2012 年 第 5 期 王 晓 爱 等,4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 的 影 响 89 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 方 法 亲 本 来 源 实 验 用 雄 鱼 于 2008 年 5 月 采 集 自 云 南 李 仙 江 流 域
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1 第 33 卷 第 5 期 2012 年 9 月 水 生 态 学 杂 志 JournalofHydroecology Vol.33,No.5 Sep 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 的 影 响 王 晓 爱 1,2, 杨 君 兴 1, 陈 小 勇 1, 潘 晓 赋 1 1, 李 再 云 (1. 中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所 遗 传 资 源 与 进 化 国 家 重 点 实 验 室, 云 南 昆 明 ; 2. 中 国 科 学 院 研 究 生 院, 北 京 ) 摘 要 :4 冷 冻 保 存 条 件 下, 以 冷 冻 精 子 活 力 寿 命 和 细 胞 膜 完 整 率 为 指 标, 检 测 二 甲 亚 砜 (DMSO) 甘 油 (Glycer ol) 乙 二 醇 (EG) 和 甲 醇 (MeOH)4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 (Semilabeoobscurus) 鲜 精 以 及 对 精 子 冷 冻 保 存 效 果 的 影 响 结 果 显 示,4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 鲜 精 活 力 呈 负 作 用,MeOH<EG<DMSO<Glycerol; 抗 冻 剂 对 鲜 精 寿 命 呈 负 作 用,MeOH<EG<DMSO 和 Glycerol; 抗 冻 剂 对 鲜 精 细 胞 膜 完 整 率 呈 负 作 用,MeOH<EG<DMSO<Glycerol 在 鲜 精 活 力 为 (36.17±4.06)%, 寿 命 为 (47.5±3.1)s, 细 胞 膜 完 整 率 为 (86.22±5.29)% 时, 经 过 短 期 冷 冻 保 存,5% MeOH 和 5% EG 解 冻 后 暗 色 唇 鱼 精 子 活 力 最 高, 分 别 为 (18.33±1.70)% 和 (17.83±2.67)%, 与 鲜 精 活 力 差 异 显 著 (P<0.05);5% MeOH 和 5% EG 解 冻 后 精 子 寿 命 最 长, 分 别 为 (44.3±3.6)s 和 (42.8±5.5)s,5% MeOH 解 冻 后 精 子 寿 命 与 鲜 精 寿 命 差 异 不 显 著 (P>0.05);5% MeOH 解 冻 后 精 子 细 胞 膜 完 整 率 最 高, 为 (85.67 ±1.11)%, 与 鲜 精 细 胞 膜 完 整 率 无 显 著 差 异 (P>0.05) 研 究 表 明,DMSO 和 Glycerol 并 不 适 合 作 为 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 的 抗 冻 剂,MeOH 和 EG 具 有 相 似 的 保 护 作 用, 是 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 潜 在 的 渗 透 性 抗 冻 剂 关 键 词 : 渗 透 性 抗 冻 剂 ; 暗 色 唇 鱼 ; 精 子 冷 冻 中 图 分 类 号 :Q952 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2012) 自 从 1949 年 首 次 用 甘 油 作 为 抗 冻 剂 冷 冻 成 功 保 存 精 子 以 来 (Polgeetal,1949), 精 子 低 温 冷 冻 保 存 的 研 究 取 得 了 很 大 进 展, 并 逐 渐 发 展 成 为 物 种 迁 地 保 护 和 遗 传 种 质 资 源 保 存 的 一 个 重 要 手 段 抗 冻 剂 是 影 响 精 子 冷 冻 保 存 的 重 要 因 素 ( 陈 松 林,2007; 王 晓 爱 等,2012) 渗 透 性 抗 冻 剂 多 是 小 分 子 物 质, 渗 透 速 度 快, 能 轻 易 地 渗 透 到 细 胞 内 使 其 脱 水, 在 溶 液 中 易 结 合 水 分 子, 发 生 水 合 作 用, 使 溶 液 的 黏 性 增 加, 从 而 弱 化 了 水 的 结 晶 过 程, 以 此 达 到 抗 冻 剂 保 护 的 目 的 (Muchlisin,2005; 陈 松 林,2007) 二 甲 亚 砜 (Dimethylsulfoxide,DMSO) 甘 油 (Glycerol) 乙 二 醇 (Ethyleneglycol,EG) 和 甲 醇 (MeOH) 是 4 种 常 见 的 渗 透 性 抗 冻 剂, 已 在 家 畜 野 生 动 物 和 人 类 精 子 冷 冻 中 发 挥 作 用 ( 司 维 等,2004), 亦 被 广 泛 应 用 在 鱼 类 精 子 冷 冻 保 存 中 (Cabritaetal,2010); 其 中,DM SO 应 用 最 为 广 泛,Glycerol 主 要 用 于 海 水 鱼 类 精 子 冷 冻 保 存 (Zhangetal,2003),EG 和 MeOH 在 少 数 鱼 类 冷 冻 保 存 中 也 取 得 了 较 好 的 冻 存 效 果 (Harvey 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 云 南 大 唐 国 际 李 仙 江 流 域 水 电 开 发 有 限 公 司 委 托 项 目 通 讯 作 者 : 杨 君 兴 E mail:yangjx@ mail.kiz.ac.cn; 陈 小 勇 E mail:chenxy@mail.kiz.ac.cn 作 者 简 介 : 王 晓 爱,1986 年 生, 女, 博 士 研 究 生, 主 要 从 事 鱼 类 细 胞 培 养 精 子 冷 冻 保 存 研 究 E mail:xueaiw@126.com etal,1982;horvathetal,2008) 在 鱼 类 遗 传 管 理 中, 精 子 低 温 和 超 低 温 冷 冻 保 存 能 有 效 地 延 长 个 体 的 繁 殖 寿 命, 并 在 塘 养 种 群 的 世 代 数 最 小 化 方 面 显 示 出 很 广 泛 的 应 用 潜 力, 但 该 技 术 仅 在 少 数 动 物 中 使 用 (Frankhametal,2002) 暗 色 唇 鱼 (SemilabeoobscurusLin) 隶 属 于 鲤 科 (Cyprinidae) 野 鲮 亚 科 (Labeoninae) 唇 鱼 属 (Sem ilabeo) 随 着 鱼 类 资 源 的 利 用 强 度 加 大 和 捕 捞 技 术 的 更 新, 鱼 类 生 物 多 样 性 呈 下 降 趋 势, 暗 色 唇 鱼 已 成 为 李 仙 江 流 域 珍 稀 濒 危 物 种 ( 杨 剑 等,2010; 杨 永 宏 等,2011);1989 年 被 列 入 云 南 省 I 级 保 护 动 物, 1998 年 被 列 入 中 国 濒 危 动 物 红 皮 书 ( 乐 佩 琦 和 陈 宜 瑜,1998) 开 展 暗 色 唇 鱼 的 精 子 冷 冻 保 存 研 究, 建 立 精 子 库 长 期 保 存 精 子, 是 种 质 资 源 保 护 的 有 效 途 径 之 一, 也 能 为 遗 传 育 种 提 供 优 良 的 种 质 材 料 迄 今 为 止, 关 于 暗 色 唇 鱼 精 子 的 冷 冻 保 存 尚 未 见 研 究 报 道 本 研 究 以 D 15 溶 液 为 稀 释 液, 二 甲 亚 砜 甘 油 乙 二 醇 和 甲 醇 为 抗 冻 剂, 精 子 活 力 寿 命 和 细 胞 膜 完 整 率 为 指 标, 进 行 暗 色 唇 鱼 精 子 短 期 冷 冻 保 存 实 验, 探 讨 抗 冻 剂 种 类 及 浓 度 对 精 子 冷 冻 效 果 的 影 响, 旨 在 初 步 了 解 其 精 子 的 生 物 学 特 性, 同 时 为 暗 色 唇 鱼 的 超 低 温 冷 冻 保 存 研 究 中 寻 找 合 适 的 抗 冻 剂 和 稀 释 液 提 供 参 考, 确 定 超 低 温 冷 冻 保 存 的 最 适 条 件, 监 测 异 地 保 育 精 子 品 质 的 变 化, 最 终 达 到 保 存 暗 色 唇 鱼 种 质 资 源 之 目 的
2 2012 年 第 5 期 王 晓 爱 等,4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 的 影 响 89 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 与 方 法 亲 本 来 源 实 验 用 雄 鱼 于 2008 年 5 月 采 集 自 云 南 李 仙 江 流 域, 饲 养 在 中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所 珍 稀 特 有 鱼 类 保 育 研 究 基 地 养 殖 池 塘 面 积 100m 2, 水 深 1.2m, 养 殖 密 度 <3kg/m 3, 雌 雄 比 水 温 16~25,10 月 到 第 二 年 3 月 光 周 期 ( 光 照 黑 暗 ) 为 10 14,4-9 月 为 饲 养 方 案 暗 色 唇 鱼 为 杂 食 性 鱼 类, 使 用 通 威 股 份 有 限 公 司 昆 明 分 公 司 生 产 的 111 鲤 鱼 种 饲 料, 颗 粒 直 径 2.0mm 1d 投 喂 2 次, 上 午 和 下 午 各 1 次 日 粮 为 亲 鱼 体 重 的 3% 左 右, 每 次 的 投 喂 量 以 15~30min 吃 完 为 度 精 液 收 集 随 机 选 取 20 尾 性 腺 成 熟 的 雄 鱼 [ 体 长 (161.9±20.7)mm, 体 重 (97.78±41.9)g] 用 于 精 液 收 集, 用 100mg/L 的 MS 222(Tricaine, C 10 H 15 NO 3 S) 麻 醉 5min, 用 毛 巾 擦 干 鱼 类, 然 后 轻 轻 挤 压 腹 部, 使 精 液 自 然 流 出 到 1.5mL 离 心 管 中 冷 冻 保 存 所 选 取 的 20 尾 雄 鱼 精 子 密 度 为 (31.96±9.43) 10 9 个 /ml, 鲜 精 平 均 活 力 为 (36 17±4.06)%, 精 子 膜 完 整 性 为 (86.22± 5 29)%, 精 子 寿 命 为 (47.5±3.1)s; 经 检 验, 个 体 间 鲜 精 活 力 差 异 不 显 著 不 同 个 体 的 精 液, 分 别 用 含 抗 冻 保 护 剂 的 稀 释 液 D 15(0.8% NaCl 0.05% KCl 1.5% Glucose) 稀 释 ( 陈 松 林 等,1992), 使 精 子 终 密 度 为 个 /ml(rana,1995), 装 入 1.8mL 冻 存 管 中,4 保 存 ;24h 后, 取 出 样 品,37 水 浴 解 冻 30s 1.2 实 验 方 法 不 同 抗 冻 剂 对 鲜 精 活 力 的 影 响 用 含 5% DMSO 5% Glycerol 5% EG 和 5% MeOH 的 D 15 以 及 不 含 抗 冻 剂 的 D 15, 分 别 将 鲜 精 稀 释 100 倍 后 常 温 放 置, 每 隔 60min 在 显 微 镜 下 观 察 各 样 品 精 子 活 力 寿 命 和 膜 完 整 率 不 同 抗 冻 剂 及 浓 度 对 精 子 冷 冻 的 影 响 选 取 抗 冻 剂 DMSO Glycerol EG 和 MeOH, 浓 度 梯 度 分 别 为 5% 和 10% 冻 存 体 积 为 100μL,4 保 存 24h 后,37 水 浴 解 冻 30s, 检 测 冻 精 活 力 寿 命 和 膜 完 整 率 1.3 数 据 处 理 精 子 密 度 (sperm density): 用 稀 释 液 将 精 液 稀 释 200 倍, 在 光 学 显 微 镜 下 放 大 400 倍, 用 血 球 计 数 板 计 数 精 子 数 量, 再 计 算 其 密 度 (Rakitinetal, 1999) 精 子 活 力 (spermmotility): 用 淡 水 激 活 精 子 后, 立 即 在 显 微 镜 下 观 察 运 动 精 子 占 全 部 精 子 的 百 分 数 (Mann,1964;Mounib,1978) 精 子 寿 命 (spermlife): 精 子 从 被 激 活 至 视 野 中 90% 以 上 的 精 子 基 本 不 动 为 止 所 持 续 的 时 间 ( 黄 晓 荣 等,2007) 精 子 细 胞 膜 完 整 率 (spermmembraneintegrity): 精 液 稀 释 100 倍 后, 用 0.4% 台 盼 蓝 染 色 3min 细 胞 膜 破 损 的 精 子 头 部 被 染 成 蓝 色, 而 细 胞 膜 完 整 的 精 子 头 部 不 被 染 色 (Freshney,2010) 显 微 镜 下 计 算 未 染 色 精 子 数 占 总 精 子 数 的 百 分 比 先 用 方 差 分 析 (ANOVA) 测 验 每 个 实 验 的 总 体 各 组 之 间 差 异 是 否 显 著 若 显 著, 再 用 LSD 多 重 比 较 检 验 处 理 组 之 间 差 异 显 著 性 实 验 数 据 均 为 平 均 值 ± 标 准 差 2 结 果 2.1 不 同 抗 冻 剂 对 鲜 精 的 影 响 对 鲜 精 活 力 的 影 响 常 温 下, 不 同 抗 冻 剂 对 鲜 精 (n=20) 活 力 的 影 响 见 图 1 加 入 抗 冻 剂 的 各 样 品 精 子 活 力 均 比 对 照 组 低, 随 着 作 用 时 间 延 长, 精 子 活 力 逐 渐 降 低 总 体 来 看, 随 着 作 用 时 间 的 延 长, 对 照 组 精 子 活 力 从 22% 缓 慢 下 降 至 15%;MeOH 作 用 时, 前 60min, 精 子 活 力 下 降 缓 慢,60min 后, 精 子 活 力 迅 速 下 降 ;EG 和 Glycerol 作 用 时, 精 子 活 力 几 乎 呈 直 线 下 降, 分 别 从 20% 和 15% 下 降 至 8% 和 3%;DMSO 作 用 时, 精 子 活 力 在 60min 前 迅 速 下 降,60min 后, 下 降 缓 慢 各 时 间 点 上, 精 子 活 力 按 高 低 排 序 结 果 基 本 一 致,MeOH >EG>DMSO> Glycerol 图 1 常 温 下 不 同 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 活 力 的 影 响 Fig.1 Efectsofdiferentcryoprotectantsonsperm motilityins.obscurusatroom temperature
3 90 第 33 卷 第 5 期 水 生 态 学 杂 志 2012 年 9 月 对 精 子 寿 命 的 影 响 不 同 抗 冻 剂 对 精 子 (n=20) 寿 命 的 影 响 见 图 2 抗 冻 剂 对 精 子 寿 命 有 负 作 用, 抗 冻 剂 作 用 曲 线 均 在 对 照 组 以 下 从 变 化 趋 势 来 看, 对 照 组 精 子 寿 命 在 60min 前 下 降 缓 慢, 60min 后 从 60s 迅 速 下 降 至 43s;MeOH 作 用 时, 精 子 寿 命 在 60min 前 从 55s 迅 速 下 降 至 44s,60min 后, 趋 于 平 缓 ;EG 和 DMSO 作 用 时, 精 子 寿 命 分 别 从 49s 和 45s 缓 慢 下 降 至 36s 和 35s;Glycerol 作 用 时, 精 子 寿 命 在 60min 前 下 降 迅 速, 从 45s 下 降 至 32s,60min 后, 精 子 寿 命 下 降 缓 慢 各 时 间 点 上, 按 精 子 寿 命 长 短 排 序,1~30min 时,MeOH>EG >DMSO 和 Glycerol; 在 其 他 各 时 间 点 上 顺 序 基 本 一 致,MeOH>EG>DMSO>Glycerol 剂 及 浓 度 的 组 合 中,5% MeOH 和 5% EG 冷 冻 效 果 最 好, 解 冻 后 精 子 活 力 最 高, 分 别 为 (18 33± 1 70)% 和 (17.83±2.67)%, 两 者 间 无 显 著 差 异 (P>0.05), 但 这 两 种 处 理 方 式 与 其 他 各 组 间 差 异 显 著 (P<0.05) 4 种 抗 冻 剂 作 用 时, 冻 精 活 力 均 随 着 抗 冻 剂 浓 度 的 增 加 而 降 低 图 3 常 温 下 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 细 胞 膜 完 整 率 的 影 响 Fig.3 Efectsofdiferentcryoprotectantsonsperm membraneintegrityins.obscurusatroom temperature 图 2 常 温 下 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 寿 命 的 影 响 Fig.2 Efectsofdiferentcryoprotectantsonsperm lifeins.obscurusatroom temperature 对 精 子 细 胞 膜 完 整 率 的 影 响 常 温 下, 不 同 抗 冻 剂 对 精 子 (n=20) 细 胞 膜 完 整 率 的 影 响 见 图 3 各 种 抗 冻 剂 对 精 子 膜 的 完 整 率 均 有 影 响, 抗 冻 剂 作 用 曲 线 均 在 对 照 组 下 方 从 精 子 膜 完 整 率 的 总 体 变 化 趋 势 看, 对 照 组 在 120min 前, 细 胞 膜 的 完 整 率 从 92% 缓 慢 下 降 至 85%, 此 后 快 速 下 降 至 180min 的 75%;MeOH 的 作 用 曲 线 几 乎 与 对 照 组 重 合 ;EG 的 作 用 曲 线 基 本 呈 直 线 下 降, 细 胞 膜 完 整 率 从 90% 下 降 至 70%;DMSO 作 用 时, 膜 完 整 率 在 120min 前 从 85% 缓 慢 下 降 至 75%, 到 180min 时 迅 速 下 降 至 60%;Glycerol 作 用 时, 细 胞 膜 完 整 率 在 60min 前, 迅 速 从 85% 下 降 至 65%,60min 后 缓 慢 下 降 从 细 胞 膜 完 整 率 在 各 时 间 点 的 高 低 顺 序 看 基 本 一 致, MeOH>EG>DMSO>Glycerol 2.2 抗 冻 剂 种 类 及 浓 度 对 精 子 冷 冻 的 影 响 对 冻 精 活 力 的 影 响 4 保 存 条 件 下, 不 同 抗 冻 剂 及 浓 度 冷 冻 保 存 的 精 子 (n=20) 复 苏 后 活 力 均 低 于 鲜 精 (36.17±4.06)%( 图 4) 在 几 种 抗 冻 图 4 4 时 抗 冻 剂 及 其 浓 度 对 冻 精 活 力 的 影 响 Fig.4 Efectsofcryoprotectantswithdiferent concentrationsonfrozen thawedsperm motilityat 对 冻 精 寿 命 的 影 响 4 保 存 条 件 下, 不 同 抗 冻 剂 及 其 浓 度 保 存 的 精 子 (n=20) 解 冻 后 精 子 寿 命 如 图 5 结 果 显 示, 冻 精 中 精 子 的 寿 命 均 比 鲜 精 短, 在 几 种 抗 冻 剂 及 浓 度 的 组 合 中,5% MeOH 和 5% EG 解 冻 后 精 子 寿 命 最 长, 分 别 为 (44.3±3.6)s 和 (42.8±5.5)s; 两 者 无 显 著 差 异 (P>0.05),5% MeOH 作 用 的 冻 精 寿 命 与 鲜 精 寿 命 (47.5±3.1)s 间 亦 无 显 著 差 异 (P>0.05),5% EG 和 10% EG (39.2 ±7.2)s 间 冻 精 寿 命 差 异 也 不 显 著 (P>0.05) 4 种 抗 冻 剂 作 用 时, 冻 精 寿 命 均 随 着 抗 冻 剂 浓 度 的 增 加 而 缩 短 对 冻 精 膜 完 整 率 的 影 响 4 保 存 条 件 下 (n=20), 不 同 抗 冻 剂 及 浓 度 保 存 的 精 子 解 冻 后 精 子 膜 完 整 率 见 图 6 5% MeOH 作 为 抗 冻 剂 时, 冷 冻 保 存 的 精 子 复 苏 后 膜 完 整 率 最 高, 为 (85.67±
4 2012 年 第 5 期 王 晓 爱 等,4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 的 影 响 )%, 其 与 鲜 精 (86.22±5.29)% 10% MeOH (81.83±2.27)% 10% EG(83.33±3.73)% 之 间 无 显 著 差 异 (P>0.05), 与 5% MeOH(81.17± 2 32)% 差 异 显 著 (P<0.05), 与 其 他 各 处 理 组 间 差 异 极 显 著 (P<0.01) DMSO Glycerol 和 MeOH 作 为 抗 冻 剂 时, 随 着 抗 冻 剂 浓 度 的 升 高, 冻 精 膜 完 整 率 下 降,EG 作 为 抗 冻 剂 时, 冻 精 膜 完 整 率 则 随 着 浓 度 升 高 而 升 高 图 5 4 时 抗 冻 剂 及 其 浓 度 对 冻 精 寿 命 的 影 响 Fig.5 Efectsofcryoprotectantswithdiferent concentrationsonfrozen thawedsperm lifeat4 图 6 4 时 抗 冻 剂 及 其 浓 度 对 冻 精 膜 完 整 率 的 影 响 Fig.6 Efectsofcryoprotectantswithdiferent concentrationsonfrozen thawedsperm membraneintegrityat4 3 讨 论 3.1 抗 冻 剂 对 精 子 的 毒 性 作 用 由 于 不 同 鱼 类 精 子 的 生 理 特 性 差 异 很 大, 对 抗 冻 剂 的 响 应 也 不 同, 而 精 子 的 冷 冻 效 率 在 一 定 程 度 上 取 决 于 所 选 抗 冻 剂 对 精 子 的 毒 性 作 用 (Rana, 1995), 因 为 它 可 以 导 致 精 子 质 膜 结 构 改 变 降 低 精 子 的 运 动 能 力 影 响 精 子 的 授 精 功 能 ( 陈 松 林, 2007); 因 此 有 必 要 探 讨 抗 冻 剂 对 鲜 精 的 影 响, 以 判 断 抗 冻 剂 的 毒 性 作 用 在 4 种 抗 冻 剂 中,DMSO 一 直 被 认 为 对 人 体 细 胞 有 较 高 的 毒 性 作 用 ( 陈 松 林 等,1992;Cabritaetal,2010);MeOH 因 其 对 细 胞 的 低 毒 作 用 而 被 应 用 于 一 些 哺 乳 动 物 细 胞 眼 虫 和 血 吸 虫 的 冷 冻 保 存 中 (Ashwood& Lough,1975;Harvey etal,1982) 本 次 研 究 结 果 表 明,Glycerol 和 DMSO 对 暗 色 唇 鱼 精 子 的 活 力 寿 命 和 膜 完 整 性 的 负 作 用 要 比 MeOH 和 EG 高, 且 在 作 用 时 间 为 1min 时, Glycerol 和 DMSO 对 应 的 各 指 标 值 都 比 MeOH 和 EG 低 笔 者 推 测, 对 于 暗 色 唇 鱼 精 子,MeOH 和 EG 的 毒 性 作 用 要 比 Glycerol 和 DMSO 低 从 4 种 抗 冻 剂 对 精 子 活 力 寿 命 和 膜 完 整 率 的 影 响 来 看, 在 180 min 时, 活 力 和 寿 命 已 降 到 最 低 水 平, 分 别 不 超 过 12% 和 45s, 而 膜 完 整 率 还 维 持 在 相 对 较 高 的 水 平, 均 在 55% 以 上, 可 能 是 抗 冻 剂 的 毒 性 作 用 主 要 影 响 了 精 子 的 运 动 和 授 精 能 力, 而 在 膜 完 整 性 上 的 表 现 并 不 明 显 抗 冻 剂 对 细 胞 的 毒 性 作 用 会 随 着 其 浓 度 升 高 而 增 强 (Lahnsteiner&Mansour,2008) 在 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 过 程 中, 随 着 抗 冻 剂 浓 度 的 增 加, 冻 精 的 活 力 寿 命 和 膜 完 整 率 均 呈 下 降 趋 势 ; 笔 者 推 测, 在 此 过 程 中 抗 冻 剂 的 毒 性 起 了 主 要 作 用 3.2 抗 冻 剂 对 精 子 的 保 护 作 用 不 同 抗 冻 剂 对 细 胞 的 通 透 性 存 在 差 异, 一 般 认 为 采 用 渗 透 性 大 的 抗 冻 剂 保 存 精 子 能 获 得 较 高 的 存 活 率 (Gilmoreetal,1997) DMSO 因 其 高 渗 透 性 和 易 与 精 子 膜 上 磷 脂 层 发 生 相 互 作 用 而 被 广 泛 应 用 于 多 种 鱼 类 的 精 子 冷 冻,MeOH 也 能 快 速 进 出 细 胞 (Harveyetal,1982; 王 晓 爱 等,2012); 很 多 研 究 也 表 明,Glycerol 的 冷 冻 效 果 次 于 DMSO MeOH 和 EG (Rana,1995;Fox& Burdick,1963) 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 过 程 中,DMSO 和 Glycerol 作 为 抗 冻 剂 时, 冷 冻 效 果 不 佳, 除 了 与 其 毒 性 作 用 有 关 外, 可 能 是 这 两 种 抗 冻 剂 对 其 精 子 细 胞 的 渗 透 性 较 低, 不 能 满 足 冷 冻 保 存 的 需 要 ; 但 其 细 胞 膜 完 整 率 还 维 持 在 较 高 水 平, 说 明 除 了 少 量 精 子 细 胞 膜 损 伤 外,DMSO 和 Glycerol 对 暗 色 唇 鱼 精 子 的 其 他 结 构 造 成 了 严 重 损 伤 ; 而 且 DMSO 和 Glycerol 往 往 会 造 成 精 子 尾 部 凝 聚 现 象, 这 与 斑 马 鱼 精 子 冷 冻 结 果 相 似 (Harveyetal,1982) 在 哺 乳 动 物 精 子 冷 冻 中, 稀 释 液 中 加 入 卵 黄 可 以 降 低 凝 集 发 生 (Polge,1980) MeOH 和 EG 作 为 抗 冻 剂 时, 暗 色 唇 鱼 冷 冻 复 苏 后 的 精 子 寿 命 和 细 胞 膜 完 整 率 与 鲜 精 差 异 不 显 著, 但 其 冻 精 活 力 不 到 鲜 精 的 50%; 笔 者 推 测, MeOH 和 EG 在 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 复 苏 过 程 中 对 细 胞 膜 起 到 了 良 好 的 保 护 作 用, 但 可 能 干 扰 了 精 子 能 量 代 谢 的 平 衡 (Hammerstedtetal,1990;Watson, 1995)
5 92 第 33 卷 第 5 期 水 生 态 学 杂 志 2012 年 9 月 志 谢 : 中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所 珍 稀 特 有 鱼 类 保 育 研 究 基 地 的 杨 世 论 倪 仰 居 施 丛 永 和 施 茂 在 实 验 过 程 中 给 予 诸 多 帮 助, 在 此 一 并 表 示 感 谢! 参 考 文 献 陈 松 林, 刘 宪 亭, 鲁 大 椿, 等 鲢 鲤 团 头 鲂 和 草 鱼 精 液 冷 冻 保 存 的 研 究 [J]. 动 物 学 报,38(4): 陈 松 林 鱼 类 精 子 和 胚 胎 冷 冻 保 存 理 论 与 技 术 [M]. 北 京 : 中 国 农 业 出 版 社. 黄 晓 荣, 章 龙 珍, 乔 振 国, 等 抗 冻 剂 对 日 本 鳗 鲡 精 子 活 力 及 运 动 时 间 的 影 响 [J]. 海 洋 渔 业,29(3): 乐 佩 琦, 陈 宜 瑜 中 国 濒 危 动 物 红 皮 书 鱼 类 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社. 司 维, 李 亚 辉, 关 沫, 等 四 种 渗 透 性 防 冻 剂 在 猕 猴 精 子 低 温 冷 冻 保 存 中 对 精 子 功 能 状 态 的 影 响 [J]. 动 物 学 研 究,25(1): 王 晓 爱, 杨 君 兴, 陈 小 勇, 等 软 鳍 新 光 唇 鱼 精 子 的 超 低 温 冷 冻 保 存 [J]. 动 物 学 研 究,33(3): 杨 剑, 潘 晓 赋, 陈 小 勇, 等 李 仙 江 鱼 类 资 源 的 现 状 与 保 护 对 策 [J]. 水 生 态 学 杂 志,3(2): 杨 永 宏, 杨 君 兴, 潘 晓 赋, 等 云 南 李 仙 江 流 域 水 电 开 发 中 的 鱼 类 资 源 保 护 [J]. 动 物 学 研 究,32(2): Ashwood SmithMJ,LoughP.1975.Cryoprotectionofmammali ancelsintisueculturewithmethanol[j].cryobiology, 12(5): CabritaE,SarasqueteC,Martínez PáramoS,etal.2010.Cryopr eservationoffishsperm:applicationsandperspectives[j]. JournalofAppliedIchthyology,26(5): FoxRR,BurdickJF.1963.PreservationofRabbitSpermato zoa EthyleneGlycolVsGlycerolforFrozenSemen[J]. ProceedingsoftheSocietyforExperimentalBiologyand Medicine,113(4): FrankhamR,BalouJD,BriscoeD A.2002.Introductionto Conservation Geneties[M]. 2nd Ed. CambridgeUK: CambridgeUniversityPres. FreshneyRI.2010.Cultureofanimalcels:amanualofbasic techniqueandspecializedapplications(6 th ed)[m].john Wiley&Sons,Inc.,Hoboken,NewJersey: GilmoreJA,LiuJ,GaoDY,etal.1997.Determinationof optimalcryoprotectantsandproceduresfortheiraddition andremovalfrom humanspermatozoa[j].humanrepro duction,12(1): HammerstedtRH,GrahamJK,NolanJP.1990.Cryopreserva tionofmammaliansperm:whatweaskthem tosurvive [J].JournalofAndrology,11(1): HarveyB,KeleyNR,Ashwood SmithM J.1982.Cryopreser vationofzebrafishspermatozoausingmethanol[j].cana dianjournalofzoology,60(8): HorvathA,WaymanW R,DeanJC,etal.2008.Viabilityand fertilizingcapacityofcryopreservedspermfromthreenorth American acipenseriform species: a retrospective study [J].JournalofAppliedIchthyology,24(4): LahnsteinerF,MansourN.2008.Protocolsforthecryopreser vationofsalmonidaesemen,lotalota(gadidae)andesox lucius(esocidae) Northerpike(Livro).In:CabritaE, RoblesV,HeraezMP(eds.).MethodsinReproductive Aquaculture:MarineandFreshwaterSpeciesBiologySeries [M].CRCPres(TaylorandFrancisgroup): MannT.1964.Thebiochemistryofsemenandofthemalerepro ductivetract[m].2nded.methuen,london:wiley, 493. MounibM.1978.Cryogenicpreservationoffishandmammalian spermatozoa[j].reproduction,53(1):13. MuchlisinZA.2005.Curentstatusofextendersandcryopro tectantsonfishspermatozoacryopreservation[j].biodiver sitas,6(1): PolgeC,SmithAU,ParkesAS.1949.Revivalofspermatozoa aftervitrificationanddehydrationatlowtemperatures[j]. Nature,164: PolgeC.1980.Freezingofspermatozoa.InLow temperature preservationinmedicineandbiology[m].editedbyash wood SmithM JandFarantJ.PitmanMedical,Tunbridge Wels: RakitinA,FergusonM M,TrippelEA.1999.Spermatocritand spermatozoadensityinatlanticcod(gadusmorhua):cor relationandvariationduringthespawningseason[j].aq uaculture,170(3-4): RanaK J.1995.Cryopreservation offish Spermatozoa[J]. MethodsinMolecularBiology,38(5): WatsonP.1995.Recentdevelopmentsandconceptsinthecryo preservationofspermatozoaand theasesmentoftheir post thawingfunction[j].reproduction,fertilityandde velopment,7(4): ZhangYZ,ZhangSC,LiuXZ,etal.2003.Cryopreservation offlounder(paralichthysolivaceus)spermwithapractical methodology[j].theriogenology,60(5): ( 责 任 编 辑 万 月 华 )
6 2012 年 第 5 期 王 晓 爱 等,4 种 渗 透 性 抗 冻 剂 对 暗 色 唇 鱼 精 子 冷 冻 保 存 的 影 响 93 EfectsofFourPenetratingCryoprotectantsonCryopreservationof SemilabeoobscurusSperm WANGXiao ai 1,2,YANGJun xing 1,CHENXiao yong 1,PANXiao fu 1,LIZai yun 1 (1.StateKeyLaboratoryofGeneticResourcesandEvolution,KunmingInstituteofZoology, thechineseacademyofsciences,kunming ,P.R.China; 2.GraduateSchooloftheChineseAcademyofSciences,Beijing ,P.R.China) Abstract:Thepresentstudyaimedtoexamineefectsoffourpenetratingcryoprotectants(dimethylsulfoxide,glyc erol,ethyleneglycolandmethanol)onfreshandfrozen thawed(freezingtemperaturewas4 )spermsofsemila beoobscurus.thefunctionoffreshandfrozen thawedspermswasevaluatedbyspermmotility,spermlifeandsperm membraneintegrity.resultsobtainedhereshowedthat:fourpenetratingcryoprotectantspresenteddiferentnegative efectsonfreshspermmotilityandmembraneintegrity,methanol<ethyleneglycol<dimethylsulfoxide<glycerol; negativeefectsonfreshspermlifewerealsoobserved,methanol<ethyleneglycol<glycerolanddimethylsulfox ide;freshspermsofs.obscurus[with(36.17±4.06)% formotility,(47.5±3.1)sforlife,and(86.22± 5.29)% formembraneintegrity]werefrozenforashort-term;thepost thawingmotilityoffrozenspermstreated with5% methanolor5% ethyleneglycolwererespectively(18.33±1.70)% and(17.83±2.67)%,whichwere significantdiferentwiththefreshsperm motilityandhigherthanthosefrozenspermswithothertreatments;the post thawinglifeoffrozenspermstreatedwith5% methanolor5% ethyleneglycolwererespectively(44.3± 3.6)sand(42.8±5.5)s,whichwerelongerthanthosefrozenspermswithothertreatments;therewasnosignif icantdiferencebetweenpost thawinglifeoffrozenspermstreatedwith5% methanolandfreshspermlife;interms ofspermmembraneintegrity,5% methanolwastheoptimalcryoprotectants,whichhadnosignificantdiferences withfreshspermmembraneintegrity.theseresultsindicatedthat:1)dimethylsulfoxideandglycerolwerenotthe suitablecryoprotectantsfors.obscurussperm cryopreservation;2) methanolandethyleneglycolhadsimilar efects,whichwerepotentialpenetratingcryoprotectantsfors.obscurusspermcryopreservation. Keywords:penetratingcryoprotectants;Semilabeoobscurus;spermcryopreservation
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