行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 補 助 大 專 生 參 與 專 題 研 究 計 畫 研 究 成 果 報 告 以 微 生 物 聚 醣 作 為 傷 口 敷 料 基 材 之 評 估 執 行 計 畫 學 生 : 陳 慧 如 學 生 計 畫 編 號 : NSC C-040 0

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2 行 政 院 國 家 科 學 委 員 會 補 助 大 專 生 參 與 專 題 研 究 計 畫 研 究 成 果 報 告 以 微 生 物 聚 醣 作 為 傷 口 敷 料 基 材 之 評 估 執 行 計 畫 學 生 : 陳 慧 如 學 生 計 畫 編 號 : NSC C B 研 究 期 間 : 98 年 7 月 1 日 至 99 年 2 月 28 日 止 指 導 教 授 : 李 明 偉 老 師

3 計 畫 書 內 容 : 1. 摘 要 2. 研 究 動 機 3. 前 言 及 文 獻 回 顧 3.1 傷 口 癒 合 機 制 3.2 敷 材 分 類 3.3 生 物 性 材 料 在 創 口 癒 合 之 特 色 3.4 目 前 作 為 表 皮 敷 材 之 生 醫 材 料 現 況 與 市 售 產 品 之 優 缺 點 4. 微 生 物 聚 醣 介 紹 4.1 微 生 物 聚 醣 之 來 源 4.2 微 生 物 聚 醣 運 用 在 生 醫 材 料 之 優 點 4.3 Gellan gum 來 源 與 結 構 4.4 Gellan gum 基 本 性 質 4.5 Gellan gum 作 為 生 醫 材 料 之 優 點 5. 實 驗 方 法 5.1 研 究 方 法 5.2 Gellan-EDC 之 作 用 機 制 5.3 Gellan-Glutaraldehyde 之 作 用 機 制 5.4 Gellan-EDC 之 紅 外 線 光 譜 儀 之 測 試 5.5 Gellan-EDC 之 拉 伸 測 試 5.6 Gellan-EDC 之 Gel-content Water-content 5.7 Gellan-EDC 之 上 皮 細 胞 增 生 測 試 5.8 Gellan-EDC 之 Nitric oxide(no) 抗 發 炎 測 試 5.9 Gellan-EDC 之 動 物 表 皮 貼 附 測 試 6. 實 驗 結 果 及 討 論 7. 結 論 8. 參 考 文 獻

4 1. 摘 要 Gellan gum 是 微 生 物 所 分 泌 的 微 生 物 聚 醣, 其 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 及 生 物 可 分 解 性, 且 因 其 是 由 微 生 物 所 製 造, 純 化 方 式 單 純, 不 會 引 發 免 疫 反 應, 因 此 以 Gellan 做 為 基 材 的 敷 料 是 一 新 型 用 於 皮 膚 創 傷 之 生 醫 材 料 但 因 以 微 生 物 聚 醣 類 製 出 的 薄 膜 性 質 較 為 脆 硬, 容 易 破 裂, 須 以 EDC 及 Glutaraldehyde 等 交 聯 劑 交 聯, 以 改 變 他 過 於 脆 硬 的 性 質, 以 增 強 膜 的 機 械 強 度 及 柔 韌 度 因 此 本 研 究 即 以 Gellan 為 創 傷 敷 料 為 基 材, 再 以 交 聯 劑 交 聯 改 質 後, 分 別 進 行 動 物 體 內 外 之 評 估 體 外 研 究 方 面, 以 紅 外 線 光 譜 儀 測 定 確 定 交 聯 劑 有 交 聯 反 應, 在 1720nm 處 出 現 波 峰, 為 C=O 官 能 基 之 變 化 以 拉 伸 測 試 交 聯 後 其 機 械 強 度 於 交 聯 劑 條 件 在 40~60% 酒 精 下 交 聯 有 明 顯 增 強, 能 符 合 我 們 所 希 望 的 改 變 其 脆 硬 容 易 破 裂 的 性 質 測 試 含 膠 量 及 含 水 量, 發 現 含 膠 量 測 試 中, 以 40~60% 酒 精 作 為 交 聯 劑 溶 液 之 條 件 下, 含 膠 量 達 最 高 最 後 是 NO 毒 性 測 試, 發 現 Gellan 在 第 一 天 時 有 抑 制 發 炎 的 效 果, 但 隨 時 間 增 加, 此 效 果 會 漸 漸 退 去 ; 而 文 獻 中 指 出, 交 聯 劑 EDC 於 高 濃 度 下 具 細 胞 毒 性,Gellan-EDC 在 NO 毒 性 測 試 中 也 出 現 NO stress, 與 文 獻 吻 合 生 物 體 內 評 估, 是 設 計 在 開 放 性 傷 口 的 狀 況 下, 以 產 品 Gellan 及 Gellan-EDC 覆 蓋 於 大 鼠 傷 口 上, 做 傷 口 的 組 織 切 片, 發 現 在 第 24 天 後 傷 口 恢 復 情 形 良 好, 發 炎 現 象 逐 漸 趨 緩, 也 無 組 織 空 洞 化 之 情 形 以 上 之 基 本 研 究 是 確 信 Gellan 作 為 新 型 生 物 性 敷 傷 材 料 的 第 一 步, 還 需 很 多 後 續 的 研 究 去 增 加 其 特 性, 如 可 以 添 加 一 些 抗 發 炎 的 材 質 在 Gellan 中, 可 以 使 其 作 為 生 物 性 敷 傷 材 料 的 優 點 更 多, 更 加 完 美 2. 研 究 動 機 現 今 用 於 深 度 皮 膚 受 傷 如 燒 燙 傷 的 救 治 所 使 用 的 方 法 其 實 並 不 完 善, 尤 其 是 對 大 面 積 燒 傷 的 病 患, 因 傷 口 面 積 太 大, 不 可 選 用 一 般 敷 材 治 療, 救 治 方 式 還 是 用 傳 統 的 Wound Dressing, 也 就 是 用 塗 抹 抗 生 素 等 軟 膏 的 方 式 做 到 殺 菌 的 效 果, 但 病 人 的 傷 口 復 原 力 及 存 活 率 是 不 高 的 在 一 般 人 工 敷 料 像 是 植 皮 方 面, 且 有 保 存 時 間 短 具 潛 在 免 疫 反 應 容 易 污 染 等 等 的 缺 點 而 目 前 市 面 上 所 販 售 的 人 工 敷 料, 如 Integra[10 11] Apligraff[12 13] 等, 這 樣 的 產 品 除 了 製 程 本 身 繁 雜 程 度 極 高 之 外, 加 上 製 作 成 本 十 分 昂 貴, 造 成 病 人 使 用 時 必 須 付 出 高 額 的 代 價, 因 此 臨 床 實 用 性 的 評 估 並 不 理 想 而 且 大 多 敷 材 都 是 不 可 降 解, 在 換 藥 時 會 有 把 新 生 肉 芽 組 織 拔 起 或 可 能 造 成 積 液 的 缺 點 為 了 改 進 以 上 人 工 敷 料 的 缺 點, 我 們 開 發 出 一 種 具 生 物 相 容 性 生 物 可 分 解 性 可 自 行 降 解 的 新 型 敷 料 :Gellan film, 他 是 一 種 由 微 生 物 分 泌 的 微 生 物 聚 醣, 具 良 好 的 生 物 相 容 性, 不 會 像 由 異 體 植 皮 或 動 物 提 煉 出 的 材 料 容 易 引 發 人 體 免 疫 反 應 或 傳 染 疾 病 問 題, 或 是 像 目 前 市 面 上 的 人 工 敷 料 會 有 積 液 的 問 題, 也 因 其 具 有 生 物 可 分 解 性, 所 以 不 會 有 因 換 藥 而 把 新 生 肉 芽 組 織 拔 起 的 問 題 且 品 質 不 會 受 到 原 物 料 優 劣 而 發 生 變 化, 其 製 造 純 化 方 式 並 不 困 難, 很 適 合 開 發 成 新 興

5 的 生 醫 材 料 而 其 性 質 和 已 開 發 成 多 種 生 醫 材 料 產 品 的 透 明 質 酸 有 一 定 的 相 似 之 處 而 Gellan 和 一 般 微 生 物 聚 醣 一 樣, 做 成 薄 膜 後 性 質 較 脆 硬, 延 展 性 不 佳, 需 加 入 交 聯 劑 來 增 加 本 身 的 機 械 強 度, 且 可 增 加 其 柔 韌 度, 更 可 延 長 材 料 使 用 在 人 體 的 壽 命 [14,15] 3. 前 言 及 文 獻 回 顧 3.1 傷 口 癒 合 機 制 [1][2] 傷 口 發 生 時, 首 先 凝 血 機 制 會 被 啟 動 來 控 制 出 血 情 況, 包 括 血 管 收 縮 血 小 板 凝 集 纖 維 蛋 白 沉 積, 促 成 血 塊 形 成, 接 下 來 進 行 一 連 串 的 傷 口 修 復 反 應, 而 其 實 傷 口 癒 合 是 一 種 動 態 並 且 有 許 多 因 素 交 互 作 用, 包 括 血 球 細 胞 細 胞 外 基 質 實 質 細 胞 調 控 因 子 一 般 傷 口 癒 合 分 為 四 個 時 期 : 一 止 血 發 炎 期 (hemostasis and inflammation phase) 受 傷 後, 由 於 血 管 內 皮 受 到 傷 害, 而 誘 發 凝 血 機 制, 所 產 生 的 纖 維 蛋 白 (fibrin) 和 血 球 細 胞, 會 在 受 傷 處 上 方 交 錯 形 成 血 塊 (fibrin clot), 一 方 面 避 免 體 液 繼 續 滲 出, 另 一 方 面 則 保 護 傷 口 不 再 曝 露 於 外 界 環 境 中 此 時, 嗜 中 性 白 血 球 (neutrophil) 和 巨 噬 細 胞 (macrophage), 會 受 到 血 塊 釋 放 的 一 些 生 長 因 子 和 感 染 物 吸 引 而 聚 集, 進 行 清 除 受 傷 組 織 細 胞 及 吞 噬 感 染 物 的 工 作, 同 時 分 泌 生 長 因 子, 誘 導 周 圍 血 管 進 行 血 管 新 生 作 用 (neovasculization) 二 纖 維 增 生 期 (fibroplasia phase) 受 傷 後 第 四 天 到 第 十 二 天, 血 球 分 泌 的 因 子, 會 吸 引 纖 維 母 細 胞 (fibroblast) 向 傷 口 處 移 動, 並 進 行 增 生 及 分 泌 細 胞 外 基 質, 形 成 暫 時 性 的 結 締 組 織, 稱 為 粒 狀 組 織 (granulation tissue), 而 表 皮 內 層 的 角 質 細 胞 (keratinocyte) 會 沿 著 傷 口 邊 緣 移 動, 進 行 所 謂 的 上 皮 新 生 (reepithelization) 三 收 縮 合 成 期 (contraction and synthetic phase) 受 傷 後 第 四 天 起, 傷 口 的 纖 維 母 細 胞, 受 到 生 長 因 子 的 影 響, 特 別 是 TGF-b1, 轉 型 為 肌 纖 維 母 細 胞 (myofibroblast), 大 量 表 現 a-actin 收 縮 傷 口, 達 到 減 少 傷 口 面 積 的 目 的, 受 傷 約 十 天 後, 膠 原 蛋 白 纖 維 並 大 量 合 成 及 沈 積 在 傷 口 處 四 傷 口 重 建 期 (remodeling phase) 受 傷 後 第 四 星 期 開 始 一 直 到 約 六 個 月, 膠 原 蛋 白 纖 維 重 新 排 列, 無 法 與 正 常 皮 膚 呈 現 相 同 排 列 狀 態 的 膠 原 蛋 白, 形 成 疤 痕 (scar) 組 織, 疤 痕 組 織 會 重 塑, 使 外 形 及 機 能 接 近 原 先 之 正 常 組 織 有 時, 有 些 傷 口 在 癒 合 的 過 程 中, 會 有 不 正 常 的 修 復 情 形, 如 疤 痕 肥 厚 (hypertrophic scar) 及 疤 痕 腫 瘤 (keloid) 的 發 生 疤 痕 肥 厚 的 情 形, 有 時 可 以 透 氣 膠 帶 覆 蓋 於 傷 口 上, 使 產 生 壓 力 而 避 免 之 不 過, 疤 痕 腫 瘤 屬 於 個 人 體 質 性 的 問 題, 有 此 體 質 的 人 一 旦 受 傷, 在 修 復 過 程 就 會 產 生 疤 痕 腫 瘤, 而 常 無 法 預 防 3.2 敷 材 分 類 目 前 用 來 解 決 深 度 皮 膚 受 傷 的 方 法 : 1. 使 用 自 體 移 植, 是 指 當 皮 膚 受 傷 而 以 其 他 部 分 的 皮 膚 組 織, 運 用 手 術 的 方 式 移 植 到 受 損 的 部 位, 這 種 方 法 有 相 當 好 的 療 效, 但 捐 出 的 位 置 仍 會 留 疤, 且 可 供 哦 值 得 組 織 有 限 2. 異 體 移 植, 將 他 人 的 皮 膚 移 植 到 受 損 的 位 置, 但 易 有 免 疫 反 應

6 3. 異 種 移 植, 取 其 他 動 物 的 皮 膚 組 織, 但 常 會 引 發 免 疫 反 應 而 移 植 失 敗, 有 時 也 會 有 疾 病 傳 染 問 題 4. 以 自 身 的 細 胞 用 體 外 培 養 方 式 做 出 表 皮 組 織, 培 養 時 間 需 2~3 週, 且 尚 無 法 以 體 外 方 式 培 養 真 皮 組 織, 此 方 法 耗 時 且 成 功 率 不 高 5. 生 物 性 材 料 部 分 : 如 膠 原 蛋 白 明 膠 矽 膠 或 是 PE 薄 膜 等 複 合 性 材 料 近 年 來 在 生 物 醫 學 領 域 對 於 具 生 物 活 性 生 物 可 降 解 性 生 物 可 吸 收 性 材 料 無 細 胞 毒 性 之 材 料 用 在 主 要 基 材 上, 故 都 選 用 膠 原 蛋 白 明 膠 幾 丁 聚 醣 海 藻 醣 等, 以 上 材 料 尤 其 是 用 以 微 生 物 製 成 的 如 微 生 物 聚 醣 或 是 交 原 蛋 白, 作 為 未 來 開 發 新 式 敷 料 的 主 要 成 分, 功 能 主 要 在 促 進 傷 口 加 速 痊 癒 無 痛 治 療 而 我 們 開 發 的 Gellan 就 是 屬 於 微 生 物 聚 醣 材 料 這 一 類, 是 有 別 於 其 他 類 別 的 方 式, 對 傷 口 癒 合 的 效 力 較 高, 受 到 其 他 不 必 要 的 感 染 或 污 染 的 機 會 降 低, 所 以 這 是 一 種 值 得 開 發 的 新 型 敷 料 3.3 生 物 性 材 料 在 傷 口 癒 合 之 特 色 生 物 性 材 料 製 成 的 敷 料 因 具 有 良 好 的 貼 合 性 及 保 水 性, 能 使 傷 口 迅 速 恢 復 防 水 蒸 氣 蒸 發 的 障 壁 和 防 止 脫 水 的 功 能, 也 能 減 少 水 蒸 氣 散 失 所 造 成 的 熱 損 失 可 管 理 傷 口 分 泌 物, 減 少 蛋 白 質 和 電 解 質 的 流 失 不 用 因 換 藥 而 把 新 興 肉 芽 組 織 拔 起, 而 可 促 進 傷 口 癒 合 速 度, 提 供 一 個 適 合 癒 合 的 封 閉 環 境, 濕 溫 偏 酸, 提 供 有 利 於 細 胞 的 移 動 與 增 生 的 基 地 減 少 疼 痛 且 與 外 界 隔 絕, 避 免 細 菌 感 染 傷 口 引 發 敗 血 症 在 癒 合 最 後 的 傷 口 收 縮 及 細 胞 外 基 質 重 整 時 能 改 進 癒 合 品 質, 防 止 造 成 纖 維 細 胞 過 度 增 生, 及 減 少 收 縮, 使 傷 口 較 為 平 整 生 物 性 材 料 中 的 微 生 物 聚 醣 材 料 更 以 取 得 容 易 來 源 穩 定 ; 較 不 會 因 原 物 料 品 質 不 穩 定 而 影 響 到 材 料 性 質 ; 造 過 程 容 易 掌 控 ; 有 良 好 的 生 物 相 容 性, 所 以 作 為 敷 料 不 會 引 發 免 疫 反 應 ; 受 到 汙 染 的 機 會 小, 而 優 於 其 他 由 各 種 生 物 體 中 所 提 煉 出 的 生 物 性 材 料 3.4 目 前 作 為 表 皮 敷 材 之 生 醫 材 料 現 況 與 市 售 產 品 之 優 缺 點 國 外 對 於 創 傷 敷 料 研 發 歷 史 較 久, 例 舉 已 商 品 化 的 人 工 皮 膚 有 以 下 幾 種 等 等 : Aligraf : Organogenesis (MA, U.S.A.) 所 生 產 的 Apligraf 為 目 前 美 國 FDA 唯 一 核 准 用 來 治 療 糖 尿 病 所 引 起 的 潰 瘍 及 靜 脈 潰 瘍 的 人 工 皮 膚 替 代 品 (Human Skin Equivalent, HSE) 二 層 的 人 工 皮 膚, 其 做 法 是 先 將 人 類 真 皮 纖 維 母 細 胞 種 植 在 typei 牛 膠 原 蛋 白 基 質 中,6 天 後, 細 胞 成 長 並 分 泌 細 胞 外 間 質, 形 成 類 似 真 皮 層 的 組 織, 再 將 來 自 人 類 新 生 兒 包 皮 的 角 質 細 胞 種 植 上 去, 讓 角 質 細 胞 附 著 在 真 皮 上, 讓 角 質 細 胞 開 始 分 裂 分 化 並 形 成 表 皮 層, 再 將 此 雙 層 人 工 皮 膚 撕 下, 繼 續 培 養 在 空 氣 及 培 養 基 的 界 面 (air-liquid interface), 誘 導 表 皮 層 更 加 成 熟, 最 後 再 包 裝 運 送 其 優 點 是 癒 合 後 表 皮 細 胞 仍 舊 由 患 者 本 身 細 胞 所 取 代, 但 病 人 不 須 再 承 受 傷 口 癒 合 撕 裂 的 痛 苦, 可 以 一 次 完 成 表 皮 和 真 皮 層 的 重 建 但 製 造 程 序 複 雜, 很 難 拿 捏 並 具 易 碎 性, 且 容 易 被 降 解, 更 由 於 含 有 異 體 細 胞, 有 病 毒 傳 入 及 產 生 免 疫 反 應 的 危 險 性 且 保 存 期 限 只 有 5 天 Intergra ( Intergra Life Science Corp.): 美 國 FDA 在 1996 年 已 核 准 Intergra 使 用 在 燒 燙 傷 治 療, 這 種 膜 對 蒸 氣 和 細 菌 具 有 暫 時 性 屏 障 作 用, 也 是 真 皮 再 生 的 保

7 護 性 材 料 Intergra 具 有 一 些 孔 洞 可 讓 纖 維 母 細 胞 淋 巴 球 及 血 小 板 生 成, 防 止 水 分 蒸 散 真 皮 層 能 與 傷 口 結 合 等 優 點 可 用 於 防 止 瘢 痕 攣 縮, 促 進 新 生 真 皮 形 成 已 在 單 個 和 多 個 中 心 試 驗 獲 得 成 功 在 燒 傷 治 療 中 發 揮 了 重 要 作 用 但 是 它 有 發 生 皮 下 積 膿 的 可 能, 且 在 移 除 敷 料 時 會 將 部 分 已 成 長 的 的 肉 芽 組 織 拔 起, 所 以 仍 具 有 改 善 的 空 間 Epicel :Genzyme Tissue Repair Corp (MA, U.S.A.) 的 產 品, 將 病 人 本 身 的 角 質 細 胞 在 實 驗 室 中 放 大 培 養, 在 移 植 後 不 具 有 免 疫 排 斥 的 問 題 其 大 部 分 用 在 大 面 積 燒 燙 傷 的 病 人, 每 50 平 方 公 分 大 小 的 人 工 表 皮 價 格 高 達 美 金 790 元, 平 均 每 一 位 病 人 使 用 到 100 張 人 工 表 皮, 價 格 十 分 昂 貴 以 上 這 些 已 上 市 的 人 工 敷 料, 不 是 臨 床 效 果 不 盡 完 美, 就 是 價 格 十 分 昂 貴, 一 般 民 眾 無 法 使 用, 都 存 在 著 極 大 的 改 善 空 間 所 以 我 們 以 微 生 物 聚 醣 作 為 開 發 重 點, 利 用 其 具 良 好 的 生 物 相 容 性 及 可 降 解 性, 再 加 上 價 格 便 宜, 製 作 出 新 型 的 人 工 敷 材 4. 微 生 物 聚 醣 介 紹 4.1 微 生 物 聚 醣 之 來 源 細 菌 包 外 聚 合 物 (extracellular polymericstance EPS) 主 要 來 源 於 細 菌 分 泌 細 菌 表 面 物 質 脫 落 細 菌 溶 解 以 及 對 周 圍 環 境 物 質 的 吸 附 抑 或 是 由 真 菌 發 酵 而 來 EPS 是 由 莢 膜 年 亦 層 及 其 他 表 面 物 質 組 成, 其 有 機 部 份 包 括 多 醣 蛋 白 質 核 酸 磷 脂 褐 藻 酸 腐 質 酸 等 主 要 是 多 醣 和 蛋 白 質 ; 其 無 機 部 份 約 佔 總 量 的 10%-20%[3] 4.2 微 生 物 聚 醣 運 用 在 生 醫 材 料 之 優 點 運 用 微 生 物 製 成 高 分 子 材 料 具 特 性 穩 定 品 質 高, 可 滿 足 醫 藥 應 用 上 的 要 求 此 種 生 產 方 法 具 污 染 性 低 產 品 價 值 高 不 會 出 現 像 是 從 動 物 提 煉 出 而 有 免 疫 反 應, 且 品 質 不 會 受 到 原 物 料 優 劣 而 發 生 變 化, 且 其 發 酵 純 化 的 步 驟 都 不 至 於 太 複 雜, 頗 適 合 現 今 環 保 意 是 高 漲 的 社 會 發 展 生 技 產 業 以 透 明 質 酸 (HA) 為 例 :HA 也 可 由 微 生 物 發 酵 來 取 得, 已 廣 泛 運 用 於 生 醫 材 料 上, 因 HA 具 有 生 物 可 吸 收 性 生 物 相 容 性 黏 稠 性 保 水 性 以 及 抗 沾 粘 性, 所 以 應 用 範 圍 很 廣, 舉 凡 心 臟 血 管 外 科 關 節 炎 外 科 手 術 房 沾 黏 劑 眼 科 整 形 外 科 及 獸 醫 等 所 以 我 們 開 發 新 的 微 生 物 聚 醣 Gellan, 是 因 其 性 質 和 HA 在 醫 學 上 的 應 用 有 相 似 之 處 4.3 Gellan gum 來 源 Gellan gum 也 是 一 種 細 菌 的 胞 外 多 醣 (EPS) 分 泌 物, 中 文 稱 作 結 冷 膠 或 結 蘭 膠, 英 文 又 稱 作 polysaccharide S-60 [5], 它 是 取 自 於 一 種 非 病 原 性 的 菌 株 -Sphingomonas elodea ATCC 所 分 泌 的 膠 體 S. elodea 是 一 種 帶 有 1 根 鞭 毛 的 需 氧 菌, 呈 現 桿 狀 在 專 用 的 培 養 基 (defined medium) 上 ( 以 葡 萄 糖 為 碳 源, 硝 酸 銨 為 氮 源 ), 會 形 成 圓 形 黃 色 並 帶 有 黏 液 狀 的 菌 落 [6] 工 業 上 利 用 發 酵 的 製 程, 來 大 量 取 得 Gellan gum Fig. 1 所 表 示 的 是 實 驗 室 規 模 的 Gellan gum 製 程, 首 先 將 S. elodea ATCC 利 用 固 態 培 養 基 進 行 培 養 及 保

8 存, 再 將 菌 株 利 用 肉 湯 來 進 行 大 量 的 增 殖 與 發 酵 接 著 加 入 isopropyl alcohol 進 行 酒 精 沉 澱 以 取 得 多 醣, 最 後 再 利 用 冷 凍 乾 燥 以 取 得 Gellan gum 的 粉 末 Fig. 1: 典 型 的 Gellan gum 發 酵 流 程 及 實 驗 室 純 化 [7] A1:S. elodea ATCC 於 固 態 培 養 基 上 的 形 態 ;A2: 經 過 72 小 時 的 肉 湯 培 養 ;A3:Gellan gum 以 isopropyl alcohol 進 行 酒 精 沉 澱 ;A4: 冷 凍 乾 燥 ;A5:Gellan gum 4.4 Gellan gum 基 本 性 質 Gellan gum 粉 末 呈 朱 黃 色 無 特 殊 味 道 分 子 量 為 5 105, 單 體 結 構 為 β-d-1,3-glucose, β-d-1,4-glucuronic acid,β-d-1,4 -glucose, 和 α-l-1,4-rhamnose 它 可 藉 著 廣 泛 且 多 樣 化 的 陽 離 子 形 成 凝 膠, 也 可 與 酸 中 的 氫 離 子 (H + ) 作 用, 這 些 陽 離 子 導 致 聚 合 物 分 子 結 合 並 行 成 凝 膠 裂 解 溫 度 約 150, 當 濃 度 大 於 0.05% 也 可 形 成 澄 清 透 明 的 凝 膠, 通 常 的 用 量 為 0.1%~0.3% Gellan gum 不 溶 解 於 非 極 性 有 機 溶 劑 也 不 溶 於 冷 水, 須 加 熱 至 85 才 可 以 溶 解 成 透 明 溶 液, 冷 卻 後 因 氫 鍵 作 用 分 子 以 螺 旋 片 段 形 成 透 明 的 凝 膠 Gellan gum 形 成 的 凝 膠 是 熱 可 逆 性 凝 膠, 一 般 凝 膠 溫 度 在 之 間, 膠 溶 溫 度 在 之 間 Gellan gum 凝 膠 一 般 在 ph 4-10 之 間 較 穩 定, 但 以 ph 4-7 條 件 下 性 能 最 好 壓 力 對 凝 膠 的 形 成 亦 有 影 響, 日 本 的 Michiko Fuchigami[8] 發 現, 在 MPa 及 -20 條 件 下, 隨 著 加 壓 凝 膠 會 產 生 凍 結, 然 而 在 MPa 壓 力 範 圍 內,Gellan gum 卻 不 會 產 生 凍 結 而 當 壓 力 釋 放 後 在 相 同 的 溫 度 條 件 下 卻 發 生 凍 結, 此 現 象 稱 之 為 變 壓 凍 結 現 象 Fig. 2(G=β-D-1,3-glucose,GA=β-D-1,4-glucuronic acid,r=α-l-1,4-rhamnose) 市 售 的 Gellan gum 大 多 經 過 去 乙 醯 化 處 理,Gellan gum 主 鏈 上 的 乙 醯 基 含 量 會 影 響 其 流 變 性 質 經 過 化 學 deacylate 處 理 的 Gellan gum 會 由 原 先 柔 軟 具 有 彈 性

9 的 熱 還 原 膠 體, 在 凝 膠 的 情 形 會 變 得 較 硬 且 脆 4.5 Gellan gum 作 為 生 醫 材 料 之 優 點 Gellan gum 作 為 新 型 生 醫 材 料 具 有 以 下 之 優 點 : 1. Gellan gum 是 通 過 美 國 FDA 及 歐 盟 認 可 的 材 料, 可 以 應 用 在 食 品 及 藥 品, 當 作 凝 膠 穩 定 劑 及 分 散 劑 來 使 用 2. Gellan gum 是 一 種 多 醣, 其 生 物 相 容 性 及 可 降 解 性 是 生 醫 材 料 必 備 的 優 點 ( 不 過 尚 未 有 相 關 paper 提 出 完 整 的 數 據 ) 3. 與 其 他 的 多 醣 做 比 較,Gellan gum 有 許 多 的 優 點, 包 括 對 熱 及 酸 較 穩 定 可 以 調 整 的 彈 性 及 堅 硬 度 高 透 光 度 等 因 此 可 依 據 應 用 上 的 需 求 進 行 材 料 型 態 上 的 變 化 4. Gellan gum 是 由 微 生 物 發 酵 而 來, 不 論 是 發 酵 流 程 或 是 純 化 步 驟 都 不 至 於 太 複 雜, 將 來 很 適 合 做 產 業 開 發, 目 前 國 內 則 尚 未 有 相 關 業 界 進 行 研 究 5. Gellan gum 是 已 經 商 品 化 的 材 料 ( 食 品 添 加 劑 ), 因 此 取 得 上 也 較 容 易 市 售 的 Gellan gum 商 品 有 各 種 乙 醯 基 含 量 產 品, 如 Phytagel Gelrite Kelcogel F 及 Kelcogel LT100 等 [9] 因 此 在 研 究 進 行 時, 可 依 照 需 求 的 不 同 進 行 採 購 6. Gellan 製 成 薄 膜 後 透 明 度 佳, 作 為 敷 材 可 直 接 觀 察 到 傷 口 狀 況, 隨 時 監 控 傷 口 癒 合 的 情 形 5. 實 驗 方 法 5.1 研 究 方 法 因 Gellan film 的 性 質 較 為 硬 脆, 所 以 以 交 聯 的 方 式 增 加 Gellan 薄 膜 的 柔 軟 度 及 延 展 性, 增 加 其 機 械 性 質 目 前 交 聯 劑 交 聯 的 方 式 可 分 為 2 種, 一 種 是 直 接 與 材 料 上 的 自 由 胺 基 形 成 穩 固 的 交 聯 (crosslinklng) 鍵 結, 如 Glutaraldehude genipin 等 等, 另 一 種 則 是 交 聯 劑 先 活 化 材 料 上 的 酸 基, 再 與 另 一 自 由 胺 基 形 成 鍵 結, 如 carbodiimide [16,17] 5.2 Gellan film 製 備 去 酯 化 Gellan0.6g 溶 入 60c.c D.D water, 加 熱 90 至 完 全 溶 解, 呈 透 明 為 膠 狀 液 體, 調 ph 值 至 ph6.4, 離 心 3000rpm,10min, 將 其 雜 質 離 掉, 倒 入 直 徑 15cm 玻 璃 培 養 皿 中, 烘 乾, 脫 膜,Gellan film 即 製 作 完 成 5.3 Gellan-Glutaraldehyde Glutaraldehyde 之 作 用 機 制 [16] 目 前 Glutaraldehyde 是 比 較 常 見 之 交 聯 劑, 是 因 Glutaraldehyde 直 接 與 Gellan 上 的 OH 基 和 COOH 基 結 合 上, 形 成 穩 定 的 連 結 而 在 Glutaraldehyde 常 用 在 與 膠 原 蛋 白 等 交 聯, 其 機 制 則 是 透 過 其 鍵 上 的 醛 基 (CHO) 與 膠 原 蛋 白 上 的 氨 基 形 成 共 價 鍵, 構 成 分 子 間 交 聯, 從 而 保 持 分 子 的 穩 定 性 但 在 近 年 的 文 獻 指 出, 以 Glutaraldehyde 作 為 交 聯 劑 雖 交 聯 效 果 強 且 穩 定, 常 用 來 做 交 聯 是 否 成 功 之 比 較 組, 但 相 對 的 毒 性 也 十 分 高, 所 以 經 多 方 考 量 後, 我 們 選 用 EDC 來 做 為 理 想 交 聯 劑 5.4 Gellan-EDC 之 作 用 機 制 [16]

10 交 聯 劑 carbodiimide,[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyll)-carbodiimide](edc) 是 個 催 化 劑, 他 催 化 Gellan 上 的 OH 基 團 和 COOH 基 團 進 行 結 合 形 成 脂 鍵 EDC 常 被 使 用 於 peptide synthesis protein 的 結 合 與 其 複 合 物 的 生 成 及 修 飾 膠 原 蛋 白, 其 機 制 是 先 活 化 材 料 上 的 酸 基, 再 與 另 一 自 由 胺 基 形 成 胜 肽 鍵 文 獻 中 指 出 EDC 交 聯 在 濃 度 高 時 (>50Mn) 下 會 具 有 細 胞 毒 性, 而 在 15Mn 以 下 之 細 胞 毒 性 較 低 所 以 我 們 以 15Mn 為 基 準, 再 以 霍 氏 紅 外 線 光 譜 儀 鑑 定 分 析 是 否 有 成 功 交 聯 交 聯 方 式 : 將 交 聯 劑 (EDC) 以 20%~100% 酒 精 為 溶 劑 泡 成 濃 度 15mM 的 交 聯 試 劑, 將 製 好 的 Gellan film 泡 入, 交 聯 反 應 24 小 時, 再 用 酒 精 脫 去 殘 餘 交 聯 劑, 交 聯 即 完 成 Fig.3 以 EDC 交 聯 Gellan gum 之 反 應 機 制 5.5 Gellan-EDC 之 紅 外 線 光 譜 儀 之 測 試 IR 是 用 來 鑑 定 有 機 化 合 物 得 一 種 工 具, 是 研 究 化 學 分 子 或 化 學 物 種 因 為 吸 收 或 發 射 紅 外 線 輻 射, 而 在 某 些 震 動 的 模 式 下 產 生 波 動, 藉 助 於 紅 外 線 光 譜 的 分 析 使 化 合 物 的 結 構 及 含 量 可 以 測 定 依 震 動 又 可 分 為 : 特 徵 頻 率 區 (4000~1300cm ¹) 其 可 顯 現 分 子 的 一 些 官 能 基 的 吸 收 頻 率 指 紋 區 (1300cm ¹ 以 下 ) 可 顯 現 分 子 結 構 的 細 微 差 異 由 此 可 以 比 對 Gella-EDC 和 Gellan-Glutaraldehyde 在 分 子 結 構 及 官 能 基 的 差 異 5.6 Gellan-EDC 之 拉 伸 測 試 由 於 Gellan film 是 要 作 為 表 皮 貼 附 之 用, 所 以 需 要 有 一 定 的 彈 性 及 柔 軟 度, 且 想 要 知 道 交 聯 過 後 其 機 械 強 度 是 否 有 增 強, 所 以 要 測 試 其 可 拉 伸 的 程 度 Flory 所 提 出 的 橡 膠 彈 性 理 論 是 描 述 水 膠 剪 力 和 應 力 之 間 的 關 係 彈 性 模 數 (G) 可 利 用 壓 縮 或 拉 長 的 方 式 測 量 其 剪 應 力 變 化 而 計 算 根 據 向 交 談 性 理 論, 高 分 子 網 路 在 施 家 外 力 拉 伸 下, 其 剪 力 和 應 力 具 一 平 衡 關 係 在 一 範 圍 內 的 形 變, 假 設 形 變 時 改 變 體 積 為 一 定, 則 剪 應 力 的 相 對 關 係 如 下 : F/A=-G(λ-λ²) F: 施 以 形 變 的 力 A: 受 力 面 積

11 G: 彈 性 模 數 λ:l/lo(l 和 Lo 分 別 為 水 膠 受 力 形 變 後 及 原 本 長 度 ) 5.7 Gellan-EDC 之 Gel-content content Water Water-content 驗 : 要 了 解 Gellan film 的 含 水 量 及 含 膠 量, 及 測 試 是 否 交 聯 成 功, 所 以 需 做 此 實 膜 含 水 量 測 試 (water content): 將 Gellan 及 Gellan-EDC 薄 膜 裁 成 1cmX2cm 大 小, n>5, 置 入 烘 箱 內 乾 燥, 待 膜 重 量 不 再 改 變 秤 得 乾 重 Wd 將 膜 浸 在 PBS 中, 於 室 溫 24hr 後 取 出, 將 膜 以 濾 紙 吸 乾 膜 表 面 水 分 後 再 秤 重, 秤 得 濕 重 Ww 膜 含 膠 量 測 試 含 水 量 (water content)=ww-wd/wwx100% 將 膜 裁 成 2X2 大 小, 置 入 烘 箱 內 乾 燥, 待 膜 重 量 不 再 改 變 秤 得 重 量 為 Wa 在 浸 泡 生 理 食 鹽 水 24hr, 取 出 秤 重 Wb 含 膠 量 (gel content)wa/wbx100% 5.8 Gellan-EDC 之 Nitric oxide(no NO) 抗 發 炎 測 試 NO 生 成 主 要 是 經 由 活 化 一 氧 化 氮 合 成 酵 素 (NOS) 而 將 細 胞 內 之 L-arginine 轉 變 成 為 L-citrulin 及 NO 自 由 基 的 釋 放 細 胞 內 NOS 主 要 分 為 兩 大 類 ; 一 為 結 構 性 NOS(constitutive NOS; cnos), 另 一 種 為 誘 導 型 NOS (inducible NOS; inos) cnos 產 生 固 定 量 之 NO 為 維 持 體 內 正 常 運 作 之 重 要 訊 息 傳 遞 因 子,NO 會 藉 由 促 使 GDP 轉 變 為 cgmp 進 而 誘 發 一 連 串 之 生 理 反 應, 包 括 血 管 擴 張 子 宮 平 滑 肌 鬆 弛 及 抑 制 血 小 板 凝 集 等 作 用 相 反 的,iNOS 所 誘 導 出 之 大 量 NO 自 由 基 則 會 造 成 細 胞 的 傷 害 與 血 管 過 度 的 舒 張 最 後 造 成 嚴 重 的 發 炎 反 應 以 及 併 發 症, 如 敗 血 性 休 克 中 風 DNA 受 損 突 變 所 造 成 細 胞 的 癌 化 等 這 次 實 驗 是 利 用 細 菌 之 細 胞 壁 成 份 中 Lipopolysaccharde (LPS) 進 行 誘 導 方 法 是 將 gellan 膜 Gellan-EDC 交 聯 後 的 膜 浸 泡 在 H-DMEM(high glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium) 未 添 加 phenol red 中, 每 天 取 出 1ml 平 均 加 到 4 個 已 添 加 J774(ATCC 60140;murine macrophage cell line)96 孔 盤 中 反 應 使 細 胞 產 生 NO2 -, 將 - 反 應 後 H-DMEM 先 與 1% sulfanilamide 作 用 將 H-DMEM 中 的 NO2 偶 氮 化, 接 著 和 0.1%α-naphthylenediamine dihydrocloride 偶 合 形 成 水 溶 性 粉 紅 色 之 染 料 (dye) 化 合 物, 於 550 nm 波 長 量 測 其 波 峰 吸 收 值 5.9 Gellan-EDC 之 動 物 表 皮 貼 附 測 試 以 動 物 實 驗 證 明 Gellan 膜 的 生 物 相 容 性 生 物 可 分 解 性 是 否 真 正 能 作 為 敷 傷 材 料 及 傷 口 癒 合 的 實 際 情 形 從 樂 斯 科 公 司 購 入 300g 的 rat( 品 種 :SD) 將 製 好 的 Gellan-EDC 及 control 組 Gellan 膜 裁 成 2X2cm, 置 於 75% 酒 精 中 24 小 時 滅 菌, 後 移 植 入 老 鼠 表 面 共 15 隻, 在 5,15,24 天 觀 察 老 鼠 傷 口 發 炎 情 況 及 傷 口 癒 合 情 況 的 改 變, 並 畫 下 傷 口 癒 合 情 況 以 利 於 比 較 各 個 時 間 點 的 差 異 6. 實 驗 結 果 去 酯 化 Gellan0.6g 溶 入 60c.c D.D water, 加 熱 90 至 完 全 溶 解, 呈 透 明 膠 狀 液 體, 調 ph 值 至 ph6.4, 離 心 3000rpm,10min, 將 其 雜 質 離 掉, 倒 入 直 徑 15cm

12 玻 璃 培 養 皿 中, 烘 乾, 脫 膜,Gellan film 即 製 作 完 成 如 Fig 4., 為 直 徑 15cm 透 明 度 佳, 完 整 的 Gellan film Fig. 4 Gellan film, 直 徑 15cm. 比 較 Gellan gum 和 Gellan-EDC 交 聯 這 2 組 的 霍 氏 紅 外 線 光 譜 儀 之 圖 形 後 可 發 現, 這 2 組 的 圖 形 類 似, 但 Gellan-EDC 的 圖 形 在 吸 收 頻 率 1720 時 有 些 微 變 化, 出 現 一 個 小 波 峰, 經 對 照 分 子 結 構 式 後 得 知, 此 波 峰 是 交 聯 成 功 後 所 顯 出 的 差 異 是 為 分 子 上 C-O 官 能 基 結 構 的 變 化 以 往 都 把 Glutaraldehyde 當 作 交 聯 劑, 原 因 是 他 交 聯 力 非 常 強, 形 成 的 交 聯 程 度 高, 但 許 多 文 獻 [17][18] 指 出 Glutaraldehyde 的 細 胞 毒 性 太 強, 不 適 合 用 於 植 入 體 內, 所 以 我 們 只 把 它 當 作 一 種 交 聯 成 功 與 否 的 指 標, 不 做 進 一 步 的 生 物 測 試 霍 氏 紅 外 線 光 譜 儀 :Gellan gum 薄 膜 (A) 和 Gellan-EDC 薄 膜 (B) 以 拉 伸 試 驗 測 試 相 同 莫 耳 濃 度, 以 20%~100% 的 酒 精 為 EDC 交 聯 溶 液 下 之

13 Gellan 膜 的 機 械 強 度, 一 般 而 言, 交 聯 程 度 越 高 者, 其 機 械 強 度 越 強, 還 有 膜 的 厚 薄 度 也 是 影 響 機 械 強 度 的 原 因, 膜 越 厚, 機 械 強 度 越 強 我 們 以 不 同 酒 精 濃 度 作 為 交 聯 劑 溶 液 所 製 出 一 系 列 之 Gellan-EDC 薄 膜 作 拉 伸 測 試 的 結 果 顯 出, 在 40%~60% 時 薄 膜 能 承 受 之 機 械 強 度 最 強, 整 個 趨 勢 成 一 波 峰 狀, 由 20% 最 弱, 至 40%~60% 時 為 機 械 強 度 最 強, 至 90%~100% 時 強 度 又 降 下 來 由 圖 形 可 清 楚 發 現, 在 40%~60% 酒 精 為 交 聯 劑 溶 液 條 件 時 機 械 強 度 達 最 高, 膜 的 強 韌 度 最 佳 GA-EDC ultimate strength % 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% alchohol cont. alchohol cont. VS ultimate strength 拉 伸 測 試,0% 為 無 EDC 交 聯 在 Gellan 膜 的 體 外 測 試 中,water content 測 試 有 實 行 上 的 困 難,water content 的 目 的 在 測 試 膜 的 含 水 量, 以 理 論 推 之, 交 聯 程 度 越 高 者, 越 不 容 易 被 水 解 其 含 水 量 應 會 越 低, 對 照 其 他 體 外 測 試 之 結 果,Gellan 在 water conten 中 在 EDC 交 聯 劑 以 40%~60% 酒 精 當 溶 液 下 所 配 成 的 交 聯 試 劑 含 水 量 會 達 最 低, 但 因 為 Gellan 的 重 量 太 輕, 在 濕 膜 秤 重 時 的 誤 差 太 大 ; 再 加 上 交 聯 不 完 全 的 模 以 水 浸 潤 時 容 易 碎 裂, 更 增 加 秤 重 的 難 度 以 上 幾 點 對 water content 的 準 確 度 及 可 信 度 造 成 極 大 的 威 脅, 由 此 我 們 決 定 water content 的 值 不 可 信 賴, 只 有 Gel content 可 採 用 Gel content 是 以 測 試 膜 的 含 膠 量, 以 含 膠 量 程 度 來 判 定 於 相 同 莫 耳 濃 度 之 EDC 作 為 Gellan 交 聯 劑 之 交 聯 程 度, 含 膠 量 越 高, 代 表 膠 體 於 水 中 水 解 程 度 越 低, 交 聯 越 顯 成 功, 我 們 已 各 以 20% ~ 100% 的 酒 精 為 EDC 之 溶 液 作 交 聯 劑, 來 測 試 交 聯 效 果 在 Gellan 膜 的 部 分, 因 沒 經 過 交 聯, 所 以 浸 泡 水 之 後 出 現 斷 裂 及 破 碎 的 現 象 ; 而 以 不 同 酒 精 濃 度 做 EDC 交 聯 之 Gellan 膜 中, 我 們 發 現 含 膠 量 程 度 是 成 一 個 波 峰, 由 20% 酒 精 作 為 交 聯 溶 液 時 為 含 膠 量 低 點, 往 上 升, 在 40% ~60% 達 含 膠 量 最 高, 再 降 下 來, 至 90%~100% 為 低 點, 代 表 其 交 聯 程 度 於 40%~60% 時 最 佳

14 gel content % Gc G20% G30% G40% G50% G60% G70% G80% G90% G100% alchohol conc. Gel content. NO 毒 性 測 試 中, 以 細 胞 產 生 NO 而 引 起 發 炎 反 應, 測 試 gellan 本 身 和 EDC 交 聯 後 的 Gellan 膜 析 出 液 是 否 能 有 效 抑 制 LPS 所 誘 導 NO 的 產 生 結 果 表 示 出 gellan 本 身 在 這 3 天 的 吸 光 值 增 加 的 程 度 推 論 有 逐 漸 增 加 的 趨 勢, 但 是 對 細 胞 而 言 無 立 即 性 發 炎 反 應 文 獻 中 [19] 記 載 之 EDC 交 聯 濃 度 大 於 50mM 出 現 明 顯 之 細 胞 毒 性, 但 是 在 5~10mM 之 間 是 可 接 受 之 交 聯 範 圍 以 15mM EDC 交 聯 過 後 之 Gellan-EDC 膜 雖 出 現 NO stress, 於 圖 型 中 相 較 於 沒 交 聯 的 Gellan 膜, 有 明 顯 的 差 異, 但 因 交 聯 濃 度 為 15mM, 尚 在 可 容 許 範 圍 內, 加 上 參 照 動 物 實 驗 大 鼠 表 皮 貼 附 測 試 之 結 果, 發 現 在 5 天 15 天 及 24 天 的 測 試 中, 只 有 在 5 天 時 有 明 顯 之 發 炎 反 應, 但 比 照 對 照 組 來 看 是 無 差 異 的, 視 為 正 常 發 炎 現 象, 在 15 天 及 24 天 的 測 試 中, 發 現 Gellan-EDC 有 良 好 的 生 物 相 容 性, 並 無 嚴 重 發 炎 現 象, 所 以 可 以 證 明 15mM EDC 交 聯 過 後 的 膜 雖 在 NO 毒 性 測 試 中 出 現 NO stress, 但 對 生 物 相 容 性 來 說 是 沒 有 影 響 的

15 0.05 NO test OD days gellan gellan-edc NO toxic test 綜 觀 物 理 性 體 外 測 試, 發 現 結 果 成 一 致 性 指 出 以 40%~60% 酒 精 作 為 EDC 交 聯 劑 容 易 之 交 聯 劑 做 出 的 Gellan-EDC 膜 期 交 聯 程 度 最 佳 Gellan 以 EDC 改 質 後, 不 再 有 Gellan 膜 脆 性 高 容 易 碎 裂 之 缺 點,Gellan-EDC 強 韌 度 提 升, 是 作 為 敷 傷 材 料 之 一 大 優 點 動 物 表 皮 貼 附 實 驗 分 別 做 天 之 測 試, 分 別 有 :HA( 透 明 質 酸 ) 作 為 Control 組 Gellan Gellan-EDC 三 組, 可 看 出 各 組 在 第 5 天 時 都 有 出 現 微 量 之 發 炎 反 應, 可 看 見 發 炎 細 胞 及 白 血 球 ; 第 15 天 時 各 組 之 發 炎 程 度 減 緩, 傷 口 微 血 管 生 成, 恢 復 狀 況 良 好,Gellan-EDC 膜 也 無 出 現 細 胞 毒 性 之 排 斥 問 題 ; 至 第 24 天, 傷 口 恢 復 完 整, 表 皮 真 皮 層 界 線 分 明, 無 發 炎 皮 層 空 洞 化 現 象, 代 表 恢 復 程 度 十 分 良 好, 並 無 排 斥 及 生 物 相 容 性 之 問 題

16 大 鼠 表 皮 貼 附 實 驗 Control(HA film) Gellan Gellam-EDC 5 Days 15 Days 24 Days 2x2 cm 2 表 皮 傷 口 貼 附 試 驗 對 照 組 5 天 (A),15 天 (B) 及 24 天 (C) GG-EDC 膜 5 天 (D),15 天 (E) 和 24 天 (F).

17 7. 結 論 以 微 生 物 聚 醣 Gellan 作 為 生 醫 材 料 是 為 一 新 型 材 料 之 開 發, 目 前 討 稐 的 文 獻 並 不 多, 我 們 已 IR 圖 形 來 確 定 交 聯 劑 是 否 有 交 聯 成 功 後, 做 了 一 系 列 體 外 測 定, 是 為 了 找 出 最 適 當 的 交 聯 程 度 : 以 拉 伸 Gel content 可 看 出, 在 以 40%~60% 酒 精 為 EDC 交 聯 劑 之 溶 液 是 最 佳 交 聯 劑 條 件, 製 出 的 Gellan-EDC 膜 強 度 最 強, 含 膠 量 也 最 高, 再 以 NO 毒 性 試 驗 去 測 試 其 產 生 之 細 胞 毒 性, 結 果 EDC 於 15mM 交 聯 濃 度 下 製 出 的 膜 雖 有 產 生 NO stress, 但 其 毒 性 仍 在 可 接 受 範 圍 內 於 動 物 實 驗 之 表 皮 貼 附 測 試 中 可 看 出,Gellan 及 Gellan-EDC 之 膜 作 表 皮 貼 附, 於 24 天 後 之 恢 復 情 況 良 好, 無 生 物 相 容 性 及 發 炎 狀 況 之 問 題 這 一 系 列 的 實 驗 是 為 了 確 定 Gellan 以 EDC 交 聯 後 所 製 成 的 膜 是 否 可 以 作 為 敷 傷 材 料 的 基 礎 研 究, 結 果 顯 出,Gellan 作 為 敷 傷 材 料 之 基 材 是 可 行 的, 但 可 以 再 做 進 一 步 的 改 質, 可 以 添 加 其 他 如 抗 發 炎 等 等 的 物 質 在 Gellan 中, 看 是 否 能 再 降 低 EDC 交 聯 所 產 生 的 細 胞 毒 性 8. 參 考 文 獻 [1] Singer, Adam J. Clark, Richard A.F Massachusetts Medical Society Volume.1999; 341(10)2:p [2] Richard A.F Clark, MD Basic of Cutaneous wound repair J Dermatol Surg Oncol.1993; 10: [3] Zhan X Q. Biofilm extracellular polymeric substances: methodology development, spatial distribution and property investigation. r. Int., B. 2000; 61 (1):461. [4]Wilén B M, Jin B, Lant P. The influence of key chemical constituents in activated sludge on surface and flocculating properties [J ].Wat Res. 2003; 37: [5]Kenneth S. Kang, George T. Colegrove, George T. Veeder. Deacetylated polysaccharide S-60. US patent [6]Kenneth S. Kang, George T. Veeder. Polysaccharide S-60 and bacterial fermentation process for its preparation. US patent [7]Fialho,A.M.,et al., Occurrence,production, and applications of gellan:current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2008; 79(6): [8]Michiko Fuchigami. Ai Teramoto. Texture and structure of high-pressure-forzen gellan gum gel. Food Hydrocolloids. 2003;65(2): [9]Fialho, A. M.,et al., Occurrence, production, and applications of gellan :current state and perspectives. Appl Microbiol Biotechnol. 2008;79(6): [10]Lam, P.K. and E.S. Chan, Integra and cultured epithelium. J Bum Care Rehabil.2001;22(2):p [11]Pandya, A.N., B. Woodward, and N. Parkhouse. The use of cultured autologous keratinocytes with integra in the resurfacing of acute burns. Plast Reconstr Surg, 1998;102(3): [12]Trent, J.F. and R.S. Kirsner, Tissue engineered Skin: Apligraf, a bi-layered living

18 akin equivalent. Int J Pract. 1998;52(6):p [13]Eaglstein, W.H. and V.Falanga, Tissue engineered and the development of Apligraf, a human skin equivalent.cutis.1998;62(1 Suppl):p.1-8. [14]Murayama, Y., Satoh, S., Oka, T. Imanishi. J., and Noishiki, Y., Reduction of the antigenicity and immunogenicity of xenografts by a new cross-linking regent, Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organ.1988; 34: [15]Nimni, M. E., Cheung, D., Strates, B.,Odama, M. K., Sheikh, K., Bioprosthesis derived from cross-linked and chemically midified collagenous tissue, Nimni, M.E.ed. collagen, Biotechnology. Florida, CRC Press, Inc ; 3:1-37. [16] 馬 純 媛, 以 Genipin 或 Carbodiimide 交 聯 生 物 組 織 材 料 的 交 聯 結 構 與 交 聯 性 質 探 討, 國 立 中 央 大 學 化 學 工 程 研 究 所 碩 士 論 文 [17] Speer DP, Chvapil M, Eskelson CD, Ulreich J. Biological effects of residual glutaraldehyde in glutaraldehyde-tanned collagen biomaterials. J Biomed Mater Res. 1980;14(6): [18] Cooke A, Oliver RF, Edward M. An in vitro cytotoxicity study of aldehyde-treated pig dermal collagen. Br J Exp Pathol.1983;64(2): [19] Heather M. Powella, Steven T. Boyce. EDC cross-linking improves skin substitute strength and stability. Biomaterials, 2006;27: