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1 同位素标记化合物 放化纯度鉴定 - 平面液相色谱 : 纸 聚酰胺薄片 薄层层析测量法 慈云树 hydrcys@126.com

2 放射性药物的质量管理和控制

3 72 前年我们开始涉足放射性核素标记化合物 那年我们被告知自己研制的标记核素化 合物如直接用于病人 必需先将详细实验资料正式报卫生部药检所审批 当时国内最风 行是搞 恶性肿瘤阳性显像剂 我们搞 99mTc 标记搏来霉素 如今好像还能见到报道 那时我们还搞过 多聚磷酸盐即现在的 PYP 经过卫生部药检所批准才用于病人 年夏正明是具体操作者 是我的核药实验导师 后来的 35 年在核药上他执全国之牛 耳 只是不少搞核药研究的人説他过于严厉甚 霸道 他跟我説 审批核药品必需严 格 人命关天不能马虎 74 年卫生部药政局将放射性药品纳入药政管理轨道 列为部管药品 并于 1975 年颁发 了 中华人民共和国卫生部放射性药品标准 收载了 15 个品种 至 1985 年 12 月共有 36 种放射性药品制订了国家药品标准 中华人民共和国药品管理法 的有关规定会同 原工业部发出通知 对其生产 经营单位进行检查 验收和核发 放射性药品经营许可 证 并颁发检查验收细则 作为发证依据 1987 年 3 月根据 中华人民共和国药品管理法 和卫生部 核工业部 (85) 卫药字 83 号 文规定 由核工业部同意 卫生部审核批准 当地省 自治区 直辖市卫生厅 ( 局 ) 颁 发了放射性药品生产 经营许可证的通告

4 所知关于 放射性药品管理 药典委员会下设核药品专业组 开始由卫生部药品生物制品鉴定所核药品室主持 当 时由夏正明与等做实验室工作 负责核药品规范的制定及协调执行和执法 我国最早几个标记化合物都是哪里鉴定和发证的 我们研究的标记化合物应用于临床 都由那里先鉴定 批示放行 pyp 99mTc-buniamycin 我国最早的五大标记 131 I- 马尿酸 203Hg- 新醇 198AU- 胶体 32P- 胶体 单体 32P 溶液 当时在北京化工厂 二车间标记组生产 都是由卫生部药品生物制品检定所鉴定所鉴定发证 并进行跟踪 监督 并进行所説的 批批检 早期 401 所生产的 99Tc-99mTc 113Se-113mIn 发生器也 都是同一程序进行鉴定和质量监督 药品管理法 和 放射性药品管理办法 中引入了比较详细的 核药品生产质量控制 quality control,qc 等管理规定细则 按前述 放射性药品管理办法 99mTc MDP DTPA dx MIBG 等都是半成品 不 可直接使用 在按规定程序 标记 并检验合格后方可用于病人 多种核医学显像剂都属于前述范畴 同位素标记需要按其说明书规定的条件标记和质 量检测数据符合规定才能视为 制药 过程完成用于病人

5 有关核素标记化合物规范的早期会议 摄于莫干山会议 黄山会议的部分照片

6 1989 年 1 月国务院发布 放射性药品管理办法 它对放射性药品的定义及 品种范围作了规定 同时对放射性药品的研制 临床研究和审批 生产经营 进出口 包装 运输 使用标准及检验等的有关管理作了严格规定 这说 明我国放射性药品是已纳入法制管理的轨道了 2000 年 10 月国家药品监督管理局和卫生部联合颁发 关于印发医疗机构制 备正电子类放射性药品管理暂行规定的通知 使正电子药物制备的管理有 章可循 为了更好地指导临床应用 药品监督管理局在北京 上海 成都等 地设立了 5 个放射性药物临床药品基地 总之 与核医学显像仪器相对而言 我国医用放射性药品绝大多数为国内生产 供应 仅少数依靠进口 而管 理法规相对健全 使生产单位及核药房制剂有章可循 但认真贯彻执行还有 待努力

7 在医院中 大部分放射性药物是通过适当的放射性核素将现在 进口或国产药盒 ( 冻干品 ) 复溶制备 这种复溶操作导致形成 一种新的化合物 因此也必须进行质量检测 药盒和放射性核 素的质量控制由生产者进行 最后一步制备的放射性药物由核 药房或具有 GMP(good manegement programme) 标准资格的 核医学科进行 理化性质和生物学的质控为最主要的两方面内 容 有条件的单位 例如放射性药物临床药理基地根据 GCP(good clinical practice) 尚可进行生物学分布和显像 毒性效应与药物动力学试验

8 1 理化性质 包括物理外观 粒子大小 ph 以及化学 放射性核纯度 和放射性化学纯度等 2 物理外观 静脉注射前要观察保证它是颗粒状或是真溶液 颗粒状 包括胶体 白蛋白聚合大颗粒 微球和红细胞 真溶液包括所有其他液体放 射性药物 3 粒子大小 用超高显微镜检查胶体粒子大小应为 1~100μm 用光学 显微镜检查聚合粒子大小应为 10~100μm 放射性药物聚合颗粒超过 150μm 的离子应该弃去 以避免阻塞肺小动脉 4 ph 值 放射性药物的 ph 值可在 2~9 范围 5 放射性核纯度 放射性核纯度是指放射性药物中所要求的放射性核 素占总放射性的比重 在核药房中所要检查的主要是存在的放射性核杂质 放射性核杂质可用 NaI(TI) 或 Ce(Li) 半导体多道能谱分析仪或测定放射性 核素的半衰期的方法来检测

9 5 放射化学纯度 放射化学纯度是指放射性药物中所要求的化学形式的放射 性占总放射性的比重 放射化学纯度可用液相色谱 平板色谱或柱色谱法测 定 在核药房 核药品的放射化学分析通常采用平板色谱法 而柱色谱法通 常用于研究和开发 采用高压注入小直径离子的柱子称作高压 也有称高效 液相色谱 液相色谱 (HPLC) 技术 以区别于重力进行的流式技术 在 HPLC 系统中通常配用紫外线 (UV) 及射线探头 HPLC 可用于分离在结构上十分相 近的样品组分 HPLC 设备复杂价格不菲 而且使用耗材也很贵 纸条或聚氨脂薄板层析 法放射化学纯度测定方法成熟 设备相对便宜 耗材也很一般 抄作简单 出结果快 我国多数放射性药品开始都是用该方法进行检测鉴定的 当然 HPLC 是很好的放射性药品尤其是分子 PET 显像剂的放射性化学纯度 鉴定设备

10 2 生物学试验 包括无菌 热原 毒性和生物分布等 1 无菌 无菌系放射性药物中没有活的微生物 它是通过对所有制备 材料和溶液高压灭菌或用 0.22μm 微孔滤膜器过滤完成的 2 热源 为了避免热源污染放射性药物 所有玻璃器皿和装备应在 200 干热 2 小时 溶液应使用双蒸水制备并尽可能使溶液通过灭菌 AI2O3 柱 含有热源的静脉注射液注射后 小时 可产生发热 寒战 白细胞减 少 关节疼痛 潮红 出汗以及头痛 3) 毒性 毒性系组织对给予药物的负面药理学反应 放射性药物不引起 药理学反应 因为使用的化合物极微量仅为示踪量 然而要求生产者保证放 射性药物中的非放射性成分在毫克级水平是无毒的 4) 生物分布 将一种放射性药物样品注射到指定的动物模型 间隔一定 的时间处死动物 解剖取出器官并测定每个器官的放射性 计算每个器官占 注入剂量的百分率及靶和非靶器官比率 与过去这种制剂的结果进行比较 如果结果很一致 那么该制剂有可能适用于人体

11 保证标记化合物质量的关键 ① 切实可行的生产工艺流程 ② 化学纯度 ③ 放射性核纯度 ④ 放射化学纯度 ⑤ 比活度 ⑥ 使用期 ( 有效期 ) ⑦ 无菌 无热源

12 有关放射性药品质量控制 放射性药物的质量保证与控制 一 放射性药物的分类 1 成品放射性药物 由核药房或特定的核素 核药品生产单位供应 2 半成品放射性药物 指标记化合物配套药盒及标记核素 包括发生器制备核素 3 用药前即时制备的放射性药物 例如 99mTc-MDP 等 4 体内标记放射性药物 例如体内标记红细胞 二 放射性药品使用许可证 的分类 根据国食药监安 [2003]199 号四部委文的通知精神 放射性药品使用许可证 分 为四类 在 核医学科组织管理及人员职责项目规程 中有关放射性药品质量控制有比较清楚 的说明

13 上海核医学科组织管理及人员职责项目规程 中有关 [99mTc] 放射性药品质量控制 鉴于锝 [99mTc] 放射性药品的特殊性 为了保证锝 [99mTc] 放射性药品质量及其用药安全有效 根据 药品管理法 和 放射性药品管理办法 特制订本指导原则 本指导原则适 用于即时标记放射性药品生产企业和自行制备锝 [99mTc] 放射性 药品的医疗机构 具有第三类以上 放射性药品使用许可证 对锝 [99mTc] 放射性药品的质量控制

14 二 放射性药品使用许可证 第二类 1 放射性药品使用范围 1 体内诊断 治疗用一般放射性药品 系指根据诊断 治疗需要 对购入的放射药品进行简单的利用稀释或不稀释 用于病人的品种 如碘 [131I] 化钠口服液 邻碘 [131I] 马尿酸钠注射液 氯化亚铊 [201Tl] 注射液等 2 即时标记放射性药品生产企业提供的已配制完成的含锝 [99TC] 注射液 2 人员 1 具有取得医师执业证书 经核医学专业培训一年以上 并获中级以上专业技术职务的人员 2 从事放射性药品治疗的医疗机构 还必须配备核医学副高级以上专业技术职务的人员 3 操作放射性物质的人员应持有卫生行业部门发给的 放射工作人员证 3 仪器与设备 1 具有表面沾污监测仪 2 配备满足辐射防护要求的储存 操作 废弃物处置设备 3 开展体内放射性药品诊断 必须配备经标定的活度计 井型电离室 功能测定仪 甲功仪或肾 图仪 或显像设备 γ 闪烁照相机或单光子发射计算机断层仪 4 开展体内放射性药品治疗 必须配备经标定的活度计 井型电离室 显像设备 γ 闪烁照相机或单光子发射计 算机断层仪 开展甲状腺疾病治疗的必须配备甲功仪 4 房屋设施 1 具有与诊断和治疗相适应的实验室和病房 使用含等效活度 1.11GBq 以上的碘 [131I] 或其它核素放 疗的医疗机构应有专用病房 2 实验室设通风橱 具有放射性药品用的具洗刷和卫生消毒设施 3 具备防昆虫和防尘设施 4 具有辐射防护要求的存放含放射性核素的分析药盒和废弃污物的设施 5 具有安全防盗设施 射性药品治

15 三 放射性药品使用许可证 第三类 1 放射性药品使用范围 1 放射性药品使用许可证 第二类 规定的放射性药品 2 采用放射性核素发生器及配套药盒自行配制的体内诊断及治疗用放射性药品 3 采用市售自动合成装置自行制备的正电子类放射性药品 2 人员 1 具有 放射性药品使用许可证 第二类 规定的人员 2 具有负责放射性药品的配制 质量控制的专职技术人员 3 具有掌握核物理或辐射计量专业知识的技术人员 3 仪器与设备 1 达到 放射性药品使用许可证 第二类 规定的相应条件 2 具有保证无菌操作的净化设备 制备正电子类放射性药品还应具备加速器 自动合成装置 高能 正电子成像设备 3 具备与所用放射性药品质量检测相适应的检验仪器和设备 如 测定化学纯度的纸色 谱分析条件及仪器等 4 房屋设施 达到 放射性药品使用许可证 第二类 的要求 制备正电子类放射性药品的还应有相应的 制备和放射防护设施

16 四 放射性药品使用许可证 第四类 1 放射性药品使用范围 1 放射性药品使用许可证 第三类 规定的放射性药品 2 可研制和使用放射性新制剂以适应核医学诊治新方法 新技术的应用 研制范围仅限国内市场没有或技术条件限制而不能供应的品种 2 人员 1 除具有 放射性药品使用许可证 第三类 规定的人员外 还应有 10 年以上核医学临床工作经验的正高级专业技术职务人员 2 具有核医学技术专业高级技术职务的人员 3 具有药学 化学等相关专业博士学位的副高级以上专业技术职务的人员 4 具有核物理或生物学位 中级专业技术职务的核物理或辐射剂量学专业技术人员 3 仪器与设备 1 达到 放射性药品使用许可证 第三类 的要求 2 具备与研制放射性制剂相适应的基本仪器和设备 包括药物合成 分析 药效学 内辐射吸收剂量等实验所需仪器 净化设备和配 制设备等 4 房屋设施 1 达到 放射性药品使用许可证 第三类 的要求 2 具备与所配制制剂相适应的配制 净化 质检和放射性制剂研制的实验室设施 3 具备符合国家规定的动物实验的基本条件和设施 五 管理制度 申请 放射性药品使用许可证 的医疗机构 应由主管院长 核医学科主任等有关成员组成领导小组 负责本单位使用放射性药品的安全监 督检查工作 并建立以下制度 1 放射性药品采购 登记 使用 核对 保管及注销制度 2 放射性药品配制 质控及记录制度 3 仪器设备的使用 管理制度 4 体内放射性药品使用 观察制度 5 卫生防护和废物处理制度 6 放射性药品不良反应 放射性污染的紧急处理及报告制度 7 研制放射性制剂的申报制度 仅限第四类

17 关于放射性药品管理 按照放射性药品的管理 由放射性药厂生产供应成品或半成品 药厂负责对药 品生产过程及最终成品的质量控制 达到保证使用药品的安全 有效 医院的放射性核药房现场制备放射性药物 在使用前负责对自己制备的药物进行 质量检验 并保证安全 有效 因此 医院的放射性核药房必须熟悉和掌握放射性 药物质量检验的全部内容和操作 并配备相应的人员和设备 放射性药物的质量检验一般分为物理 化学和生物学检验三个方面 物理检验包 括 药物性状 色泽 澄清度 粒子等 的观察 放射性核素的鉴别 放射性核纯 度 ridio nuclide purity 放射性化学纯度 (radiochemical purity) 本仪器主要用 于核素标记物的放射性化学纯度测量 ; 下面仅就该方面进行讨论

18 放射性药物标记制备应考虑的要素 标记方法的选择 标记产率的高低 是放射性药物标记制备的重要因素 1 标记产物的稳定性 放射性核素与被标记物之间键合的形式与稳定性密切相关 通常共价键结合的标记化 合物相对稳定 2 失活或变性 标记过程中 由于标记条件的影响 使被标记物结构改变或丧失生物活性 3 核素效应 由于核素相互间质量不同而引起的理化和生物学性质的改变称核素效应 原子量大的 核素间核素效应微乎其微 但氚标记是个例外 4 辐射自分解 由于标记化合物自身的放射性核素发出的粒子或射线作用 导致自身分解的现象 放 射性药物的比活度越高 越易发生辐射自分解 辐射发生在溶液中也可能产生自由基 自 由基能破坏标记物的共价键 引起间接辐射自分解 这是高放射性浓度的放射性药物常易 产生的质量问题之一 上述几方面都会引致标记物质量下降 而每种标记物都有标记率的要求 所以标记物 的 放射化学纯度 检测被列为重要 必须的检测指标

19 质量控制与质量检验 质量控制与质量检验是两个相关而不相同的概念 质量控制包括质量保证和质量检验 质量控制是指达到药品质量标准 生产厂家 按 药品生产质量管理规范 要求 而采取的一系列措施 质量检验是质量控制中的一部分 是按药品标准进行实验室检验 核医学科自行 制备放射性药物 如利用核素发生器和配套药盒现场制备放射性药物 生产超短 半衰期放射性核素 制备放射性药物以及利用放射性核素标记单克隆抗体 进行 放射免疫显像或放射免疫治疗等 故应建立自己的质量控制体系

20 放射性性核素的核纯度测定 1 γ 多道谱仪的 γ 谱扫描法 据云 众成 的层析仪有 256 道 γ 谱扫描仪功能 由于多道谱仪晶 体分辨率要求很高 国外多道一般用锗 - 锂能量高分辨型晶体 价格 昂贵 当然也可以采取分次扫描 γ 单道能谱测量 方法 寻找核杂 质的峯位所在 2 半衰期测定法 这是我们贯常的方法 就是延长测量时间 测量其半衰期 以确定 所含同位素种类及核素杂质 以计算所用核素纯度百分比

21 关于 放射化学纯度 检测的规定 一 发货或使用前必须进行检验的质量控制项目 1 性状 将锝 [99mTc] 放射性药品置于铅玻璃后通过肉眼观察 不得出现与其相应的质 量标准有明显区别的性状 如规定为无色澄明液体 若发现颗粒状物质 出现浑浊或 颜色变化 应停止发货和使用 2 ph 值 可用经过校正精密 ph 试纸检查 其 ph 值应在相应法定标准规定的范围内 3 放射化学纯度 放射化学纯度应按相应的质量标准规定的方法进行测定 鉴于有些检 验方法耗时较长 为适应快速质量控制的要求 企业或医疗机构可以采用经过验证的 快速测定方法进行测定 快速测定方法必须经过测定本单位配制的三批以上样品 每 批样品不少于三个时间点 即制备后即刻 有效期中间点和有效期末点 的严格验证 其限值不得低于标准中的限值 在日常使用过程中 应定期对该快速测定方法进行再验 证 每年至少验证一次 确保其准确有效

22 放射化学纯度 是指某一种放射性核素的某一化学形式的放射性占该放射性核素总放射性的 百分比 放射化学纯度是衡量放射性药物质量的重要指标之一 也是放射性药物 常规检验项目中最重要的项目 须指出的是 放射化学纯度的计算应在放射性核 纯度的基础上进行 如含 99mTc 注射液的放射化学纯度 是指除去供试品中可能 含有的其他放射性杂质 如 99Mo 等 以外 所有 99mTc 的其他放射性作为 100% 来计算可能存在的其他化学形式的 99mTc 例如 高锝酸根 99mTcO4- 或还原锝 99m TcO2 常用的放射化学纯度测定法有纸层析法 聚酰胺薄膜层析法 快 速硅胶薄层层析法 高效液相色谱法以及电泳法等 对某些特殊理化性质的放射 性药物也可采用其他分离分离分析方法 如过滤法 离心法等 但提倡的方法 也是经常使用的方法是纸层析法 在纸层析法中 涉及放射性药物中各组分的比 移值 Rf 所谓比移值是供试品中某组分 从点样原点移动到纸上任意一点的 距离 被展开剂移动的距离除后所得的商值 用公式表示为 Rf = 原点至供试品中某一组分移动的距离 展开剂移动的距离 放射性药物中各组分的 Rf 值 在一定的条件下是一个常数 但当条件改变时 也可能随着改变

23 放化纯度鉴定方法 - 平面液相色谱法 : 纸 聚酰胺薄片 薄层层析测量法

24 层析法的由来 层析法属于色谱分析法 又叫色层分离法 或色 谱法 1903 年俄国化学家茨维特 (HBeT) 发现用挥发油 冲洗菊粉柱时 各种颜色的色素在吸附柱上从上 到下排列成色谱 故称 色层分离法 1931 年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同 分异构体 显示了这一分离技术的高度分辩力 从此引起了人们的广泛注意 自 1944 年应用滤纸作为固定支持物的 纸层析 诞生以来 层析技术的发展越来越快

25 纸层析法原理 纸层析法是 平面液相色谱中最简单的一种 它方便 快速 用滤纸 作为惰性支持物 进行分配层析 以水 被滤纸纤维结合 作为固定 相 以有机溶剂为流动相 样品点在滤纸上进行展层 氨基酸等有机 化合物在两相中不断分配 因为分配系数不同 故样品随流动相移动 的速率不同 从而被分开 形成距原点距离不等的层析点 被检测物分离后在纸层析图谱上的位置是用 Rf 值 ( 比移值 ) 来表示 的 Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数 Rf 值的大小与物质的结构 性质 溶剂系统 层析滤纸的质量和层析温度等因素有关

26 点样

27 将已经点样的层析纸条 按上行法 下行法放入展开装置进行展开

28 如果是薄板层析则将点样之薄板斜放于 专用层析缸中 进行层析

29 纸色谱分析 - 纸层析 Rf 值的计算

30 纸层析多方向扩展 - 双相层析谱的用途 纸层析可看作是溶质 样品 在固定相与流动相之间的连续抽提 由于溶质 在两相之间的分配系数不同而达到分离 一定的物质在两相间有固定的分配 系数 因而在恒定条件 液剂 PH 温度 下 各物质有固定的 Rf 值 据 此可达到分析鉴定的目的 由于滤纸纤维可吸收 20 25% 的水分 且其中 6 7% 以氢键形式与纤维素 上羟基结合 一般条件下难脱去 所以纸层析实际上是以水相作固定相 展 开的溶剂作流动相 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行 下行和径向三 种 氨基酸分离一般用上行法 上行法又分单向 成分较为简单的样品 和 双向 单向时斑点重叠分离不开 于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展 层 双相层析谱可分辨十几种以上的样品

31 纸层析抄作过程 1 平衡 将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中 单相可不做 2 准备滤纸 取层析滤纸 ( 长 22 cm 宽 14 cm) 一张 纸的窄边朝下 距下端 2 cm 处 用铅笔划一条与底边平行的直线 在此直线上每间隔 2cm 作一记号 3 点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在中间 5 个记号 上 吹干后再点一次 每点在纸上扩散的直径 最大不超过 5 mm 4 扩展 用线将滤纸缝成筒状 纸的两边不能接触 用胶带粘住两边 将盛有约 20 ml 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中 并将滤纸直立于培养皿中 ( 点样的一端在下 扩展剂的液面需低于点样线 1 cm) 待溶剂前沿上升 cm 时即取出滤纸 铅 笔描出溶剂前沿界线 自然干燥或用吹风机热风吹干 5 将已干燥的纸层析条放置于层析扫描仪扫描平台上进行扫描 6 打印 Rf 值及放化纯度 结果

32 纸层析 paper chromatograpy 聚酰胺脂薄层层析 (thin layer chromatograpy) 的原理 基本操作与结果测量 1 基本原理 1 纸层析 是以层析纸作为固定相 以适当的展开剂作为流动相 当样品随着流动 相从点样的下端沿着纤维素分子上行时 由于样品组分的性质不同 在固定相上的吸附能 力和在流动相中的溶解度的不同 各个组分在固定相上的移动距离也就不同 从而使各个 组分能有效地分开 常用比移值 Rf 值 来表示各组分移动的相对速度 Rf = 标记物与原点的距离 流动相前沿与原点的距离 Rf 在 0 1 之间 在同一层系系统和同一层析条件下 某物质的 Rf 值总是保持不变的 2 薄层层析 一般简写为 TLC 其基本原理因固定相的不同而异 例如 硅胶或 氧化铝作为固定相的分离原理是根据各个组分吸附能力和分配系数的不同 离子交换树脂作为 固定相的分离原理是根据各个组分离子荷电性质和数量不同 聚酰胺作为固定相的分离原理是 根据各组分的氢键吸附能力的不同 所以 应根据待分析的物质的性质 选用相应的固定相

33 2 基本操作 1 选择固定相 固定相可以选用层析纸和薄层层析板 其大小依据实验的要求而定 一般 长度在 7 20cm 之间 对于时间要求短的实验 宜选用短的层析纸 对于难分离的放射性核素标 记组分可选用长的薄层层析板 2 展开剂的选择 展开剂在纸层析和薄层层析中是一个重要的因素 它将直接影响各组分 的分离效果以及拖尾的程度 因此 应精心设计合适的溶剂体系 往往同时进行 2 3 种展开体系 的分析 以资比较 溶剂体系的选择主要根据待分析物的极性和溶解度的不同 通过各种极性不同 的溶液的配伍构成展开剂 使各组分能在展开过程中有效的分离 3 层析的点样与展开 ①点样 在层析纸或薄层层析板的一端距底边 2cm 处用铅笔轻轻地 画一条线 该线与底边平行 待测样品点在此线上 样品之间的距离不小于 2cm 一般用玻璃毛细 管点样 点样斑点直径最好在 0.2~0.3cm 之间 不得大于 0.5cm 如果为了鉴定 在待测样品斑点 另一侧对称性地点上参考样品 ② 展开 纸层析是将纸吊在层析瓶中进行 薄板层析则在层析缸中进行 展开剂的液面不得碰到 样品斑点 大约浸到点样线下方 1cm 处即可 当展开剂展至层析纸或层析板 60% 80% 的长度时 取出 标记溶剂前沿边界 晾干备测

34 纸层析 聚氨酯薄层层析操作注意事项 纸层析或薄层层析虽然具有高效 简便 快速的特点 但如果层析的条件选择不当 或者操 作方法不正确 会造成较大的偏差 甚至得到错误的结果 因此 应注意如下几个方面 ① 选择确能将所观察的组分区分开来的层析系统 如果所观察的样品组分复杂 一种层析系 统区分有困难 可同时应用 2 3 个层析系统进行展开 例如 99mTc- 抗体的层析分析 (Ⅰ) 85% 的甲醇作展开剂时 99mTc- 抗体和 99mTc 胶体都在原点 只有为标记的 99mTcO4上移至前沿 (Ⅱ) 乙醇 : 水 : 氨水 =2:5:1 v/v 的混合液展开剂时 99mTc- 抗体和 99mTcO4- 都上移 至前沿 因此通过两者的测量结果可准确计算 99mTc- 抗体的标记率 ② 对于高比活度的标记化合物 点样前要加入适量的载体 以减少或防止样品在层析固定相 上的吸附 ③ 点样样时 如果样品的放射性浓度较低 可多次重复点样 但不可用热风吹干 尤其对于 易氧化或易分解的样品 要用氮气吹干

35 纸层析 聚氨酯薄层层析结果测量 1 放射自显影 将层析后的纸或薄板与感光胶片紧贴一起 暴射一定时间后 取出 胶片进行显影和定影 即可在胶片上显示出放射性分布情况 并可进行各组分的半定量 估算 2 分段测量 将层析后的层析纸或薄板 按照等距离的刻度 一般是 cm 从下到上分段剪取或刮取或刮取相应等份进行放射性测量 然后将测量结果对 层析的距离作图 从参考样的位置找出标记物放射性峰的位置 计算标记率 3 放射性扫描 采用放射性薄层扫描仪对层析纸或层析板进行连续放射性测量扫描 能够直接从扫描图上得到各组分的分布图 本法分析速度快 分辨率高 经微机处理可 立即得到结果 但对样品的放射性有一定的活度要求

36 放化纯度鉴定方法 1 高效液相色谱法 2 薄板层析法 3 纸层析法 4 电泳法 第一种方法设备比较贵 耗材也贵 一般在大的研究所内应用 严格意义上的老式薄板层析已经不应用于普通放射化学纯度测定 因为 制板及检测都比较烦杂 电泳法如今看来也显手续繁杂 过程长 不符合简 单 快好的原则

37 FCY 型放射性层析扫描仪 是 放化纯度层析结果检测的最佳选择

38 层析扫描仪开机界面 此界面可进行 层析扫描仪 系统软件的设置工作 如核素和样品参数设置 包括 作人员姓名的输入 相关参数设置等等

39 纸层析法 快速方法 载体 - 纸条 起始点与终点量度与划线

40 确定点样点 起始线之中央

41 点样玻璃毛细管及橡皮吸头

42 点样

43 点样

44 刚刚点完样 未干 可见点样斑点大小及位置

45 已标记起止点 编号并点样待干的纸层析条

46 将点好样并凉干的层析条放在已注入推进剂 的试管 层析缸 中进行层析

47 将已层析到位的层析条放置在扫描样品台上

48 如无层析扫描仪可以将已干燥的层析条从点 样处至推进终止点分成十等分 剪成十等份

49 层析完成的滤纸条处理 将完成层析 干燥后的层析条沿原划线剪 成十份小条 按编号逐个装入测量试管准 备测量

50 将每小段分开放入r测量仪测量每段放射性 CPM

51 将测量结果画至坐标纸上形成放射性 / 区段 曲线 计算标记率 : 高峰区放射性总和 / 总放射性 = 标记率

52 层析扫描仪纸条扫描操作 开始测量 将待测样品试纸条放置于 样品托架槽内 选择 待测核素 样品名称 日期 制作人员 测量方式 行走速度 采样点 扫描长度 等 参数 设置 原点 距离 溶剂前沿 距离 初值 和 终值 等参数 最后点击 测量 按钮进入测量状态

53 层析扫描仪纸层析扫描结果显示

54 99mTc 层析结果图 提示 99mTc 胶体存在

55 关于无菌和热原检查 1 无菌检查 在 中华人民共和国药典 中有详 细介绍和规定 其中最大不足是检测时间 长 所以药典规定该项检测结果报告前产 品可以发放使用 2 热原检查 : 原来以家兔体温升高为指标 但该 方法时间太长 不好操作 为此 1980 年美国药典 推出细菌毒素试验法 很快为各国所接受 3 鲎试剂 厦门产品是菌毒素试验的核心试剂

56 放射化学纯度纸层析测定 纸层析测定方法放射化学纯度检测的最方便 快倢 便宜的 方法 只需要 1 一支大小合适的可封闭的试管 作为 层析缸 2 合适的支持物 滤纸 层析条 目前可以使用 新华 1 号滤纸 3 适合的推进剂 其所需化学试剂一般化学试剂商店都可以买到而 且不贵 4, 操作简单 检测过程短出结果快

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58 纸层析检测放化纯方法举例 一 骨显像标记物 99mTc-MDP(99m- 锝标记亚甲基二膦酸盐 ) 99mTc-MDP 1 标记方法 无菌条件下取 99mTc 淋洗液 4~6ml 注 入 亚锡亚甲基二膦酸盐冻干粉 密封瓶中 充 分震摇 使冻干物溶解 静置 5 分钟即完成标记 99mTc- 锝标记亚甲基二膦酸 2 放射化学纯度规定 该冻干品使用说明书中规 定 本标记物使用前必须进行放射化学纯度测 定 放化纯度应大于 90% 3 放射化学纯度测定

59 99m Tc-MDP 的放射化学纯度纸层析测定 1 取约 1*10cm 新华一号滤纸一条 2 用毛细管取上述标记物适量 点于层析条下端 1 厘米处点样 样品斑不能超 过层析条宽度的 50% 最好是 30%-40% 活度在 个豪居里 3 干燥后 凉 风吹 烤 用生理盐水作展开剂 上行展开一定距离 4 取出置 层析扫描仪 测定台上进行扫描 得出其放射性分布 5 其中 99m- 锝标记亚甲基二膦酸盐 99mTc-MDP 的 Rf 值为 0.7~1.0 高锝酸 (99mTc) 钠和胶体锝 99mTc 的 Rf 值为 0~0.1 99m- 锝标记亚甲基二膦 99mTc-MDP

60 纸层析检测放化纯方法举例 二 心肌血流灌注显像标记物 99m 锝 - 甲氧异晴 99mTc-MIBG 1 取约 1*10cm 新华一号滤纸一条 2 用毛细管取上述标记物适量 点于层析条下端 1 厘米处点样 样品斑不能超 过层析条宽度的 50% 最好是 30%-40% 活度在 个豪居里 3 氯仿 丙酮 氨水 = v/v 作展开剂 上行展开一定距离 3 干燥后 凉 风吹 烤 用生理盐水作展开剂 上行展开一定距离 4 取出置 层析扫描仪 测定台上进行扫描 得出其放射性分布

61 Tc-MIBI 纸层析结果 99m 其中 : - 锝标记甲氧异晴 (99mTc-MIBI) 的 Rf 值为 0.85~1.0 99m 高锝酸 (99mTc) 钠和胶体锝 99mTc 的 Rf 值为 0.6 胶体锝 (99mTc) 的 Rf 值为 0

62 纸层析的其他用途 1 标记化合物的鉴定 2, 标记化合物的制备和纯化的定位指示 制备电泳分离产品 包括羣脂 盘状电泳 的 定位 以便准确切取 这对科研中间产物提起 和认定是一个简单而便宜的手段

63 FCY 型放射性层析扫描仪 还可以用于下述检测结果的扫描测量和相对定量 放射性标记物聚酰胺薄片层析条层析结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物聚酰胺薄片层析片层析结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物聚酰胺薄层层析板层析结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物纸电泳结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物琼脂电泳层析结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物盘状电泳结果扫描及标记物相对定量 放射性标记物柱层析结果扫描及标记物相对定量

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