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1 学 习 目 标 掌 握 蛋 白 质 的 概 念 生 物 功 能 和 分 子 组 成 掌 握 氨 基 酸 的 结 构 通 式 和 20 种 氨 基 酸 的 名 称 符 号 结 构 分 类 ; 掌 握 氨 基 酸 的 理 化 性 质 ; 熟 悉 肽 和 活 性 肽 的 概 念 掌 握 蛋 白 质 的 一 二 三 四 级 结 构 的 特 点 及 其 重 要 化 学 键 了 解 蛋 白 质 结 构 与 功 能 间 的 关 系 熟 悉 蛋 白 质 在 食 品 加 工 中 的 性 质 及 功 能

2 一 蛋 白 质 的 概 述 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋 白 质 (Protein,pr) : 是 一 切 生 物 体 中 普 遍 存 在 的, 由 天 然 氨 基 酸 按 照 一 定 的 顺 序, 通 过 肽 键 连 接 而 成 的 一 条 或 多 条 肽 链 构 成 的 生 物 大 分 子 ; 其 种 类 繁 多, 各 具 有 一 定 的 相 对 分 子 质 量, 复 杂 的 分 子 结 构 和 特 定 的 生 物 功 能 ; 是 表 达 生 物 遗 传 性 状 的 一 类 主 要 物 质 ( 一 ) 蛋 白 质 的 元 素 组 成 一 般 蛋 白 质 含 氮 量 平 均 为 16%, 即 1 份 氮 素 相 当 于 6.25 份 蛋 白 质, 此 即 蛋 白 质 系 数

3 按 分 子 形 状 按 分 子 组 成 和 溶 解 度 分 球 状 蛋 白 纤 维 状 蛋 白 单 纯 蛋 白 结 合 蛋 白 蛋 白 质 的 分 类 动 物 体 内 广 泛 存 在 清 蛋 白 谷 蛋 白 球 蛋 白 组 蛋 白 醇 溶 蛋 白 精 蛋 白 硬 蛋 白 核 蛋 白 磷 蛋 白 脂 蛋 白 糖 蛋 白 色 蛋 白 从 营 养 学 上 根 据 所 含 氨 基 酸 的 种 类 和 数 量 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 齐 全, 比 例 合 适 半 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 齐 全, 但 比 例 不 合 适 不 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 不 齐 全

4 蛋 白 质 的 生 物 学 重 要 性 1. 蛋 白 质 是 生 物 体 重 要 组 成 成 分 分 布 广 含 量 高 2. 蛋 白 质 具 有 重 要 的 生 物 学 功 能 1) 催 化 生 物 化 学 反 应 ( 酶 ) 2) 结 构 成 分 ( 结 缔 组 织 的 胶 原 蛋 白 皮 肤 的 弹 性 蛋 白 膜 蛋 白 ) 3) 贮 藏 ( 卵 清 蛋 白 种 子 蛋 白 ) 4) 物 质 运 输 ( 血 红 蛋 白 脂 蛋 白 电 子 传 递 体 ) 5) 细 胞 运 动 ( 肌 肉 收 缩 的 肌 球 蛋 白 肌 动 蛋 白 ) 6) 激 素 功 能 ( 胰 岛 素 ) 7) 防 御 功 能 ( 抗 体 血 凝 蛋 白 ) 8) 接 受 传 递 信 息 ( 受 体 蛋 白 味 觉 蛋 白 ) 9) 调 节 细 胞 生 长 分 化 和 遗 传 信 息 的 表 达 ( 阻 遏 蛋 白 ) 3. 氧 化 供 能

5 氨 基 酸 (amino acids)

6 氨 基 酸 的 分 类 氨 基 酸 蛋 白 质 氨 基 酸 非 蛋 白 质 氨 基 酸 基 本 氨 基 酸 : 具 有 密 码 子 不 常 见 的 蛋 白 质 氨 基 酸 1 基 本 氨 基 酸 ( 编 码 的 蛋 白 质 氨 基 酸 ): 组 成 蛋 白 质, 20 种, 又 称 为 天 然 氨 基 酸 常 见 的 蛋 白 质 氨 基 酸 2 稀 有 氨 基 酸 : 常 见 氨 基 酸 修 饰 而 来 3 非 蛋 白 质 氨 基 酸 : 存 在 于 生 物 体 内 但 不 组 成 蛋 白 质 ( 约 150 种 ), 大 多 是 蛋 白 质 中 存 在 的 L 型 氨 基 酸 的 衍 生 物

7 基 本 氨 基 酸 的 分 类 - 方 式 1 按 R 基 结 构 分 类 (1) 脂 肪 族 氨 基 酸 Aliphatic Amino Acids 一 氨 基 一 羧 基 的 氨 基 酸 Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser.Thr,Cys,Met 一 氨 基 二 羧 基 的 氨 基 酸 ( 酸 性 氨 基 酸 ) 及 酰 胺 :Asp,Glu.Asn,Gln 二 氨 基 一 羧 基 的 氨 基 酸 ( 碱 性 氨 基 酸 ):Arg,Lys (2) 芳 香 族 氨 基 酸 : Phe,Tyr,Trp Aromatic Amino Acids (3) 杂 环 族 氨 基 酸 :His,Pro

8 (1) 侧 链 为 烃 链 的 中 性 氨 基 酸 丙 氨 酸 异 亮 氨 酸 亮 氨 酸 缬 氨 酸 甘 氨 酸 R 基 均 为 中 性 烷 基,R 基 对 分 子 酸 碱 性 影 响 很 小, 它 们 几 乎 有 相 同 的 等 电 点 从 Gly 至 Ile,R 基 团 疏 水 性 增 加 Gly 是 唯 一 不 含 手 性 碳 原 子 的 氨 基 酸, 不 具 旋 光 性, Gly 的 侧 链 介 于 极 性 与 非 极 性 之 间, 也 把 它 归 为 非 极 性 类

9 (2) 侧 链 含 有 羟 基 的 氨 基 酸 (2 种 ) Ser 的 -CH 2 OH 基 (pk a =15) 在 生 理 条 件 下 不 解 离, 但 在 大 多 数 酶 的 活 性 中 心 都 发 现 有 Ser 残 基 存 在 Ser 和 Thr 的 -OH 往 往 与 糖 链 相 连, 形 成 糖 蛋 白 丝 氨 酸 苏 氨 酸

10 (3) 侧 链 含 硫 原 子 的 氨 基 酸 Sulfur Containing Amino Acids Cys 的 R 中 含 巯 基 (-SH) 两 个 Cys 的 巯 基 氧 化 可 以 生 成 二 硫 键, 生 成 胱 氨 酸 Met 在 生 物 合 成 中 是 一 种 重 要 的 甲 基 供 体, 蛋 白 质 合 成 的 第 一 个 氨 基 酸 蛋 氨 酸 半 胱 氨 酸

11 两 个 半 胱 氨 酸 氧 化 可 以 形 成 胱 氨 酸

12 (4) 侧 链 含 有 羧 基 或 酰 胺 基 的 氨 基 酸 (4 种 ) 天 冬 氨 酸 侧 链 为 - 羧 基 谷 氨 酸 侧 链 为 - 羧 基 天 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺 Asp 和 Glu 它 们 是 唯 一 在 生 理 条 件 下 带 有 负 电 荷 的 的 两 个 氨 基 酸

13 (5) 侧 链 含 有 碱 性 基 团 的 氨 基 酸 (3 种 ) 组 氨 酸 赖 氨 酸 精 氨 酸 侧 链 有 咪 唑 环 侧 链 有 - 氨 基 侧 链 有 胍 基 它 们 是 唯 一 在 生 理 条 件 下 带 有 正 电 荷 的 的 三 个 氨 基 酸

14 碱 性 氨 基 酸 Basic Amino Acids Lys 侧 链 氨 基 的 pka 为 10.53, 生 理 条 件 下,Lys 侧 链 带 有 一 个 正 电 荷 ( NH 3+ ), 侧 链 的 氨 基 反 应 活 性 增 大 胶 原 蛋 白 中 的 Lys 侧 链 氧 化 时 能 形 成 很 强 的 分 子 间 ( 内 ) 交 联 Arg 是 碱 性 最 强 的 氨 基 酸, 侧 链 上 的 胍 基 是 已 知 碱 性 最 强 的 有 机 碱,pKa 值 为 12.48, 生 理 条 件 下 完 全 质 子 化 与 NaOH 相 当 His 是 pka 值 最 接 近 生 理 ph 值 的 一 种 ( 游 离 氨 基 酸 中 为 6.00, 在 多 肽 链 中 为 7.35 ), 是 在 生 理 ph 条 件 下 唯 一 具 有 缓 冲 能 力 的 氨 基 酸 His 在 酶 的 酸 碱 催 化 机 制 中 起 重 要 作 用 它 往 往 存 在 于 许 多 酶 的 活 性 中 心

15 (6) R 为 芳 香 族 基 团 的 氨 基 酸 (3 种 ) Aromatic Amino Acids

16 R 为 芳 香 族 基 团 的 氨 基 酸 三 种 芳 香 族 氨 基 酸 在 紫 外 光 区 都 吸 收 紫 外 光, 在 中 性 ph 条 件 下, 色 氨 酸 和 酪 氨 酸 的 紫 外 吸 收 峰 在 280nm, 而 苯 丙 氨 酸 的 在 260nm, 大 多 数 蛋 白 质 中 都 含 有 色 氨 酸 和 酪 氨 酸 或 其 中 的 一 种, 所 以 溶 液 中 280nm 吸 收 的 测 量 常 用 来 估 算 蛋 白 质 的 浓 度 也 与 蛋 白 质 发 荧 光 有 关

17 (7) 杂 环 氨 基 酸 : 脯 氨 酸, 组 氨 酸 一 种 亚 氨 酸, 具 有 固 定 的 构 型 Pro 的 α- 亚 氨 基 是 环 的 一 部 分, 因 此 具 有 特 殊 的 刚 性 结 构 一 般 出 现 在 两 段 α- 螺 旋 之 间 的 转 角 处,Pro 残 基 所 在 的 位 置 必 然 发 生 骨 架 方 向 的 变 化,

18 基 本 氨 基 酸 结 构 特 点 小 结 链 氨 基 酸 : 缬 氨 酸 亮 氨 酸, 异 亮 氨 酸 含 羟 基 的 氨 基 酸 : 丝 氨 酸 苏 氨 酸 含 硫 的 氨 基 酸 : 半 胱 氨 酸 ( 含 巯 基 ) 甲 硫 氨 酸 ( 含 硫 甲 基 ) 含 苯 环 的 氨 基 酸 : 苯 丙 氨 酸 色 氨 酸 酪 氨 酸 含 胍 基 的 氨 基 酸 : 精 氨 酸 含 咪 唑 基 的 氨 基 酸 : 组 氨 酸 亚 氨 基 酸 : 脯 氨 酸 含 酰 胺 的 氨 基 酸 : 天 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺 含 吲 哚 基 的 氨 基 酸 : 色 氨 酸 含 ε- 氨 基 的 氨 基 酸 : 赖 氨 酸

19 基 本 氨 基 酸 的 分 类 - 方 式 2 1. 非 极 性 R 基 氨 基 酸, 侧 链 无 极 性 按 侧 链 R 基 极 性 分 类 甘 氨 酸, 丙 氨 酸, 缬 氨 酸, 亮 氨 酸, 异 亮 氨 酸, 甲 硫 氨 酸, 苯 丙 氨 酸, 色 氨 酸 脯 氨 酸, 2. 极 性 R 基 氨 基 酸 (1) 不 带 电 荷 的 极 性 R 基 的 aa: 丝 氨 酸, 苏 氨 酸, 酪 氨 酸, 半 胱 氨 酸, 天 冬 酰 胺, 谷 氨 酰 胺 (2) 带 正 电 荷 的 极 性 R 基 aa( 碱 性 aa): 赖 氨 酸, 精 氨 酸, 组 氨 酸 (3) 带 负 电 荷 的 极 性 R 基 aa( 酸 性 aa): 天 冬 氨 酸, 谷 氨 酸

20 1. nonpolar (hydrophobic) amino acids

21 2. Polar Uncharged Amino Acids

22 3. Positively charged at physiological ph R groups have one - NH 2. Amino Acids with Basic Side Chains R groups are positively charged at neutral ph (=7.0). AAs are highly hydrophilic. 组 氨 酸 赖 氨 酸 精 氨 酸 侧 链 有 咪 唑 环 侧 链 有 - 氨 基 侧 链 有 胍 基 Positively charged at physiological ph

23 4. Amino acids with acidic side chains R groups have COOH. The acidic amino acids Amino Acids with Acidic Side Chains R groups are negatively charged at physiological ph (=7.4). AAs are soluble in H 2 O. Aspartic acid glutamic acid (Asp or D) (Glu or E) 天 冬 氨 酸 侧 链 为 - 羧 基 谷 氨 酸 侧 链 为 - 羧 基

24 极 性 与 非 极 性 与 蛋 白 质 空 间 结 构 形 成 密 切 相 关 非 极 性 aa 一 般 形 成 蛋 白 质 的 疏 水 核 心, 带 电 荷 的 aa 和 极 性 aa 位 于 表 面 Protein structure Non-polar groups do not interact with water Polar groups readily interact with water

25 氨 基 酸 的 疏 水 性 和 蛋 白 质 三 维 结 构 思 考 : 假 设 该 序 列 只 是 大 的 球 蛋 白 的 一 部 分, 下 面 氨 基 酸 残 基 中 哪 些 可 能 分 布 在 蛋 白 的 外 表 面, 哪 些 分 布 在 内 部? 天 冬 氨 酸 ; 异 亮 氨 酸 ; 苏 氨 酸 ; 缬 氨 酸 ; 谷 氨 酰 胺 ; 赖 氨 酸 分 析 : 分 布 在 外 表 面 的 为 极 性 和 带 电 荷 的 残 基 :Asp Gln 和 Lys; 分 布 在 内 部 的 是 非 极 性 的 氨 基 酸 残 基 :Try Leu 和 Val;Thr 尽 管 有 极 性, 但 疏 水 性 也 很 强, 因 此, 它 出 现 在 外 表 面 和 内 部 的 可 能 性 都 有

26 氨 基 酸 的 疏 水 性 和 蛋 白 质 三 维 结 构 思 考 : 有 一 个 蛋 白 质 分 子 在 ph7 的 水 溶 液 中 可 以 折 叠 成 球 状, 通 常 是 带 极 性 侧 链 的 氨 基 酸 位 于 分 子 外 部, 带 非 极 性 侧 链 的 氨 基 酸 位 于 分 子 内 部 请 回 答 : (1) 在 Val Pro Phe Asp Lys Ile 和 His 中, 哪 些 位 于 分 子 内 部, 哪 些 位 于 分 子 外 部? (2) 为 什 么 在 球 蛋 白 内 部 和 外 部 都 能 发 现 Gly 和 Ala? (3)Ser Thr Asn 和 Gln 都 是 极 性 氨 基 酸, 为 什 么 会 在 分 子 内 部 发 现? (4) 在 球 蛋 白 的 分 子 内 部 和 外 部 都 能 找 到 Gys, 为 什 么?

27 氨 基 酸 的 疏 水 性 和 蛋 白 质 三 维 结 构 分 析 :(1)Val Pro Phe Ile 是 带 有 非 极 性 测 链 的 氨 基 酸, 这 些 氨 基 酸 残 基 位 于 分 子 内 部 ;Asp Lys His 是 带 有 极 性 侧 键 的 氨 基 酸, 这 些 氨 基 酸 残 基 位 于 分 子 的 外 部 (2) 因 为 Ala 和 Gly 两 者 的 侧 链 都 比 较 小, 疏 水 性 和 极 性 都 小 ;Gly 只 有 一 个 H + 与 α 碳 原 子 相 连,Ala 只 有 CH3 与 α 碳 原 子 相 连, 故 它 们 既 可 以 出 现 在 分 子 内 部, 也 可 以 出 现 在 分 子 外 部 (3)Ser Thr Asn Gln 在 ph 7.0 时 含 有 不 带 电 荷 的 极 性 侧 链, 参 与 分 子 内 部 的 氢 键 形 成, 从 而 减 少 了 它 们 的 极 性, 故 会 在 分 子 内 部 发 现 (4) 因 为 Cys 属 于 不 带 电 荷 的 极 性 氨 基 酸, 可 位 于 分 子 外 部, 但 又 由 于 Cys 常 常 参 与 链 内 和 链 间 的 二 硫 键 形 成, 使 其 极 性 减 弱 ( 少 ),

28 基 本 氨 基 酸 的 分 类 - 方 式 3 Essential/Non-Essential Amino Acids 按 氨 基 酸 是 否 能 在 人 体 内 合 成 分 : (1) 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 不 能 合 成 的 氨 基 酸, 必 须 从 食 物 中 摄 取, 有 八 种 :Lys, 赖 氨 酸 Trp, 色 氨 酸 Met 甲 硫 氨 酸 Met 苯 丙 氨 酸 Val 缬 氨 酸 Leu 亮 氨 酸 Ile 异 亮 氨 酸 Thr 苏 氨 酸 (2) 非 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 可 以 合 成 的 氨 基 酸 有 十 种 (3) 半 必 需 氨 基 酸 : 指 人 体 内 可 以 合 成 但 合 成 量 不 能 满 足 人 体 需 要 ( 特 别 是 婴 幼 儿 时 期 ) 的 氨 基 酸, 有 两 种 : 组 氨 酸 (His) 精 氨 酸 (Arg)

29 2 不 常 见 蛋 白 质 氨 基 酸 也 称 修 饰 氨 基 酸, 是 在 蛋 白 质 合 成 后, 由 基 本 氨 基 酸 修 饰 而 来 1 胱 氨 酸 (Cystine) 广 泛 地 存 在 于 蛋 白 质 中 它 由 两 个 半 胱 氨 酸 的 巯 基 氧 化 之 后 形 成 的, 形 成 二 硫 键

30 不 常 见 蛋 白 质 氨 基 酸 及 非 蛋 白 质 氨 基 酸

31 3 非 蛋 白 质 氨 基 酸 : 存 在 于 生 物 体 内, 但 不 组 成 蛋 白 质 的 呈 游 离 或 结 合 态 的 氨 基 酸, 约 150 种, 具 有 多 种 生 理 功 能 (1) L-α- 氨 基 酸 的 衍 生 物 L- 瓜 氨 酸 和 L- 鸟 氨 酸 是 合 成 精 氨 酸 的 中 间 产 物 (2)D-α- 氨 基 酸 D-Ala 存 在 于 肽 聚 糖 中,D-Phe 是 短 杆 菌 肽 S 的 组 分 (3)β γ δ- 氨 基 酸 β-ala 是 泛 酸 的 前 体,γ- 氨 基 丁 酸 是 传 递 神 经 冲 动 的 化 学 介 质

32 真 核 生 物 中 的 D 型 氨 基 酸 1990 年 以 后 陆 续 发 现 哺 乳 动 物 体 内 大 量 存 在 D-Ser, D-Asn D-Ser 在 大 脑 前 叶 中 与 谷 氨 酸 受 体 (NMDA 受 体 ) 的 分 布 一 致, 能 激 活 NMDA 受 体, 与 学 习 记 忆 有 关 而 D-Asn 则 在 大 鼠 的 所 有 组 织 中 都 有 分 布, 可 能 与 成 熟 有 关

33 四 氨 基 酸 的 酸 碱 性 质 P65 ( 一 ) 氨 基 酸 的 兼 性 离 子 形 式 兼 性 ( 两 性 ) 离 子 : 指 在 同 一 分 子 上 带 有 能 释 放 质 子 的 正 离 子 基 团 和 能 接 受 质 子 的 负 离 子 基 团 兼 性 离 子 本 身 既 是 酸 又 是 碱 因 此 它 既 可 以 和 酸 反 应, 也 可 以 和 碱 反 应 1 晶 体 溶 点 高 离 子 晶 格, 不 是 分 子 晶 格 2 不 溶 于 非 极 性 溶 剂 极 性 分 子 3 介 电 常 数 高 水 溶 液 中 的 氨 基 酸 是 极 性 分 子

34 ( 二 ) 氨 基 酸 的 解 离 at low ph, Amino acids can be diprotic acids, or even triprotic acids if their R groups are ionizable. (have > one dissociable H+). 每 个 氨 基 酸 所 带 电 荷? triprotic diprotic triprotic 完 全 质 子 化 的 氨 基 酸 可 以 看 成 二 元 酸 或 三 元 酸

35 氨 基 酸 的 解 离 酸 性 环 境 中 性 环 境 碱 性 环 境 氨 基 后 解 离 羧 基 先 解 离 零 电 荷 氨 基 酸 解 离 集 团 的 解 离 有 顺 序, 不 同 解 离 集 团 解 离 过 程 中 的 电 荷 变 化

36 甘 氨 酸 的 解 离 曲 线 pka 值 pka 值 正 电 荷 越? 负 电 荷 越?

37 氨 基 酸 的 解 离 -- pka 值 pka 值 就 是 指 某 种 解 离 基 团 有 一 半 解 离 时 的 ph 值,pK 值 的 大 小 可 以 表 示 解 离 基 团 酸 性 的 强 弱,pK 值 小 则 酸 性 强 在 pka 时 缓 冲 能 力 最 强 COOH ½ COOH + ½ COO- (1) α-cooh( 羧 基 ) pk 值 在 2.0 左 右, 当 ph>3.5, α-cooh 以 α-coo- 形 式 存 在 (2) α-νη 2 ( 氨 基 )pk 值 在 9.4 左 右, 当 ph<8.0 时, α-νη 2 以 α-νη + 3 形 式 存 在

38 氨 基 酸 解 离 的 PKa His 是 唯 一 具 有 近 中 性 pka 基 团 (imidazole) 的 氨 基 酸

39 氨 基 酸 氨 基 和 羧 基 的 解 离 和 PKa 值 当 溶 液 的 ph 值 在 范 围 内 时, 氨 基 酸 是 两 性 离 子 ( 偶 极 离 子 ) 存 在, 为 什 么? 熔 点 : 氨 基 酸 的 熔 点 一 般 都 比 较 高, 一 般 都 大 于 200, 超 过 熔 点 以 上 氨 基 酸 分 解 产 生 胺 和 二 氧 化 碳

40 Titrations of polyprotic amino acids 滴 定 Titration of glutamic acid three stages (three ionization steps three pk a values)

41 Titrations of polyprotic amino acids Titration of lysine. three stages (three ionization steps three pk a values)

42 Henderson-Hasselbalch equation Ans: ph = pka + log [A-]/[HA] pka ph = log [HA]/[A-] antilog (pka ph) = [HA]/[A-] antilog ( ) = [HA]/[A-] 4 = [HA]/[A-] or 4[A-] = [HA] Therefore, at ph 5.4, 4/5 (80%) of the histidine will be in the protonated form.

43 思 考 题 2012 年 厦 门 大 学 生 物 化 学 一 多 肽 有 侧 链 羧 基 30 个 (pk1=4.3), 咪 唑 基 15 个 (pk2=6.0), 氨 基 10 个 (pk3=10) 两 端 羧 基, 氨 基 的 pk 分 别 为 COOH=3.5 和 NH4 + =9.5 求 该 蛋 白 的 PI 值 分 析 : 1) 全 部 质 子 化 后 ( 正 ) 电 荷 ( 氨 基 ): =26 2) 全 部 羧 基 ( 零 电 荷 ):30+1=30( 3)30 个 羧 基 只 需 解 离 26 个 就 可 使 该 肽 位 于 等 电 点 ( 这 时 侧 链 有 25 个 解 离, 还 有 5 个 未 解 离 ) ph = pk a +log 10 [A-] [HA] 25 5

44 氨 基 酸 的 等 电 点 和 计 算 氨 基 酸 解 离 程 度 取 决 于 所 处 溶 液 的 酸 碱 度 1 氨 基 酸 的 等 电 点 (isoelectric point, pi) : 指 氨 基 酸 的 正 离 子 浓 度 和 负 离 子 浓 度 相 等 时 的 溶 液 的 ph 值 称 为 该 氨 基 酸 的 等 电 点, 用 符 号 pi 表 示 ( 或 使 氨 基 酸 净 电 荷 为 零 时 溶 液 的 ph 值 )

45 等 电 点 的 计 算 : 中 性 氨 基 酸 : 以 Gly 为 例 + COOH H 3 N CH 2 K 1 H + + COO - H 3 N CH 2 COO - H 2 N CH 2 Gly + Gly + - Gly - K 2 H + K 1 = [Gly± ] [H + ] [Gly + ] K 2 = [Gly- ] [H + ] [Gly ± ] pi 时, [Gly + ] = [Gly - ] [Gly ± ] [H + ] K 1 = [Gly± ] K 2 [H + ] [H + ] 2 =K 1 K 2 ph=(pk 1 +pk 2 )/2 pi=(pk 1 +pk 2 )/2 pi =( )/2=5.97 Gly

46 氨 基 酸 的 等 电 点 等 电 点 相 当 于 该 aa 两 性 离 子 状 态 两 侧 解 离 基 团 pk 值 之 和 的 一 半 中 性 氨 基 酸 PI = (Pk a- 羧 基 + Pk a- 氨 基 )/2 酸 性 氨 基 酸 PI = (Pk a- 羧 基 + Pk 侧 链 羧 基 )/2 碱 性 氨 基 酸 PI = (Pk a- 氨 基 + Pk 侧 链 氨 基 )/2 即 : 等 电 点 ph 值 与 离 子 浓 度 无 关, 只 取 决 于 兼 性 离 子 两 侧 基 团 的 pk 值 是 否 随 PH 变 化?

47 酸 性 氨 基 酸, 以 Asp 为 例 :

48 碱 性 氨 基 酸, 以 Lys 为 例 : pk 1 -COOH = 2.2 pk 2 NH + 3 = 9.0 pk 3 -R group = 10.5 pi = (pk 2 + pk 3 )/2 = (9+10.5)/2 = 9.75

49 氨 基 酸 等 电 点 思 考 加 酸 H + 晶 体 H + 加 碱 H + H + H + PH 小 于 7 PH=7 PH 大 于 7 PH 问 题 1: 把 一 个 氨 基 酸 结 晶 加 入 ph7.0 的 纯 水 中, 得 到 ph6.0 的 溶 液, 此 氨 基 酸 的 pi 值 是 大 于 6.0? 小 于 6.0? 还 是 等 于 6.0? ( 小 于 6.0)

50 2 氨 基 酸 在 等 电 点 的 特 点 : (a) (b) 等 电 点 时 缓 冲 能 力 最 小 (c) 蛋 白 质 等 电 点 时 溶 解 度 最 小 蛋 白 质 等 电 点 沉 淀 思 考 : 蛋 白 质 的 等 电 点 和 等 离 子 点

51 氨 基 酸 的 甲 醛 滴 定 法 在 一 般 情 况 下,α NH + 3 在 ph12-13 时 才 能 出 现 解 离, 一 般 的 指 示 剂 则 难 以 指 示 加 入 过 量 甲 醛, 滴 定 过 程 中 降 低 了 氨 基 的 碱 性 使 滴 定 曲 线 向 低 ph=9 转 移 ( 是 非 题 ) 用 甲 醛 滴 定 法 测 定 氨 基 酸 的 含 量 时, 甲 醛 的 作 用 是 使 氨 基 酸 的 -NH3 + 酸 性 增 强 南 京 大 学 2002 年 生 物 化 学

52 六 氨 基 酸 的 化 学 性 质 P135 1)α-NH2 参 与 的 反 应 (1). 与 亚 硝 酸 反 应 (2). 与 酰 化 试 剂 反 应 (3). 烃 基 化 反 应 (4). 西 佛 碱 反 应 (5). 脱 氨 基 反 应 2)α-COOH 参 与 的 反 应 (1). 成 盐 和 成 酯 反 应 (2). 成 酰 氯 反 应 (3) 脱 羧 基 反 应 (4) 叠 氮 反 应 3) 由 α- 氨 基 与 羧 基 共 同 参 与 的 反 应 (1) 茚 三 铜 反 应 ;(2) 成 肽 反 应 4). 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应

53 ( 一 )a- 氨 基 参 与 的 反 应 1. 与 亚 硝 酸 反 应 室 温 下, 与 亚 硝 基 作 用 生 产 氮 气 根 据 氮 气 体 积, 计 算 氨 基 酸 的 量

54 2. 与 酰 化 试 剂 反 应 氨 基 酸 的 氨 基 与 酰 氯 或 酸 酐 在 弱 碱 溶 液 中 发 生 作 用 时, 氨 基 即 被 酰 基 化 例 如 与 苄 氧 ( 苯 甲 氧 ) 甲 酰 氯 反 应

55

56 3. 烃 基 化 反 应 Sanger 试 剂 Sanger 法 2,4- 二 硝 基 氟 苯 (FNDB) 在 碱 性 条 件 下, 能 够 与 肽 链 N- 端 的 游 离 氨 基 作 用, 生 成 二 硝 基 苯 衍 生 物 在 酸 性 条 件 下 水 解, 得 到 黄 色 DNP- 氨 基 酸 该 产 物 能 够 用 乙 醚 抽 提 分 离 不 同 的 DNP- 氨 基 酸 可 以 用 色 谱 法 进 行 鉴 定 Sanger, 确 定 了 胰 岛 素 的 一 级 结 构,1958 年 获 Nobel 化 学 奖 1975 年 建 立 了 快 速 测 定 DNA 序 列 的 加 减 法,1976 年 又 一 次 获 Nobel Prize.) 简 述 Sanger 氨 基 酸 测 序 和 核 苷 酸 测 序 的 方 法? P180 中 国 海 洋 大 学 2012 生 物 化 学 试 题

57 3. 烃 基 化 反 应 - Edman 试 剂 反 应 用 途 : 是 鉴 定 多 肽 N- 端 aa 和 aa 顺 序 的 重 要 方 法

58 4 形 成 西 佛 碱 (Schiff) 反 应 氨 基 酸 的 α- 氨 基 能 与 醛 类 反 应 生 成 弱 碱, 这 个 弱 碱 叫 西 佛 碱 (Schiff s base). 西 佛 碱 是 某 些 酶 促 反 应 的 中 间 产 物 ( 如 转 氨 基 反 应 的 中 间 产 物 )

59 5 脱 氨 基 反 应 氨 基 酸 在 生 物 体 内 经 氨 基 酸 氧 化 酶 催 化, 脱 去 α- 氨 基 转 变 为 酮 酸

60 ( 二 ) α- 羧 基 参 与 的 反 应 1 成 酯 和 成 盐 反 应 : 氨 基 酸 酯 是 制 备 氨 基 酸 酰 胺 的 中 间 物 Hcl 成 盐 成 酯 后 羧 基 的 化 学 反 应 性 能 被 保 护, 而 氨 基 的 化 学 反 应 性 能 得 到 加 强 或 说 氨 基 被 活 化, 易 与 酰 基 或 烃 基 结 合 为 什 么 氨 基 酸 的 酰 基 化 和 烃 基 化 在 碱 性 溶 液 中 进 行?

61 α- 羧 基 参 与 的 反 应 2 形 成 酰 氯 的 反 应 用 途 : 这 是 使 氨 基 酸 羧 基 活 化 3 脱 羧 基 反 应 : 释 放 二 氧 化 碳 生 成 一 级 胺 4 叠 氮 反 应

62 ( 三 )α- 氨 基 和 羧 基 共 同 参 与 的 反 应 茚 三 酮 反 应 所 有 氨 基 酸 及 具 有 游 离 α- 氨 基 的 肽 与 茚 三 酮 反 应 都 产 生 蓝 紫 色 物 质, 只 有 脯 氨 酸 和 羟 脯 氨 酸 与 茚 三 酮 反 应 产 生 黄 色 物 质 应 用 : 氨 基 酸 定 性 和 定 量 分 析 ( 光 吸 收 法 和 测 压 法 )

63 茚 三 酮 反 应 应 用 : 氨 基 酸 定 性 和 定 量 分 析 ( 光 吸 收 法 和 测 压 法 ) 注 意 : 所 有 α- 氨 基 酸 及 一 切 蛋 白 质 都 能 和 茚 三 酮 反 应 生 成 蓝 紫 色 物 质 β- 丙 氨 酸 氨 和 许 多 一 级 胺 都 呈 阳 性 反 应, 虽 然 蛋 白 质 和 氨 基 酸 均 有 茚 三 酮 反 应, 但 能 与 茚 三 酮 呈 阳 性 反 应 的 不 一 定 就 是 蛋 白 质 或 氨 基 酸

64 茚 三 酮 反 应 的 修 改 ⑴ 脯 氨 酸 是 亚 氨 基 酸, 没 有 具 α- 氨 基 的 氨 基 酸 酸 性 茚 三 酮 反 应 ⑵ 脯 氨 酸 可 以 与 茚 三 酮 反 应, 在 酸 性 条 件 下 生 成 的 直 接 产 物 是 红 色 的, 最 大 吸 收 峰 值 是 520 nm ⑶ 脯 氨 酸 与 酸 性 茚 三 酮 在 有 氰 化 物 存 在 时 反 应 产 物 是 黄 色 或 橙 黄 色, 最 大 吸 收 值 是 440 nm;⑷ 脯 氨 酸 与 茚 三 酮 在 碱 性 条 件 下 生 成 不 稳 定 的 黄 色 产 物 李 绍 军, 郭 蔼 光, 梁 宗 锁, 生 化 教 材 中 关 于 脯 氨 酸 与 茚 三 酮 反 应 描 述 的 修 改 建 议, 生 命 的 化 学, 2005(6):

65 2 成 肽 反 应 体 内 的 成 肽 反 应 如 何?

66 ( 四 ) 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应

67 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应

68 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应 ( 续 )

69 1. pauly 反 应 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应 Tyr + 对 氨 基 苯 磺 酸 橘 黄 色 His + 重 氮 苯 磺 酸 红 色 ( 棕 红 色 ) 2. Folin 一 酚 反 应 Tyr or Trp + 磷 钼 酸 磷 钨 酸 蓝 色 ( 钼 蓝 与 钨 蓝 混 合 物 )

70 氨 基 酸 的 侧 链 基 团 的 反 应

71 断 开 二 硫 键 过 甲 酸 巯 基 乙 醇 二 硫 苏 糖 醇 DTT 氧 化 法 还 原 法 烷 基 化 试 剂 保 护

72 五 氨 基 酸 的 光 学 性 质 和 光 谱 性 质 ( 一 ) 氨 基 酸 的 旋 光 性 和 立 体 化 学 氨 基 酸 的 构 型 也 是 与 甘 油 醛 构 型 比 较 而 确 定 的

73 氨 基 酸 的 旋 光 性 和 立 体 化 学 1 除 R=H 的 甘 氨 酸 外, 其 他 19 种 基 本 氨 基 酸 a- 碳 原 子 均 有 不 对 称 碳 原 子, 有 D- 型 和 L- 型 两 种 异 构 体, 因 而 是 光 学 活 性 物 质, 构 成 蛋 白 质 的 氨 基 酸 除 Gly 外 均 为 L- 型 异 构 体 2. Thr 和 Ile 有 四 种 光 学 异 构 体 3. 胱 氨 酸 异 构 体, 内 消 旋

74 氨 基 酸 的 旋 光 性 3 氨 基 酸 的 旋 光 性 ( 符 号 和 大 小 ) 取 决 于 它 的 R 基 的 性 质, 并 与 溶 液 的 PH 值 有 关 比 旋 光 度 是 氨 基 酸 的 重 要 物 理 常 数 之 一, 是 鉴 别 各 种 氨 基 酸 的 重 要 依 据 外 消 旋 物 :D- 型 和 L- 型 的 等 摩 尔 混 合 物 内 消 旋 物 : 分 子 内 消 旋

75 旋 光 性 和 构 型 1. 肽 链 中 的 肽 键 一 般 是 反 式 构 型, 2. 天 然 存 在 的 已 醛 糖 都 是 D 型 的 3. 天 然 氨 基 酸 为 多 L 型 4. 戊 糖 与 嘧 啶 或 嘌 呤 碱 以 C-N 糖 苷 键 连 接 就 称 为 核 苷,β 型 糖 苷 键, 碱 基 与 糖 环 平 面 互 相 垂 直, 反 式 存 在

76 ( 二 ) 氨 基 酸 光 谱 性 质 Spectroscopic Properties of Amino Acids 氨 基 酸 的 一 个 重 要 光 学 性 质 是 对 光 有 吸 收 作 用,20 种 蛋 白 质 氨 基 酸 在 可 见 光 区 域 均 无 光 吸 收, 在 远 紫 外 区 ( 220nm) 均 有 光 吸 收, 在 紫 外 区 ( 近 紫 外 区 ) (220nm 300nm) 只 有 三 种 氨 基 酸 有 光 吸 收 能 力 The UV spectra of the aromatic amino acids at ph 6. 酪 氨 酸 : max=275nm, 苯 丙 氨 酸 : max=257nm, 色 氨 酸 : max=280nm,

77 六 氨 基 酸 混 合 物 的 分 析 分 离 p148 ( 一 ) 层 析 法 (chromatography) 分 配 柱 层 析 纸 层 析 薄 层 层 析 离 子 交 换 层 析 法 ( 二 ) 电 泳 法 (Electophy) ( 三 ) 气 相 色 谱 法 ( 四 ) 高 效 液 相 层 析

78 ( 一 ) 层 析 法 (chromatography) 色 谱 法 (chromatography) 又 称 色 谱 分 析 色 谱 分 析 法 层 析 法, 是 一 种 分 离 和 分 析 方 法, 色 谱 过 程 的 本 质 是 待 分 离 物 质 分 子 在 固 定 相 和 流 动 相 之 间 分 配 平 衡 的 过 程, 不 同 的 物 质 与 两 相 发 生 相 互 作 用, 如 吸 附 溶 解 或 结 合 等, 结 果 在 两 相 之 间 的 分 配 会 不 同, 这 使 其 随 流 动 相 运 动 速 度 各 不 相 同, 随 着 流 动 相 的 运 动, 混 合 物 中 的 不 同 组 分 在 固 定 相 上 相 互 分 离 根 据 物 质 的 分 离 机 制, 又 可 以 分 为 吸 附 色 谱 分 配 色 谱 离 子 交 换 色 谱 凝 胶 色 谱 亲 和 色 谱 等 类 别

79 ( 一 ) 分 配 层 析 1 原 理 : 组 成 层 析 系 统 的 固 定 相 和 流 动 相 具 有 相 反 的 极 性 被 分 析 的 样 品 ( 如 aa 混 合 物 ) 中 的 各 组 分 依 据 其 自 身 极 性 的 强 弱, 与 此 两 相 的 亲 和 力 不 同 与 固 定 相 亲 和 力 大 者, 易 留 滞 于 原 地, 与 流 动 相 亲 和 力 大 者, 易 随 流 动 相 移 动, 因 而 达 到 分 离 的 目 的 分 配 定 律 : 当 一 种 溶 质 在 两 种 一 定 的 互 不 相 溶 的 溶 剂 中 分 配 时, 在 一 定 的 温 度 下 达 到 平 衡 后, 溶 质 在 两 相 中 的 浓 度 比 值 为 一 常 数 即 分 配 系 数 (k d )

80 分 配 层 析 分 离 的 先 决 条 件 : 各 种 AA 成 分 的 分 配 系 数 有 差 异, 差 异 越 大, 越 容 易 分 开

81 分 配 层 析 的 原 理 : 逆 流 分 配 流 动 相 固 定 相 分 离 的 先 决 条 件 : 各 种 AA 成 分 的 分 配 系 数 有 差 异, 差 异 越 大, 越 容 易 分 开 分 配 系 数 为 3

82 2 分 配 柱 层 析

83 3 纸 层 析 原 理 : 纸 层 析 法 属 于 分 配 层 析 纸 层 析 法 是 用 滤 纸 作 为 惰 性 支 持 物 的 分 配 层 析 法 纤 维 素 吸 附 的 水 为 固 定 相, 有 机 溶 剂 为 流 动 相 当 有 机 溶 剂 沿 滤 纸 流 动 时, 层 析 点 中 的 物 质 就 会 在 有 机 相 和 水 相 中 进 行 分 配, 其 中 部 分 溶 质 随 有 机 相 的 不 断 流 动 进 入 水 相, 或 从 水 相 进 入 有 机 相, 如 此 进 行 反 复 的 分 配, 由 于 不 同 物 质 的 分 配 系 数 不 同 移 动 速 度 不 同 因 而 得 以 分 离

84 相 对 迁 移 率 R f R f 主 要 与 R 基 的 极 性 有 关, 溶 剂 的 ph 可 影 响 R 基 的 极 性, 氨 基 酸 与 滤 纸 的 吸 附 作 用 也 影 响 R f 在 流 动 相 中 分 配 系 数 越 大, 移 动 越 快 预 测 在 以 苯 酚 - 甲 酚 - 水 为 展 层 剂 利 用 纸 层 析 分 离 下 列 氨 基 酸 时 Rf 值 大 小 顺 序 : (1) Ala Leu Ser (2) Val Gly Glu

85 双 向 纸 层 析 图

86 5. 离 子 交 换 层 析 Separation by Charge

87 离 子 交 换 层 析 原 理 : 分 离 氨 基 酸 时, 用 离 子 交 换 树 脂 作 为 支 持 物, 利 用 离 子 交 换 树 脂 上 的 活 性 基 团 与 溶 液 中 的 离 子 进 行 交 换 反 应, 由 于 各 种 离 子 交 换 能 力 不 同, 与 树 脂 结 合 的 牢 固 程 度 就 不 同, 在 洗 脱 过 程 中, 各 种 离 子 以 不 同 的 速 度 移 动, 从 而 达 到 分 离 的 目 的 离 子 交 换 层 析, 利 用 氨 基 酸 的 两 性 游 离 性 质, 在 某 一 特 定 PH 时, 各 氨 基 酸 的 电 荷 量 及 性 质 不 同, 故 可 以 通 过 离 子 交 换 层 析 得 以 分 离 氨 基 酸 与 树 脂 的 亲 和 力 : 取 决 于 它 们 之 间 的 (1) 静 电 吸 引 和 (2) 氨 基 酸 侧 链 与 树 脂 基 质 之 间 的 疏 水 相 互 作 用

88 离 子 交 换 层 析 阳 离 子 交 换 树 脂 - 负 电 荷 氨 基 酸 阴 离 子 交 换 树 脂 - 正 电 荷 - - -

89 Ion-exchange chromatography 阳 离 子 交 换 树 脂 - 负 电 荷 + + 氨 基 酸 + + 氨 基 酸 PI=3 PI=7 PI=10 阴 离 子 交 换 树 脂 - 正 电 荷 - - 氨 基 酸 - -

90 Ion-exchange chromatography 阳 离 子 交 换 树 脂 - 负 电 荷 1. 氨 基 酸 + 2. 氨 基 酸 + 3. 氨 基 酸 + 氨 基 酸 PI=3 PI=7 PI=10 Separation by Charge 阴 离 子 交 换 树 脂 - 正 电 荷 - - -

91 离 子 交 换 树 脂 离 子 交 换 树 脂 可 以 分 为 阳 离 子 交 换 树 脂 ( 如 羧 甲 基 纤 维 素 等 ) 和 阴 离 子 交 换 树 脂 ( 如 二 乙 基 氨 基 乙 基 纤 维 素 等 ) (1) 阳 离 子 交 换 树 脂 : 供 交 换 的 是 阳 离 子, 树 脂 带 负 电 荷 (2) 阴 离 子 交 换 树 脂 : 可 供 交 换 的 是 阴 离 子, 树 脂 带 正 电 荷

92 氨 基 酸 的 洗 脱 Changes in ionic strength or ph 洗 脱 方 法 : C - C + (1) 改 变 PH 值 ( 改 变 离 子 电 荷 ) (2) 增 加 离 子 浓 度 ( 竞 争 作 用 ). 阴 离 子 树 脂 : 降 低 PH, 则 阳 离 子 树 脂 升 高 PH 阴 离 子 交 换 树 脂 A -1 B -2 阳 离 子 交 换 树 脂 A +1 B+ 2

93 氨 基 酸 的 洗 脱 氨 基 酸 与 树 脂 上 解 离 基 团 之 间 的 静 电 引 力 氨 基 酸 与 树 脂 基 质 聚 苯 乙 烯 之 间 的 疏 水 作 用

94 习 题 举 例 ( 中 国 科 技 大 学 2002) (1) 在 PI=6 时, 用 阳 离 子 交 换 柱 层 析 分 离 Lys His 和 Leu 的 氨 基 酸 的 洗 脱 顺 序 (2) 在 PI=8 时, 用 阴 离 子 交 换 柱 层 析 分 离 Glu Arg 和 Val 的 氨 基 酸 的 洗 脱 顺 序 阳 离 子 交 换 树 脂 洗 脱 顺 序 (aa 带 正 电 荷 ) 先 酸 性 aa 中 性 aa 碱 性 aa 后 阴 离 子 交 换 树 脂 洗 脱 顺 序 (aa 带 负 电 荷 ) 先 碱 性 aa 中 性 aa 酸 性 aa 后

95 习 题 举 例 有 一 种 蛋 白 质 水 解 物, 在 ph6 时, 用 阳 离 子 交 换 柱 层 析 分 离, 第 一 个 被 洗 脱 的 氨 基 酸 是 ( ) A. Val (pi5.96) B. Lys (pi9.74) C. Asp(pI2.77) D. Arg(pI10.76) E. Tyr (pi5.66) 用 强 酸 型 阳 离 子 交 换 树 脂 分 离 下 述 每 对 氨 基 酸, 当 用 ph7.0 的 缓 冲 液 洗 脱 时, 下 述 每 对 中 先 从 柱 上 洗 脱 下 来 的 是 哪 种 氨 基 酸? 1 天 冬 氨 酸 和 赖 氨 酸 ;2 精 氨 酸 和 甲 硫 氨 酸 ;8 谷 氨 酸 和 缬 氨 酸 ;4 甘 氨 酸 和 亮 氨 酸 ;5 丝 氨 酸 和 丙 氨 酸

96 ( 三 ) 电 泳 电 泳 (electrophoresis): 带 电 粒 子 在 电 场 的 作 用 下, 向 它 所 带 的 电 荷 相 反 方 向 泳 动 的 现 象 称 为 电 泳 氨 基 酸 在 ph 高 于 或 低 于 其 pi 的 溶 液 中 为 带 电 的 颗 粒, 在 电 场 中 能 向 正 极 或 负 极 移 动

97 ( 四 ) 气 液 层 析 层 析 系 统 的 流 动 相 为 气 体 如 氢 氮 氦, 固 定 相 为 涂 渍 在 固 体 颗 粒 表 面 的 液 体 气 相 层 析 仪

98 ( 五 ) 高 效 液 相 层 析 HPLC 使 用 的 固 定 相 支 持 剂 颗 粒 很 细, 比 表 面 积 很 大 ; 溶 剂 系 统 采 用 高 压, 洗 脱 速 度 增 多

99 思 考 题 1 三 种 氨 基 酸 Thr Lys 和 Glu 在 PH=6 进 行 电 泳 分 离, 茚 三 酮 染 色, 画 出 分 离 结 果 图 和 正 负 极 厦 门 大 学 生 物 化 学 试 题 2. 从 赖 氨 酸 中 分 离 出 谷 氨 酸 的 可 能 性 最 小 的 方 法 是 ( ) A 纸 层 析 B 阳 离 子 交 换 层 析 C 阴 离 子 交 换 层 析 D 葡 萄 糖 凝 胶 过 滤 E 电 泳 2005 年 江 南 大 学 生 物 化 学 上 海 交 通 大 学 生 物 化 学 试 题 3. 所 有 的 α 氨 基 酸 共 有 的 显 色 反 应 是 ( ) A 茚 三 酮 反 应 B 双 缩 膫 反 应 C 坂 口 反 应 D 福 林 酚 试 剂 反 应 湖 南 大 学 2006 年 生 物 化 学

100 思 考 题 4. 可 用 于 测 定 蛋 白 质 分 子 量 的 方 法 是 ( ) A SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 B 离 子 交 换 层 析 C 凯 氏 定 氮 法 D 亲 和 层 析 湖 南 大 学 2006 年 生 物 化 学 5 下 列 哪 种 方 法 可 得 到 蛋 白 质 的 指 纹 图 谱? A 酸 水 解, 然 后 凝 胶 过 滤 B 用 胰 蛋 白 酶 水 解, 然 后 纸 层 析 或 纸 电 泳 C 彻 底 碱 水 解 并 用 例 子 交 换 层 析 测 定 氨 基 酸 的 组 成 D 用 2,4- 二 硝 基 氟 苯 处 理 蛋 白 质 厦 门 大 学 2005 年 生 物 化 学

101 思 考 题 6 有 一 个 某 种 溶 液 中 含 有 三 种 三 肽 :Tyr -Arg- Ser, Glu - Met - Phe 和 Asp - Pro - Lys, α- COOH 基 团 的 pka 为 3.8; α-nh3 基 团 的 pka 为 8.5 在 哪 种 ph(2.0, 6.0 或 13.0) 下, 通 过 电 泳 分 离 这 三 种 多 肽 的 效 果 最 好? 答 :ph=6.0 7 有 一 混 合 蛋 白 质 溶 液, 各 种 蛋 白 质 的 pl 为 4.6;5.0; 5.3;6.7;7.3 电 泳 时 欲 使 其 中 4 种 泳 向 正 极, 缓 冲 液 的 ph 应 该 是 :(D) A.5.0 B. 4.0 C. 6.0 D. 7.0 E.8.0

102 一 蛋 白 质 的 概 述 蛋 白 质 的 共 价 结 构 蛋 白 质 (Protein,pr) : 是 一 切 生 物 体 中 普 遍 存 在 的, 由 天 然 氨 基 酸 按 照 一 定 的 顺 序, 通 过 肽 键 连 接 而 成 的 一 条 或 多 条 肽 链 构 成 的 生 物 大 分 子 ; 其 种 类 繁 多, 各 具 有 一 定 的 相 对 分 子 质 量, 复 杂 的 分 子 结 构 和 特 定 的 生 物 功 能 ; 是 表 达 生 物 遗 传 性 状 的 一 类 主 要 物 质 ( 一 ) 蛋 白 质 的 元 素 组 成 一 般 蛋 白 质 含 氮 量 平 均 为 16%, 即 1 份 氮 素 相 当 于 6.25 份 蛋 白 质, 此 即 蛋 白 质 系 数

103 后 面 不 讲!!!!

104 凯 氏 定 氮 法

105 凯 氏 定 氮 法 1 消 化 : 含 氮 的 有 机 物 ( 除 硝 基 外 ) 与 浓 硫 酸 共 热 时, 其 中 的 碳 氢 二 元 素 被 氧 化 成 二 氧 化 碳 和 水, 而 氮 则 转 变 成 氨 ; 氨 进 一 步 与 过 量 的 硫 酸 作 用, 生 成 硫 酸 铵 ; 2 蒸 馏 : 加 强 碱 碱 化, 可 使 消 化 液 中 的 硫 酸 铵 分 解, 放 出 氨 ; 3 吸 收 : 可 用 水 蒸 汽 将 产 生 的 氨 蒸 馏 到 过 量 的 硼 酸 标 准 溶 液 中, 硼 酸 吸 收 氨 后 使 溶 液 中 的 氢 离 子 浓 度 降 低 ; 4 滴 定 : 用 标 准 无 机 酸 滴 定 硼 酸 溶 液, 直 至 恢 复 溶 液 中 原 来 的 氢 离 子 浓 度 为 止, 最 后 根 据 所 用 标 准 酸 的 摩 尔 数 ( 相 当 于 待 测 物 中 氮 原 子 的 摩 尔 数 ) 计 算 出 待 测 物 中 的 总 氮 量 凯 氏 定 氮 法 的 原 理 是 什 么?-2009 年 中 科 院 生 物 化 学

106 按 分 子 形 状 按 分 子 组 成 和 溶 解 度 分 球 状 蛋 白 纤 维 状 蛋 白 单 纯 蛋 白 结 合 蛋 白 蛋 白 质 的 分 类 动 物 体 内 广 泛 存 在 清 蛋 白 谷 蛋 白 球 蛋 白 组 蛋 白 醇 溶 蛋 白 精 蛋 白 硬 蛋 白 核 蛋 白 磷 蛋 白 脂 蛋 白 糖 蛋 白 色 蛋 白 从 营 养 学 上 根 据 所 含 氨 基 酸 的 种 类 和 数 量 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 齐 全, 比 例 合 适 半 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 齐 全, 但 比 例 不 合 适 不 完 全 蛋 白 质 : 所 含 氨 基 酸 种 类 不 齐 全

107 C 按 多 肽 链 条 数 分 类 * 单 体 蛋 白 质 : 仅 含 一 条 多 肽 链 牛 核 糖 核 酸 酶 : 一 条 多 肽 链 * 多 聚 蛋 白 质 : 含 两 条 或 多 条 多 肽 链 胰 岛 素 : 两 条 ( 两 种 ) 多 肽 链 血 红 蛋 白 : 四 条 ( 两 种 ) 多 肽 链 多 聚 蛋 白 质 为 什 么 可 以 多 聚? 血 红 蛋 白 和 肌 红 蛋 白 谁 的 疏 水 氨 基 酸 更 多? 体 积 大 的 球 状 蛋 白 质 疏 水 氨 基 酸 比 例 在 增 加 还 是 减 少? 胰 岛 素

108 ( 三 ) 蛋 白 质 的 结 构 层 次

109 蛋 白 质 的 结 构 层 次 1. 一 级 结 构 : 指 蛋 白 质 分 子 中 的 氨 基 酸 的 排 列 顺 序 2. 二 级 结 构 : 指 蛋 白 质 多 肽 链 的 主 链 骨 架 中 的 若 干 肽 段 的 构 象, 排 列 所 有 蛋 白 质 的 主 链 结 构 相 同, 长 短 不 同 3. 三 级 结 构 ; 指 多 肽 链 在 二 级 结 构 的 基 础 上, 各 原 子 的 空 间 排 布, 包 括 侧 链 基 团 的 取 向, 是 二 级 结 构 的 基 础 上 范 围 更 广 的 盘 旋 和 折 叠 4. 四 级 结 构 : 是 指 多 条 肽 链 组 成 的 一 个 蛋 白 质 分 子 时, 各 亚 单 位 在 寡 聚 蛋 白 质 中 空 间 排 布 及 亚 单 位 间 的 相 互 作 用

110 ( 四 ) 蛋 白 质 的 生 物 学 重 要 性 1. 蛋 白 质 是 生 物 体 重 要 组 成 成 分 分 布 广 含 量 高 2. 蛋 白 质 具 有 重 要 的 生 物 学 功 能 1) 催 化 生 物 化 学 反 应 ( 酶 ) 2) 结 构 成 分 ( 结 缔 组 织 的 胶 原 蛋 白 皮 肤 的 弹 性 蛋 白 膜 蛋 白 ) 3) 贮 藏 ( 卵 清 蛋 白 种 子 蛋 白 ) 4) 物 质 运 输 ( 血 红 蛋 白 脂 蛋 白 电 子 传 递 体 ) 5) 细 胞 运 动 ( 肌 肉 收 缩 的 肌 球 蛋 白 肌 动 蛋 白 ) 6) 激 素 功 能 ( 胰 岛 素 ) 7) 防 御 功 能 ( 抗 体 血 凝 蛋 白 ) 8) 接 受 传 递 信 息 ( 受 体 蛋 白 味 觉 蛋 白 ) 9) 调 节 细 胞 生 长 分 化 和 遗 传 信 息 的 表 达 ( 阻 遏 蛋 白 ) 3. 氧 化 供 能

111 二 肽 (peptide) 和 肽 键 (peptide bond) ( 一 ) 肽 和 肽 键 的 结 构 和 命 名 肽 是 由 一 个 氨 基 酸 的 - 羧 基 与 另 一 个 氨 基 酸 的 - 氨 基 脱 水 缩 合 而 形 成 的 无 分 支 线 形 聚 合 物 其 中 的 氨 基 酸 单 位 称 氨 基 酸 残 基 氨 基 酸 间 缩 水 形 成 的 共 价 键 称 肽 键 肽 链 中 的 氨 基 酸 在 参 加 肽 键 形 成 时 失 去 了 1 分 子 水, 已 经 不 是 原 来 完 整 的 分 子, 称 为 氨 基 酸 残 基 氨 基 酸 残 基 的 平 均 分 子 量 为 :110 或 120

112 肽 氨 基 酸 借 肽 键 连 接 的 分 子 叫 肽 : 1) 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 叫 二 肽 ; 二 肽 没 有 双 缩 脲 反 应 2) 三 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 叫 三 肽 ; 3) 多 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 叫 多 肽 ; 4) 氨 基 酸 借 肽 键 连 成 长 链, 称 为 肽 链, 肽 链 两 端 有 自 由 -NH 2 和 -COOH, 自 由 -NH2 端 称 为 N- 末 端 ( 氨 基 末 端 ), 自 由 -COOH 端 称 为 C- 末 端 ( 羧 基 末 端 ); 5) 构 成 肽 链 的 氨 基 酸 已 残 缺 不 全, 称 为 氨 基 酸 残 基 ; 6) 肽 链 中 的 氨 基 酸 的 排 列 顺 序, 一 般 -NH 2 端 开 始, 由 N 指 向 C, 即 多 肽 链 有 方 向 性,N 端 为 头,C 端 为 尾

113 肽 的 写 法

114 肽 键 的 结 构 特 点 : (1) 酰 胺 氮 上 的 孤 对 电 子 与 相 邻 羰 基 之 间 形 成 共 振 杂 化 体 (2) 肽 键 具 有 部 分 双 键 性 质, 不 能 自 由 旋 转 肽 键 比 一 般 C-N 键 短 C-N: nm 肽 键 : 0.132nm C=N :0.127 nm

115 肽 键 的 结 构 特 点 (3) 肽 键 具 有 平 面 性, 组 成 肽 键 的 4 个 原 子 和 2 个 C α 几 乎 处 在 同 一 平 面 内 ( 酰 氨 平 面 ) (4) 肽 键 亚 氨 基 在 ph0 14 内 不 解 离 (5) 肽 链 中 的 肽 键 一 般 是 反 式 构 型, 而 Pro 的 肽 键 可 能 出 现 顺 反 两 种 构 型. 肽 键 的 紫 外 吸 收 210~230nm 蛋 白 质 溶 液 在 238nm 处 的 光 吸 收 的 强 弱, 与 肽 键 的 多 少 成 正 比

116 相 关 名 词 - 肽 单 元 肽 单 元 : 参 与 肽 键 的 6 个 原 子 被 约 束 于 一 个 平 面 上, 与 此 相 应 的 -C α -CO-NH-C α - 则 称 为 肽 单 元 一 个 氨 基 酸

117 相 关 名 词 - 多 肽 主 链 多 肽 主 链 : 在 多 肽 链 中 由 肽 键 连 接 的 各 氨 基 酸 残 基 形 成 的 长 链 骨 架 为 多 肽 链 的 主 链 或 : 肽 链 的 骨 干 是 由 肽 单 元 重 复 排 列 而 成 长 链, 称 为 主 链 长 链 骨 架 N-C-C-N-C-C-N-C-C 判 断 题 : 蛋 白 质 中 主 链 骨 架 由 NCCNCCNCC 和 NCCCNCCCNCC 等 方 式 组 成 2003 年 福 州 大 学 生 物 化 学

118 ( 二 ) 肽 的 物 理 和 化 学 性 质 1 肽 的 晶 体 是 离 子 晶 格, 溶 点 高 2 旋 光 性 : 一 般 短 肽 的 旋 光 度 等 于 其 各 个 氨 基 酸 的 旋 光 度 的 总 和, 长 肽 不 等 于 3 具 有 两 性 解 离 和 等 电 点 : 肽 的 酸 碱 性 质 取 决 于 末 端 α- 氨 基 和 α- 羧 基 及 R 基 在 长 肽 或 蛋 白 质 中, 可 解 离 的 基 团 主 要 是 侧 链 基 团 肽 中 C 端 的 羧 基 的 pk 要 比 自 由 氨 基 酸 的 pk 大. 肽 中 N 端 的 氨 基 的 pk 要 比 自 由 氨 基 酸 的 pk 小, 酸 性 强 了 R 基 的 解 离 和 氨 基 酸 差 不 多

119 氨 基 酸 和 肽 解 离 比 较 -e 自 由 氨 基 酸 的 pk 要 比 肽 中 C 端 的 羧 基 的 pk 小. 自 由 氨 基 酸 的 pk 要 比 肽 中 N 端 的 氨 基 的 pk 大,

120 肽 的 两 性 解 离 和 肽 的 等 电 点 Comparing the pka Values of Alanine and Polyalanine The titration of di-, tri-, and larger oligopeptides of alanine also shows the ionization of only two functional groups, although the experimental pka values aredifferent. The trend in pka values is summarized in the table. Amino acid or peptide pk1-cooh pk2-nh + 3 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala (Ala)n Ala, n 大 于

121 肽 的 物 理 和 化 学 性 质 4 双 缩 脲 反 应 : 含 有 两 个 或 两 个 以 上 肽 键 的 化 合 物 与 碱 性 硫 酸 铜 作 用, 生 成 蓝 紫 色 的 复 合 物, 肽 键 越 多 颜 色 越 深, 受 蛋 白 质 特 异 性 影 响 小, 可 用 于 肽 和 蛋 白 质 定 量 测 定 及 测 定 蛋 白 质 水 解 程 度 ( 两 个 肽 键 以 上 的 肽 均 有 该 反 应, 二 肽 没 有 ) 双 缩 脲 反 应 是 肽 和 蛋 白 质 特 有 的 反 应, 游 离 氨 基 酸 无 此 反 应 该 法 测 定 蛋 白 质 含 量 需 肽 端 完 整, 不 能 水 解 思 考 : 用 下 列 方 法 测 定 蛋 白 质 含 量,_ 需 要 完 整 的 肽 键 A. 双 缩 脲 反 应 B. 凯 氏 定 氮 C. 紫 外 吸 收 D. 茚 三 酮 反 应 华 中 农 业 大 学 2002 生 物 化 学 试 题 四 川 大 学 生 物 化 学

122 双 缩 脲 反 应 思 考 ( 判 断 ): 双 缩 脲 反 应 是 肽 和 蛋 白 质 特 有 的 反 应, 所 以 二 肽 也 有 双 缩 脲 反 应 中 国 科 学 院 2001 年 招 收 攻 读 硕 士 学 位 研 究 生 入 学 考 试 试 卷

123 双 缩 脲 法 测 量 蛋 白 质 含 量 具 有 两 个 或 两 个 以 上 肽 键 的 化 合 物 皆 有 双 缩 脲 反 应 而 蛋 白 质 及 多 肽 的 肽 键 能 与 Cu 2+ 形 成 紫 红 色 络 合 物, 其 最 大 光 吸 收 在 540nm 处 其 颜 色 深 浅 与 蛋 白 质 浓 度 成 正 比, 而 与 蛋 白 质 的 分 子 量 及 氨 基 酸 的 组 成 无 关, 该 法 测 定 蛋 白 质 的 浓 度 范 围 适 于 1~10mg /ml 双 缩 脲 法 常 用 于 蛋 白 质 的 快 速 测 定 双 缩 脲 法 主 要 针 对 蛋 白 质 的 肽 键 多 少 双 缩 脲 法 的 缺 点 是 灵 敏 度 差 所 需 样 品 量 大 5 肽 也 有 茚 三 酮 反 应

124 Folin- 酚 试 剂 法 测 定 蛋 白 质 含 量 Folin 酚 试 剂 法 测 定 蛋 白 质 含 量 是 最 灵 敏 的 方 法 之 一 此 法 的 显 色 原 理 与 双 缩 脲 方 法 是 相 同 的 ( 甲 试 剂 由 碳 酸 钠 氢 氧 化 钠 硫 酸 铜 及 酒 石 酸 钾 钠 组 成 ), 只 是 加 入 了 第 二 种 试 剂, 即 Folin 酚 试 剂 ( 磷 钼 酸 和 磷 钨 酸 硫 酸 溴 等 组 成 ), 以 增 加 显 色 量, 从 而 提 高 了 检 测 蛋 白 质 的 灵 敏 度 这 两 种 显 色 反 应 产 生 深 蓝 色 的 原 因 是 : 在 碱 性 条 件 下, 蛋 白 质 中 的 肽 键 与 铜 结 合 生 成 复 合 物 Folin 酚 试 剂 中 的 磷 钼 酸 盐 磷 钨 酸 盐 被 蛋 白 质 中 的 酪 氨 酸 和 苯 丙 氨 酸 残 基 还 原, 产 生 深 蓝 色 ( 钼 兰 和 钨 兰 的 混 合 物 ) 在 一 定 的 条 件 下, 蓝 色 深 度 与 蛋 白 的 量 成 正 比 四 川 大 学 2011 年 生 物 化 学

125 思 考 题 1 在 下 列 检 测 蛋 白 质 的 方 法 中, 哪 一 种 取 决 于 完 整 的 肽 链? A. 凯 氏 定 氮 法 B. 双 缩 尿 反 应 C. 紫 外 吸 收 法 D. 茚 三 酮 法 四 川 大 学 生 物 化 学

126 ( 三 ) 天 然 存 在 的 活 性 肽 在 生 物 体 中, 多 肽 最 重 要 的 存 在 形 式 是 作 为 蛋 白 质 的 亚 单 位 有 许 多 分 子 量 比 较 小 的 多 肽 以 游 离 状 态 存 在, 这 类 多 肽 通 常 都 具 有 特 殊 的 生 理 功 能, 常 称 为 活 性 肽 如 : 脑 啡 肽 ; 激 素 类 多 肽 ; 抗 生 素 类 多 肽 ; 谷 胱 甘 肽 ; 蛇 毒 多 肽 等

127 1. 谷 胱 甘 肽 三 肽 (Glu-Cys-Gly), 广 泛 存 在 于 生 物 细 胞 中, 含 有 自 由 的 巯 基, 具 有 很 强 的 还 原 性, 可 作 为 体 内 重 要 的 还 原 剂, 保 护 某 些 蛋 白 质 或 酶 分 子 中 的 巯 基 免 遭 氧 化, 使 其 处 于 活 性 状 态

128 谷 胱 甘 肽 解 毒 作 用 : 与 毒 物 或 药 物 结 合, 消 除 其 毒 性 作 用 ; 参 与 氧 化 还 原 反 应 : 作 为 重 要 的 还 原 剂, 参 与 体 内 多 种 氧 化 还 原 反 应 ; 保 护 巯 基 酶 的 活 性 : 使 巯 基 酶 的 活 性 基 团 - SH 维 持 还 原 状 态 ; 维 持 红 细 胞 膜 结 构 的 稳 定 : 消 除 氧 化 剂 对 红 细 胞 膜 结 构 的 破 坏 作 用

129 2. 抗 生 素 类 多 肽 含 有 D- 苯 丙 氨 酸 鸟 氨 酸,

130 3 激 素 类 多 肽 4 α- 鹅 膏 蕈 碱 天 然 存 在 的 活 性 肽 主 要 抑 制 真 核 RNA 聚 合 酶 Ⅱ 和 Ⅲ, 对 细 菌 的 RNA 聚 合 酶 作 用 极 小 5 肌 肽 和 鹅 肌 肽 肌 肽 (carnosine): β-ala-his 鹅 肌 肽 (anserine):β-ala-1-me-his

131 三 蛋 白 质 一 级 结 构 的 测 定 P168 ( 一 ) 蛋 白 质 一 级 结 构 的 定 义 : 蛋 白 质 分 子 中 氨 基 酸 残 基 的 排 列 顺 序, 即 氨 基 酸 的 线 性 序 列 一 级 结 构 中 包 含 的 共 价 键 主 要 指 肽 键 和 二 硫 键 在 基 因 编 码 的 蛋 白 质 中, 这 种 序 列 是 由 mrna 中 的 核 苷 酸 序 列 决 定 的

132 一 级 结 构 测 定 的 方 法 1 直 接 法 ( 测 蛋 白 质 的 序 列 ) 2 间 接 法 ( 测 核 酸 序 列 推 断 氨 基 酸 序 列, 目 前 往 往 采 用 从 待 测 蛋 白 质 的 基 因 序 列 反 推 出 蛋 白 质 的 一 级 结 构 ) 一 个 纯 蛋 白 质, 理 想 方 法 是 从 N 端 直 接 测 至 C 端, 但 目 前 只 能 测 60 个 N 端 氨 基 酸 所 以 需 要 将 大 化 小, 逐 段 分 析, 制 成 两 套 肽 片 段, 找 出 重 叠 位 点, 排 出 肽 的 前 后 位 置, 最 后 确 定 蛋 白 质 的 完 整 序 列

133 蛋 白 质 一 级 结 构 测 定 的 策 略 P168 直 接 法 (1) 测 定 蛋 白 质 分 子 中 多 肽 链 的 数 目 (2) 拆 分 蛋 白 质 分 子 的 多 肽 链 样 品 纯 度 必 须 >97% 以 上 ; (3) 断 开 多 肽 链 内 的 二 硫 桥 (4) 分 析 每 一 多 肽 链 的 氨 基 酸 组 成 (5) 鉴 定 多 肽 链 的 N 末 端 和 C 末 端 残 基 (6) 裂 解 多 肽 链 成 较 小 的 片 段 (7) 测 定 各 肽 段 的 氨 基 酸 序 列 (8) 重 建 完 整 多 肽 链 的 一 级 结 构 (9) 确 定 半 胱 氨 酸 残 基 间 形 成 的 S--S 交 联 桥 的 位 置

134 蛋 白 质 一 级 结 构 测 定 的 策 略 : 1 测 定 蛋 白 质 中 多 肽 链 的 条 数 测 定 蛋 白 质 多 肽 链 种 类 和 数 目 的 方 法 种 类 : N- 末 端 分 析 ;C- 末 端 分 析 (P169) 数 目 :N 末 端 氨 基 酸 残 基 摩 尔 数 / 蛋 白 质 摩 尔 数 2 多 肽 链 的 拆 分 由 多 条 多 肽 链 组 成 的 蛋 白 质, 必 须 先 进 行 拆 分 (1) 拆 分 非 共 价 键, 可 用 8mol/L 尿 素 或 6mol/L 盐 酸 胍 处 理, 即 可 分 开 多 肽 链 ( 亚 基 ). 如, 血 红 蛋 白 为 四 聚 体, 烯 醇 化 酶 为 二 聚 体 ; (2) 拆 分 二 硫 键

135 3 断 开 二 硫 键 ; 氧 化 法 或 还 原 法 拆 分 二 硫 键 : 几 条 多 肽 链 通 过 二 硫 键 交 联 在 一 起 可 用 8mol/L 尿 素 或 6mol/L 盐 酸 胍 变 性, 应 用 过 甲 酸 氧 化 法 或 过 量 的 - 巯 基 乙 醇 处 理, 使 二 硫 键 还 原 为 巯 基, 然 后 用 烷 基 化 试 剂 保 护 生 成 的 巯 基, 以 防 止 它 重 新 被 氧 化 链 间 非 共 价 力 盐 酸 胍 ; 尿 素 二 硫 键 过 甲 氧 酸 氧 化 法 巯 基 还 原 法

136 断 开 二 硫 键 过 甲 酸 氧 化 法 巯 基 乙 醇 二 硫 苏 糖 醇 还 原 法 烷 基 化 试 剂 保 护

137 4 多 肽 链 的 氨 基 酸 组 成 分 析 方 法 : 酸 水 解 辅 助 以 碱 水 解, 再 用 蛋 白 质 分 析 仪 蛋 白 质 水 解 氨 基 酸 分 析 仪 酸 水 解 (Trp,Ser,Thr,Tyr,Asn,Gln) 碱 水 解 (exc. Trp)

138 5 分 析 多 肽 链 的 N 末 端 和 C 末 端 多 肽 链 端 基 氨 基 酸 分 为 两 类 :N- 端 氨 基 酸 (amino-terminal) 和 C- 端 氨 基 酸 1. N 末 端 氨 基 酸 的 分 析 方 法 (1) 二 硝 基 氟 苯 法 (DNFB) (2) 丹 磺 酰 氯 法 (3) 苯 异 硫 氰 法 (PITC) (4) 氨 肽 酶 法 2. C 末 端 测 定 方 法 (1) 羧 肽 酶 法 : (2) 肼 解 法 (3) 还 原 法 :

139 分 析 多 肽 链 的 N 末 端 和 C 末 端 N 端 氨 基 不 能 被 封 闭 1. DNS-Cl 法 : 丹 磺 酰 氯 最 常 用, 黄 色 荧 光, 灵 敏 度 极 高, DNS- 多 肽 水 解 后 的 DNS- 氨 基 酸 不 需 要 提 取 2. DNFB 法 :Sanger 试 剂,DNP- 多 肽, 酸 水 解, 黄 色 DNP- 氨 基 酸, 有 机 溶 剂 ( 乙 酸 乙 酯 ) 抽 提 分 离, 纸 层 析 薄 层 层 析 液 相 等 3. PITC 法 :Edman 法, 逐 步 切 下 无 色 PTH- 氨 基 酸, 有 机 溶 剂 抽 提, 层 析

140 (1)N 端 分 析 方 法 1 二 硝 基 氟 苯 法 (DNP 法 ) Sanger 法 2,4- 二 硝 基 氟 苯 在 碱 性 条 件 下, 能 够 与 肽 链 N- 端 的 游 离 氨 基 作 用, 生 成 二 硝 基 苯 衍 生 物 (DNP) 在 酸 性 条 件 下 水 解, 得 到 黄 色 DNP- 氨 基 酸 该 产 物 能 够 用 乙 醚 抽 提 分 离 不 同 的 DNP- 氨 基 酸 可 以 用 色 谱 法 进 行 鉴 定

141 Sanger 试 剂 和 Sanger 应 用 : 鉴 定 多 肽 或 蛋 白 质 的 N- 末 端 氨 基 酸 Sanger, 确 定 了 胰 岛 素 的 一 级 结 构,1958 年 获 Nobel 化 学 奖 1975 年 建 立 了 快 速 测 定 DNA 序 列 的 加 减 法,1976 年 又 一 次 获 Nobel Prize.) 思 考 题 :1. 简 述 sanger 氨 基 酸 测 序 和 核 苷 酸 测 序 的 方 法 中 国 海 洋 大 学 生 物 化 学 2. 有 一 蛋 白 分 子 量 为 180KD, 用 什 么 方 法 可 以 鉴 别 它 是 直 链 的 还 是 闭 合 环 状 的 (10) 年 中 山 大 学 生 物 化 学

142 2 丹 磺 酰 氯 法 (DNS 法 ) N 端 分 析 方 法 在 碱 性 条 件 下, 丹 磺 酰 氯 ( 二 甲 氨 基 萘 磺 酰 氯 ) 可 以 与 N- 端 氨 基 酸 的 游 离 氨 基 作 用, 得 到 丹 磺 酰 - 氨 基 酸 此 法 的 优 点 是 丹 磺 酰 - 氨 基 酸 有 很 强 的 荧 光 性 质, 检 测 灵 敏 度 可 以 达 到 mol N(CH 3 ) 2 SO 2 Cl 丹 磺 酰 氯 R O + H 2 N CH C 多 肽 N- 端 N(CH 3 ) 2 N(CH 3 ) 2 R O SO 2 HN CH C 丹 磺 酰 N- 端 氨 基 酸 水 解 R O + 氨 基 酸 SO 2 HN CH C OH 丹 磺 酰 氨 基 酸

143 N 端 分 析 方 法 3 苯 异 硫 氰 酸 ( 酯 ) 法 (PITC 法 PTH 法 Edman 降 解 法 ) 蛋 白 质 序 列 分 析 仪 的 分 析 原 理!

144 氨 肽 酶 法 N 端 分 析 方 法 从 多 肽 链 的 N- 末 端 逐 个 地 向 里 切 根 据 不 同 的 反 应 时 间 测 出 酶 水 解 所 释 放 的 氨 基 酸 种 类 和 数 量, 按 反 应 时 间 和 残 基 释 放 量 作 动 力 学 曲 线 亮 氨 酸 氨 肽 酶 : 最 常 用 氨 肽 酶 M: 较 常 用

145 分 析 多 肽 链 的 N 末 端 有 些 蛋 白 质 的 肽 链 没 有 游 离 的 氨 基 端, 较 多 的 情 况 是 (1) 氨 基 端 因 受 到 乙 酰 化 或 谷 氨 酸 残 基 自 身 环 化 ; (2)N 端 修 饰 甲 酰 基 常 以 甲 酰 甲 硫 氨 酸 的 形 式 存 在 于 原 核 体 系 的 初 生 肽 链 的 端 部 思 考 题 : 一 个 寡 肽, 研 究 人 员 无 论 如 何 也 不 能 进 行 Edman 降 解 法 测 序, 分 析 两 种 可 能 性 原 因? 2012 北 京 大 学 生 物 化 学 试 题

146 (2) C- 末 端 分 析 方 法 1. 羧 肽 酶 法,(Pro 不 能 测 ) 羧 肽 酶 A: 除 Pro Arg Lys 外 的 所 有 C 端 a.a 羧 肽 酶 B: 只 水 解 Arg Lys 2. 还 原 法, 硼 氢 化 锂 (LiBH4) 肽 -COOHÆ 生 成 肽 -CH2OHÆ 水 解, 分 离, 层 析 鉴 定 此 法 比 较 少 用 3. 肼 解 法 Val Ser Gly

147 3 多 肽 链 部 分 裂 解 成 较 小 的 片 段 酶 解 法 : 胰 蛋 白 酶, 糜 蛋 白 酶, 胃 蛋 白 酶 等 化 学 法 : 溴 化 氰 水 解 法, 它 能 选 择 性 地 切 割 由 甲 硫 氨 酸 的 羧 基 所 形 成 的 肽 键

148 酶 解 法 A. 胰 蛋 白 酶 ( trypsin ) 专 一 裂 解 Lys Arg 的 羧 基 参 与 形 成 的 肽 键 为 了 减 少 的 作 用 位 点, 可 用 化 学 修 饰 将 多 肽 链 侧 链 保 护 起 来,1.2- 环 己 酮 封 闭 Arg, 马 来 酸 酐 封 闭 Lys 氮 丙 啶 形 成 带 正 电 荷 点, 增 加 位 点 B. 糜 蛋 白 酶 (Chymotrypsin) 断 裂 Phe,Trp,Tyr 等 疏 水 AA 的 羧 基 所 形 成 的 肽 键 断 裂 键 邻 近 的 基 团, 碱 性 : 裂 解 能 力, 酸 性 : 裂 解 能 力 C. 胃 蛋 白 酶 (Pepsin) 断 裂 键 两 侧 的 殘 基 都 是 疏 水 性 或 芳 香 氨 基 酸 残 基 其 后 和 前 为 Pro 时 抑 制

149 化 学 法 溴 化 氰 (BrCN) 水 解 法, 选 择 性 切 割 甲 硫 氨 酸 的 羧 基 所 形 成 的 肽 键

150 Specific Peptide Cleavage Reactions To make trypsin even more versatile you can modify side chains of amino acids

151 蛋 白 质 一 级 结 构 测 定 的 策 略 6 肽 段 的 分 离 纯 化 1 电 泳 法 :SDS-PAGE : 根 据 分 子 量 大 小 分 离 2 离 子 交 换 层 析 法 (DEAE Cellulose DEAE Sephadex) 根 据 肽 段 的 电 荷 特 性 分 离 3 反 相 HPLC 法 : 根 据 肽 段 的 极 性 分 离 4 凝 胶 过 滤 : 根 据 分 子 大 小 7 测 定 各 短 肽 段 的 氨 基 酸 序 列 方 法 : 蛋 白 质 序 列 分 析 仪 原 理 : 1. Edman 法 2. DNS- Edman 法 3. 有 色 - Edman 法

152 Peptide characterization by mass spectrometry 质 谱 分 析 法 基 本 原 理 质 谱 法 一 般 采 用 高 速 电 子 来 撞 击 气 态 分 子, 将 样 品 转 化 为 运 动 的 带 电 气 态 正 离 子, 加 速 导 入 质 量 分 析 器, 然 后 按 质 荷 比 (m/z) 的 大 小 顺 序 进 行 收 集 和 记 录, 测 出 了 离 子 的 准 确 质 量, 得 到 质 谱 图, 根 据 质 谱 峰 的 位 置 进 行 定 性 和 结 构 分 析, 根 据 峰 的 强 度 进 行 定 量 分 析

153 电 喷 射 串 联 质 谱 可 分 析 微 量 的 肽 链, 短 肽 在 第 一 台 质 谱 仪 中 经 电 喷 射 电 离, 按 荷 质 比 分 离, 依 次 在 经 碰 撞 池 被 裂 解 成 离 子 碎 片, 在 第 二 台 质 谱 仪 中 测 出 各 个 离 子 碎 片 的 谱 线, 推 算 出 短 肽 的 氨 基 酸 序 列 在 蛋 白 质 组 学 中 应 用 广 泛, 但 不 能 区 分 亮 氨 酸 和 异 亮 氨 酸 质 谱 法 测 序 的 突 出 优 点 是 可 以 识 别 翻 译 后 修 饰 (posttranslations modification) 而 得 到 的 特 殊 氨 基 酸 思 考 题 : Edman 测 序 和 质 谱 法 测 序 的 方 法 和 原 理 浙 江 大 学 2011 生 物 化 学 试 题

154 8 重 建 完 整 多 肽 链 的 一 级 结 构 不 同 的 方 法 指 的 是 断 裂 的 专 一 性 不 同, 即 切 口 彼 此 是 错 位 的 因 此 两 套 肽 段 正 好 相 互 跨 过 切 口 而 重 叠, 这 种 跨 过 切 口 而 重 叠 的 肽 称 为 重 叠 肽 (overlaping peptide) 借 助 重 叠 肽 可 以 确 定 肽 段 在 原 多 肽 链 中 的 正 确 位 置, 拼 凑 出 整 个 多 肽 链 的 氨 基 酸 顺 序

155 9 二 硫 键 位 置 的 确 定 - 对 角 线 电 泳 来 测 点 样 滤 纸 中 央 PH6.5 第 一 向 电 流 肽 段 按 大 小 及 电 荷 分 开 滤 纸 暴 露 在 过 甲 酸 蒸 汽 中 (-S-S- 断 裂 ) 含 二 硫 键 肽 段 被 氧 化 成 氧 化 成 一 对 含 半 胱 氨 磺 酸 的 肽 滤 纸 旋 转 90,PH6.5 第 二 向 电 流 含 半 胱 氨 磺 酸 的 成 对 肽 段 负 电 荷 偏 离 对 角 线 茚 三 酮 AA 顺 序 分 析 确 定 二 硫 键 的 位 置

156 二 硫 键 位 置 的 确 定 - 对 角 线 电 泳

157 二 硫 键 位 置 的 确 定 - 对 角 线 电 泳 来 测 1 为 测 定 蛋 白 质 中 的 二 硫 键 位 置, 常 采 用 对 角 线 电 泳 法, 问 点 样 时 样 品 应 点 在 下 列 所 指 的 哪 个 位 置 滤 纸 的 1 左 下 角 ; 2 右 上 角 ;3 边 缘 中 间 ; 4 中 央 答 ( ) 厦 门 大 学 生 命 科 学 学 院 2005 年 考 研 试 题 2. 分 离 含 胡 二 硫 键 的 肽 段 可 以 用 (2) 1 SDS-PAGE 电 泳 ;2 对 角 线 电 泳 ;3 琼 脂 糖 电 泳 中 科 院 上 海 生 化 与 细 胞 所 生 物 化 学 2002 年 中 国 计 量 学 院 以 胰 岛 素 为 例, 设 计 一 个 实 验 为 测 定 蛋 白 质 中 的 二 硫 键 位 置 浙 江 大 学 2011 生 物 化 学 试 题

158 二 硫 键 位 置 的 确 定 - 对 角 线 电 泳 来 测 4 对 角 线 电 泳 先 是 用 专 一 性 适 中 的 蛋 白 质 水 解 酶, 将 蛋 白 质 降 解 为 若 干 片 段 随 后 进 行 二 维 纸 电 泳, 在 第 一 相 电 泳 用 氧 化 剂 处 理, 然 后 进 行 第 二 相 电 泳 经 显 色 后, 在 多 角 线 上 的 肽 段 均 不 含 有 二 硫 键, 而 偏 离 对 角 线 的 肽 段 是 形 成 二 硫 键 的 肽 段 目 前 利 用 质 谱 技 术 也 可 以 测 定 二 硫 键

159 10 酰 胺 基 位 置 的 确 定 Asp Asn Glu Gln 方 法 : 酶 解 肽 链, 产 生 含 有 单 个 Asx 或 Glx 的 肽, 用 电 泳 法 确 定 是 Asp 还 是 Asn 举 例 :Leu-Glx-Pro-Val 肽 在 ph=6.0 时, 电 荷 量 是 Leu + Pro 0 Val - 此 肽 除 Glx 外, 净 电 荷 为 0, 可 根 据 此 肽 的 电 泳 行 为 确 定 是 Glu 或 是 Gln

160 七 蛋 白 质 测 序 举 例 P180 Proteolytic processing of insulin Insulin consists of two polypeptide chains, A and B, held together by two disulfide bonds. The A chain has 21 residues and the B chain has 30 residues.

161 蛋 白 质 测 序 举 例 1953 年 Frederick Sanger 和 他 的 同 事 们 首 次 测 定 了 牛 胰 岛 素 的 氨 基 酸 一 级 结 构, 它 包 含 2 条 肽 链 51 个 氨 基 酸 由 于 此 项 工 作, 他 获 得 了 1958 年 度 诺 贝 尔 奖 60 年 代, 我 国 首 次 人 工 合 成 结 晶 牛 胰 岛 素 bovine insulin 第 一 个 被 确 定 氨 基 酸 序 列 的 酶 : 核 酸 酶 (Hirs 等,1960 年 ) 第 一 个 侧 出 二 三 级 结 构 的 蛋 白 质 : 肌 红 蛋 白 第 一 个 侧 出 四 级 结 构 的 蛋 白 质 : 血 红 蛋 白

162 八 蛋 白 质 序 列 数 据 库 美 国 国 家 医 学 基 金 会 (National Biomedical Research Foundation) 主 持 的 PIR(Protein Information Resource, 蛋 白 质 信 息 库 ) 或 (Protein Identification Resource, 蛋 白 质 鉴 定 库 ) 美 国 政 府 扶 持 的 Gen Bank(Gene Sequence Data Bank) 和 欧 洲 EMBL(European Molecular Biology Laboratory Data Bank)

163 六 蛋 白 质 间 接 法 测 序 间 接 法 : 待 测 蛋 白 质 做 抗 原 免 疫 动 物 得 抗 体 再 以 后 者 做 抗 原 免 疫 动 物, 沉 淀 含 有 待 测 蛋 白 质 得 核 糖 体, 得 到 待 测 蛋 白 质 得 mrna, 逆 转 录 得 cdna 测 序 优 点 : 成 本 低 周 期 短, 一 次 可 测 序 列 长 缺 点 : 二 硫 键 无 法 确 定 无 法 测 定 其 修 饰 基 团 未 必 是 蛋 白 质 的 最 终 形 式 推 测 蛋 白 质 可 能 比 实 际 蛋 白 质 大 或 小?

164 思 考 题 华 东 师 范 大 学 2006 生 物 化 学 一 个 未 知 序 列 的 8 肽, 其 氨 基 酸 组 成 为 :Asp1 Ser1 Gly1 Ala1 Met1 Phe1 和 Lys2, 做 了 一 系 列 分 析 结 果 如 下 : (1) 用 DNFB 与 它 反 应, 再 酸 水 解 后 得 到 DNP-Ala (2) 用 胰 凝 乳 蛋 白 酶 消 化 后, 从 产 物 中 分 出 一 个 纯 四 肽, 其 组 成 为 Asp1 Gly1 Lys1 Met1 此 四 肽 用 DNFB 反 应 后, 降 解 为 DNP-Gly (3) 用 胰 蛋 白 酶 消 化 八 肽 后 又 可 得 到 组 成 成 分 分 别 为 Lys1 Ala1 Ser1 及 Phe1 Lys1 Gly1 的 两 个 三 肽 及 一 个 二 肽 此 二 肽 被 CNBr 处 理 后 游 离 出 自 由 天 冬 氨 酸 (Ala)- ( )S ( )S ( )Se ( )S ( )Sr ( )S - ( )S

165 思 考 题 华 东 师 范 大 学 2006 生 物 化 学 一 个 未 知 序 列 的 8 肽, 其 氨 基 酸 组 成 为 :Asp1 Ser1 Gly1 Ala1 Met1 Phe1 和 Lys2, 做 了 一 系 列 分 析 结 果 如 下 : (2) 用 胰 凝 乳 蛋 白 酶 消 化 后, 从 产 物 中 分 出 一 个 纯 四 肽, 其 组 成 为 Asp1 Gly1 Lys1 Met1 此 四 肽 用 DNFB 反 应 后, 降 解 为 DNP-Gly Asp1 Lys1 Met1 (Ala)- ( )S ( )S ( )Se ( Gly) ( )Sr ( )S - ( )S

166 思 考 题 华 东 师 范 大 学 2006 生 物 化 学 一 个 未 知 序 列 的 8 肽, 其 氨 基 酸 组 成 为 :Asp1 Ser1 Gly1 Ala1 Met1 Phe1 和 Lys2, 做 了 一 系 列 分 析 结 果 如 下 : (3) 用 胰 蛋 白 酶 消 化 八 肽 后 又 可 得 到 组 成 成 分 分 别 为 Lys1 Ala1 Ser1 及 Phe1 Lys1 Gly1 的 两 个 三 肽 及 一 个 二 肽 此 二 肽 被 CNBr 处 理 后 游 离 出 自 由 天 冬 氨 酸 (Ala)- (Ser ) (Lys ) ( Phe) ( Gly) ( Lys) ( Met)- ( Asp)S Asp1 Lys1 Met1

167 课 后 第 2 题 2 有 一 个 A 肽, 经 酸 解 分 析 得 知 为 Lys His Asp Glu2 Ala 以 及 Val Tyr 和 两 个 NH 3 分 子 组 成 (1) 当 A 肽 与 FDNB 试 剂 反 应 后 得 DNPAsp; 当 用 羧 肽 酶 处 理 后 得 游 离 缬 氨 酸 (2) 如 果 我 们 在 实 验 中 将 A 肽 用 胰 蛋 白 酶 降 解 时, 得 到 两 种 肽, 其 中 一 种 (Lys Asp Glu Ala Tyr) 在 ph6.4 时, 净 电 荷 为 零, 另 一 种 (His Glu 以 及 Val) 可 给 除 DNPHis, 在 ph6.4 时, 带 正 电 荷 (3) 此 外,A 肽 用 糜 蛋 白 酶 降 解 时, 也 得 到 两 种 肽, 其 中 一 种 (Asp Ala Tyr) 在 ph6.4 时 全 中 性, 另 一 种 (Lys His Glu2 以 及 Val) 在 ph6.4 时 带 正 电 荷 问 A 肽 的 氨 基 酸 序 列 如 何?

168 课 后 第 2 题 (1) 当 A 肽 与 FDNB 试 剂 反 应 后 得 DNPAsp; 当 用 羧 肽 酶 处 理 后 得 游 离 缬 氨 酸 Asp Val (2) 如 果 我 们 在 实 验 中 将 A 肽 用 胰 蛋 白 酶 降 解 时, 得 到 两 种 肽, 其 中 一 种 (Lys Asp Glu Ala Tyr) 在 ph6.4 时, 净 电 荷 为 零, 另 一 种 (His Glu 以 及 Val) 可 给 除 DNPHis, 在 ph6.4 时, 带 正 电 荷 ( 可 以 判 断 Glu 为 Gln) Asp Lys - His - Glu - Val Gln

169 Specific Peptide Cleavage Reactions (3) 此 外,A 肽 用 糜 蛋 白 酶 降 解 时, 也 得 到 两 种 肽, 其 中 一 种 (Asp Ala Tyr) 在 ph6.4 时 全 中 性 ( 可 以 判 断 Asn 为 Asn), 另 一 种 (Lys His Glu2 以 及 Val) 在 ph6.4 时 带 正 电 荷 Asp - Ala - Tyr - Glu - Lys - His - Gln - Val 最 后 根 据 电 荷 判 断 两 个 NH 3 [AsnAlaTyrGluLysHisGlnVal]