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1 第 卷 第 期 化 工 学 报 年 月! " 研究论文 锌离子提高絮凝酵母乙酸胁迫耐受性 徐桂红 赵心清 李 宁 白凤武 大连理工大学生命科学与技术学院 辽宁大连 摘要 研究了锌离子对絮凝酵母 # 乙酸胁迫条件下乙醇发酵的影响 结果表明 添加适当浓度的锌离子可以缓解乙酸对自絮凝酵母生长的抑制 进而缩短其发酵周期 其中添加 $% & 锌离子对乙酸胁迫下细胞活性的保护作用最明显 可使 '$% & 乙酸存在时发酵周期缩短近 最终生物量得率提高 乙醇产率提高 同时锌离子还可以使乙酸抑制条件下 发酵液中副产物乳酸和丙酸的含量降低 关键词 自絮凝酵母 锌离子 乙酸胁迫 乙醇发酵 ())* + ' * 中图分类号, 文献标志码 - 文章编号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收到初稿 && 收到修改稿 联系人 赵心清 第一作者 徐桂红 * 女 硕士研究生 基金项目 教育部中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 :;.& & /# " 63-8 (9($497!0/"0.," ) /"0 / " 0! "/! ")"!. 0) 1 / " "/! ; (2")(/(") (()/ 1 0.!/( :;

2 ' 化 工 学 报 第 卷!00(/( ("!!"/"1"./!) )"2"0 )..((.!.(0!0.(/(.!.(0 () / ")() "")/) 1 / ())/0 ) "0/ "( /!/"17(.(."$ /!0"/!1" "/!/( " ) ".//!."/(.!.(0)/"))!00" )/!/"0/!/!0 )/($/ ".."/!/( 17(.( / "./" "0(!)! )( "!0 "1"./(2" "/ 0 /( 2" "/!1" "/!/(.."/!/( 1!."/(.!.(0 "1!."( / " ")"." 1 ($ 0$- )"1+1..!/($ "!)/7(.(!."/(.!.(0/4(.(/ "/!1" "/!/( 引 言 以来源丰富而廉价的纤维质农林废弃物为原料 生产燃料乙醇 是燃料乙醇发展的重要方向 但原 料水解过程中产生的毒性副产物对细胞活性和发酵 具有抑制作用 这些毒性副产物包括弱酸类 醛 类和酚类等 其中乙酸是含量较高的毒性抑制 物 +' 本课题组前期研究表明 当乙酸浓度大于 $% & 时 重组酿酒酵母的木糖利用率和生物量积累受到明显影响 乙酸浓度为 $% & 时 细胞停止利用木糖和生长 对树干毕赤酵母和絮 凝酵母的研究也发现类似的现象 除纤维素原料 水解液中存在和酵母发酵产生的乙酸外 工业乙醇 发酵常被产乳酸或乙酸的细菌污染 因此 研究 如何提高酵母菌对乙酸的耐受性 从而改善乙酸胁 迫条件下细胞的生长和提高乙醇发酵效率具有重要 意义 近年来对乙酸胁迫条件下细胞相关基因的表 + 达研究较多 但对如何消除或降低其毒害作 用的研究还较少!)" 等发现随着 3 值的增加 乙酸对酵母乙醇发酵的抑制得到明显的缓解 因此提出通过提高 3 值 调至 '' 或 时 缓解乙酸对酵母的毒害作用 但酵母生长和发酵的最适 3 值为 *'' 在高浓度乙酸存在时 通过添加大量的碱来调节将增加工业生产的成本 而且提高培养基的 3 值也会增加染菌的可能性 因此需要开发更有效的降低乙酸毒害作用的方法 锌是酵母细胞维持正常生长和代谢所必需的微量元素之一 在细胞代谢中发挥着重要的作 + * 用 本课题组的前期研究结果表明 絮凝酵母 # 在进行高浓度乙醇发酵时 培养基中锌离子的浓度与酵母细胞的胁迫耐性密切相关 调控培养基中的锌离子浓度 可提高酵母细胞的乙醇产量 高温和乙醇耐受性 但锌对其他环境胁迫因子的影响还不清楚 本文研究了 % 发酵罐乙醇批 式发酵中高浓度乙酸存在条件下不同浓度的锌离子对絮凝酵母细胞生长和发酵的影响 以期开发相关的调控策略来缓解乙酸对酵母的毒害作用 实验材料和方法 1 1 菌种自絮凝酵母 # 由本实验室保存 1 培养基斜面培养基 $% & 葡萄糖 酵母粉 * 蛋白胨 琼脂粉 种子培养基 $% & 葡萄糖 酵母粉 * 蛋白胨 批次发酵培养基 $% & 葡萄糖 酵母粉 * 蛋白胨 硫酸锌 ' 乙酸 ' ' 发酵在 % 发酵罐中进行 工作体积为 '% 3 控制为 *' 1 种子活化和批次发酵 菌种保存及种子活化 从斜面上接一环自絮凝酵母到种子培养基中 ' ( & 过夜培养 然后用 % & 柠檬酸钠缓冲液解絮凝 均分成若干管于 & 冷冻保存 作为批次发酵的初始菌种 种子活化是将保存的初始菌种迅速融化 取 到种子培养基中 ' ( & 培养 作为批次发酵的种子 批次发酵 将种子用 % & 柠檬酸钠缓冲液解絮凝 调节 8: ' 接种量接到 '% 的发酵罐中 ( & * 223 <*' * % &!83 发酵罐自动控制 进行发酵 发酵过程中每 定时取样 测定乙醇产量 残糖 生物量及发酵液中各种副产物的含量 每批实验重复 次 1 分析方法 * 葡萄糖浓度 乙醇浓度以及生物量的测定 发酵过程中葡萄糖浓度 乙醇浓度和生物量均按照文献 * 进行测定 * 发酵液中有机酸及甘油的测定 发酵液中柠檬酸 琥珀酸 乳酸 乙酸 丙酸和甘油用高效

3 第 期 徐桂红等 锌离子提高絮凝酵母乙酸胁迫耐受性 液相色谱进行分析 分离条件为 - ("4 3#+ 3 有机酸分析柱 = >(+!0 3".")' % & 3 8 * 为流动相 流速 ' ( & 进样量 柱温 ' 示差折光检测器温度 ' * 发酵性能评价 乙醇得率 由式 计算 /83!4 )$!.) "0 式中 /83!4 为发酵过程中最大乙醇浓度 )$!.) "0 为发酵所消耗的糖 生物量得率 > 由式 计算 > < >(!))!4 )$!.) "0 式中 >(!))!4 为发酵过程积累的最大生物量 实验组的乙醇得率和生物量得率都以对照组的百分数表示 乙醇产率 为发酵过程中最高乙醇产量与达到这一产值所需时间的比值 实验结果与讨论 1 乙酸对自絮凝酵母 /21 发酵性能的影响 乙酸对自絮凝酵母 # 葡萄糖消耗 乙醇生成及生物量的影响 分别研究了乙酸浓度为 图 不同浓度乙酸对自絮凝酵母 # 乙醇生成 糖的消耗及生物量的影响 ($!./10(1""/.."/!/( 1!."/(.!.(0 )"1+1..!/($ "!)/ #1"/!$.)"!0 (!)) -"4 "( "/) "".!("0/( /( (.!/")!0/ ")! "!/"!) )"2"0 :!/!1 "" ")"/!/(2""4 "( "/!") $.)" "/! (!))

4 ( 化 工 学 报 第 卷 ' 和 '$% & 时对自絮凝酵母乙醇发酵的影 响 其抑制作用主要表现在菌体延迟期和发酵周期 的延长 以及生物量的减少 图 如乙酸浓度 为 和 '$% & 时 自絮凝酵母 # 的延迟 期从对照的 * 分别延长到 和 发酵周 期从 分别增加到 * 和 生物量分别 减少为对照的 和 但乙酸对自絮凝 酵母发酵终点的乙醇产量和葡萄糖浓度均没有明显 影响 乙酸对自絮凝酵母 # 乙醇发酵液中 副产物的影响 甘油 乳酸均是乙醇发酵的副产 物 + 甘油含量与菌体的渗透耐性正相关 而乙 酸的胁迫使酵母胞内甘油含量明显降低 图! 高浓度的乳酸抑制微生物的生长 本课题组 前期实验结果表明 当发酵液中乳酸浓度达到 $% & 时 对自絮凝酵母 # 发酵时耗糖速率和乙醇生成产生抑制作用 且乳酸浓度越高抑制作 用越强 ' 图 显示 乙酸添加使发酵液中 乳酸的含量明显降低 远低于其最小抑菌浓度 但有机酸的协同抑制效应会降低乳酸的最小抑菌 浓度 因此在高浓度乙酸存在时 乳酸的含量越 少越好 丙酸是酵母乙醇发酵过程中检测到含量很低的 一种有机酸 但其对酵母的毒害作用比乙酸强 烈 本课题组前期实验结果表明 丙酸对自絮 凝酵母发酵的最小抑制浓度为 '$% & 当丙 酸浓度为 '$% & 时 对酵母抑制率达到 以 上 ' 而添加 '$% & 乙酸时 发酵液中丙酸的 含量高达 $% & 是对照的 ' 倍 图. 发酵液中柠檬酸和琥珀酸的含量差别不明显 而且 不同乙酸的影响程度也没有明显差别 数据未 显示 锌离子对自絮凝酵母 /21 乙酸胁迫耐受 性的影响 锌离子对乙酸胁迫时自絮凝酵母 # 发酵周期的影响 在乙酸存在的条件下 添加适 当浓度的锌离子可以缩短酵母菌生长的停滞期和 发酵周期 尤其是添加 $% & 锌离子时保 护效果最佳 表 $% & 和 '$% & 乙酸 条件下 培养基中加入 $% & 硫酸锌使发 酵周期和对照 只添加乙酸 相比分别缩短 和 可见锌离子添加对细胞活性具有明显的 保护作用 图 不同浓度乙酸对自絮凝酵母 # 发酵液中副产物的影响 ($!./10(1""/.."/!/( 1!."/(.!.(0 )"1+1..!/($ "!)/ #1 + 0./) -"4 "( "/) "".!("0/( /( (.!/")!0 / ")! "!/"!) )"2"0:!/!1 " " ")"/!/(2""4 "( "/!") $% &!."/(.!.(0 '$% &!."/(.!.(0 $% &!."/(.!.(0 '$% &!."/(.!.(0

5 第 期 徐桂红等 锌离子提高絮凝酵母乙酸胁迫耐受性 ) 表 1 不同浓度锌离子对乙酸胁迫条件下自絮凝酵母 /21 发酵周期的影响 3 %1 &!" #$ /21- -."/(.!.(0$%& 6(.($% & ' ' %!$/( " " "/!/( /( " %!$/( " " "/!/( /( " %!$/( " " "/!/( /( " ' * * * * * ' ' * * * * * * ' 6(.( $% & 表 不同浓度锌离子对乙酸存在条件下自絮凝酵母 /21 乙醇得率 生物量得率以及乙醇生成速率的影响 3 %& $ % $ ""!" #$ /21- -."/(.!.(0$% & > ' ' $ > $ > $././ "/!% & &././ "/!% & &././ "/!% & & * ' * ' ' * ' ' * /! ("0 < /83!4 )$!.) "0 >(!)) ("0 > < >(!))!4 )$!.) "0 /!2 "/(. 0./(!/" 锌离子对乙酸胁迫时 # 发酵过程中 生物量积累及乙醇生成的影响 酵母发酵过程中生 物量积累得越快 则菌体生长得越好 发酵性能越 好 当培养基中含有 和 '$% & 乙酸时 添 加不同浓度的锌离子均使发酵最终的生物量明显大 于对照 图 可见锌离子的添加可在一定程度 上缓解乙酸对自絮凝酵母 # 生长的抑制 在 '$% & 乙酸胁迫时锌的保护作用尤为明显 表 列出了在乙酸浓度为 ' 和 '$% & 时不同浓度锌离子对自絮凝酵母 # 发酵乙醇 得率 生物量得率以及乙醇生成速率的影响 在乙 酸浓度为 '$% & 时 * 个水平的锌离子添加均 使乙醇得率和乙醇生成速率有所提高 使最终生物 量得率明显提高 $% & 锌离子使生物量得 率与对照相比提高了 而乙酸浓度为 $% & 时 不同浓度的锌离子对乙醇得率和乙醇生成速率影响不大 但使生物量得率明显增加 可 见添加适量的锌离子可以使自絮凝酵母在乙酸胁迫 时生物量明显提高 同时也提高了乙醇得率和发酵 效率 锌离子对乙酸胁迫条件下自絮凝酵母 #+ 发酵液中副产物的影响 锌离子添加可以使 不同浓度乙酸抑制条件下发酵液中副产物乳酸的最高含量有所降低 其中 '$% & 乙酸浓度下锌的作用最明显 由图 *! 可以看出 $% & 硫酸锌的添加使乳酸生成降低得最明显 而其他两个添加浓度无明显差异 同时可以看到 不同浓度锌离子的添加明显降低了丙酸的含量 图 * 当发酵液中乙酸含量为 '$% & 时 最终发酵液中丙酸含量均降低至对照的一半 丙酸浓度的降低可缓解丙酸与高浓度乙酸的协同抑制作用 推测这种协同抑制作用的改善也许是锌离子提高酵母细胞活性 缩短发酵周期的一个原因 利用絮凝酵母进行乙醇连续发酵可提高细胞密 度 提高乙醇产率 具有良好的工业应用前景 本研究发现絮凝酵母在高达 '$% & 的乙酸中仍然可以生长和发酵 说明絮凝酵母具有良好的乙酸耐受性 而目前的报道中酵母对乙酸的最高耐受浓度是 *$% & 乙酸是纤维素原料水解的主要副产物 研究表明水解产物中乙酸的质量浓度可达 $% & 对木质纤维素水解液的脱毒方法已有很多报道 包括物理 化学 生物及理化生结合法 其中用碱将 3 值调到 然后再调到发酵所需 3 值 是目前对水解液脱毒的有效方法之

6 化 工 学 报 第 卷 图 不同浓度锌离子添加对乙酸存在条件下自絮凝酵母 # 生长和发酵的影响 ($!./10(1""/7(.) " "/!/( (!)) 1)"1+1..!/($ "!)/ # (/!."/(.!.(0 -"4 "( "/) "".!("0/( /( (.!/")!0/ " )! "!/"!) )"2"0:!/!1 "" ")"/!/(2" "4 "( "/!") 7(..."/!/($% & = ' 一 但该方法产生大量沉淀 增加了成本 本文通过添加适当浓度的锌离子缓解乙酸对絮凝酵母的抑制作用 不需要大幅度调节 3 值 更容易工业化操作 结 论 乙酸明显抑制自絮凝酵母 # 的生长 图 * 不同浓度锌离子添加对乙酸存在条件下自絮凝酵母 # 发酵液中副产物的影响 ($*!./10(1""/7(.) " "/!/(!./(.!.(01)"1+1..!/($ "!)/ # (/!."/(.!.(0 -"4 "( "/) "".!("0/( /( (.!/"!0/ ")! "!/"!) )"2"0:!/!1 "" ")"/!/(2" "4 "( "/!") 7(..."/!/($% & = ' 和发酵 使延滞期增加 发酵周期延长 最终生物量减少 培养基中添加锌离子使乙酸胁迫时 #+ 菌体的延滞期和发酵周期缩短 最终生物量也明显提高 但未提高最终的乙醇产量 在培养基中添加 $% & 的硫酸锌时 对乙酸胁迫条件下 # 的生长和乙醇发酵

7 第 期 徐桂红等 锌离子提高絮凝酵母乙酸胁迫耐受性 具有明显促进作用 * 高浓度乙酸胁迫下添加硫酸锌可以使发酵液中副产物乳酸的含量有所降低 并可明显减低副产物丙酸的含量. %(3$4($ 李洪兴 6!$ (!! 张笑然 "? 沈煜 :$?$) "$ 董永胜 >! (! ($ 鲍晓明 ( (/)!0/ "("1"./) "&# "!#!0 ""2!/./" "!)")( (.")) 1 "/! 0./( 1 ($.")"! "2(" % #*+" 生物工程学报 4 ""!5!/! :! ) A# " 1"./ 1 3!0!./(.!."/(.!.(0 "/! 0./(2(/ "&#"!# (.!) *, -". * +* ""!5!/! :! ) A# " /"!./( "1"./)1!./(.!.(0!0!."/(.!.(0!/0(1""/ /" "!/") "/! 0./( "&# "!# (.!) /00-". 5 '+ * :($ ($7 B!$ (?!$?!$?!?($ ( "/! (. )/0 1 (/"!./(2" "1"./) 1 " 11!!0!."/(.!.(0 "&#"!# 1-,%*,"14 * +' ' %(>($7 (?!?($ (!).( / ") (1/)( ") )" /11!!0!."/(.!.(0( "&#"!# /00-". 67 '+ * %( >"( 林贝 6! (9($ "$ 葛旭萌 >!( "$ 白凤武 ""1"./)10(/"!.(0 0 )!/" + 0./) 1. )/2" "/! 1" "/!/( 1 4 )"+/((7($ "&#"!# ' + % #*+" 中国生物工程杂志 5 + $ (!$!$ 宋向阳 %C "(1"$ 吕美峰 " 陈牧 8!$ (! 欧阳嘉?$,(!$ 勇强 1"./11" "/!/( ( ( (/( 11" "/!/( 1 "/)" /1..!/($ "!)/ *+" 生物学杂志 6 *+ # (!!$!(0! )! " D+ "(!@" "+ (0" (0"/(1(.!/( 1 "&#"!# $"")"9("01/"!."/!."/(.!.(0 -".% 8 (! #>".5" D+ (. "4 "))( $! (22($ / " 3!! +"$ ( "&# "!# ") )"/!."/(.!.(0 1-,%*," 1 '' +!)" "0!5!. B 3?!/! 1"./1!."/(.!.(0!0 3 / ".1" "/!/( 1$.)"!04 )"/"/!!$""/(.! "$("""0)/!( 1 "&#"!# - # # 12 * '+ 6! (9($>!( "$ 6(.!0 "!)/)/"))/"!." (./("/! )! ($" * ( ")) "$!! % % ) 6(. ( "!)/ ".!() ) (22"0 ( ")/!)()! D)!/((! ".!>($ 1 "/!3 ")/!)()!0:"/4(1(.!/( (. ")/! (.)( "/@""/(.) "?5 ($" +'* 6!! 赵楠 6! "( 赵飞 %(?! 李玉花 -02!.")( ")"!. 7(.1($" /"( "# 生物技术通讯 2 + * * 6! (9($ "!$@" "$B!$ ($?! B" (">!( "$!./17(.) " "/!/( / "( 2" "/1"/!/"!."!0"/! ("01 )"1+1..!/($ "!)/(./() "/!1" "/!/( * 1 8''+ ' 6!$ ($ 张春明 6(%(! 孜力汗 6! (9($ 赵心清 6! :! "( 赵大伟 >!( "$ 白凤武!./ 1!..!/"0 + 0./) 0($ 0()/(!$""..($ $ /!0"/!1" "/!/( 1 / " )"1+1..!/($ "!)/ # $ % # *+" "## " 过程工程学报 12 * + 6!$ "$ ($ (!$ %(! 6 $$( 6!$ (!!!$ %"( 1"./) 1 ((.!.(0!0 3 "/!1" "/!/( "&#"!# (.!))!2!!) /00 & 174 * + %(! 6! "$ >!( "$ - ( 2!/(2".)"./(2"!/. 1" "/!/(."))12" ($ $!2(/ "/!1" "/!/( (/ )"1+1..!/($ "!)/ /00-". 6 + %?($ "$?!1"(3" ( ($@ "!6!$ >2" "/1 )/"))!0"/! 0./( 1 "/!$"(. "&#"!# 0".+)/"))1 "!/!0 ( ( (/) *, -". 8 +! "7!0" (5!)) 1"(!!" (.!/..2")( 1$.)"/"/! "&#"!# %& 4 ''+'

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