第期董惠钧等大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素用葡聚糖凝胶过滤或硅胶柱层析的方法收集高纯度产品最后经脱色结晶洗涤和干燥获得成品 & 但这些工艺前处理有

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严黄
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1 第卷第期年月生物加工过程 % = (% 8%,% &%%% 大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素董惠钧赵军杰陈启林张文波王成军鲁南制药集团股份有限公司临沂摘要采用大孔吸附树脂层析结合硅胶柱层析对环孢菌素的分离纯化进行研究确定了最佳层析条件建立了工业化制备环孢菌素的工艺大孔吸附树脂层析选用 7 树脂作为吸附介质提取液丙酮含量控制在最大吸附量为湿树脂洗脱剂选用丙酮硅胶柱层析选用 C 硅胶作为层析介质最优层析条件为柱床高径比 D 流动相配比 ) 石油醚 D) 丙酮 E D 流速 6 环孢菌素上样质量浓度 6 硅胶层析平均收率为 B 环孢菌素纯度可达到以上整个工艺总收率为 C 关键词环孢菌素大孔吸附树脂硅胶柱层析纯化中图分类号文献标志码文章编号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环孢菌素 ++/,'., 是从雪白白僵菌 *+ 的培养物中分离得到的一种含个氨基酸的环状多肽能够用于肾脏肝脏和心脏等移植手术的免疫抑制治疗 & 还可以用来治疗红斑狼疮类风湿性关节炎特发性血小板减少性紫癜溃疡性结肠炎重症肌无力慢性肾炎慢性活动性肝炎和肾病综合症等多种自身免疫性疾病 & 环孢菌素是一种非极性物质不溶于水石油醚溶于甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯等有机溶剂目前环孢菌素工业化纯化制备方法是首先通过有机溶媒提取后利用环孢菌素的溶解性差异多次萃取将环孢菌素转移至有机混合相中再利收稿日期 & & 作者简介董惠钧男山西黎城人博士工程师研究方向生化药物 :/(" 8A/%+

件建立了工业化制备环孢菌素的工艺大孔吸附树脂层析选用 7 树脂作为吸附介质提取液丙酮含量控制在最大吸附量为湿树脂洗脱剂选用丙酮硅胶柱层析选用 C 硅胶作为层析介质最优层析条件为柱床高径比 D 流动相配比 ) 石油醚

2 第期董惠钧等大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素用葡聚糖凝胶过滤或硅胶柱层析的方法收集高纯度产品最后经脱色结晶洗涤和干燥获得成品 & 但这些工艺前处理有机溶剂用量大处理设备要求容积大而硅胶层析用梯度洗脱的方法导致效率和收率低而且色素去除效果差产品需活性炭脱色方东升等利用高速逆流色谱分离环孢菌素但该方法不适用于工业化生产在此基础上陈秀明等利用大孔吸附树脂 # 结合高速逆流色谱分离环孢菌素小组分对环孢菌素实现富集再分离但该方法处理规模小设备要求高也不容易规模化生产本研究结合大孔吸附树脂层析和硅胶柱层析在优化层析条件基础上探索收率高成本低的环孢菌素分离纯化工艺 - 材料与方法 -2- 试剂与仪器大孔吸附树脂 77 和安徽三星树脂科技有限公司 # 日本三菱化学公司 #7 沧州宝恩化工有限公司层析硅胶 C 青岛海浪硅胶干燥剂厂丙酮石油醚乙腈色谱纯? # 碘盐酸乙酸乙酯高效硅胶薄板 + + 青岛海洋化工有限公司高效液相色谱仪 /*/**+" /*, 层析柱 + + 和 + + 江阴金确层析设备有限公司旋转蒸发仪 5*,. 无锡星海王生化设备有限公司搅拌器 5:5 上海申生科技有限公司蠕动泵 ; 9 保定兰格恒流泵有限公司 -2+ 方法 BB 环孢菌素提取液制备取环孢菌素发酵液加入倍体积丙酮保温搅拌提取 " 过滤除去菌体得到环孢菌素提取液通过比较提取液与发酵原液中环孢菌素的质量浓度可计算提取收率按下式计算,E 滤液 ) 滤液发酵液 ) 发酵液式中, 为提取收率滤液为丙酮提取后的滤液中环孢菌素的质量浓度 6) 滤液为滤液体积 6 发酵液为发酵液中环孢菌素质量浓度含胞内 6) 发酵液为发酵液体积 6 提取液中环孢菌素的质量浓度约为 B CB 6 纯度约为 C 杂质为环孢菌素同系物和色素 BB 大孔吸附树脂静态吸附率与解析率测定分别称取已处理非极性大孔吸附树脂 7 # 和各按照含水率折算成干质量置于 6 具塞锥形瓶中分别加入环孢菌素发酵提取液 6 常温低速振荡 ". 过滤测定滤液中环孢菌素的质量浓度取过滤后树脂加入 6 丙酮在相同的处理条件下进行解析测定洗脱液中环孢菌素的质量浓度每种树脂平行样个最后根据式 C 计算树脂对环孢菌素的吸附量吸附率和解吸率 - * E & * ). /E & *. 0E 1 ). & * ) 式中 - * 为吸附量为初始质量浓度 6 * 为平衡质量浓度 6) 为加样体积 6 为树脂干质量 / 为吸附率 0 为解吸率 1 为洗脱液质量浓度 6) 为洗脱液体积 6 BB 大孔吸附树脂吸附动力学分析按照 BB 中的方法每隔测定一次吸附量连续测定 " 以时间为横轴吸附量 - * 为纵轴绘制大孔吸附树脂的动力学吸附曲线 BB 大孔吸附树脂吸附等温线的测定准确称取 7 树脂分别加入不同质量浓度的环孢菌素丙酮水溶液 6 丙酮体积分数在和下振荡吸附 " 使吸附达到平衡测定上清液中环孢菌素质量浓度计算吸附量根据树脂吸附平衡后吸附量与溶液中环孢菌素质量浓度之间的关系绘制 7 树脂吸附环孢菌素的等温曲线 BB 大孔吸附树脂动态吸附和解吸称取大孔吸附树脂 7 装入玻璃层析柱 + + 柱床体积为 B 6 按每小时倍柱体积速度上样环孢菌素提取液分步收集流出液每瓶收集 6 测定收集液中环孢菌素的质量浓度按照式计算未吸附率 / E 式中为流出液中环孢菌素质量浓度 6 为上样液中环孢菌素质量浓度 6/ 为未吸附率以流出液体积 ) 6 为横坐标未吸附率为纵坐标绘制动态吸附曲线平行实验次 BB 大孔吸附树脂吸附解吸过程将环孢菌素发酵液的丙酮提取液过滤除去菌体调整丙酮体积分数少于然后上样 7 大孔吸附树脂 + + 用薄层层析分析 6 监测吸附渗漏点吸附饱和后用盐酸

现富集再分离但该方法处理规模小设备要求高也不容易规模化生产本研究结合大孔吸附树脂层析和硅胶柱层析在优化层析条件基础上探索收率高成本低的环孢菌素分离纯化工艺 - 材料与方法 -2- 试剂与仪器大孔吸附树脂 77 和安

3 生物加工过程第卷溶液洗柱个柱体积用丙酮洗脱环孢菌素用 6 监测洗脱终点 BB 硅胶柱层析将丙酮洗脱液减压旋蒸浓缩至一定体积无环孢菌素析出加入石油醚调节丙酮石油醚比例然后上样层析硅胶柱 + + 待上样液进入层析硅胶后用丙酮石油醚流动相洗脱用高效液相色谱 #6 监测并收集环孢菌素纯度高于的洗脱液 BB 薄层层析分析 6 将一定量的蒸馏水加入乙酸乙酯中搅拌后静置分层取上层水饱和乙酸乙酯作为展开剂取试样点样高效薄层层析板在层析缸中预饱和后置于展开剂中展开展开结束吹干后用碘蒸气熏蒸显色 BB 高效液相分析 #6 高效液相色谱系统为 /* 色谱柱为反相柱 B 柱温流动相为 ) 乙腈 D) 水 E D 检测波长流速 B 6 进样量为 6 + 结果与讨论 +2- 大孔吸附树脂层析条件优化 BB 大孔吸附树脂选择在同样实验条件下对种非极性大孔吸附树脂进行了静态吸附量吸附率和解吸率测定洗脱剂选用丙酮结果见表表 - 不同树脂对环孢菌素的吸附量吸附率和解吸率.#$-.#'/ #"'/"#/#"'/ "#/ %*$'" %"/" 异会导致不同的吸附特性在吸附动力学上会表现出差异因此比较了种优选树脂的动力学吸附过程结果如图所示图 - 静态吸附动力学曲线 3-/#/#"'//!"4 由图可知种树脂的吸附动力学曲线呈指数型分布起始阶段吸附速率为最大吸附量 - * 迅速增加后树脂吸附趋于饱和吸附速率下降比较种树脂的吸附动力学曲线可以看出 7 树脂的吸附速率最优因此遴选 7 树脂作为环孢菌素的吸附树脂 BB 丙酮提取液配比对 7 树脂吸附的影响由于环孢菌素为胞内产物且为非极性物质需用有机溶剂对发酵液进行萃取对比丙酮甲醇和乙醇的提取收率确定丙酮为最佳萃取溶剂丙酮在提取液中比例不但影响提取收率而且对大孔吸附树脂 7 的吸附量也有影响因此对不同浓度的丙酮提取液进行了提取收率和吸附量实验结果如图所示树脂型号吸附量 & 吸附率解吸率 # B B B 7 B B B B B B #7 B B B 7 B B B 从表可以看出大孔吸附树脂 7# 和的吸附和解吸能力强因此选择这种树脂作进一步吸附行为研究 BB 树脂静态吸附动力学曲线尽管优选的种大孔树脂在静态实验中的数据显示都比较理想但是由于树脂本身物化性质的差图 + 不同浓度丙酮对环孢菌素提取收率和吸附量影响 3+%/ %#//"#/ //"#/ "#/##"'/ %*$'" 从图可以看出随着丙酮浓度的增加环孢菌素的提取收率增加而相反 7 树脂对环孢菌

饱和后置于展开剂中展开展开结束吹干后用碘蒸气熏蒸显色 BB 高效液相分析 #6 高效液相色谱系统为 /* 色谱柱为反相柱 B 柱温流动相为 ) 乙腈 D) 水 E D 检测波长流速 B 6 进样量为 6 + 结果与讨论 +2- 大孔吸附树脂层析条件优化

4 第期董惠钧等大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素素的吸附量则下降这是由于环孢菌素为非水溶性非极性分子在丙酮含量高的流动相中与树脂的相互作用力减弱从而导致吸附量下降因此条曲线的交叉点附近即 B C 倍丙酮含量应该是较佳的比例能同时保证高提取收率和树脂吸附量 BB7 树脂吸附等温线在环境温度和下测定了环孢菌素在 7 树脂上的吸附等温线图从图可以看出环孢菌素在大孔吸附树脂上的吸附随着温度的升高吸附量下降表明该吸附过程为放热过程在高温条件下不利于环孢菌素的吸附因此适宜的吸附温度为进一步研究种溶剂对 7 树脂吸附环孢菌素的洗脱率如表所示丙酮的洗脱回收率最高为 B 几乎可以完全将环孢菌素从树脂上洗脱乙酸乙酯洗脱回收率最低为 B 表 + 不同洗脱剂的洗脱率.#$+$!/"!$/ %;-,- ""0#/"#'! %"/$!#/ 洗脱剂类型环孢菌素 6 & 洗脱体积 6 洗脱率甲醇 B B B 丙酮 B B B 乙酸乙酯 B B B 图 (;-,- 树脂在不同温度下吸附环孢菌素的等温线 3("'//"0 %*$'" ;-,- "#/%"//0'"#/!" BB 洗脱剂选择在相同上样量环孢菌素条件下对比了甲醇丙酮和乙酸乙酯对环孢菌素的洗脱能力结果如图所示由图可知丙酮对环孢菌素的洗脱能力最强从树脂上完全洗脱所需体积最小约为 6 相比较甲醇的洗脱能力优于乙酸乙酯后者需要 6 的体积才能将环孢菌素从树脂上完全洗脱因此选用丙酮为洗脱剂 BB 穿透曲线在柱床体积 6 环孢菌素上样质量浓度 B 6 丙酮体积分数上样流速 6 的条件下测定 7 树脂的穿透曲线结果如图所示从图可看出吸附 6 上样液后流出液环孢菌素质量浓度与原液质量浓度比值超过 B 说明树脂对环孢菌素的吸附已经饱和开始渗漏根据上述数据可推算出动态吸附过程中树脂对环孢菌素的饱和吸附量约为湿树脂图 7;-,- 树脂对环孢菌素的穿透曲线 37&"#/"!!"4 %*$'" ;-,- " 图 6 不同洗脱剂对环孢菌素洗脱能力 36$/ %%"/$!/#/#/ *$'" BB 洗脱曲线按 %% 条件上样大孔吸附树脂并洗脱绘制洗脱曲线图用 6 丙酮可将环孢菌素从树脂上完全洗脱收率可以达到洗脱液中环孢菌素质量浓度约为 6 纯度为 B +2+ 硅胶柱层析条件优化 BB 流动相选择用 C 硅胶装填 + + 层析

为放热过程在高温条件下不利于环孢菌素的吸附因此适宜的吸附温度为进一步研究种溶剂对 7 树脂吸附环孢菌素的洗脱率如表所示丙酮的洗脱回收率最高为 B 几乎可以完全将环孢菌素从树脂上洗脱乙酸乙酯洗脱回收率最低为 B 表

5 生物加工过程第卷图 9 优化条件下环孢菌素洗脱曲线 39$!/!"4 %*$'"!"/ '/0#$/ 图流动相流速对环孢菌素层析影响 3%/ %%$"#/ /"#0 /#"#' %*$'" 柱柱床体积 6 在流动相流速控制在 6 环孢菌素上样质量浓度为 6 上样体积 6 和常温条件下分别对种不同配比的石油醚丙酮流动相进行了层析实验数据结果表表明随着流动相极性减弱丙酮含量减少环孢菌素的分离效果递增但所耗流动相体积和收率也下降综合考虑选择流动相配比 ) 石油醚 D) 丙酮 E D 作为洗脱剂可使产品纯度达到 B 收率 B 表 ( 不同配比流动相层析结果.#$(8!$/ %$!0"0#/"#'! %"/%$!'# 析柱中出现横向扩散分离效果差而高流速下环孢菌素在流动相与固定相的分配无法达到平衡致使有拖尾现象分离纯化效果也不理想而当流速 6 时环孢菌素的收率和纯度值最高 BB 环孢菌素上样质量浓度选择用 C 硅胶装填 + + 层析柱柱床体积 6 以 ) 石油醚 D) 丙酮 E D 作为流动相流速 6 上样体积 6 和常温条件下考察不同浓度环孢菌素的分离收率 1 + 和纯度 + 结果如图所示 ) 石油醚 D) 丙酮 ) : D B B D B B D B B D B B D B B 注 ) : 为流动相用量 1 + 为环孢菌素回收率 + 为环孢菌素纯度图环孢菌素上样质量浓度对层析的影响 3%/ %*$'"/"#/ "0#/"#' BB 流动相流速选择用 C 硅胶装填 + + 层析柱柱床体积 6 以 ) 石油醚 D) 丙酮 E D 作为流动相在环孢菌素上样质量浓度 6 上样体积 6 和常温条件下考察流速对环孢菌素的分离纯化效果结果如图所示由图可知当流速低于 6 或高于 6 时环孢菌素层析收率 1 + 和纯度 + 都会降低主要是低流速会使环孢菌素在层由图可以看出当环孢菌素质量浓度为 6 时层析收率最高而纯度略低随着浓度的增加出现环孢菌素同系物的重叠峰无法分离收率显著下降纯度也降低只是幅度要小一些综合考虑收率和纯度要求选择 6 为环孢菌素的上样质量浓度 BB 柱床高径比选择以 ) 石油醚 D) 丙酮 ED 作为流动相流速 6 环孢菌素上样质量浓度

果表表明随着流动相极性减弱丙酮含量减少环孢菌素的分离效果递增但所耗流动相体积和收率也下降综合考虑选择流动相配比 ) 石油醚 D) 丙酮 E D 作为洗脱剂可使产品纯度达到 B 收率 B 表 ( 不同配比流动相层析结果.#$(8!$/ %$!

6 第期董惠钧等大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素 6 上样体积 6 和常温条件下考察柱床高径比对环孢菌素的分离纯化收率 1 + 和纯度 + 的影响结果如图所示素层析工艺的重现性结果如图所示图柱床高径比对环孢菌素层析的影响 3%/ %#'/"#/ /"0#/"#' %*$'" 由图可知随着高径比增大环孢菌素的收率和纯度都逐渐增大当高径比大于收率和纯度增加的幅度减少考虑树脂和有机溶剂用量以及层析效率选择硅胶柱层析的高径比为 D BB 洗脱曲线在柱床高径比 D 柱体积 6 环孢菌素上样质量浓度 6 流动相比例 ) 石油醚 D) 丙酮 ED 流速 6 的优化条件下进行环孢菌素的层析分离以流动相体积 6 为横坐标环孢菌素质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线图整个洗脱过程需流动相个柱体积洗脱峰对称系数接近表明分离效果理想图 -, 优化条件下环孢菌素的硅胶柱层析洗脱曲线 3-,$!/!"4 %*$'" $# $$!0"0#/"#'!" / '/0#$/ BB 重现性考察在优化条件下连续上样层析次考察了环孢菌图 -- 环孢菌素硅胶柱层析的重现性考察 3--8'"!$/* // %*$'"$# $ $!0"0#/"#' 从图可看出环孢菌素的平均收率为 B 平均纯度为 B 分离纯化的重现性较好从图中收率和纯度的趋势虚线可看出随着分离次数增加两者都会略有下降这主要是由于硅胶的死吸附造成的硅胶柱的再生使用丙酮可以将绝大部分吸附的物质洗脱从而保证分离纯化的重现性 ( 结论本研究根据环孢菌素弱极性的特征引入非极性大孔吸附树脂层析技术并结合硅胶柱层析建立了环孢菌素分离纯化的工业化路线大孔吸附树脂层析选用 7 树脂作为吸附介质提取液丙酮含量控制在及以下最大吸附量可以达到倍柱体积洗脱剂选用丙酮洗脱体积为 B 6 洗脱收率为 B 硅胶柱层析选用 C 硅胶作为层析介质最优层析条件为柱床高径比 D 流动相配比为 ) 石油醚 D) 丙酮 ED 硅胶层析平均收率为 B 纯度可达到以上总收率为 C 该工艺能够非常有效地去除色素大幅提高产品收率而且纯化过程中所使用溶剂可套用或回收再利用可显著降低生产成本参考文献 "* 79 6*.,+"*. 0 = */%+/,'.* *< 0,0''.*,**-...,'/9% *. =*(% 6**+".(, =5*.9*/% //,0(-+ +/,'.*+'., -*./*.,0,+,'.,/*"*.., '/.*+'*,9%9*.60.,'/%

比 D 柱体积 6 环孢菌素上样质量浓度 6 流动相比例 ) 石油醚 D) 丙酮 ED 流速 6 的优化条件下进行环孢菌素的层析分离以流动相体积 6 为横坐标环孢菌素质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线图整个洗脱过程需流动相个柱体积洗脱峰对称

7 生物加工过程第卷 0(*#%+/,'.* "*.**-('"+* '".,,9%95+*'"./% 6??50 #5+".**.6*/%+/,'.* "*.* *-(*./+(,*,* 0'(* 9%=/ #.+ % 柳志文凌天贺建泽等 % 复方环孢菌素含漱液治疗口腔扁平苔藓的研究 9% 湖南医科大学学报 % 60 "<*6*9!**/%*,*.+" -+'0( ++/,'. 0"<," "*.**-.//+"* '/0, 9%;0 /0 =*( 4% ;",/*5) 2#.*,<. #5%#.+*,-."*,/ - '".+*0+/+'0( ++/,' , 6@*,!'.*25%#.+*,-."* ' /,'. 45#%% ;)".= =! /"'0.= */%#.(0+ ( ' /,'.*-.-*.*." -#! "9%5+*.+% 方东升谢阳陈勇等 % 高速逆流色谱法分离纯化环孢菌素 9% 中国抗生素杂志 % 7,"**3"* 3*/%5*'. -++/, '., "",'**( +0*.+0.*+"..'" 9%"*,* 90./-+,% 陈秀明方剑英陈振伟等 % 大孔吸附树脂柱层析结合高速逆流色谱分离纯化环孢菌素小组分 9% 中国抗生素杂志 % "* 09"* "*<**/%5*'. ( ' /,'..+'*, +.'.0,(,.'.*, ( "",'**( +0*.+0.*+"..'" 9% "*,*90./-+,% 国外动态德开发用纤维素纳米颗粒生产化妆品新工艺脂质体作为药物载体制剂的研究一直受到医学界的重视脂质体技术是将药用活性物质包裹于磷脂双分子层所形成的囊泡中的制作技术由于生物体质膜的基本结构也是磷脂双分子层脂质体具有与生物体细胞相似的结构因此有很好的生物相容性化妆品厂家称脂质体携带被包裹封存的护肤活性物质可以更有效渗入肌肤提高护肤活性物质的功效但德国耶拿大学的化学家认为某些脂质体的稳定性有待提高所以其作用有局限性因此这所大学的研究人员通过研究选中了一种更好的替代品纤维素纳米颗粒耶拿大学的研究人员发现 C 大小的纤维素颗粒放在实验室中几年其稳定性都没有变化纤维素颗粒的基本化学结构还使其具有多重亲和性能与具有护肤作用的维生素和维生素 : 等很多活性物质结合因而可以携带这些不溶于水的物质渗入肌肤提高护肤效果古巴从植物中提取抗癌抗艾药物蒜臭母鸡草是一种在古巴较常见的热带植物当地居民常把它作为草药用于抗痉挛镇痛利尿和发汗并用它治疗皮肤炎症关节炎等古巴卫生部门宣布该国已开始批量生产一种用热带植物蒜臭母鸡草提取物制成的药物它已经通过了临床实验和毒性实验并在治疗癌症和艾滋病临床中显示出较好效果文伟河

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第 期 董 惠 钧 等 大 孔 吸 附 树 脂 结 合 硅 胶 柱 层 析 纯 化 环 孢 菌 素 用 葡 聚 糖 凝 胶 过 滤 或 硅 胶 柱 层 析 的 方 法 收 集 高 纯 度 产 品 最 后 经 脱 色 结 晶 洗 涤 和 干 燥 获 得 成 品 & 但 这 些 工 艺 前 处 理 有

第期董惠钧等大孔吸附树脂结合硅胶柱层析纯化环孢菌素用葡聚糖凝胶过滤或硅胶柱层析的方法收集高纯度产品最后经脱色结晶洗涤和干燥获得成品 & 但这些工艺前处理有