的添加浓度 :FeSO 4 7H 2O 和 MnCl 2 4H 2O 的添加浓度 (mg L -1 ) 分别为和 120,CoCl 2 6H 2O 和 ZnSO 4 7H 2O 的添加浓度 (mg L -1 ) 分别为和 40,MgSO 4 7H 2O 的添加浓度 (g L -1 ) 为和 1.6,CaCl 2 2H 2O 的添加浓度 (g L -1 ) 为和 0.8 以上各添加浓度从低到高分别标记为 level1~level 摇瓶培养和发酵从斜面上接一环菌体于含 100 ml 种子培养基的 250 ml 摇瓶中, 在摇床上以 150r min -1 和 30 的条件培养 24h 后, 将菌体用 0.1mol L -1 三水合柠檬酸钠 (ph 5.0) 解絮, 并均分于 5 ml 离心管中, 作为摇瓶发酵的种子, 与 200g L -1 甘油 1 1 混合, 冻存于 -40 冰箱开始摇瓶实验时, 将种子接入添加不同金属离子的发酵培养基中 ( 每个添加浓度做 3 个平行样 ), 在 150r min -1 和 30 的条件下进行乙醇发酵, 并定期取样测残糖浓度, 待残葡萄糖浓度降到 1 g L -1 以下时停止发酵, 取样测定乙醇浓度, 同时收集酵母细胞进行乙醇冲击实验 1 4 连续发酵实验摇瓶生长培养基 (g L -1 ): 葡萄糖 30, 酵母粉 4, 蛋白胨 3 种子生长培养基 (g L -1 ): 葡萄糖 100, 酵母粉 4, 蛋白胨 3 连续发酵培养基 (g L -1 ): 葡萄糖 245, 酵母粉 5, 蛋白胨 3 将摇瓶培养的种子以 (5.2±0.2)g DCW (drycelweight) 的接种量接入装有生长培养基工作容积为 765 ml 的搅拌式生物反应器中, 以间

3 2584 化工学报第 59 卷歇培养的方式进行种子培养, 待葡萄糖基本耗竭后, 流加发酵培养基, 进入连续发酵状态当生物量发酵液中葡萄糖和乙醇含量基本不变时, 确定系统已经达到稳态发酵过程中控制稀释速率为 0.025h -1,pH 值为 4.5, 通气量 23 ml min -1, 温度 30, 搅拌速率 270r min -1 连续发酵共进行 4 次, 不同批次的发酵中培养基中硫酸锌的添加浓度分别为 g L 测定分析方法 (1) 发酵参数和自絮凝颗粒酵母粒径分布的乙醇浓度生物量葡萄糖浓度的分析, 及 FBRM 测定自絮凝颗粒酵母粒径分布的实验方法均参考文献 [12] 进行 (2) 菌体乙醇耐受性的测定发酵结束后, 离心收获酵母菌体, 用无菌去离子水洗涤两次后, 用 0.1mol L -1 三水合柠檬酸钠 (ph5.0) 解絮, 于 30 在 20 % ( 体积 ) 乙醇浓度下进行冲击, 定期检测残余活细胞数目, 菌体的乙醇耐性以存活率 (viability) 表示 [2] (3) 胞内和发酵液锌含量的测定发酵液和胞内锌含量采用原子吸收光谱分析胞内锌测定时, 先取适量菌体用 0.1 mol L -1 三水合柠檬酸钠 (ph 5.0) 解絮, 然后用去离子水清洗 3 次, 将菌体在 85 干燥至恒重, 用 3.5 mol L -1 HNO 3 和 1.0mol L -1 HClO 4 硝化后作原子吸收光谱分析 [13] (4) 胞内总麦角固醇和游离麦角固醇含量的 [14 15] 测定总麦角固醇和游离麦角固醇按文献 [14] 的实验方法提取后, 根据文献 [15] 的比色法进行定量法进行 1 6 [16] (5) 海藻糖含量的测定海藻糖的提取及定量根据文献 [16] 的实验方统计学分析金属离子的添加对摇瓶发酵中乙醇耐性的影响实验对两批平行实验做单因素方差分析, 连续乙醇发酵中每 12h 测量生物量乙醇浓度和残糖浓度, 每批发酵取 3 个样品进行参数的测定, 每次测定取 3 次测量的平均值所得到的实验数据均使用 SAS8.0 处理, 得到平均值和方差 2 实验结果 2 1 金属离子的添加对酵母细胞乙醇耐性的影响图 1 所示为 6 种金属离子 (Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+,Fe 2+,Zn 2+,Co 2+ ) 不同的添加浓度对酵母细胞高浓度酒精冲击下存活率的影响, 可见在高浓度乙醇的冲击下, 添加 3 种金属离子 Mg 2+ Ca 2+ Zn 2+ 的发酵培养基里的酵母细胞, 其存活率要比对照组高很多, 说明这 3 种离子对提高酵母细胞乙醇耐性有明显的促进作用, 而 Mn 2+ Fe 2+ 和 Co 2+ 3 种离子对酵母细胞乙醇耐性没有明显影响对这 6 种金属离子对酵母乙醇耐性的影响做单因素方差分析, 得到表 1 所示的犘值可以看出, Mg 2+ Ca 2+ 和 Zn 2+ 的犘值均远小于 0.001, 而 Mn 2+ Fe 2+ 和 Co 2+ 均大于 0.05, 进一步表明 Mg 2+ Ca 2+ 和 Zn 2+ 对酵母细胞乙醇耐性影响显著 Mg 2+ 和 Ca 2+ 对酵母细胞絮凝和乙醇耐性的影 [6,8 9] 响已有报道, 但本研究首次发现了 Zn 2+ 对酵母菌乙醇耐性的重要作用实验结果表明, 硫酸锌添加量仅为 0.01g L -1 时就可以明显提高酵母菌的乙醇耐性, 然而在硫酸锌浓度达到 0.03g L -1 时促进作用降低, 进一步增加硫酸锌的浓度反而使酵母菌的乙醇耐性降低, 显示了培养基中的锌离子浓度对酵母细胞生理和代谢的双重影响图 1 高浓度乙醇冲击下金属离子添加水平对酵母细胞存活率的影响 Fig.1 Efectofmetalionsadditionsonyeastcel viabilitywhensubjectedtoethanolshocktreatment 2 2 培养基中的锌离子浓度对絮凝酵母平均粒度的影响前期的研究工作结果表明, 酵母絮凝影响其乙 [2 3] 醇耐性, 因此在线检测了在连续发酵条件下锌

4 第 10 期薛闯等 : 锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响 2585 表 1 金属离子添加水平对酵母细胞存活率的影响的相关性分析犜犪犫犾犲 1 犆狅狉狉犲犾犪狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犲犳犲犮狋狅犳犿犲狋犪犾犻狅狀狊犪犱犱犻狋犻狅狀狊狅狀狔犲犪狊狋犮犲犾狏犻犪犫犻犾犻狋狔 Viability/% Compound 犘 value Significance min max ( 体积 ), 高温 45 ] 下的酵母细胞的存活率, 添加组比对照组提高了约 10 % 这些实验结果说明锌的添加不仅对酵母细胞由高浓度乙醇诱导的致死效应有保护作用, 同时对高温胁迫也有保护作用 MnCl2 4H2O MgSO4 7H2O < CaCl2 2H2O < FeSO4 7H2O ZnSO4 7H2O < CoCl2 6H2O 图 3 添加锌对胁迫冲击下酵母絮凝颗粒存活率的影响 Fig.3 Impactofzincadditiononviabilityof yeastflocsunderstressshock 2 4 锌离子的添加对细胞膜麦角固醇含量的影响图 2 锌离子的添加对絮凝酵母平均粒度的影响 Fig.2 Impactofzincadditiononaveragesizeofyeastflocs 离子的添加对酵母细胞絮凝特性的影响如图 2 所示,3 个浓度锌离子的添加均使絮凝酵母的平均粒度减小, 其中锌离子添加浓度为 0.05g L -1 时絮凝酵母的平均粒度最小, 为 (264±9) μ m, 而未添加组的平均粒度为 (326±6) μ m 这是继钙镁两种离子后首次发现锌离子的添加对自絮凝酵母粒度的影响 2 3 锌离子的添加对热冲击 / 乙醇冲击下酵母细胞存活率的影响收获培养 10d 达到稳态的酵母细胞分别进行高浓度乙醇冲击 [20% ( 体积 )] 热冲击 (45 ) 和两种胁迫条件的混合冲击, 考察了酵母细胞的活性差异, 实验结果如图 3 所示经过 5h 的乙醇冲击, 添加 g L -1 硫酸锌的酵母细胞的存活率分别为 71.2% 72.5% 和 70.4%, 比对照组 (50.9%) 提高约 20% 同时, 经过 5h 的高温冲击后, 添加 g L -1 硫酸锌的酵母细胞的存活率分别为 82.1% 84.1% 和 84.5%, 与对照组 (60.2%) 相比也提高了约 20%, 而高浓度乙醇和高温联合冲击 [ 乙醇 20% 细胞膜麦角固醇含量的变化是酵母细胞抗乙醇冲击的生理反应, 不同锌离子添加水平下细胞膜上总麦角固醇和游离麦角固醇含量测定结果如表 2 所示锌离子添加浓度为 g L -1 的自絮凝酵母细胞膜总麦角固醇的含量分别为对照组的 158% 164% 和 188%; 游离麦角固醇的含量 3 个添加组分别为对照组的 221% 192% 和 164%, 表明锌离子明显刺激了酵母细胞膜麦角固醇的合成表 2 硫酸锌对自絮凝酵母麦角固醇合成的影响犜犪犫犾犲 2 犐犿狆犪犮狋狅犳狕犻狀犮狊狌犾犳犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犫犻狅狊狔狀狋犺犲狊犻狊 ZnSO4 7H2O 2 5 狅犳犲狉犵狅狊狋犲狉狅犾狅犳狊犲犾犳犳犾狅犮犮狌犾犪狋犻狀犵狔犲犪狊狋 Totalergosterol /mg (gdcw) -1 Freeergosterol /mg (gdcw) ± ± ± ± ± ± ± ±0.05 锌离子的添加对酵母细胞内海藻糖的影响海藻糖也是酵母细胞在环境胁迫条件下积累的胞内产物 [17], 不同锌离子添加水平下自絮凝酵母细胞内海藻糖含量如表 3 所示添加组的自絮凝酵母细胞海藻糖含量大约是对照组的两倍

5 2586 化工学报第 59 卷 2 6 表 3 硫酸锌对自絮凝酵母胞内海藻糖合成的影响犜犪犫犾犲 3 犐犿狆犪犮狋狅犳狕犻狀犮狊狌犾犳犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犻狀狋狉犪犮犲犾狌犾犪狉狋狉犲犺犪犾狅狊犲犫犻狅狊狔狀狋犺犲狊犻狊狅犳狊犲犾犳犳犾狅犮犮狌犾犪狋犻狀犵狔犲犪狊狋 ZnSO4 7H2O Trehalose/mg (gdcw) ± ± ± ±0.8 锌离子的添加对乙醇发酵的影响锌离子的添加对酵母细胞乙醇耐性的提高和对麦角固醇及海藻糖含量的影响, 说明了锌离子对细胞代谢的深刻影响进一步考察了连续发酵过程中锌离子添加对酵母菌乙醇发酵的影响表 4 为发酵培养基中添加不同浓度的硫酸锌时, 达到稳态条件下的乙醇浓度与对照组相比, 各实验组的乙醇浓度均有所提高, 其中添加 0.05g L -1 的硫酸锌使发酵终点乙醇浓度提高到 (110.1±2.1)g L -1, 比对照组 [(101.6± 2.7)g L -1 ] 提高了 8.5 g L -1, 约 8.4%, 而且发酵液中的残糖浓度基本没有变化, 进一步表明了锌离子能提高自絮凝酵母乙醇耐受性, 使相同发酵条件下可以获得更高的乙醇浓度和底物糖对产物乙醇的收率锌离子对连续发酵稳态下的生物量没有明显的影响 2 7 酵母细胞内锌离子的积累为了判断锌离子是否在酵母细胞内积累, 对培养基和发酵液中锌离子的浓度进行了定量分析, 结果如表 5 所示由表可知, 当锌离子的添加达到 0.05g L -1 时, 犆 Z,in- 犆 Z,out 趋于稳定, 显示发酵体系对锌的吸收达到饱和由添加量 0.01g L -1 和 0.05g L -1 的实验组犆 Z,out 和犆 Z,in- 犆 Z,out 比较可知, 当硫酸锌的添加量为 0.01g L -1 时, 添加的锌 97 % 都被细胞吸收, 而对照组中锌的含量对体系是不足的从表 5 可知,3 个实验组酵母胞内锌积累水平相当, 均比对照组高 6~7 倍, 而且值得注意的是, 3 个实验组胞内锌的积累并没有随添加水平改变而变化, 这和耐性实验 ( 热冲击和乙醇冲击 ) 中 3 个添加组的细胞耐性相似的实验结果吻合将 3 种耐性冲击实验和胞内锌含量做单因素方差分析, 犘值均小于 0.001, 说明胞内锌含量显著影响自絮凝酵母细胞对高温 / 乙醇胁迫的耐受性并且, 胞内锌含量与 20% 乙醇冲击 45 热冲击和混合冲击 2 [ 乙醇 20%, 温度 45 ] 存活率的相关系数犚分别为和 , 进一步说明胞内锌含量和细胞存活率的密切联系 3 讨论锌锰钴等微量元素对酵母菌乙醇耐性的研究长期以来一直受到忽视本文利用合成培养基, 研究了作为糖酵解途径关键酶辅助因子的 6 种金属离子对酵母菌乙醇耐性的影响, 发现锌离子对乙醇表 4 添加硫酸锌对自絮凝酵母乙醇发酵的影响犜犪犫犾犲 4 犐犿狆犪犮狋狅犳狕犻狀犮狊狌犾犳犪狋犲犪犱犱犻狋犻狅狀狅狀犲狋犺犪狀狅犾犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀狑犻狋犺狊犲犾犳犳犾狅犮犮狌犾犪狋犻狀犵狔犲犪狊狋 ZnSO4 7H2O 犈犡 /(gdcw) L -1 犛 r 狇 -1 犢犈 h / 犛 ± ±1 0.73± ± ± ± ±1 0.75± ± ± ±2.1 22±1 0.63± ± ± ±2.5 22±1 0.65± ± ±0.010 表 5 酵母细胞内和发酵液中锌的含量犜犪犫犾犲 5 犣犻狀犮犮狅狀狋犲狀狋狊犻狀狔犲犪狊狋犮犲犾狊犪狀犱犮狌犾狋狌狉犲犫狉狅狋犺犆 Z,add 犆 Z,cel/ μ mol (gdcw) -1 犆 Z,in/ μ mol L -1 犆 Z,out/ μ mol L -1 ( 犆 Z,in- 犆 Z,out)/ μ mol L

6 第 10 期薛闯等 : 锌离子对自絮凝酵母乙醇耐性和絮凝颗粒大小的影响 2587 耐性提高有重要作用, 并进一步进行了连续发酵培养, 发现培养基中锌的添加不但提高了酵母菌的乙醇耐受性, 而且提高了乙醇产量, 表明在大规模乙醇发酵过程中重视锌离子的补加, 将是提高酵母细胞高乙醇浓度条件下活性的有效手段锌离子是酵母生长必需的营养成分, 是糖酵解和乙醇形成途径关键酶的辅助因子, 参与酵母细胞内的多种代谢反应 [18] 在啤酒酵母 ( 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲 ) 基因组中, 大约 2% 的基因含有锌离子的 DNA 结构域, 编码蛋白质, 进而对细胞的代谢功能起到调节作用 [19 20] 虽然前人已经报道了培养基中添加锌离子能提高酵母菌的乙醇产量 [11,21 22], 但是锌的添加对酵母细胞乙醇耐性的影响及细胞结构成分的改变 ( 麦角固醇海藻糖的含量 ) 还未见报道添加锌离子后细胞内麦角固醇和海藻糖的含量约为对照的两倍, 这可能是絮凝酵母颗粒群体乙醇耐性提高的重要原因另外, 在乙醇耐性提高的同时, 添加锌也相同程度地提高了自絮凝酵母对高温胁迫的耐受性, 提示了自絮凝酵母的乙醇耐性和高温耐性可能有共同的机制, 与文献报 [23] 道的研究结果相符合对自絮凝酵母细胞内锌含量的分析表明, 培养基中添加锌离子使酵母细胞内锌离子含量有很大提高, 并与其对高浓度乙醇和高温等胁迫条件下耐性的提高密切相关酵母细胞吸收锌离子后细胞膜麦角固醇和胞内海藻糖浓度提高, 发酵活性同时也得到了提高, 显示了酵母细胞内锌的积累对酵母细胞整体代谢的调节作用酵母细胞内锌的积累引起的相关代谢通量的改变的研究, 将有助于进一步通过代谢工程方法提高酵母菌对发酵过程中的各种胁迫因子的耐受性培养基中添加锌离子使酵母细胞絮凝颗粒平均粒度减小也是本文新的发现已知适量的钙离子对酵母细胞絮凝有促进作用 [6], 目前还不清楚锌离子是否可被吸附在酵母细胞表面, 与钙离子进行竞争, 从而影响絮凝颗粒的大小酵母细胞内含有锌离子的调节蛋白和以锌为辅因子的酶是否受细胞内锌含量的影响而影响细胞内部的代谢, 从而导致絮凝颗粒的变化还有待进一步研究前期研究结果表明, 絮凝酵母群体形态对乙醇耐性具有重要的影响, 通过调整不同机械搅拌速度得到的平均粒度不同的絮凝酵母颗粒群体, 其乙醇耐性和乙醇产量均有所不同 [3] 本文的研究结果显示通过简单的调节培养基中锌离子浓度, 也可以起到调控絮凝酵母群体形态的作用, 锌离子的添加减小了絮凝酵母的平均粒度, 提高了自絮凝酵母的乙醇耐性, 并提高了乙醇产量研究结果表明, 培养基中锌离子浓度的调控是提高絮凝酵母乙醇耐性的一个新途径 4 结论 (1) 培养基中锌的添加降低了自絮凝酵母颗粒的平均粒度, 提高其对乙醇和高温胁迫的耐性, 使连续发酵终点乙醇浓度相应提高, 表明调控培养基中的锌离子浓度, 是提高絮凝酵母乙醇耐性的新途径 (2) 细胞内锌离子的积累能提高自絮凝酵母细胞内麦角固醇和海藻糖的含量, 显示了酵母细胞胞内锌含量的增加对细胞整体代谢的重要影响符号说明犆 Z,add 培养基中添加的硫酸锌浓度,g L -1 犆 Z,cel 锌在酵母细胞中的含量, μ mol g -1 犆 Z,in 锌在培养基中的浓度, μ mol L -1 犆 Z,out 锌在发酵液中的浓度, μ mol L -1 犇稀释速率,h -1 犈乙醇浓度,g L -1 犘统计学差异显著性 -1 狇乙醇生产强度 ( 狇 = 犇犈 ),g L -1 h 犛 i 培养基中底物浓度,g L -1 犛 r 终点底物浓度,g L -1 犡生物量浓度,g L -1 犢犈 / 犛乙醇产率 ( 犢犈 / 犛 = 犈 / 犛 i) 犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊 [1] BaiF W,Chen L J,Zhang Z, Anderson W A, Moo Young M. Continuousethanolproductionandevaluationof yeastcellysisandviabilitylossundervery high gravity mediumconditions. 犑. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾.,2004,110: [2] HuChunkeng ( 胡纯铿 ),BaiFengwu ( 白凤武 ),AnLijia ( 安利佳 ).Efectofflocculenceofaself flocculatingyeast onitstoleranceto ethanolandthe mechanism. 犆犺犻狀犲狊犲犑狅狌狉狀犪犾狅犳犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔 ( 生物工程学报 ),2005,21: [3] LeiJJ,ZhaoX Q,GeX M,BaiF W. Ethanoltolerance andthevariationofplasmamembranecompositionofyeast floc populations with diferent size distribution. 犑. 犅犻狅狋犲犮犺.,2007,131: [4] ZhangBorun ( 张博润 ),RenJian ( 任建 ),Liu Yufang ( 刘玉芳 ).Progressinyeastflocculationmechanismstudies andprospectofapplication. 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔 ( 微生物学通报 ),

7 2588 化工学报第 59 卷 1996,23: [5] VerstrepenKJ,DerdelinckxG,VerachtertH,DelvauxF R. Yeastflocculation:whatbrewersshouldknow. 犃狆狆犾. 犕犻犮狉狅犫犻狅犾. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾.,2003,61: [6] Ge X M,Zhang L,BaiF W. Impactsoftemperature, ph, divalent cations, sugars and ethanol on the flocculating of SPSC01. 犈狀狕狔犿犲犕犻犮狉狅犫犻狅犾. 犜犲犮犺狀狅犾., 2006,39: [7] Jones R P, Greenfield P F. A review of yeastionic nutrition:growthandfermentationrequirements. 犘狉狅犮犲狊狊犅犻狅犮犺犲犿.,1984,19:48 46 [8] NabaisR C,Sa CorreiaI, Viegas C A, Novais J M. Influence of calcium ion on ethanol tolerance of 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犫犪狔犪狀狌狊 and alcoholic fermentation by yeasts. 犃狆狆犾. 犈狀狏犻狉狅狀. 犕犻犮狉狅犫犻狅犾.,1988,54: [9] BirchR M, WalkerG M.Influenceofmagnesiumionson heatshockandethanolstressresponsesof 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲. 犈狀狕狔犿犲犕犻犮狉狅犫犻狅犾. 犜犲犮犺狀狅犾., 2000, 26: [10] Brauer M J,Saldanha A J, Dolinski K, Botstein D. Homeostatic adjustment and metabolic remodeling in glucose limitedyeastcultures. 犕狅犾. 犅犻狅犾. 犆犲犾.,2005, 16: [11] TosunA,Ergun M. Useofexperimentaldesignmethodto investigate metalion efectsin yeastfermentations. 犑. 犆犺犲犿. 犜犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾.,2007,82:11 15 [12] Ge X M,Zhao X Q,BaiF W. On line monitoringand characterization of flocculating yeast cel flocs during continuous ethanol fermentation. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犲狀犵., 2005,90: [13] Clésia C Nascentes, Marcos Y Kamogawa, Kely G Fernandes, Marco A Z Arruda, Ana Rita A Nogueira, Joaquim A Nóbrega.DirectdeterminationofCu, Mn,Pb, and Zn in beer by thermospray flame furnace atomic absorption spectrometry. 犛狆犲犮狋狉狅犮犺犻犿犻犮犪犃犮狋犪犘犪狉狋犅 : 犃狋狅犿犻犮犛狆犲犮狋狉狅狊犮狅狆狔,2005,60: [14] MegumiS, MitsuedaSI, Mariko A. Efectsofculture condition on ergosterol biosynthesis by 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲. 犅犻狅狊犮犻. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾. 犅犻狅犮犺犲犿.,2005,69: [15] ShangF, Wen S, Wang X,Tan T. Efectofnitrogen limitationontheergosterolproductionbyfed batchculture of 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲. 犑. 犅犻狅狋犲犮犺狀狅犾.,2006,122: [16] ParrouJ L,Teste M A,FrancoisJ. Efectsofvarious typesofstressonthemetabolismofreservecarbohydratesin 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲 :genetic evidencefor a stress inducedrecyclingofglycogenandtrehalose. 犕犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵狔, 1997,143: [17] Iwahashi H, Obuchi K, Fuji S, Komatsu Y. The correlative evidence suggesting that trehalose stabilizes membranestructureintheyeast 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲. 犆犲犾. 犕狅犾. 犅犻狅犾.,1995,41: [18] ValeeB L,Auld D S. Zinccoordination,function,and structureofzincenzymesandotherproteins. 犅犻狅犮犺犲犿犻狊狋狉狔, 1990,29: [19] SchwabeJ W,Klug A. Zincminingforproteindomains. 犖犪狋. 犛狋狉狌犮狋. 犅犻狅犾.,1994,1: [20] Schjerling P, Holmberg S. Comparative amino acid sequence analysis of the C6 zinc cluster family of transcriptionalregulators. 犖狌犮犾犲犻犮. 犃犮犻犱狊犚犲狊.,1996,24: [21] MaddoxIS,HoughJS. Efectofzincandcobaltonyeast growth and fermentation. 犑. 犐狀狊狋. 犅狉犲狑.,1970,76: [22] ChandrasenaG,WalkerG M. Useofresponsesurfaceto investigatemetalioninteractioninyeastfermentations. 犑. 犃犿. 犛狅犮. 犅狉犲狑. 犆犺犲犿.,1997,55:24 29 [23] PlessetJ,Palm C, McLaughlin C S. Induction ofheat shock proteins and thermotolerance by ethanol in 犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲. 犅犻狅犮犺犲犿. 犅犻狅狆犺狔狊. 犚犲狊. 犆狅犿犿狌狀.,1982,108:

殐殐 27 1 Vol.27 No ImagingScienceandPhotochemistry Jan.,2009 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐 *O! "# #B) 1,CDE 1, 2, 1 (1., ;2., ) $ %:3 J = 2J4

殐殐 27 1 Vol.27 No ImagingScienceandPhotochemistry Jan.,2009 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐 *O! # #B) 1,CDE 1, 2, 1 (1., ;2., ) $ %:3 J = 2J4 殐殐 27 1 Vol.27 No.1 2009 1 ImagingScienceandPhotochemistry Jan.,2009 檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭檭殐殐 *O! "# #B) 1,CDE 1, 2, 1 (1., 200092;2., 200092) $ %:3 J = 2J4 ',V T, _` * C?. + SU L 3 H4 E '.< 4 893?, V 9 P>?.