砷在小鼠血浆和血细胞中的代谢研究

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奠帚印
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1 GC 法测定砷 (Ⅲ) 在小鼠血浆和血细胞中的浓度及药动学研究李士敏 1, 朱亚尔 1, 李俊 (1. 浙江大学分析测试中心, 杭州,310029;2. 浙江省台州市药品检验所, 台州,318000) 2 摘要 : 目的建立血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的气相色谱测定方法, 考察小鼠静脉注射砷 (Ⅲ) 溶液后血浆和血细胞中的药代动力学情况方法血浆样品经 6% 高氯酸去蛋白, 二巯基丙醇 (BAL) 衍生化后, 苯萃取, 浓缩后用苯溶解后进样, 血细胞样品则直接衍生化后经苯萃取浓缩再溶解后进行 GC 分析采用该方法测定给小鼠静脉注射砷 (Ⅲ) 后血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 浓度, 计算主要的药动学参数结果血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 分别在 ~ 2.40μ g ml -1 和 ~1.00μ g ml -1 的范围内线性关系良好, 两者的 T1/2α 分别是 7.178min 和 2.531min,T1/2β 分别为 min 和 min,AUC0- 则分别为 mg/l*min 和 mg/l*min 结论本实验建立的小鼠血样中砷的气相色谱测定法设备简单方便方法灵敏可靠, 砷在小鼠血浆和血细胞中的消除很快, 没有蓄积的倾向, 而血细胞中砷的浓度要高于血浆中的浓度关键词 : 砷 (Ⅲ); 气相色谱法 ; 血浆 ; 血细胞由于砷对人体健康带来的危害从而引起了越来越多的人的关注有关砷在人体内的代谢变化以及砷的致癌机制, 便成了各国学者关注的热点砷虽然是一种毒物, 同时, 在临床上也有应用, 有报道采用亚砷酸注射液治疗急性早幼粒细胞白血病和慢性粒细胞白血病 [1,2,3], 具有良好的疗效, 因此研究砷化合物在体内的分布具有很重要的意义目前对生物样本中砷的测定有采用原子荧光或者 GC 测定 [4], 但血浆处理方式都是采用氧化消解, 测定的是血浆中总砷的含量 [1,5], 本文拟采用气相色谱方法对血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的浓度进行测定, 并对其药动学进行研究 1. 材料与方法 1.1 仪器与试药岛津 GC-15A 气相色谱仪,N2010 色谱工作站,ECD 检测器, 旋涡混合器,SorvaLL fuge stratos 高速台式离心机砷标准溶液 ( 国家标准物质中心提供 ),2,3- 二巯基丙醇 ( 纯度 95%, 购自 Lancaster Synthesis 公司 ), 苯为色谱纯 ( 天津四友生物医学技术有限公司 ),Triton X-100 为分析纯试剂 ( 上海化学试剂公司 ), 其余试剂均为分析纯 1.2 实验动物 ICR 小鼠, 雌雄各半, 体重 20g 左右, 由浙江省医学科学院提供 1.3 方法色谱条件 10% OV-101 填充色谱柱, 载气流速 :60ml min -1 ; 尾吹 :35ml min -1 ; 进样口温度 280, 检测器温度 :300, 柱温 : 初温 180, 保持 12min, 以 30 min -1 的速度升至 270, 保留 5min 样品预处理取血浆 200μL, 加 6% 的高氯酸水溶液 200μL, 混匀, 旋涡振荡 1min,20000rpm 高速作者简介 : 李士敏, 男, 副教授,Tel:(0571) zhuyaer@zju.edu.cn Fax:(0571)

2 离心 15min 去蛋白, 将上清液转移到 10mL 玻璃离心管中, 加 0.02% 的二巯基丙醇 20μL, 旋涡振荡 2min, 静置 1h 使其充分衍生化再加入 1.5mL 苯旋涡振荡 2min, 静置后 3000rpm 离心 10min 破除乳化, 吸取上层有机相置于 5mL 尖底刻度试管中, 常温下通氮气吹干, 再以 100μL 苯溶解, 加无水硫酸钠脱水后取 2μl 进样分析取血细胞样本 400μL( 含血细胞 200μL), 加入 40μL5.5% 的 Triton X-100 溶液 [5], 旋涡振荡 1min, 再加入 0.04% 的二巯基丙醇溶液 20μL, 旋涡振荡 2min,4 静置 1h 使其充分衍生化 ; 再加 3ml 苯振荡 5min,3000rpm 离心 10min, 吸取上层有机相到另一玻璃离心管中, 常温下通氮气吹干, 再加 100μL 苯溶解, 加入无水硫酸钠脱水后取 2μL 进样分析 2 结果 2.1 色谱行为与专属性在上述色谱条件下, 血浆和血细胞中砷 (Ⅲ)- 衍生物的保留时间约为 9.6min, 峰型良好, 空白血浆中也无杂峰干扰, 具有较高的专属性, 见图 1 A B C (1) 血浆样品色谱图 (2) 血细胞样品色谱图 A: 空白样品 ;B: 加入标准品后的样品 ;C: 小鼠给药后的样品图 1 不同样品的 GC 色谱图 (Fig 1. Typical GC chromatograms of different samples)

3 2.2 血浆和血细胞样品中砷 (Ⅲ) 的标准曲线制备取小鼠空白血浆 200μL, 分别精密加入不同浓度的砷 (Ⅲ) 对照液 20μL, 使血浆中砷 (Ⅲ) 的浓度分别为 2.40,1.20,0.60,0.30,0.15,0.075,0.0375μg ml -1, 旋涡混合, 按项下的血浆处理方法进行处理, 取 2μL 进样取空白血细胞样品 400μL( 含血细胞 200μL), 分别精密加入不同浓度的砷 (Ⅲ) 对照液 20μL, 使血细胞样品中砷 (Ⅲ) 的浓度分别为 1.00,0.50,0.25,0.125,0.0625, μg ml -1, 旋涡混合, 按项下的血细胞样品处理方法进行处理, 取 2μL 进样以峰面积 A 对浓度 (µg ml -1 ) 进行线性回归, 得血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的标准曲线分别为 : A= C r= 血浆中砷 (Ⅲ) A= C r= 血细胞中砷 (Ⅲ) 结果表明血浆中砷 (Ⅲ) 浓度在 ~2.40μg ml -1 和血细胞中砷 (Ⅲ) 浓度在 ~ 1.00μg ml -1 范围内线性良好在上述条件下以 S/N=3 计算, 得到在血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的检测限分别为 0.01μg ml-1 和 0.015μg ml 方法回收率和精密度取空白血浆和空白血细胞, 分别加入不同浓度砷 (Ⅲ) 对照溶液, 配成血浆中砷 (Ⅲ) 的浓度分别为 μg ml -1 的血浆样品和血细胞中砷 (Ⅲ) 的浓度分别为 μg ml -1 的血细胞样品, 按项下方法操作低中高 3 浓度日内平行测定 5 次, 计算日内精密度和方法回收率每日测定 1 次, 连测 5d, 计算日间精密度结果见表 1 2, 表明该方法符合生物样品分析要求表 1. 血浆样品中的方法回收率和精密度 (Tab1. Recovery and precision of arsenic in plasma) 砷 (Ⅲ) 溶液浓度方法回收率精密度 RSD(%) (μg ml -1 ) (x±s,%) 日内日间 ± ± ± 表 2. 血细胞样品中的方法回收率和精密度 (Tab2. Recovery and precision of arsenic in red blood cells) 砷 (Ⅲ) 溶液浓度方法回收率精密度 RSD(%) (μg ml -1 ) (x±s,%) 日内日间 ± ± ± 药动学测定取 ICR 小鼠, 随机分为 11 组, 每组 5 只, 采用尾静脉注射砷溶液, 剂量为 5.0mg kg -1 分别在注射后 5min 15min 30min 1h 1.5h 2h 3h 4h 5h 6h 8h 取血, 分离血浆和血细胞按项下方法测定血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的含量, 得药 - 时曲线见图 2 结果用 DAS1.0 药动学软件进行拟合后得到部分药代动力学参数, 见表 3

4 图 2. 砷 (Ⅲ) 在血浆和血细胞中的浓度 - 时间曲线 (Fig 2. concentration-time curve of As(Ⅲ) in plasma and red blood cells) 表 3. 小鼠静脉注射后砷 (Ⅲ) 的药代动力学参数 (Tab3. Pharmacokinetic parameters for mice after ) 参数血浆血细胞 T 1/2α /min T 1/2β /min AUC (mg/l*min) AUC (mg/l*min) AUC 0- (mg/l*min) 讨论目前国内一些报道采用原子荧光进行生物样本中砷的测定 [4], 或者采用 GC 测定, 但血浆处理方式是完全氧化消解, 测定的是血浆中总砷的含量 [1,5] 本文首次建立了血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的气相色谱分析方法该方法没有破坏砷 (Ⅲ) 的形态, 测出的是砷 (Ⅲ) 真实值, 能比较真实地反应出血样中砷的变化情况同时经方法学验证表明该气相色谱分析方法操作简单, 准确, 适用于血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的含量测定从表 3 可见小鼠静脉注射砷 (Ⅲ) 后, 砷 (Ⅲ) 在血浆和血细胞中的分布和消除均呈二室模型, 砷 (Ⅲ) 在血液中分布和消除相对较快, 不存在蓄积倾向, 与文献报道一致总体上, 血细胞中的砷 (Ⅲ) 的浓度要高于血浆, 显示砷 (Ⅲ) 进入血液后主要分布在血细胞中, 而血浆中的砷 (Ⅲ) 迅速消除, 分布到其他组织和器官, 或转化成其它的形式对于具体转化成什么砷形态有待于进一步去研究参考文献 [1] 倪建华陈国强沈志祥等, 静脉滴注三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的药代动力学分析, 中华血液学杂志,1997,18(5): 250~253 [2] 郭宇. 乔振华, 三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病研究进展, 临床医药实践杂志, 2005,14(2): 87~90 [3] 张日, 支雅军, 陶瑞芳等亚砷酸钠治疗加速期慢性粒细胞性白血病的疗效观察临床肿瘤学杂志,2000,5(4): 263~265 [4] 秦燕刘海卫, 气相色谱法对血浆及尿中砷的测定, 上海第二医科大学学报,1998,

5 18(3): 216~217 [5] Knowles, F.C., Benson, A.A., The biochemistry of arsenic. Trends Biochem.Sci.8,178~180. The Determination of As(Ⅲ) in plasma and red blood cells by GC and Pharmacokinetic analysis of As(Ⅲ) in mice LI-Shi-min 1, ZHU Ya-er 1, LI Jun 2 (1. Centre of Testing and Analysis, Zhejiang university, hangzhou , China;2. Taizhou Institute for drug control,taizhou ,China) Abstract: Objective: To develop a GC method for determination As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells and to discuss pharmacokinetics of As(Ⅲ) in mice blood by intravenously injection of arsenite solutions Methods: After being deproteined by 6% HClO 4, derivatized with 2,3-dimercaptopropanol (BAL), extracted by benzene, dried by N 2, and redissolved in 0.1mL benzene, plasma samples were separated by GC. Red blood cells samples were directly derivatized and injected after the same disposal. Mice blood samples were collected in different time point by extirpating eyeball after intravenously injection, separated adopting above established GC determination methods and the main pharma- cokinetic parameters were determined thereby. Results: Calibration curve of As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells were both linear in the range of ~2.40μg ml -1 和 ~1.00μg ml -1 respectively. T 1/2α were respectively 7.178min and 2.531min, T 1/2β were min and min, AUC 0- were mg/l*min and mg/l*min Conclusion: GC method for determination As(Ⅲ) in mice blood samples was sensitive, reliable, and equipment was simple and convenient. Elimination of As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells was rapid, and had no cumulation trend. Concentration of As(Ⅲ) in mice red blood cells was higher than in plasma. Key words: arsenic; GC method; plasma; red blood cells

6 GC 法测定砷 (Ⅲ) 在小鼠血浆和血细胞中的浓度及药动学研究李士敏 1, 朱亚尔 1, 李俊 (1. 浙江大学分析测试中心, 杭州,310029;2. 浙江省台州市药品检验所, 台州,318000) 摘要 : 目的建立血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 的气相色谱测定方法, 考察小鼠静脉注射砷 (Ⅲ) 溶液后血浆和血细胞中的药代动力学情况方法血浆样品经 6% 高氯酸去蛋白, 二巯基丙醇 (BAL) 衍生化后, 苯萃取, 浓缩后用苯溶解后进样, 血细胞样品则直接衍生化后经苯萃取浓缩再溶解后进行 GC 分析采用该方法测定给小鼠静脉注射砷 (Ⅲ) 后血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 浓度, 计算主要的药动学参数结果血浆和血细胞中砷 (Ⅲ) 分别在 ~ 2.40μg ml -1 和 ~1.00μg ml -1 的范围内线性关系良好, 两者的 T1/2α 分别是 7.178min 和 2.531min,T1/2β 分别为 min 和 min,AUC0- 则分别为 mg/l*min 和 mg/l*min 结论本实验建立的小鼠血样中砷的气相色谱测定法设备简单方便方法灵敏可靠, 砷在小鼠血浆和血细胞中的消除很快, 没有蓄积的倾向, 而血细胞中砷的浓度要高于血浆中的浓度关键词 : 砷 (Ⅲ); 气相色谱法 ; 血浆 ; 血细胞 2 The Determination of As(Ⅲ) in plasma and red blood cells by GC and Pharmacokinetic analysis of As(Ⅲ) in mice LI-Shi-min 1, ZHU Ya-er 1, LI Jun 2 (1. Centre of Testing and Analysis, Zhejiang university, hangzhou , China;2. Taizhou Institute for drug control,taizhou ,China) Abstract: Objective: To develop a GC method for determination As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells and to discuss pharmacokinetics of As(Ⅲ) in mice blood by intravenously injection of arsenite solutions Methods: After being deproteined by 6% HClO 4, derivatized with 2,3-dimercaptopropanol (BAL), extracted by benzene, dried by N 2, and redissolved in 0.1mL benzene, plasma samples were separated by GC. Red blood cells samples were directly derivatized and injected after the same disposal. Mice blood samples were collected in different time point by extirpating eyeball after intravenously injection, separated adopting above established GC determination methods and the main pharma- cokinetic parameters were determined thereby. Results: Calibration curve of As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells were both linear in the range of ~2.40μg ml -1 和 ~1.00μg ml -1 respectively. T 1/2α were respectively 7.178min and 2.531min, T 1/2β were min and min, AUC 0- were mg/l*min and mg/l*min Conclusion: GC method for determination As(Ⅲ) in mice blood samples was sensitive, reliable, and equipment was simple and convenient. Elimination of As(Ⅲ) in mice plasma and red blood cells was rapid, and had no cumulation trend. Concentration of As(Ⅲ) in mice red blood cells was higher than in plasma. Key words: arsenic; GC method; plasma; red blood cells

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