07-24.FIT)

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2 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 饲 料 添 加 剂 林 娜 妹 李 大 光 舒 绪 刚 微 量 元 素 和 氨 基 酸 都 是 生 物 体 所 必 需 的 重 要 营 养 要 素 袁 微 量 元 素 直 接 或 间 接 地 参 与 机 体 几 乎 所 有 的 生 理 和 生 化 过 程 袁 对 生 物 的 生 命 活 动 起 着 极 其 重 要 的 作 用 袁 而 氨 基 酸 则 是 构 成 蛋 白 质 的 基 本 结 构 单 元 遥 铁 尧 锌 尧 铜 等 微 量 元 素 对 人 体 和 动 物 都 具 有 许 多 重 要 的 作 用 遥 微 量 元 素 产 品 经 历 了 三 个 发 展 阶 段 院 第 一 代 产 品 即 无 机 盐 类 添 加 剂 袁 如 硫 酸 亚 铁 尧 硫 酸 铜 尧 硫 酸 锌 等 曰 第 二 代 产 品 为 一 些 简 单 的 有 机 化 合 物 袁 如 柠 檬 酸 亚 铁 尧 富 马 酸 锌 尧 乳 酸 镁 等 袁 但 以 上 二 类 产 品 均 存 在 吸 收 利 用 率 差 的 缺 陷 袁 微 量 元 素 之 间 存 在 拮 抗 作 用 袁 因 此 不 能 充 分 满 足 动 物 体 生 长 的 需 求 曰 第 三 代 产 品 为 新 型 的 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 袁 由 于 它 具 有 良 好 的 生 物 化 从 而 易 于 被 排 出 体 外 遥 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 可 由 一 种 氨 基 酸 与 某 个 金 属 元 素 制 备 单 一 螯 合 物 袁 也 可 由 一 种 可 溶 性 盐 与 氨 基 酸 可 水 解 蛋 白 质 螯 合 而 成 袁 称 为 金 属 蛋 白 或 复 合 氨 基 酸 螯 合 物 遥 复 合 氨 基 酸 螯 合 物 针 对 性 不 强 袁 含 有 禽 畜 不 缺 乏 尧 不 需 添 加 的 组 分 等 遥 单 一 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 虽 然 成 本 较 高 袁 但 其 针 对 性 强 袁 可 避 免 重 复 添 加 袁 且 添 加 量 少 袁 有 利 于 氨 基 酸 的 平 衡 遥 单 一 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 制 备 方 法 较 多, 传 统 方 法 为 液 相 法 袁 该 法 比 较 成 熟 袁 近 几 年 也 出 现 了 微 波 固 相 合 成 法 遥 本 文 主 要 介 绍 液 相 法 尧 微 波 固 相 合 成 法 和 室 温 固 相 合 成 法 制 备 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 遥 学 稳 定 性 袁 易 为 动 物 体 所 吸 收 袁 无 毒 副 作 用 袁 且 生 物 学 效 价 明 显 高 于 无 机 态 矿 物 盐 遥 1 液 相 法 制 备 氨 基 酸 螯 合 物 液 相 法 制 备 氨 基 酸 螯 合 物 的 工 艺 大 致 为 院 氨 基 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 是 以 二 价 阳 离 子 与 给 电 子 体 的 氨 基 酸 形 成 配 位 键 袁 同 时 又 与 给 电 子 体 的 羰 基 酸 溶 解 加 金 属 盐 调 节 ph 值, 加 热 螯 合 物 加 有 机 溶 剂 沉 淀 分 离 干 燥 产 品 遥 中 的 氧 构 成 离 子 键 形 成 五 元 环 或 六 元 环 袁 一 般 琢 原 氨 基 酸 的 螯 合 物 为 五 元 环 袁 茁 氨 基 酸 能 形 成 六 元 环 遥 微 1.1 氨 基 酸 亚 铁 的 合 成 在 接 触 空 气 的 水 溶 液 中 袁 Fe 3 和 Fe 2 的 存 在 状 态 量 元 素 与 氨 基 酸 之 间 形 成 的 两 种 键 使 该 化 合 物 构 成 五 元 环 或 六 元 环 袁 是 化 学 稳 定 性 和 生 化 稳 定 性 很 好 的 螯 合 物 遥 螯 合 物 中 的 二 价 阳 离 子 袁 如 铁 尧 铜 尧 锰 尧 锌 尧 钴 等 均 属 过 渡 元 素 袁 且 已 确 认 是 动 物 必 需 的 微 量 元 素 袁 由 于 过 渡 金 属 元 素 电 子 结 构 的 物 化 性 质 常 会 与 富 含 电 子 对 的 氧 尧 氮 或 硫 原 子 配 对 形 成 同 时 具 有 离 子 键 和 配 位 键 的 螯 合 物 袁 而 在 必 需 氨 基 酸 中 的 中 性 氨 基 酸 分 子 中 袁 又 有 氧 尧 氮 尧 硫 原 子 为 构 成 螯 合 物 提 供 电 子 遥 微 量 元 素 与 氨 基 酸 结 合 的 螯 合 物 袁 这 种 结 构 使 分 子 电 荷 趋 于 中 性 袁 在 体 内 ph 值 环 境 下 微 量 元 素 的 溶 解 度 提 高 袁 吸 收 率 增 加 袁 生 物 利 用 率 提 高 袁 并 阻 止 螯 合 物 中 的 微 量 元 素 与 其 它 物 质 形 成 不 溶 或 难 溶 的 金 属 化 合 物 袁 由 氧 化 还 原 电 位 和 ph 值 共 同 决 定 遥 在 酸 性 很 强 的 溶 液 中 袁 Fe 2 不 易 氧 化 袁 而 当 ph 值 >2 时 袁 随 着 ph 值 升 高 袁 Fe 2 氧 化 趋 势 增 加 曰 当 ph 值 抑 4 时 袁 Fe 2 氧 化 趋 势 因 其 氧 化 产 物 为 氢 氧 化 铁 而 急 剧 增 强 遥 Fe 2 在 水 溶 液 中 接 触 空 气 时 的 自 氧 化 速 度 与 OH 浓 度 平 方 成 正 比 袁 碱 性 越 强 袁 氧 化 越 快 曰 在 ph 值 >6 时 袁 天 然 水 中 的 Fe 2 迅 速 氧 化 成 Fe 3 而 沉 淀 遥 赵 惠 敏 等 将 氨 基 乙 酸 溶 解 在 蒸 馏 水 中 袁 在 搅 拌 状 况 下 缓 慢 加 入 一 定 量 的 FeSO 4 窑 7H 2 O 固 体 粉 末 袁 溶 解 后 用 0.1 mol/l NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 7 左 右 袁 在 水 浴 上 加 热 并 浓 缩 袁 静 置 袁 分 离 出 沉 淀 物 袁 干 燥 粉 碎 袁 最 后 制 得 褐 色 粉 末 样 品 遥 林 萍 等 将 甘 氨 酸 溶 解 后 经 水 浴 加 热 至 50 益 恒 温 袁 待 甘 氨 酸 完 全 溶 解 后 加 入 复 合 抗 氧 化 剂 袁 同 时 充 氮 气 使 溶 液 处 于 无 氧 状 态 袁 加 入 一 定 林 娜 妹, 广 东 工 业 大 学 轻 工 化 工 学 院,510006, 广 州 市 番 禺 区 广 州 大 学 城 外 环 西 路 100 号 李 大 光, 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一 作 者 舒 绪 刚, 广 州 天 科 生 物 科 技 有 限 公 司 收 稿 日 期 : 量 的 氯 化 亚 铁 袁 用 40% 氢 氧 化 钠 溶 液 调 ph 值 至 5.5 袁 反 应 后 乙 醇 洗 涤 沉 淀 物 数 次 后 干 燥 得 产 品 遥 采 用 有 机 溶 剂 沉 淀 法 时 氯 化 亚 铁 能 完 全 溶 于 乙 醇 中 袁 并 且 该 实 验 研 究 表 明 三 氯 化 铁 也 能 溶 于 乙 醇 遥 这 样 袁 就 可 以 利 用 乙 醇 处 理 反 应 液 袁 将 游 离 的 Fe 2 或 Fe 3 溶 解 在 乙 醇 绎 广 州 市 科 技 成 果 重 点 推 广 项 目 (2007CE3G0091) 广 东 省 自 然 科 学 基 金 团 队 项 目 ( ) 中 袁 而 螯 合 铁 在 乙 醇 中 沉 淀 析 出 遥 因 此 用 氯 化 亚 铁 做 铁 源 袁 可 以 实 现 有 机 铁 和 无 机 铁 的 分 离 袁 提 高 产 品 的 2

3 饲 料 添 加 剂 林 娜 妹 等 : 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 制 备 方 法 研 究 进 展 纯 度 遥 林 萍 又 尝 试 了 氢 氧 化 钙 沉 淀 法 袁 以 硫 酸 亚 铁 为 铁 源 袁 用 氢 氧 化 钙 中 和 来 制 备 甘 氨 酸 螯 合 铁 遥 加 入 氢 氧 化 钙 调 节 反 应 ph 值 时 袁 溶 液 中 钙 离 子 与 硫 酸 根 结 合 生 成 硫 酸 钙 沉 淀 袁 可 以 脱 除 部 分 的 硫 酸 根 袁 这 是 去 除 产 品 中 硫 酸 根 的 好 办 法 遥 Gingasu 等 将 摩 尔 比 为 2 1 的 Fe (NO 3 ) 3 窑 9H 2 O 和 Cu(NO 3 ) 窑 2 3H 2 O 溶 解 在 水 中, 然 后 加 入 甘 氨 酸 [2Fe(NO 3 ) 3 1Cu(NO 3 ) 2 mgly,m=8 或 4.5] 遥 当 m=8 时 得 [Fe(III) 2 Cu(II) (NH 2 CH 2 COO) 4 (OH) 3 ](NO 3 ) 窑 H 2 O 曰 当 m=4.5 时 得 [Fe(III) 2 Cu(II)(NH 2 CH 2 COO) 6 (NH 2 CH 2 COOH) 2 ](NO 3 ) 2 遥 Agristudi 1.2 氨 基 酸 锌 的 合 成 钟 国 清 将 甘 氨 酸 渊 Gly 冤 溶 于 水 中 袁 加 入 碱 式 碳 酸 等 采 用 一 步 法 制 备 了 [CH 3 SCH 2 CH 2 CH(OH)COO] 2 M 窑 nh 2 O 渊 M=Ca 2 尧 Mg 2 尧 Mn 2 尧 Co 2 尧 Cu 2 尧 Zn 2 冤 遥 Giovanni Predieri 锌 袁 95 益 温 度 下 加 热 搅 拌 反 应 8h, 趁 热 过 滤, 滤 液 于 水 浴 上 缓 慢 加 热 浓 缩 至 晶 膜 出 现, 冷 却, 析 出 大 量 白 色 晶 体, 抽 滤, 用 乙 醇 洗 涤, 晶 体 于 P 2 O 5 干 燥 器 中 干 燥 1 周 袁 得 到 甘 氨 酸 锌 遥 用 元 素 分 析 尧 红 外 光 谱 尧 热 重 差 热 分 析 尧 X 射 线 粉 末 衍 射 对 螯 合 物 进 行 了 表 征 分 析, 其 组 成 为 Zn(NH 2 CH 2 COO) 2 窑 H 2 O[Zn(Gly) 2 窑 H 2 O] 遥 于 桂 生 采 用 了 两 种 方 法 制 备 了 蛋 氨 酸 锌 袁 一 种 方 法 是 按 锌 与 蛋 氨 酸 物 质 的 量 比 为 1 2 袁 称 取 七 水 硫 酸 锌 和 蛋 氨 酸 置 于 三 颈 瓶 中 用 蒸 馏 水 溶 解 袁 加 入 氢 氧 化 钠 溶 液 袁 调 节 体 系 的 ph 值 在 6 耀 7 之 间 袁 三 颈 瓶 的 一 口 装 一 个 盛 有 氢 氧 化 钠 溶 液 的 滴 液 漏 斗 袁 另 一 口 装 上 球 型 冷 凝 等 制 备 了 [CH 3 SCH 2 CH 2 CH(OH)COO] 2 Fe 窑 2H 2 O 遥 A.Stanila 等 将 2mmol 的 蛋 氨 酸 (L 1 ) 或 丙 氨 酸 (L 2 ) 溶 解 后 加 入 到 蒸 馏 水 中, 蛋 氨 酸 需 缓 慢 加 热 使 其 溶 解, 加 入 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 8 耀 10, 另 将 1mmol Cu(NO 3 ) 2 窑 3H 2 O 溶 解 后 加 入 其 中 袁 搅 拌 几 分 钟 后 过 滤 沉 淀 袁 水 洗 后 自 然 干 燥 [CuL 1 ] 窑 H 2 O[CuL 2 ] 窑 H 2 O 遥 P.Arranz 等 按 配 位 比 1 1 和 1 4 渊 金 属 / 配 体 冤 合 成 了 Zn(L) 2 (H 2 O) 4 窑 6H 2 O 和 {Cd( 滋 L)Cl(H 2 O) 2 ] 窑 H 2 O} n [L 为 N2(4amino1,6dihy 鄄 dro1methyl5nitroso6oxopyrimidinyl)glycine] 遥 1 1 比 率 形 成 的 配 合 物 间 的 作 用 力 比 较 弱, 实 验 表 明 1 4 配 比 比 较 合 适 遥 管 袁 加 热 回 流 遥 在 反 应 过 程 中 以 适 当 的 速 度 滴 加 氢 氧 化 钠 溶 液 以 保 持 体 系 的 ph 值 在 6 耀 7 之 间 袁 回 流 1h 1.4 液 相 法 制 备 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 工 艺 条 件 氨 基 酸 配 体 与 金 属 离 子 的 摩 尔 比 即 投 料 比 袁 是 影 后 袁 螯 合 反 应 完 成 曰 停 止 加 热 尧 冷 却 袁 使 结 晶 析 出 袁 抽 滤 袁 母 液 转 入 烧 杯 中 袁 蒸 发 掉 部 分 溶 剂 袁 冷 却 袁 滤 集 析 出 的 晶 体 遥 另 一 种 方 法 是 在 烧 杯 中 加 入 水 袁 加 热 至 沸 腾 袁 缓 缓 加 入 蛋 氨 酸 袁 并 加 入 盐 酸 溶 液 袁 加 热 至 蛋 氨 酸 全 部 溶 解 袁 溶 液 呈 透 明 淡 黄 色 遥 在 不 断 搅 拌 情 况 下 袁 加 热 维 持 温 度 在 70 耀 80 益 之 间 袁 将 Zn 渊 OH 冤 2 缓 慢 加 到 蛋 氨 酸 溶 液 中 袁 继 续 搅 拌 反 应 40 min 遥 冷 却 尧 过 滤 袁 用 水 2 洗 涤 至 滤 液 中 无 SO 4 时 袁 再 用 无 水 乙 醇 洗 涤 一 次 袁 将 产 品 移 至 表 面 皿 上 袁 于 114 益 烘 干 袁 得 白 色 产 物 蛋 氨 酸 锌 遥 响 螯 合 反 应 的 重 要 因 素 遥 理 论 上 讲 袁 配 位 比 太 小 则 螯 合 程 度 不 高 袁 不 能 形 成 稳 定 的 螯 合 物 曰 配 位 比 太 大 则 螯 合 物 稳 定 性 过 高 袁 微 量 元 素 难 以 被 生 物 体 吸 收 利 用 袁 同 时 也 会 造 成 氨 基 酸 的 浪 费 袁 经 济 上 不 划 算 遥 故 要 求 螯 合 反 应 既 能 达 到 一 定 程 度 的 最 小 配 位 比 以 保 证 产 品 质 量 袁 又 要 能 充 分 利 用 氨 基 酸 遥 根 据 文 献 可 知 一 般 最 佳 配 位 比 为 2 1 遥 螯 合 反 应 受 酸 度 条 件 的 影 响 较 大 袁 在 ph 值 较 低 的 酸 性 条 件 下 袁 由 于 酸 效 应 的 影 响 袁 氨 基 酸 难 以 解 离 袁 不 能 同 金 属 离 子 配 位 形 成 稳 定 的 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 1.3 其 它 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 合 成 Daver M 等 在 热 的 氨 基 酸 水 溶 液 (60~70 益 ) 中 加 合 物 曰 而 在 ph 值 较 高 的 碱 性 条 件 下 袁 金 属 离 子 则 会 发 生 水 解 袁 以 氢 氧 化 物 的 形 式 沉 淀 析 出 遥 一 般 情 况 下 ph 入 5 水 杨 醛 硫 酸 钠 或 3 甲 氧 基 5 水 杨 醛 硫 酸 钠, 搅 拌 30 min 后 逐 滴 加 入 Zn(Ac) 2, 同 时 用 0.5 mol/dm 3 的 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 7, 在 60~70 益 温 度 下 搅 拌 1h 后, 在 室 温 下 冷 凝 1 夜 遥 将 白 色 沉 淀 物 过 滤 后 用 乙 醇 或 乙 二 醚 洗 涤, 自 然 干 燥 得 到 氨 基 酸 席 夫 碱 遥 O.Versiane 等 将 3mmol 的 胍 基 醋 酸 (GAA) 和 3mmol 的 甘 氨 酸 或 丝 氨 酸 值 控 制 在 6 耀 7 遥 氨 基 酸 与 金 属 离 子 的 螯 合 反 应 为 吸 热 反 应 袁 反 应 温 度 越 高 对 反 应 越 有 利 袁 但 若 反 应 温 度 太 高 袁 反 应 时 间 过 短 将 导 致 反 应 不 彻 底 袁 且 温 度 太 高 容 易 破 坏 氨 基 酸 及 其 螯 合 物 曰 若 反 应 温 度 太 低 袁 则 螯 合 反 应 速 度 较 慢 袁 收 率 较 低 遥 一 般 温 度 控 制 在 70 耀 80 益 遥 (Ser) 溶 解 在 去 离 子 水 中, 在 60 益 温 度 下 搅 拌 直 到 完 全 溶 解, 再 加 入 3mmol 的 硝 酸 铜 遥 在 60 益 温 度 下 搅 拌 8h 2 微 波 固 相 法 制 备 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 利 用 微 波 技 术 加 热 化 学 物 质 进 行 反 应 袁 其 速 度 较 后 在 4 益 冷 却 24 h, 过 滤 后 用 KOH 调 节 滤 液 的 ph 值 为 4.3, 缓 慢 蒸 发 得 到 蓝 色 晶 体, 用 乙 醇 洗 涤 后 在 50 益 下 干 燥 2h, 最 后 得 CuGlymGAA 和 CuSermGAA 遥 Dana 传 统 加 热 技 术 快 数 倍 乃 至 数 千 倍 遥 正 是 基 于 这 种 原 因 袁 微 波 加 速 有 机 化 学 反 应 引 起 了 广 泛 的 关 注 遥 微 波 固 相 法 制 备 氨 基 酸 螯 合 物 的 制 备 工 艺 大 致 是 将 反 应 3

4 林 娜 妹 等 : 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 制 备 方 法 研 究 进 展 饲 料 添 加 剂 物 充 分 混 合 后 将 混 合 物 放 进 试 管 袁 用 微 量 进 样 器 加 入 引 发 剂 渊 一 般 为 水 尧 乙 醇 等 冤 袁 然 后 进 行 微 波 催 化 合 成 袁 反 应 后 进 行 洗 涤 干 燥 遥 充 分 接 触 袁 接 着 发 生 键 的 断 裂 和 重 组 等 化 学 作 用 袁 生 成 新 的 产 物 分 子 遥 产 物 分 子 分 散 在 原 反 应 物 中 袁 当 积 累 到 一 定 大 小 后 袁 出 现 产 物 的 晶 核 袁 随 着 晶 核 的 长 大 袁 2.1 各 种 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 合 成 钟 国 清 以 甘 氨 酸 和 氧 化 钙 为 原 料 袁 用 微 波 固 相 化 达 到 一 定 大 小 后 出 现 产 物 的 独 立 晶 体 袁 即 固 相 反 应 经 历 扩 散 尧 反 应 尧 成 核 尧 生 长 4 个 阶 段 遥 学 法 合 成 了 甘 氨 酸 钙 螯 合 物 袁 并 用 化 学 元 素 分 析 尧 IR 尧 TGDTA 尧 X 射 线 粉 末 衍 射 对 螯 合 物 进 行 了 表 征 袁 确 认 其 组 成 为 [Ca 渊 Gly 冤 2] 窑 H 2 O 遥 李 亮 等 以 硫 酸 亚 铁 尧 蛋 氨 酸 渊 Met 冤 为 原 料 对 食 品 营 养 强 化 剂 蛋 氨 酸 亚 铁 螯 合 物 的 微 波 固 相 合 成 进 行 了 研 究 遥 确 定 最 佳 反 应 条 件 为 : 配 位 摩 尔 比 2 1 尧 微 波 辐 射 时 间 180 s 尧 引 发 剂 渊 水 冤 添 加 量 14% 尧 反 应 物 粒 度 140 目 尧 吸 附 剂 添 加 量 14% 袁 用 乙 醇 提 取 纯 化 螯 合 物 遥 经 化 学 元 素 分 析 尧 红 外 光 谱 分 析 表 征 产 物, 确 定 蛋 氨 酸 亚 铁 螯 合 物 的 组 成 为 FeMet 2 窑 H 2 O 遥 安 徽 农 业 大 学 饲 料 科 学 技 术 研 究 所 用 乙 酸 锌 和 蛋 氨 酸 合 成 了 白 色 的 蛋 氨 酸 锌 遥 胡 亮 等 以 氯 化 锌 和 蛋 氨 酸 为 原 料 袁 利 用 微 波 固 相 的 方 式 合 成 了 蛋 氨 酸 锌 螯 合 物 袁 确 定 了 最 佳 反 应 条 件 为 院 配 体 摩 尔 比 2 1 尧 微 波 加 热 时 间 240 s 尧 引 发 剂 ( 水 ) 添 加 量 12% 尧 反 应 物 粒 度 140 目 尧 碳 酸 钠 添 加 量 20%, 经 红 外 光 谱 分 析 和 元 素 分 析, 确 定 蛋 氨 酸 锌 的 组 成 为 Zn(Met) 2 遥 Dana Gingasu 等 将 配 比 为 2Fe(NO 3 ) 3 1Cu(NO 3 ) Gly 的 原 料 混 合 在 研 钵 中 研 磨 直 到 均 匀 尧 粘 稠 的 溶 液 形 成, 然 后 放 在 P 2 O 5 中 干 燥,48 h 后 得 到 [Fe(III) 2 Cu(II)(NH 2 CH 2 COO) 6 (NH 2 CH 2 COOH) 2 ](NO 3 ) 2 和 [Fe(III) 2 Cu(II)(NH 2 CH 2 COO) 4.5 ](NO 3 ) 窑 8 4H 2 O 遥 P.Arranz 等 按 配 位 比 1 1 合 成 了 [Zn(L) 2 (H 2 O) 窑 4 6H 2 O 和 {Cd( 滋 L)Cl(H 2 O) 2 ] 窑 H 2 O} n 遥 王 莉 等 以 醋 酸 铜 和 甘 氨 酸 为 原 料, 利 用 一 步 室 温 固 相 化 学 反 应 合 成 了 分 布 均 匀 尧 粒 径 20 耀 30 nm 的 金 属 配 合 物 trans[cu(gly) 2 窑 (H 2 O)] 球 形 的 纳 米 粒 子, 在 该 反 应 基 础 上, 通 过 在 体 系 中 添 加 适 当 表 面 活 性 剂 做 软 模 板, 成 功 制 备 了 直 径 100 耀 150 nm 袁 长 度 达 几 个 微 米 的 trans[cu 渊 Gly 冤 2] 纳 米 棒 遥 朱 妙 琴 将 摩 尔 比 为 2 1 的 甘 氨 酸 和 醋 酸 铜 晶 体 在 室 温 下 混 置 于 研 钵 中 研 磨 60 min 后 得 到 了 甘 氨 酸 铜 遥 室 温 下 袁 充 分 的 研 磨 不 仅 使 反 应 的 固 体 颗 粒 变 小 以 充 分 接 触 遥 室 温 固 相 反 应 主 要 跟 固 体 的 表 面 积 尧 反 2.2 微 波 固 相 法 合 成 氨 基 酸 微 量 元 素 的 工 艺 条 件 应 物 的 组 成 和 结 构 等 因 素 有 关 遥 配 体 摩 尔 比 对 螯 合 率 的 影 响 同 液 相 法 相 似 遥 在 一 定 的 微 波 输 出 功 率 下, 微 波 辐 射 时 间 是 影 响 反 应 螯 合 4 结 论 与 展 望 传 统 的 液 相 法 制 备 微 量 元 素 氨 基 酸 螯 合 物 存 在 率 的 重 要 因 素 遥 辐 射 时 间 太 短 袁 则 螯 合 不 完 全 曰 辐 射 时 间 太 长, 螯 合 率 也 会 下 降, 可 能 是 由 于 微 波 处 理 时 间 过 长 造 成 反 应 体 系 温 度 过 高, 积 累 的 热 量 无 法 快 速 释 放, 导 致 产 物 分 解 的 缘 故 遥 一 般 物 质 对 微 波 吸 收 能 力 主 要 是 由 介 电 常 数 和 介 质 损 耗 角 正 切 来 决 定 的 遥 为 了 更 好 地 吸 收 微 波, 引 发 反 应, 需 要 加 入 微 量 引 发 剂 来 加 速 反 应, 且 适 量 的 引 发 剂 可 以 避 免 产 物 的 焦 糊 尧 分 解, 有 利 于 反 应 的 进 行 遥 从 理 论 上 讲, 反 应 物 的 颗 粒 越 小, 越 能 增 加 不 同 物 质 间 的 接 触 频 率, 提 高 反 应 的 螯 合 率 遥 但 是, 太 小 的 颗 粒 度 会 增 加 原 料 的 加 工 时 间 和 成 本 遥 固 相 反 应 物 的 表 面 接 触 程 度 尧 反 应 产 物 表 面 晶 核 形 成 速 度 尧 反 应 产 物 表 面 晶 核 更 新 速 度 是 决 定 固 相 反 应 速 度 的 三 大 因 素 遥 在 反 应 物 中 加 入 的 碱 是 作 为 脱 酸 剂, 能 迅 速 中 和 反 应 过 程 中 产 生 的 副 产 物 要 酸, 调 节 反 应 体 系 的 酸 碱 度, 促 进 反 应 向 正 方 向 进 行 遥 加 碱 量 合 成 时 间 长 尧 成 本 高 尧 需 要 大 量 的 碱 液 中 和 螯 合 产 生 的 氢 离 子 尧 生 成 大 量 盐 类 等 副 产 物 尧 存 在 废 液 污 染 尧 纯 化 工 艺 复 杂 等 缺 点 遥 微 波 作 为 一 种 电 磁 波 袁 能 高 速 促 使 分 子 极 化 旋 转 袁 增 加 反 应 物 分 子 的 碰 撞 频 率 遥 微 波 加 热 的 非 传 导 性 加 热 效 应 袁 可 以 加 速 化 学 反 应 的 进 行 遥 采 用 微 波 法 固 相 合 成 螯 合 物 袁 可 提 高 化 学 反 应 速 度 尧 减 少 能 耗 尧 简 化 工 艺 并 降 低 废 液 排 放 和 环 境 污 染 遥 但 微 波 辐 射 存 在 易 焦 化 副 产 品 的 问 题 袁 而 且 实 际 工 业 生 产 时 采 用 微 波 进 行 辐 射 也 不 方 便 遥 室 温 固 相 合 成 是 新 兴 的 合 成 方 法 袁 比 起 微 波 辐 射 可 以 简 化 工 艺 遥 固 相 反 应 不 仅 不 使 用 溶 剂 袁 可 以 减 少 对 环 境 的 污 染 袁 而 且 反 应 选 择 性 高 袁 副 反 应 少 袁 所 以 可 以 尝 试 用 此 方 法 进 行 合 成 遥 但 目 前 对 室 温 固 相 合 成 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 的 研 究 比 较 少 遥 不 是 越 多 越 好, 而 应 根 据 实 验 的 具 体 情 况 而 确 定 遥 3 室 温 固 相 合 成 氨 基 酸 微 量 元 素 螯 合 物 ( 参 考 文 献 39 篇, 刊 略, 需 者 可 函 索 ) 室 温 固 固 反 应 的 发 生 起 始 于 两 个 反 应 物 分 子 的 ( 编 辑 : 王 芳,xfang2005@163.com) 4

5 饲 料 添 加 剂 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 概 况 朱 将 伟 按 照 美 国 食 品 药 物 管 理 局 (FDA) 定 义 袁 所 谓 抗 氧 化 剂 是 指 作 为 延 滞 因 氧 化 所 引 起 的 劣 变 尧 酸 败 或 变 色 [1] 的 物 质 遥 食 物 的 氧 化 腐 败 往 往 引 起 风 味 变 化 尧 营 养 价 值 下 降 尧 毒 性 物 质 的 产 生 遥 抗 氧 化 剂 可 保 护 食 物 的 色 尧 香 尧 味 袁 避 免 维 生 素 等 营 养 素 的 损 失 袁 抗 氧 化 剂 一 般 可 分 为 油 溶 性 和 水 溶 性 两 类 袁 油 溶 性 包 括 天 然 的 VE 和 人 工 合 成 的 没 食 子 酸 丙 酯 (PG) 尧 抗 坏 血 酸 酯 类 尧 丁 羟 基 茴 香 醚 (BHA) 尧 二 丁 基 羟 基 甲 苯 (BHT) 等 曰 水 溶 性 包 括 VC 尧 异 VC 及 其 盐 类 尧 植 酸 尧 苯 多 酚 等 遥 目 前 食 品 工 业 主 要 使 用 人 工 合 成 抗 氧 化 剂 BHA 和 BHT [2], 它 们 的 抗 氧 化 性 能 良 好 袁 但 化 学 合 成 抗 氧 化 剂 的 安 全 性 一 直 是 十 分 敏 感 的 问 题 袁 动 物 试 验 表 明 袁 用 BHT 及 其 代 谢 产 物 BHT 原 OOH 尧 BHT 原 OH 尧 DBQ 和 BHT 原 SCH3 注 射 到 雄 性 幼 鼠 腹 膜 内 袁 会 使 鼠 肺 细 胞 增 生 尧 肺 组 织 增 重 遥 在 日 本 袁 BHA 只 能 用 于 棕 榈 油 和 棕 榈 仁 油 抗 氧 化 作 用 曰 美 国 尧 欧 共 体 等 国 已 禁 止 使 用 合 成 抗 氧 化 剂 遥 许 多 国 家 对 其 添 加 量 已 加 以 严 格 限 制 袁 叶 FAO/WHO 食 品 标 [3] 准 法 典 曳 明 确 规 定 了 合 成 抗 氧 化 剂 的 添 加 量 遥 以 具 有 安 全 性 高 尧 抗 氧 化 能 力 强 尧 无 副 作 用 尧 防 腐 保 鲜 等 特 点 的 天 然 食 物 抗 氧 化 剂 日 益 受 到 重 视 遥 为 了 满 足 食 品 以 及 饲 料 渊 宠 物 食 品 冤 生 产 的 需 要 袁 研 究 开 发 广 谱 尧 高 效 尧 安 全 的 天 然 抗 氧 化 剂 已 经 成 为 食 品 添 加 剂 研 究 领 域 中 的 热 点 遥 目 前 袁 世 界 各 国 开 发 的 大 量 天 然 抗 氧 化 剂 产 品 袁 受 到 了 人 们 的 普 遍 关 注 遥 臭 冤 的 功 能 性 食 品 添 加 剂 遥 甘 草 的 提 取 物 甘 草 甜 素 能 抑 制 肝 中 单 纯 疤 疹 型 病 毒 糖 蛋 白 的 合 成 袁 甘 草 皂 甙 能 促 进 胆 固 醇 排 泄 遥 甘 草 抗 氧 化 物 具 有 较 强 的 清 除 自 由 基 袁 尤 其 是 氧 自 由 基 的 作 用, 可 抑 制 油 脂 的 酸 败, 并 对 [4] 生 成 油 脂 过 氧 化 终 产 物 丙 二 醛 有 明 显 的 抑 制 作 用 遥 阿 魏 尧 川 芎 尧 根 荭 等 植 物 中 所 含 的 阿 魏 酸 具 有 抗 氧 化 作 用 袁 其 苯 环 上 的 羟 基 是 抗 氧 化 的 活 性 基 团 袁 可 消 除 自 由 基 袁 抑 制 氧 化 反 应 和 自 由 基 反 应 遥 阿 魏 酸 钠 还 能 抑 制 OH 诱 导 的 脂 质 过 氧 化 反 应 袁 保 护 生 物 膜 的 结 构 和 功 能 遥 人 参 茎 根 尧 三 七 根 等 植 物 中 提 取 的 天 然 化 合 物 人 参 皂 甙 Rb1 具 有 显 著 的 抗 脂 质 过 氧 化 作 用 袁 它 不 但 可 以 直 接 消 除 自 由 基 袁 还 可 通 过 间 接 过 程 消 除 自 由 基 遥 马 希 汉 等 的 研 究 表 明 袁 银 杏 叶 的 石 油 醚 乙 醇 提 取 物 具 有 抗 氧 化 活 性 袁 特 别 是 对 猪 油 的 抗 氧 化 效 果 可 以 与 BHT 媲 美 遥 孟 洁 等 对 厚 朴 进 行 了 抗 氧 化 作 用 研 究 袁 结 果 表 明 袁 不 同 溶 剂 的 厚 朴 提 取 物 对 DPPH 自 由 基 均 有 清 除 作 用 袁 其 中 以 乙 醇 提 取 物 的 清 除 能 力 最 强 袁 厚 朴 乙 醇 提 取 物 对 亚 油 酸 尧 猪 油 的 脂 质 过 氧 化 有 [5] 良 好 的 阻 断 作 用 遥 Kim 等 对 180 种 中 草 药 的 甲 醇 提 取 物 的 抗 氧 化 作 用 进 行 筛 选 袁 发 现 乌 附 子 尧 白 屈 菜 尧 细 辛 等 11 味 中 药 具 有 极 强 的 抗 氧 化 能 力 袁 其 中 淫 羊 藿 尧 丁 香 尧 补 骨 脂 是 不 同 极 性 的 提 取 物 袁 黄 芩 尧 甘 草 的 甲 醇 提 取 物 抗 氧 1 天 然 抗 氧 化 剂 的 来 源 化 性 能 最 为 突 出 遥 补 骨 脂 的 甲 醇 提 取 物 对 猪 油 的 抗 氧 1.1 中 草 药 提 取 物 近 年 来 袁 国 内 一 些 研 究 报 告 指 出 袁 甘 草 尧 阿 魏 尧 红 化 性 良 好,HPLC 的 分 析 表 明 袁 其 中 含 有 大 量 的 VE [6] 遥 Su 等 人 用 乙 醇 提 取 195 种 中 草 药 的 研 究 表 明 袁 其 中 参 尧 当 归 尧 生 地 尧 酸 枣 仁 尧 银 杏 等 中 草 药 及 其 成 分 均 有 抗 脂 质 过 氧 化 作 用 袁 能 有 效 抑 制 丙 二 醛 渊 油 脂 过 氧 化 终 产 物 冤 的 生 成 遥 22 种 强 于 等 重 量 的 VE 的 抗 氧 化 能 力 袁 金 锦 香 尧 石 榴 皮 尧 马 鞭 草 的 甲 醇 提 取 物 和 金 锦 香 尧 三 七 草 尧 芡 实 尧 钩 藤 的 乙 酸 乙 酯 提 取 物 的 抗 氧 化 能 力 均 强 于 BHA 遥 从 甘 草 中 提 取 的 抗 氧 化 成 分 袁 是 一 种 既 可 增 甜 调 味 尧 抗 氧 化 袁 又 具 有 生 理 活 性 渊 能 抑 菌 尧 消 炎 尧 解 毒 尧 除 1.2 辛 香 料 提 取 物 香 辛 料 植 物 是 天 然 植 物 抗 氧 化 剂 的 重 要 来 源 袁 这 类 植 物 主 要 有 迷 迭 香 尧 鼠 尾 草 尧 百 里 香 尧 牛 至 草 尧 丁 香 尧 薄 荷 尧 胡 椒 尧 生 姜 尧 芝 麻 尧 大 蒜 等 遥 国 内 外 对 辛 香 料 植 物 朱 将 伟, 上 海 市 南 汇 农 技 中 心,201300, 上 海 收 稿 日 期 : 的 抗 氧 化 功 能 均 有 大 量 报 道 遥 Chipult 等 渊 1951 冤 报 道 袁 迷 迭 香 和 鼠 尾 草 具 有 较 好 5

6 朱 将 伟 : 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 概 况 饲 料 添 加 剂 的 抗 氧 化 能 力 遥 Inatani 等 渊 1982 耀 1984 冤 从 迷 迭 香 干 叶 的 正 己 烷 提 取 物 中 分 离 得 到 3 种 酚 系 二 萜 化 合 物 院 迷 迭 香 酚 尧 表 迷 迭 香 酚 和 异 迷 迭 香 酚 袁 它 们 对 猪 油 和 亚 油 酸 都 有 很 强 的 抗 氧 化 能 力 袁 尤 其 对 猪 油 的 抗 氧 化 能 力 是 BHA 和 BHT 的 4 倍 遥 唇 形 科 百 里 香 的 精 油 中 含 有 百 里 香 酚 和 香 芹 酚 等 抗 氧 化 成 分 遥 Yayoh 等 从 百 里 香 的 丙 酮 提 取 物 中 分 离 得 到 6 种 黄 酮 类 物 质 及 5 种 联 苯 化 合 物 袁 发 现 3 种 黄 酮 类 化 合 物 和 2 种 联 苯 化 合 物 的 抗 氧 化 能 力 与 BHT 相 当 遥 唇 形 科 牛 至 草 的 正 己 烷 或 乙 醚 提 取 物 对 猪 油 的 抗 氧 化 能 力 与 BHA 相 当 曰 大 蒜 中 含 有 多 种 烯 丙 基 化 合 物 袁 有 一 定 的 抗 氧 化 活 [7] 性 遥 Lee 等 研 究 指 出 袁 胡 椒 类 黄 酮 尧 亲 脂 酚 类 和 其 它 非 极 性 化 合 物 具 有 抗 氧 化 活 性 袁 其 中 毛 地 黄 黄 酮 (3,4,5,7 四 羟 基 黄 酮 ) 抗 氧 化 能 力 最 强 袁 这 种 强 抗 氧 化 活 性 归 因 于 芳 香 环 上 的 邻 苯 羟 基 遥 Kikuzaki 等 从 生 姜 申 鸿 等 研 究 表 明 袁 葡 萄 籽 和 葡 萄 皮 水 提 物 对 羟 基 及 DPPH 自 由 基 均 有 较 强 的 清 除 作 用 遥 国 外 对 葡 萄 提 取 物 的 抗 氧 化 性 研 究 及 应 用 十 分 活 跃 袁 法 国 等 不 少 国 家 已 将 葡 萄 籽 作 为 原 料 制 备 葡 萄 籽 提 取 物 袁 并 将 其 加 入 到 红 葡 萄 酒 中 袁 以 提 高 其 抗 氧 化 活 性 物 质 含 量 及 葡 萄 酒 的 品 质 遥 张 立 新 等 对 21 种 蔬 菜 抗 氧 化 能 力 的 比 较 研 究 中 发 现 袁 茄 子 ( 尤 其 是 茄 子 皮 ) 尧 苔 菜 尧 菜 椒 尧 西 红 柿 [11] 对 DPPH 的 抑 制 率 较 高 袁 具 有 较 高 的 抗 氧 化 活 性 遥 钱 明 赛 在 测 试 的 11 种 水 果 中 发 现 袁 草 莓 的 抗 氧 化 性 最 高 袁 其 次 是 李 子 尧 柳 橙 等 遥 郭 长 江 对 坚 果 类 食 物 清 除 ROO 窑 作 用 的 研 究 发 现 袁 葵 花 籽 具 有 较 强 的 清 除 ROO 窑 作 用 袁 花 生 尧 核 桃 次 之 遥 程 霜 等 研 究 表 明 袁 绿 豆 皮 中 乙 酸 乙 酯 萃 取 物 具 有 较 强 的 抗 氧 化 性 能 袁 0.03% 的 乙 酸 乙 酯 萃 取 物 抗 氧 化 性 优 于 相 同 浓 度 的 VE 袁 略 低 于 化 学 合 成 的 抗 氧 化 剂 TBHQ [12] 遥 中 分 离 出 14 种 酚 类 化 合 物 袁 其 中 12 种 化 合 物 具 有 比 VE 强 的 抗 氧 化 能 力 遥 芝 麻 是 使 用 最 早 的 辛 香 料 之 一 袁 1.5 其 它 天 然 抗 氧 化 物 质 在 食 品 加 工 和 贮 存 过 程 中 常 常 发 生 非 酶 催 化 的 芝 麻 油 的 稳 定 性 高 是 因 为 芝 麻 酚 及 酌 生 育 酚 的 作 用 袁 后 来 研 究 发 现 芝 麻 油 中 尚 有 多 种 抗 氧 化 物 袁 如 芝 麻 酚 二 聚 物 尧 丁 香 酸 尧 阿 魏 酸 与 4 种 木 聚 糖 系 列 化 合 物 遥 生 姜 也 是 人 们 喜 爱 的 辛 香 料 袁 姜 中 的 姜 油 酮 尧 6 姜 [8] 油 醇 尧 6 姜 油 酚 均 具 有 较 强 的 抗 氧 化 活 性 遥 Nakatani 等 还 从 胡 椒 的 三 氯 甲 烷 提 取 物 中 得 到 5 种 酚 系 酰 胺 袁 它 们 均 是 无 色 尧 无 味 的 化 合 物 袁 抗 氧 化 活 性 优 于 琢 生 褐 变 反 应 袁 它 是 糖 的 羰 基 和 蛋 白 质 或 氨 基 酸 的 氨 基 之 间 发 生 的 缩 合 反 应 袁 这 种 反 应 称 为 美 拉 德 反 应 袁 其 反 应 产 物 具 有 抗 氧 化 性 袁 反 应 进 行 程 度 越 深 袁 其 产 物 的 抗 氧 化 效 果 越 明 显 遥 石 轶 松 曾 对 永 川 豆 豉 中 通 过 美 拉 德 反 应 得 到 的 类 黑 精 的 抗 氧 化 性 进 行 了 研 究 发 现 袁 各 种 添 加 量 的 豆 豉 类 黑 精 均 有 抗 氧 化 作 用 袁 其 中 0.5% 和 1.0% 添 加 量 抗 氧 化 效 果 较 明 显 袁 1.0% 的 添 加 量 与 育 酚 遥 [13] 0.2% 的 BHT 作 用 相 当 遥 翁 新 楚 等 对 多 胺 型 化 合 物 1.3 茶 叶 提 取 物 茶 叶 富 含 一 类 多 羟 基 的 酚 类 物 质 袁 称 为 茶 多 酚 袁 精 胺 的 抗 氧 化 性 质 进 行 了 研 究 发 现 袁 在 0.02 豫 耀 0.08% 的 范 围 内 有 较 强 的 抗 氧 化 作 用 袁 并 随 浓 度 的 升 高 而 急 是 十 分 优 良 的 抗 氧 化 剂 遥 中 国 农 科 院 茶 叶 研 究 所 于 剧 升 高 袁 酚 型 抗 氧 化 剂 BHA 和 BHT 也 有 较 强 的 抗 氧 1984 年 开 始 研 究 茶 叶 天 然 抗 氧 化 剂 袁 分 离 出 了 一 系 [14] 化 性 能 袁 但 较 多 胺 型 弱 遥 另 外 袁 还 有 一 些 生 物 碱 尧 愈 列 茶 叶 抗 氧 化 成 分 遥 在 猪 油 尧 大 豆 油 尧 菜 油 尧 花 生 油 等 食 用 油 脂 中 添 加 0.02 豫 耀 0.08 豫 的 茶 叶 天 然 抗 氧 化 剂 袁 疮 酸 和 某 些 微 生 物 的 代 谢 产 物 都 具 有 一 定 的 抗 氧 化 作 用 遥 证 明 其 具 有 优 异 的 抗 氧 化 活 性 袁 过 氧 化 值 和 酸 价 的 抑 制 率 在 90 豫 以 上 袁 抗 氧 化 的 效 价 比 VE 高 5 倍 袁 与 VC 2 天 然 抗 氧 化 剂 的 活 性 成 分 及 抗 氧 化 机 理 具 有 抗 氧 化 性 质 天 然 物 质 结 构 类 型 主 要 有 院 黄 [9] 和 VE 合 用 时 有 协 同 增 效 作 用 遥 1988 年 袁 卫 生 部 正 式 公 布 了 茶 叶 天 然 抗 氧 化 剂 为 我 国 食 品 添 加 剂 之 一 遥 此 酮 尧 单 宁 尧 维 生 素 类 尧 醌 尧 含 氮 化 合 物 尧 植 酸 尧 苯 丙 素 尧 香 豆 素 尧 萜 类 尧 烯 酸 等 遥 其 中 较 重 要 的 有 以 下 几 种 院 后 袁 关 于 茶 叶 抗 氧 化 的 机 理 及 应 用 研 究 不 断 深 入 袁 在 整 个 天 然 植 物 抗 氧 化 剂 的 研 究 中 起 着 先 锋 作 用 袁 其 抗 2.1 酚 类 酚 类 化 合 物 是 一 族 结 构 中 含 有 酚 的 化 合 物 袁 广 泛 氧 化 的 主 体 成 分 茶 多 酚 已 成 为 衡 量 天 然 植 物 抗 氧 化 [10] 成 分 功 效 的 参 照 物 遥 存 在 于 植 物 食 品 中 遥 酚 类 抗 氧 化 剂 有 从 橄 榄 油 中 分 离 出 来 的 羟 基 酪 醇 尧 松 脂 醇 尧 乙 酰 松 脂 醇 曰 从 芒 果 种 仁 中 1.4 果 蔬 提 取 物 众 多 果 蔬 类 植 物 亦 表 现 出 优 异 的 抗 氧 化 性 能 遥 许 分 离 出 的 鞣 花 酸 尧 木 质 素 或 阿 拉 伯 木 聚 糖 与 酚 性 物 质 的 结 合 产 物 曰 从 茶 叶 中 获 取 的 表 没 食 子 儿 茶 素 尧 表 没 6

7 饲 料 添 加 剂 朱 将 伟 : 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 概 况 食 子 儿 茶 素 没 食 子 酸 酯 尧 表 儿 茶 素 没 食 子 酸 酯 以 及 儿 [15] 茶 素 曰 从 蔷 薇 果 中 获 取 的 羟 基 肉 桂 酸 尧 儿 茶 素 遥 酚 类 是 极 好 的 氢 或 电 子 供 体 袁 由 于 形 成 的 酚 类 是 立 体 结 构 和 电 性 因 素 遥 杂 环 中 氮 原 子 野 裸 露 冶 在 外 有 利 于 充 分 接 近 活 性 氧 并 与 之 反 应 袁 抗 氧 化 效 果 就 较 [19 袁 20] 好 曰 有 机 胺 的 抗 氧 化 活 性 与 其 离 子 势 有 关 遥 游 离 基 中 间 体 的 共 振 非 定 域 作 用 和 没 有 适 合 分 子 氧 进 攻 的 位 置 袁 因 而 比 较 稳 定 袁 不 会 引 发 新 的 游 离 基 或 2.5 植 酸 也 叫 环 已 六 醇 六 磷 酸 酯 袁 大 多 以 钙 尧 镁 尧 钾 的 复 盐 者 由 于 链 反 应 而 被 迅 速 氧 化 袁 所 以 是 很 好 的 抗 氧 化 [16] 剂 遥 形 式 存 在 遥 植 酸 有 很 强 的 螯 合 能 力 袁 由 于 金 属 离 子 ( 如 铁 离 子 尧 铜 离 子 ) 与 其 形 成 了 螯 合 物 袁 可 减 少 金 属 离 子 2.2 黄 酮 类 黄 酮 类 化 合 物 是 植 物 光 合 作 用 产 生 的 一 大 类 化 所 催 化 的 氧 化 作 用 遥 一 般 螯 合 剂 单 独 使 用 效 果 不 佳 袁 但 对 其 它 抗 氧 化 剂 有 协 同 增 效 作 用 遥 柠 檬 酸 尧 多 聚 磷 合 物 袁 包 括 以 黄 酮 (2 苯 基 色 原 酮 ) 为 母 核 的 一 类 黄 色 [21] 酸 作 为 抗 氧 化 剂 与 此 类 似 遥 色 素 和 黄 酮 同 分 异 构 体 ( 异 黄 酮 ) 及 其 还 原 产 物 ( 黄 烷 酮 ) 遥 迄 今 认 为 其 作 用 机 制 至 少 包 括 3 种 院 淤 通 过 酚 羟 3 抗 氧 化 活 性 的 评 价 目 前 袁 虽 然 有 多 种 生 物 的 尧 化 学 的 鉴 别 天 然 抗 氧 基 与 自 由 基 进 行 抽 氢 反 应 生 成 稳 定 的 半 醌 自 由 基 袁 从 而 中 断 链 式 反 应 以 完 成 抗 氧 化 作 用 曰 于 通 过 抗 氧 化 剂 [17] 的 还 原 作 用 直 接 给 出 电 子 而 清 除 自 由 基 曰 盂 通 过 抗 氧 化 剂 对 金 属 离 子 的 络 合 袁 降 低 若 干 需 金 属 离 子 催 化 的 反 应 袁 从 而 间 接 实 现 抗 氧 化 作 用 遥 化 物 的 抗 氧 化 活 性 强 弱 的 方 法 袁 但 尚 未 形 成 一 种 标 准 方 法 遥 研 究 抗 氧 化 剂 抗 氧 化 活 性 的 思 路 一 般 是 : 先 以 化 学 或 物 理 的 方 法 袁 在 某 一 研 究 体 系 袁 如 水 溶 液 体 系 尧 光 照 体 系 尧 酶 体 系 尧 细 胞 体 系 或 组 织 体 系 中 产 生 氧 自 由 基 袁 并 对 这 一 体 系 造 成 损 害 袁 然 后 采 用 氧 自 由 基 检 2.3 维 生 素 测 技 术, 如 电 子 自 旋 共 振 (electron spin resonance, ESR) 茁 胡 萝 卜 素 茁 胡 萝 卜 素 是 维 生 素 A 的 前 体 袁 有 很 好 的 抗 氧 波 谱 解 析 技 术 等 袁 对 氧 自 由 基 及 其 氧 化 产 物 进 行 检 测 袁 从 而 对 抗 氧 化 剂 的 抗 氧 化 活 性 及 机 理 进 行 研 究 遥 化 性 能 袁 能 通 过 提 供 电 子 来 抑 制 活 性 氧 的 生 成 达 到 清 除 自 由 基 的 目 的 袁 能 清 除 单 线 态 氧 袁 减 少 光 过 敏 作 用 袁 也 是 单 线 态 氧 的 淬 灭 剂 遥 这 些 研 究 方 法 在 不 同 程 度 上 都 能 反 映 出 抗 氧 化 剂 的 抗 氧 化 活 性 袁 但 结 果 极 易 受 实 验 条 件 的 影 响 袁 尤 其 对 于 那 些 以 生 物 实 验 为 基 础 的 方 法 袁 由 于 操 作 繁 琐 袁 加 维 生 素 E 存 在 于 自 然 界 中 的 琢 生 育 酚 尧 茁 生 育 酚 尧 酌 生 育 上 生 物 实 验 不 确 定 性 因 素 相 对 增 加 袁 使 得 实 验 结 果 往 往 对 实 验 条 件 有 很 强 的 依 赖 性 遥 有 些 抗 氧 化 剂 在 不 同 酚 和 啄 生 育 酚 及 琢 三 烯 生 育 酚 尧 茁 三 烯 生 育 酚 尧 酌 三 烯 生 育 酚 和 啄 三 烯 生 育 酚 共 8 种 同 族 异 构 体 袁 统 称 为 维 生 素 E 袁 均 有 很 强 的 抗 氧 化 活 性 袁 其 中 琢 生 育 酚 是 已 知 生 物 活 性 最 大 的 一 种 生 育 酚 遥 维 生 素 E 能 经 过 一 个 自 由 基 中 间 体 氧 化 成 醌 袁 将 ROO 窑 转 变 成 化 学 性 质 不 活 泼 的 ROOH 袁 中 断 脂 类 过 氧 化 的 连 锁 反 应 袁 [18] 有 效 地 抑 制 脂 类 过 氧 化 作 用 遥 的 实 验 模 型 中 表 现 出 来 的 抗 氧 化 活 性 相 差 很 大 袁 甚 至 有 时 有 助 于 氧 化 现 象 发 生 袁 从 而 阻 碍 了 人 们 对 其 抗 氧 [22] 化 作 用 的 正 确 评 价 遥 近 年 来 兴 起 的 以 电 化 学 分 析 技 术 研 究 天 然 抗 氧 化 剂 的 抗 氧 化 活 性 的 方 法 有 望 解 决 这 一 难 点 遥 电 化 学 分 析 技 术 研 究 天 然 抗 氧 化 剂 抗 氧 化 活 性 的 理 论 基 础 是 院 氧 自 由 基 清 除 剂 的 抗 氧 化 作 用 是 通 过 电 子 转 移 清 维 生 素 C 维 生 素 C 是 一 种 重 要 的 自 由 基 清 除 剂 袁 能 通 过 逐 除 氧 自 由 基 袁 其 在 电 极 上 的 氧 化 反 应 与 其 在 体 内 的 抗 氧 化 反 应 类 似 遥 由 此 袁 氧 自 由 基 清 除 剂 的 电 化 学 特 性 袁 级 供 给 电 子 而 转 变 成 半 脱 氢 抗 坏 血 酸 和 脱 氢 抗 坏 血 酸 以 达 到 清 除 活 性 氧 自 由 基 的 目 的 遥 如 氧 化 电 位 尧 电 子 转 移 数 等 袁 应 与 其 抗 氧 化 活 性 密 切 相 关 袁 氧 化 电 位 值 应 是 其 最 基 本 的 抗 氧 化 活 性 指 标 袁 2.4 含 氮 化 合 物 具 有 抗 氧 化 活 性 的 含 氮 化 合 物 主 要 属 于 生 物 碱 尧 氧 自 由 基 清 除 剂 的 电 极 反 应 行 为 有 助 于 解 释 和 推 测 [23] 其 抗 氧 化 机 理 遥 国 内 外 关 于 利 用 外 电 化 学 分 析 法 研 杂 环 氨 基 酸 尧 肽 或 有 机 胺 类 袁 如 茶 叶 中 的 咖 啡 碱 和 咖 啡 中 的 咖 啡 因 袁 还 有 马 钱 子 碱 尧 金 雀 花 碱 尧 精 胺 等 遥 影 响 生 物 碱 和 杂 环 氨 基 酸 抗 氧 化 活 性 的 结 构 因 素 主 要 究 天 然 抗 氧 化 剂 抗 氧 化 活 性 的 报 道 袁 充 分 表 明 电 化 学 技 术 研 究 抗 氧 化 剂 的 抗 氧 化 活 性 具 有 广 阔 的 前 景 遥 最 近 也 有 报 道 用 DFT 和 AMI 结 合 的 量 子 化 学 方 7

8 朱 将 伟 : 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 概 况 饲 料 添 加 剂 法 计 算 抗 氧 化 剂 的 OH 键 解 离 焓 和 电 离 势 袁 并 以 此 为 理 论 指 标 评 价 其 抗 氧 化 活 性 袁 也 取 得 了 很 理 想 的 效 [24] 果 遥 4 存 在 的 问 题 和 研 究 方 向 4.1 我 国 目 前 对 天 然 抗 氧 化 剂 研 究 有 相 当 一 部 分 还 停 留 在 未 纯 化 或 部 分 纯 化 的 萃 取 物 上 袁 而 国 外 已 经 将 纯 化 的 提 取 物 商 品 化 袁 如 分 离 纯 化 葡 萄 籽 中 的 原 花 青 素 的 二 聚 体 和 三 聚 体 用 于 化 妆 品 尧 功 能 食 品 等 遥 虽 然 天 然 抗 氧 化 剂 在 实 际 应 用 中 并 不 一 定 要 求 是 单 体 袁 但 研 究 中 应 尽 量 分 离 并 收 集 一 系 列 单 体 化 合 物 袁 研 究 其 抗 氧 化 机 制 尧 化 学 结 构 与 抗 氧 化 活 性 及 稳 定 性 关 系 袁 并 为 人 工 合 成 高 效 抗 氧 化 剂 提 供 指 导 遥 4.2 单 一 活 性 成 分 抗 氧 化 作 用 往 往 弱 于 混 和 物 袁 应 重 视 对 抗 氧 化 活 性 成 分 之 间 抗 氧 化 协 同 作 用 的 研 究 袁 寻 找 并 合 成 高 效 尧 低 毒 尧 复 合 型 抗 氧 化 剂 遥 4.3 天 然 抗 氧 化 物 进 入 生 物 体 后 本 身 及 其 代 谢 产 物 的 生 理 功 能 等 方 面 的 研 究 应 受 到 重 视 遥 4.4 有 些 天 然 抗 氧 化 剂 具 有 一 定 毒 性 袁 在 使 用 前 需 进 行 相 关 毒 理 学 实 验 遥 4.5 如 何 运 用 现 代 生 物 技 术 或 其 它 技 术 来 实 现 已 知 天 然 抗 氧 化 物 的 工 业 化 生 产 而 需 进 一 步 研 究 遥 5 结 束 语 以 天 然 食 用 抗 氧 化 剂 取 代 合 成 抗 氧 化 剂 是 今 后 食 品 工 业 的 发 展 趋 势 袁 开 发 实 用 尧 高 效 尧 成 本 低 廉 的 天 然 抗 氧 化 剂 仍 是 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 重 点 遥 尤 其 在 我 国 食 品 添 加 剂 中 袁 抗 氧 化 剂 是 最 薄 弱 的 一 环 袁 因 此 袁 对 于 天 然 食 用 抗 氧 化 剂 的 研 究 开 发 亟 待 加 强 遥 参 考 文 献 1 李 文 林, 黄 风 洪. 天 然 抗 氧 化 剂 研 究 现 状 [J]. 粮 食 与 油 脂,2003, 2 (10):10 耀 13 2 赵 爱 云. 新 型 天 然 抗 氧 化 剂 茶 多 酚 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 食 品 添 加 剂,2005(5):78 耀 80 3 杨 洋, 韦 小 英. 国 内 外 天 然 食 品 抗 氧 化 剂 的 研 究 进 展 [J]. 食 品 科 学, 2002, 6(10):137 耀 Tian yun, LU xiangyang, He xiaojie. Scavenging Capacities on Oxy 原 gen Radicals of Natural Plant Antioxidants [J]. Food Science, 2005, 35(6):123 耀 孟 洁, 胡 迎 芬, 胡 博 路. 厚 朴 抗 氧 化 作 用 研 究 [J]. 中 国 油 脂,2000,25 (4):30 耀 33 6 李 文 智. 我 国 天 然 抗 氧 化 剂 的 研 究 及 应 用 [J]. 西 部 粮 油 科 枝, 2003,12(3):39 耀 40 7 Qiao fengyun, Chen xin, Yu liuqing. Research on the Antioxidative Factors and Natural Antioxidants [J]. Bulletin of Science and Tech 原 8 nology, 2006, 22(3):332 耀 Lin Mao, Kan Jianquan. Application on antioxidant of ginger [J]. China Food Additives, 2007, 33(1):151 耀 杨 怀 霞, 马 庆 一, 杨 林 莎. 茶 叶 及 诃 子 等 植 物 提 取 物 的 抗 氧 化 作 用 [J]. 郑 州 大 学 学 报 ( 医 学 版 ), 2003, 38(3):413 耀 邹 盛 勤. 茶 叶 的 药 用 成 分 药 理 作 用 及 应 用 研 究 进 展 [J]. 中 国 茶 叶 加 工,2004,12(3):35 耀 赵 文 恩. 类 胡 萝 卜 素 抗 氧 化 性 质 的 研 究 [J]. 郑 州 大 学 学 报 ( 工 学 版 ),2003,24(1):38 耀 程 永 强, 张 海 涛, 石 波. 功 能 性 食 品 以 及 其 中 的 功 能 性 成 分 的 最 新 发 现 [J]. 食 品 科 学,2004,25(S1):197 耀 张 汆, 骆 会 婷. 食 品 类 黑 精 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 食 品 添 加 剂, 2005,4(3):11 耀 Xu Zongyun. Detection of Antioxidant Capacity to 37 Plant Samples by DPPH Method [J]. Journal of Tarim University of Agricultural Reclamation, 2004, 16(2):1 耀 4 15 Jin Ying, Sun Aidong. Food Sources and Bioavailability of Polyphe 原 nols[j]. Food and Fermentation Industries, 2006, 30(9):101 耀 Baoshan Sun, G. Pedro Belchior. Isolation and purification of dimeric and trimeric procyanidins from grape seeds [J]. Journal of Chromatography A, 1999(841):115 耀 陈 贵 林, 李 建 文, 何 洪 巨. 蔬 菜 类 黄 酮 研 究 进 展 [J]. 中 国 食 物 与 营 养,2007, 20(1):57 耀 Li SG, Zhao WH. Study on the Progress of Edible Oil Antioxi 原 dants and its Safety[J]. Cereals &Oils,2006, 13(5):34 耀 郑 炜. 果 蔬 抗 氧 化 作 用 机 理 及 评 价 方 法 研 究 进 展 [J]. 浙 江 林 业 科 技,2004,24(2):59 耀 Zaiun Liu, Lan Ping Ma, Bo Zhou, et al. Antioxidative effects of green tea polyphenols on free radical initiated and photosensitized peroxidation of human low density lipoprotein [J].Chemistry and Physics of Lipids, 2000, 751(6):53 耀 吕 艳 春. 天 然 抗 氧 化 剂 在 食 品 工 业 中 的 应 用 [J]. 邯 郸 农 业 高 等 专 科 学 校 学 报,2002,17(1):23 耀 Pan JQ. Study and Application of Antioxidant in Polymer Area[J]. Polymer Bulletin, 2002, 7(1):57 耀 何 建 波, 徐 红 梅, 朱 燕 舞. 电 化 学 方 法 研 究 天 然 抗 氧 化 剂 [J]. 化 学 与 生 物 工 程,2004,4(5):10 耀 郑 诗 超, 陈 宗 道, 阚 健 全. 油 脂 天 然 抗 氧 化 剂 研 究 进 展 [J]. 粮 食 与 油 脂,2003,17(6):43 耀 44 ( 编 辑 : 王 芳,xfang2005@163.com)

9 饲 料 添 加 剂 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 植 物 提 取 物 添 加 剂 对 畜 禽 肉 品 风 味 的 影 响 杨 红 军 汪 鲲 唐 维 新 1 营 养 成 分 对 风 味 的 影 响 风 味 (flavor) 是 衡 量 肉 品 质 的 一 个 重 要 指 标 袁 指 食 研 究 主 要 源 于 氨 基 酸 尧 脂 肪 及 脂 肪 酸 尧 糖 原 和 肌 苷 酸 与 鸟 苷 酸 等 几 类 遥 物 刺 激 味 觉 或 嗅 觉 受 体 而 产 生 的 综 合 生 理 反 应 ( 郭 锋 等 袁 2003) 袁 即 摄 入 口 腔 的 食 物 使 人 产 生 的 味 觉 尧 嗅 觉 尧 1.1 氨 基 酸 对 肉 品 风 味 的 影 响 氨 基 酸 的 种 类 及 含 量 的 高 低 是 决 定 肉 品 风 味 优 触 觉 等 各 种 感 觉 的 总 和 ( 田 刚 等 袁 2000) 遥 肉 品 风 味 包 括 滋 味 (savor) 和 香 味 (aroma) 两 部 分 袁 分 别 与 人 的 味 觉 和 嗅 觉 有 关 (Yamaguchi 等 袁 1998a) 遥 肉 的 香 味 由 肉 受 热 过 程 中 产 生 的 挥 发 性 物 质 刺 激 嗅 觉 而 产 生 袁 这 些 挥 发 性 化 合 物 主 要 由 肌 肉 中 的 氨 基 酸 尧 核 苷 酸 尧 还 原 糖 类 和 脂 肪 酸 等 基 质 在 受 热 过 程 中 产 生 的 不 饱 和 醛 尧 酮 (Cross 等 袁 1965) 尧 含 硫 化 合 物 以 及 一 些 杂 环 化 合 物 等 组 成 ( 钟 炜 袁 2004 ) 遥 关 于 肉 香 味 的 起 源 有 两 种 学 说 院 淤 瘦 肉 起 源 学 说 袁 认 为 香 味 来 自 瘦 肉 中 水 溶 性 香 味 前 体 物 质 在 加 热 时 所 产 生 的 含 N 尧 S 的 芳 香 类 化 合 物 曰 于 脂 肪 起 源 学 说 袁 认 为 香 味 来 自 脂 肪 而 不 是 瘦 肉 遥 一 般 认 为 袁 瘦 肉 产 生 基 本 肉 味 袁 而 不 同 畜 禽 间 的 特 有 肉 味 则 来 自 脂 肪 ( 郭 锋 等 袁 2003) 遥 滋 味 通 过 味 觉 产 生 袁 是 由 水 溶 性 物 质 与 味 蕾 受 体 相 互 作 用 而 形 成 的 味 道 袁 酸 尧 甜 尧 苦 尧 咸 是 4 种 基 本 味 道 袁 而 鲜 味 被 认 为 是 第 5 种 基 本 味 道 遥 鲜 味 是 一 种 复 杂 的 综 合 味 感 袁 其 呈 味 物 主 要 有 两 类 袁 一 类 是 氨 基 酸 类 袁 主 要 是 谷 氨 酸 钠 盐 (MSG 袁 又 称 味 精 ) 尧 甘 氨 酸 及 小 肽 曰 另 一 类 是 核 苷 酸 类 袁 主 要 有 肌 苷 酸 (5'IMP) 和 鸟 苷 酸 (5'GMP) ( 陈 继 兰 袁 2004) 遥 风 味 是 一 项 复 杂 的 综 合 指 标, 风 味 物 质 种 类 繁 多, 目 前 已 经 发 现 的 风 味 物 质 就 有 近 千 种 ( 王 晓 明 袁 2004), 劣 的 重 要 因 素 ( 聂 磊 等 袁 2006) 遥 Batzer 等 (1962) 研 究 认 为 袁 丝 氨 酸 尧 谷 氨 酸 尧 甘 氨 酸 尧 亮 氨 酸 尧 茁 丙 氨 酸 尧 脯 氨 酸 和 苏 氨 酸 等 是 肉 香 味 的 必 需 前 体 物 袁 如 果 这 些 氨 基 酸 含 量 的 提 高 袁 则 预 示 着 肉 品 风 味 的 改 善 遥 谷 氨 酸 钠 和 天 冬 氨 酸 钠 与 咸 味 有 关 袁 甘 氨 酸 尧 赖 氨 酸 尧 羟 脯 氨 酸 等 与 甜 味 有 关 ( 何 叶 如 袁 2003) 遥 肉 中 的 鹅 肌 酸 尧 精 氨 酸 尧 赖 氨 酸 尧 组 氨 酸 等 能 在 口 腔 中 停 留 袁 故 食 后 回 味 无 穷 ( 姚 勇 芳 袁 2001) 遥 氨 基 酸 的 呈 味 与 其 物 理 化 学 结 构 有 关 袁 如 果 谷 氨 酸 羧 基 端 带 有 疏 水 能 较 小 的 氨 基 酸 渊 如 天 冬 氨 酸 尧 苏 氨 酸 尧 丝 氨 酸 冤 时 袁 就 能 呈 现 肉 汤 鲜 味 (Arai 袁 1973) 遥 从 目 前 的 研 究 结 果 来 看 袁 对 鲜 味 贡 献 最 大 的 氨 基 酸 为 谷 氨 酸 和 甘 氨 酸 袁 它 们 是 肌 肉 鲜 味 的 基 本 成 分 ( 曹 特 等 袁 2005) 遥 饲 料 中 氨 基 酸 的 含 量 将 直 接 影 响 畜 禽 肌 肉 中 的 含 量 袁 为 了 提 高 畜 禽 肉 品 的 风 味 袁 各 种 有 致 鲜 作 用 的 氨 基 酸 将 被 重 新 考 虑 袁 如 组 氨 酸 的 配 给 量 在 原 NRC 基 础 上 还 需 考 虑 形 成 肌 肽 和 鹅 肌 肽 以 及 抗 氧 化 的 需 要 (Kuo 等 袁 1999) 遥 赖 氨 酸 不 但 能 改 进 滋 味 还 能 促 进 肌 内 脂 肪 合 成 (Witte 等 袁 2000) 遥 谷 氨 酸 虽 属 非 必 需 氨 基 酸 袁 但 它 是 重 要 致 鲜 成 分 袁 在 后 期 配 方 中 的 重 要 性 是 不 言 而 喻 的 袁 其 最 佳 配 比 值 得 进 一 步 研 究 ( 张 伟 力 袁 2003) 遥 其 分 子 结 构 缺 乏 普 遍 规 律 性 (Wasserman 袁 1979) 袁 因 此 袁 对 风 味 进 行 量 化 是 比 较 困 难 的 袁 其 评 定 主 要 靠 专 家 的 1.2 脂 肪 及 脂 肪 酸 对 肉 品 风 味 的 影 响 脂 肪 加 热 能 产 生 游 离 脂 肪 酸 尧 醛 尧 酮 等 呈 味 挥 发 品 尝 来 确 定 ( 刘 梅 等 袁 2003) 遥 肉 味 前 体 物 质 是 研 究 肉 风 味 的 前 提 和 开 端 袁 它 有 助 于 解 释 肉 味 的 起 源 遥 目 前 的 物 袁 且 与 肉 熟 化 过 程 中 生 成 的 还 原 糖 尧 肽 类 尧 氨 基 酸 等 肉 香 前 体 物 有 很 好 的 亲 和 力 袁 在 加 热 过 程 中 产 生 特 殊 的 香 味 ( 曹 特 等 袁 2005) 遥 肌 肉 脂 肪 通 常 被 分 为 肌 间 脂 肪 和 肌 内 脂 肪 (Intra 杨 红 军, 北 京 天 福 莱 生 物 科 技 有 限 公 司,100097, 北 京 海 淀 区 汪 鲲 唐 维 新, 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一 作 者 收 稿 日 期 : muscular fat 袁 IMF) 遥 肌 间 脂 肪 是 指 存 在 于 完 整 的 肌 肉 块 之 间 的 脂 肪 袁 而 肌 内 脂 肪 则 是 均 匀 分 布 于 肌 肉 组 织 中 的 脂 肪 ( 杨 龙 江 袁 2000) 袁 它 们 与 肌 肉 中 的 膜 蛋 白 质 紧 密 结 合 在 一 起 遥 肌 内 脂 肪 是 肌 肉 滋 润 多 汁 的 物 理 因 9

10 杨 红 军 等 : 植 物 提 取 物 添 加 剂 对 畜 禽 肉 品 风 味 的 影 响 饲 料 添 加 剂 子 袁 也 是 产 生 风 味 化 合 物 的 前 体 物 质 ( 李 德 发 袁 2003) 袁 肉 质 风 味 随 肌 内 脂 肪 增 加 得 到 持 续 改 善 袁 而 肌 间 脂 肪 在 肉 品 风 味 形 成 中 的 作 用 很 小 遥 肌 内 脂 肪 的 主 要 成 分 是 磷 脂 (60 豫 耀 70 豫 )( 李 凤 娜 等 袁 2006) 袁 而 肌 间 脂 肪 的 主 要 成 分 是 甘 油 三 酯 遥 英 国 的 肉 品 风 味 研 究 者 Mottram 等 (1991) 研 究 证 实 袁 磷 脂 是 肉 品 风 味 的 重 要 前 体 物 质 袁 磷 脂 通 过 Maillard 反 应 (Oleagineux 等,1997) 而 产 生 香 味 遥 与 甘 油 三 酯 相 比 袁 磷 脂 富 含 不 饱 和 脂 肪 酸, 如 亚 麻 酸 和 花 生 四 烯 酸 等 袁 特 别 是 含 4 个 以 上 不 饱 和 键, 具 有 22 个 碳 原 子 的 长 链 不 饱 和 脂 肪 酸, 极 易 被 氧 化, 氧 化 ( 或 降 解 ) 产 物 直 接 影 响 风 味 成 分 的 组 成, 继 而 改 善 肉 品 风 味 ( 侯 生 珍,2000) 遥 刘 秀 荣 等 (1997) 研 究 认 为 袁 土 杂 鸡 的 气 味 香 尧 味 道 好 是 因 为 亚 麻 酸 和 亚 油 酸 含 量 高 袁 土 杂 鸡 亚 麻 酸 含 量 是 快 大 型 鸡 的 倍 遥 肌 内 脂 肪 被 认 为 与 肉 质 及 口 感 呈 正 相 关 袁 影 响 肉 质 的 嫩 度 尧 剪 切 力 尧 风 味 等 袁 但 是 多 余 的 肌 内 脂 肪 却 会 影 响 肉 的 口 感 ( 束 婧 婷 等 袁 2006) 遥 通 常 袁 新 鲜 猪 肉 产 品 的 肌 内 脂 肪 在 2% 耀 3% 时 较 为 理 想 渊 Femandez 等 袁 Penny(1956) 研 究 指 出 袁 腺 苷 酸 (AMP) 脱 氨 主 要 发 生 在 非 正 常 生 理 状 态 袁 如 剧 烈 运 动 或 尸 僵 时 袁 而 动 物 活 体 中 IMP 含 量 很 少 (Bendall 等,1957 曰 李 建 军 袁 2003) 遥 动 物 宰 杀 后 袁 供 氧 停 止 袁 短 时 间 内 由 糖 酵 解 渊 肌 肉 僵 直 冤 供 能 合 成 一 定 量 三 磷 酸 腺 苷 (ATP) 遥 与 此 同 时 袁 ATP 在 ATP 酶 的 作 用 下 迅 速 降 解 为 二 磷 酸 腺 苷 (ADP) 袁 ADP 在 肌 酸 激 酶 的 作 用 下 袁 分 解 成 AMP 遥 AMP 在 脱 氨 酶 渊 腺 嘌 呤 核 苷 酸 脱 氨 酶 冤 作 用 下, 脱 氨 形 成 肌 苷 酸 渊 IMP 冤 袁 肌 肉 中 IMP 及 其 降 解 产 物 的 积 累 可 使 肌 肉 鲜 味 增 加 渊 田 刚 袁 2001 冤 遥 IMP 形 成 后 的 降 解 过 程 相 对 缓 慢 袁 而 且 降 解 速 度 直 接 受 肌 肉 保 存 温 度 的 影 响 渊 陈 继 兰 袁 2004 冤 遥 核 苷 酸 类 物 质 与 谷 氨 酸 钠 共 用 袁 有 强 烈 的 增 鲜 作 用 渊 南 基 哲 等 译 袁 1994 冤 遥 肌 苷 酸 与 谷 氨 酸 钠 以 1 5 耀 1 20 的 比 例 混 合 袁 谷 氨 酸 钠 的 鲜 味 可 增 至 6 倍 ( 张 海 燕 等 袁 2004) 曰 而 Maga(1994) 发 现 袁 当 两 者 比 例 为 1 1 时 袁 鲜 味 强 度 是 等 量 谷 氨 酸 钠 鲜 味 强 度 的 30 倍 袁 这 表 明 各 呈 味 物 质 的 协 同 作 用 可 能 是 决 定 肉 品 风 味 的 重 要 因 素 袁 但 是 最 佳 的 混 合 比 例 还 需 要 进 一 步 的 研 究 遥 1999) 遥 1.4 硫 胺 素 对 肉 品 风 味 的 影 响 1.3 肌 苷 酸 (IMP) 对 肉 品 风 味 的 影 响 肌 苷 酸 (inosine monphosphate 袁 IMP) 又 称 次 黄 嘌 呤 硫 胺 素 受 热 时 可 产 生 以 含 硫 化 合 物 为 主 的 多 种 挥 发 性 香 味 物 质 (Buttery 等 袁 1984) 袁 已 鉴 定 的 68 种 硫 核 苷 酸 袁 是 一 种 单 核 苷 酸 袁 属 于 芳 香 杂 环 化 合 物 袁 其 结 构 具 有 空 间 专 一 性 袁 作 为 ATP 代 谢 的 中 间 产 物 天 然 胺 素 分 解 产 物 中 含 硫 化 合 物 占 50% 以 上 袁 这 些 化 合 物 在 肉 受 热 过 程 中 产 生 浓 郁 的 香 味 遥 存 在 于 肌 肉 中 ( 丁 耐 克 袁 1996) 遥 Kodama 等 渊 1913 冤 研 究 2 植 物 提 取 物 添 加 剂 对 风 味 的 影 响 发 现 袁 肌 苷 酸 具 有 鲜 味 特 征 ( 张 海 艳 等 袁 2004) 袁 而 且 是 鲜 味 最 强 的 物 质 袁 其 鲜 味 是 味 精 的 50 多 倍 渊 汪 以 真 2.1 甜 菜 碱 甜 菜 碱 袁 化 学 名 为 三 甲 基 甘 氨 酸 袁 是 一 种 无 毒 尧 无 等 袁 2000 曰 陈 国 宏 等 袁 2000) 遥 畜 禽 肌 肉 中 的 肌 苷 酸 作 为 一 种 鲜 味 物 质 袁 已 成 为 衡 量 肉 质 是 否 优 良 的 一 项 重 要 指 标 ( 蔡 海 峰 等 袁 2004) 遥 IMP 还 是 形 成 肉 香 味 的 重 要 前 体 物 渊 Arya 等 袁 1979 曰 Cambero 等 袁 1992 冤 遥 肌 苷 酸 和 肌 苷 酸 降 解 产 生 极 活 泼 的 核 糖 和 磷 酸 核 糖 袁 在 加 热 过 程 中 与 氨 基 酸 发 生 Maillard 反 应 袁 产 生 各 种 挥 发 性 香 味 物 质 袁 肌 苷 酸 不 但 可 增 强 食 品 风 味 袁 而 且 能 抑 制 食 品 中 硫 磺 味 尧 苦 味 等 不 良 风 味 ( 陈 继 兰 袁 2004) 遥 有 研 究 表 明 袁 IMP 在 畜 禽 肉 类 尧 鱼 肉 中 的 含 量 较 为 丰 富 袁 是 主 要 鲜 味 化 合 物 袁 如 猪 肉 和 鸡 肉 中 IMP 含 量 分 别 是 游 离 谷 氨 酸 的 8.7 倍 和 4.5 倍 (Ninomiya 袁 1998) 遥 目 前 袁 世 界 上 已 有 不 少 国 家 把 肉 品 中 IMP 含 量 作 为 影 响 肉 质 的 重 要 指 标 之 一 (Fuijmura 袁 1998) 遥 害 袁 类 似 于 维 生 素 的 天 然 化 合 物 袁 其 味 甘 甜 ( 张 乙 山 等 袁 2006) 袁 广 泛 分 布 于 动 植 物 体 内 遥 甜 菜 碱 具 有 活 性 甲 基 供 体 袁 为 机 体 提 供 甲 基 袁 因 而 可 以 替 代 胆 碱 和 蛋 氨 酸 ( 王 友 明 袁 2001) 遥 动 物 自 身 是 难 以 合 成 甲 基 的 袁 需 由 食 物 摄 取 袁 甜 菜 碱 是 直 接 有 效 的 甲 基 供 体 袁 它 直 接 参 与 脂 肪 代 谢 尧 氨 基 酸 的 生 成 等 各 种 生 化 过 程 袁 是 合 成 蛋 氨 酸 尧 胆 碱 尧 肉 碱 尧 肌 酸 尧 磷 脂 等 若 干 具 有 生 理 作 用 的 物 质 所 必 需 的 ( 王 宏 等 袁 1999) 遥 同 时 袁 甜 菜 碱 脱 掉 甲 基 后 可 转 变 成 甘 氨 酸 袁 而 甘 氨 酸 是 嘌 呤 核 苷 酸 从 头 合 成 途 径 的 一 重 要 底 物 (Rudolph 袁 1994) 遥 占 秀 安 等 (1999) 研 究 认 为 袁 甜 菜 碱 可 能 是 通 过 肝 脏 合 成 多 量 的 肉 碱 和 肌 酸 袁 促 进 肌 细 胞 内 脂 肪 酸 的 茁 氧 化 反 应 袁 加 速 三 羧 酸 循 环 袁 产 生 的 能 量 主 要 以 磷 酸 肌 酸 形 式 储 存 袁 然 后 转 化 为 ATP 袁 10

11 饲 料 添 加 剂 杨 红 军 等 : 植 物 提 取 物 添 加 剂 对 畜 禽 肉 品 风 味 的 影 响 最 终 便 能 形 成 较 高 含 量 的 肌 苷 酸 袁 从 而 改 善 肉 的 风 味 ( 孙 德 文 等 袁 2002) 遥 汪 以 真 等 渊 2000 冤 报 道 袁 日 粮 中 以 添 加 1000 mg/kg 水 平 的 甜 菜 碱 能 显 著 提 高 猪 肌 内 脂 肪 和 肌 苷 酸 含 量 袁 提 高 肉 的 鲜 味 遥 甜 菜 碱 还 能 提 高 猪 脂 肪 酶 的 活 性 袁 促 进 体 脂 的 氧 化 分 解 袁 降 低 猪 背 膘 厚 渊 汪 以 真 等 袁 2001 冤 遥 占 秀 安 等 渊 1999 冤 报 道 袁 饲 粮 中 添 加 甜 菜 碱 可 显 著 提 高 艾 维 茵 肉 鸡 肌 肉 中 的 肌 酸 尧 肌 苷 酸 等 的 含 量 遥 Shette 渊 1993 冤 报 道 袁 甜 菜 碱 可 使 肉 鸡 体 脂 分 布 均 匀 袁 提 高 肉 的 嫩 度 和 适 口 性 遥 耿 家 驹 渊 1999 冤 报 道 袁 在 肉 鸡 饲 料 中 添 加 甜 菜 碱 可 使 鸡 肉 中 肌 苷 酸 的 含 量 增 加 遥 有 试 验 表 明 袁 随 甜 菜 碱 添 加 量 增 加 袁 鸡 胸 肌 IMP 含 量 呈 明 显 增 加 趋 势 袁 500 mg/kg 和 1000 mg/kg 组 鸡 肉 IMP 含 量 极 显 著 高 于 对 照 组 和 250 mg/kg 组 渊 P<0.01 冤 遥 张 拴 峰 渊 2004 冤 试 验 结 果 表 明 袁 在 饲 粮 中 添 加 1000 mg/kg 甜 菜 碱 明 显 地 改 善 了 肉 质 袁 其 中 肌 酸 尧 肌 苷 酸 和 肌 红 蛋 白 含 量 较 对 照 组 分 别 提 高 17.28% 尧 26.92% 尧 9.15% 遥 王 述 柏 (2004) 试 验 结 果 表 明 袁 鸡 胸 肌 肌 内 脂 肪 有 随 甜 菜 碱 添 加 量 增 加 而 升 高 的 趋 势 袁 腹 脂 沉 积 和 皮 脂 厚 有 明 显 减 少 趋 势 袁 说 明 甜 菜 碱 可 促 进 机 体 脂 肪 的 分 解 遥 类 的 意 图 袁 以 提 高 动 物 生 产 和 饲 料 利 用 率 为 目 标 袁 确 保 人 类 健 康 和 生 态 环 境 平 衡 为 目 的 袁 添 加 于 饲 料 中 的 纯 天 然 物 质 遥 近 年 来 袁 中 草 药 在 肉 质 风 味 改 善 方 面 的 研 究 已 受 到 日 益 重 视 遥 研 究 显 示 袁 中 草 药 添 加 剂 能 够 明 显 地 提 高 兔 ( 杲 仁 义 袁 2001) 尧 猪 ( 张 先 勤 等 袁 2002) 尧 鸡 ( 王 权 等 袁 1996) 的 肉 品 风 味 遥 中 草 药 饲 料 添 加 剂 影 响 肉 品 风 味 变 化 可 能 与 提 高 氨 基 酸 和 肌 苷 酸 含 量 袁 改 善 脂 肪 酸 等 多 种 综 合 因 素 有 关 遥 聂 磊 等 (2006) 试 验 表 明 袁 添 加 中 草 药 组 猪 肉 中 各 种 氨 基 酸 的 含 量 均 比 添 加 抗 生 素 组 高 袁 且 谷 氨 酸 尧 脯 氨 酸 含 量 有 显 著 提 高 (P<0.05) 遥 何 叶 如 (2003) 研 究 也 表 明 袁 添 加 0.15 豫 耀 0.20% 的 中 草 药 ( 由 北 京 天 福 莱 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 ) 袁 谷 氨 酸 和 甘 氨 酸 分 别 提 高 了 14.29% 尧 5.26% 袁 能 够 显 著 改 善 肉 质 风 味 (P<0.05) 曰 添 加 0.35% 和 0.70% 中 草 药 组 的 肌 苷 酸 含 量 分 别 提 高 了 6.29% 和 9.43% 袁 谷 氨 酸 和 甘 氨 酸 含 量 分 别 提 高 了 0.15% 尧 2.89% 和 0.95% 尧 4.14% 曰 0.35% 添 加 组 的 亚 油 酸 (C18 2) 含 量 提 高 了 22.98%( 钟 炜,2004) 遥 刘 彦 慈 (2004) 试 验 发 现, 在 基 础 日 粮 里 添 加 1% 的 中 草 药, 肉 仔 鸡 肌 肉 中 的 肌 苷 酸 提 高 了 22.40%(P<0.05) 曰 添 加 1.5% 的 中 草 药 袁 与 风 味 有 关 的 谷 氨 酸 尧 胱 氨 酸 含 2.2 大 蒜 素 生 化 分 析 表 明 袁 大 蒜 中 含 有 丰 富 的 构 成 鸡 肉 香 味 量 分 别 提 高 了 %(P<0.01) 和 22.28%(P<0.01) 曰 一 定 程 度 上 改 善 了 肌 肉 中 的 脂 肪 酸 组 成 袁 其 中 显 著 提 高 的 主 要 成 分 ( 孙 德 文 等 袁 2002) 遥 鸡 肉 尧 鸡 蛋 中 的 香 味 成 分 主 要 是 C 3 H 5 S(O) 基 团 袁 而 大 蒜 中 的 硫 醚 化 合 物 含 有 这 一 结 构 袁 在 鸡 饲 料 中 添 加 大 蒜 素 能 生 产 具 有 鲜 美 香 味 的 产 品 ( 王 能 友 袁 2004) 遥 同 时 袁 大 蒜 粉 能 有 效 地 调 整 刺 激 动 物 肌 肉 产 生 香 味 的 氨 基 酸 袁 使 肉 品 风 味 提 高 ( 张 拴 峰 袁 2004) 遥 在 鸡 日 粮 中 添 加 1 豫 耀 2% 鲜 大 蒜 或 0.2% 的 大 蒜 粉 袁 鸡 肉 的 鱼 腥 味 便 会 消 失 袁 鸡 肉 香 味 变 浓 ( 于 千 桂 袁 2006) 遥 大 蒜 素 能 增 强 鸡 肉 香 味 成 分 袁 使 肉 更 鲜 ( 张 春 雷 等 袁 2002) 遥 了 不 饱 和 脂 肪 酸 的 比 例 袁 尤 其 是 C18 3 和 C18 2 的 比 例 遥 品 尝 试 验 结 果 表 明 袁 中 草 药 对 鸡 肉 的 风 味 有 所 改 善 袁 这 与 肌 肉 中 氨 基 酸 尧 脂 肪 酸 及 肌 苷 酸 含 量 的 测 定 结 果 一 致 遥 中 草 药 添 加 剂 具 有 提 高 肌 肉 中 鲜 味 和 甜 味 氨 基 酸 含 量 和 肌 肉 中 肌 苷 酸 含 量 的 趋 势 袁 能 有 效 改 善 肉 质 风 味 袁 是 有 效 替 代 抗 生 素 的 绿 色 环 保 型 饲 料 添 加 剂 ( 夏 中 生 等 袁 2006) 遥 总 之 袁 风 味 是 一 项 复 杂 的 综 合 指 标 袁 风 味 物 质 种 2.3 茶 叶 茶 叶 中 富 含 多 酚 类 化 合 物 (TP) 袁 它 是 一 类 活 性 成 类 繁 多 袁 对 其 量 化 研 究 是 比 较 困 难 的 遥 同 时 袁 植 物 提 取 物 添 加 剂 的 功 能 较 多 袁 其 对 肉 质 风 味 的 改 善 是 显 而 易 分 袁 属 纯 天 然 抗 氧 化 剂 袁 其 抗 氧 化 作 用 比 维 生 素 C 和 维 生 素 E 强 袁 长 期 饲 喂 添 加 适 量 茶 叶 的 饲 料 袁 猪 肉 中 见 的 袁 但 有 些 机 理 还 不 是 很 清 楚 袁 因 此 袁 有 必 要 继 续 加 强 该 方 面 的 研 究 袁 从 而 更 好 的 改 善 畜 禽 肉 质 风 味 遥 的 维 生 素 E 含 量 可 增 至 一 般 猪 肉 的 3 倍 袁 肌 苷 酸 含 量 也 有 所 提 高 袁 使 肉 味 更 佳 ( 侯 慧 丽 等 袁 2006) 遥 2.4 复 方 中 草 药 中 草 药 饲 料 添 加 剂 袁 是 指 以 中 国 关 于 中 草 药 的 物 ( 参 考 文 献 63 篇, 刊 略, 需 者 可 函 索 ) 性 尧 物 味 和 物 间 相 互 关 系 的 传 统 理 论 为 指 导 袁 按 照 人 ( 编 辑 : 王 芳,xfang2005@163.com) 11

12 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 酶 制 剂 本 栏 目 由 北 京 挑 战 生 物 技 术 有 限 公 司 协 办 汤 海 鸥 汪 勇 李 富 伟 饲 用 酶 制 剂 是 酶 制 剂 工 业 的 一 个 重 要 方 面 袁 饲 用 酶 制 剂 的 使 用 已 经 有 50 多 年 的 历 史 袁 但 饲 用 酶 制 剂 的 快 速 发 展 期 却 只 是 在 最 近 的 10 耀 15 年 时 间 遥 近 年 来 袁 随 着 生 物 技 术 的 发 展 袁 酶 制 剂 的 发 酵 活 性 得 到 极 大 提 高 袁 生 产 成 本 日 渐 下 降 袁 酶 制 剂 得 以 越 来 越 多 的 被 应 用 在 饲 料 中 袁 目 前 已 经 形 成 了 庞 大 的 饲 用 酶 制 剂 市 场 袁 其 中 常 用 的 饲 料 酶 制 剂 主 要 有 植 酸 酶 尧 淀 粉 酶 尧 蛋 白 酶 和 非 淀 粉 多 糖 酶 等 4 大 类 遥 而 随 着 酶 制 剂 生 产 发 展 的 需 要 袁 酶 制 剂 活 性 的 检 测 在 日 常 工 作 中 显 得 越 来 越 重 要 遥 目 前 我 国 饲 料 工 业 标 准 中 已 经 确 立 了 植 酸 酶 尧 纤 维 素 酶 尧 茁 葡 聚 糖 酶 活 性 的 测 定 方 法 遥 另 外 袁 许 多 企 事 业 单 位 也 制 定 了 其 它 酶 制 剂 活 性 的 测 定 方 法 遥 但 是 以 化 学 方 法 检 测 酶 制 剂 的 活 性 时 存 在 许 多 变 异 因 素 袁 这 些 因 素 对 不 同 酶 制 剂 的 影 响 不 是 平 行 和 同 步 的 袁 需 要 对 酶 制 剂 活 性 的 检 测 方 法 和 检 测 过 程 有 加 快 曰 另 一 方 面 由 于 随 着 温 度 的 升 高 将 使 酶 的 稳 定 性 下 降, 部 分 酶 蛋 白 分 子 逐 渐 变 性 而 失 去 活 性, 引 起 酶 反 应 速 率 下 降 遥 温 度 的 这 两 种 影 响 的 综 合 作 用 而 产 生 酶 反 应 的 野 最 适 温 度 冶 遥 对 于 不 同 的 酶 制 剂 在 不 同 的 情 况 下 最 适 温 度 有 一 定 的 差 别 遥 研 究 木 聚 糖 酶 时 发 现 袁 在 30 耀 40 益 条 件 下 酶 活 较 稳 定,50 益 后 随 着 温 度 的 升 高, 酶 活 性 开 始 下 降,90 益 时 基 本 失 活 ( 李 卫 芬 等,1999) 遥 研 究 纤 维 素 酶 最 适 酶 解 条 件 时 发 现 袁 在 36 耀 58 益 之 间 纤 维 素 酶 相 对 酶 活 性 随 着 温 度 升 高 而 升 高 曰 当 温 度 在 58 耀 62 益 之 间 时 袁 相 对 酶 活 性 没 有 明 显 变 化 袁 曲 线 近 似 呈 水 平 状 态 曰 在 40 尧 45 尧 50 益 条 件 下 袁 其 相 对 酶 活 分 别 为 56% 尧 70% 尧 80%, 而 当 温 度 大 于 58 益 以 上 时 相 对 酶 活 性 不 再 升 高 渊 王 琳 等 袁 1998 冤 遥 同 时 袁 酶 在 不 同 条 件 下 适 宜 温 度 也 可 能 要 受 到 酶 的 纯 度 尧 底 物 尧 激 活 剂 尧 抑 制 剂 以 及 酶 促 反 应 时 间 等 因 素 的 影 响 遥 一 个 正 确 的 理 解 遥 因 此 袁 本 文 就 饲 用 酶 制 剂 活 性 测 定 影 响 因 素 进 行 了 总 结 分 析 袁 以 便 为 酶 制 剂 的 应 用 提 供 1.2 ph 值 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 ph 值 对 酶 活 性 的 测 定 结 果 影 响 很 大 袁 各 种 酶 制 参 考 遥 剂 在 一 定 条 件 下 都 有 其 特 定 的 最 适 酶 解 ph 值 袁 酶 的 1 影 响 饲 用 酶 制 剂 活 性 测 定 的 四 大 要 素 所 谓 的 酶 活 性 是 指 在 特 定 的 系 统 和 条 件 下 测 到 最 适 ph 值 会 随 着 底 物 种 类 和 浓 度 尧 缓 冲 液 种 类 和 浓 度 的 不 同 而 改 变 袁 因 此 袁 最 适 ph 值 也 只 有 在 一 定 条 件 的 反 应 速 度 遥 为 了 确 保 酶 制 剂 测 定 结 果 的 一 致 性 袁 饲 用 酶 制 剂 活 性 单 位 定 义 中 对 影 响 酶 活 大 小 的 主 要 条 件 进 行 了 规 定 袁 其 中 包 括 温 度 尧 ph 值 尧 时 间 和 底 物 袁 这 些 都 是 酶 活 性 测 定 系 统 中 最 重 要 的 因 素 袁 对 酶 促 反 应 速 度 影 响 很 大 遥 下 才 有 意 义 遥 ph 值 影 响 酶 活 性 的 原 因 可 能 有 以 下 几 个 方 面 院 淤 过 酸 或 过 碱 可 以 使 酶 的 空 间 结 构 破 坏 袁 引 起 酶 构 象 的 改 变 袁 也 影 响 酶 活 性 部 位 催 化 基 团 和 结 合 基 团 的 解 离 状 态 袁 使 酶 活 性 丧 失 曰 于 当 ph 值 改 变 不 是 很 剧 烈 时 袁 酶 虽 未 变 性 袁 但 酶 活 性 受 到 了 影 响 遥 ph 值 1.1 温 度 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 酶 制 剂 对 温 度 非 常 敏 感 袁 在 检 测 过 程 中 对 温 度 的 影 响 了 底 物 的 解 离 状 态 袁 或 者 使 底 物 不 能 和 酶 结 合 袁 或 者 结 合 后 不 能 生 成 产 物 遥 ph 值 影 响 酶 分 子 活 性 部 控 制 非 常 重 要 遥 温 度 对 酶 活 性 的 影 响 主 要 表 现 在 两 个 方 面 袁 一 方 面 是 当 温 度 升 高 时 袁 酶 与 底 物 的 反 应 速 率 位 上 有 关 基 团 的 解 离 袁 从 而 影 响 与 底 物 的 结 合 或 催 化 袁 使 酶 活 性 降 低 可 能 影 响 到 中 间 络 合 的 解 离 状 态 袁 不 利 于 酶 解 生 成 产 物 曰 盂 ph 值 影 响 维 持 酶 分 子 空 间 结 构 的 有 关 基 团 解 离 袁 从 而 影 响 了 酶 活 性 部 位 的 构 汤 海 鸥, 北 京 挑 战 生 物 技 术 有 限 公 司,100081, 北 京 市 海 淀 区 中 关 村 南 大 街 12 号 汪 勇 李 富 伟, 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一 作 者 收 稿 日 期 : 象 袁 进 而 影 响 酶 的 活 性 曰 榆 ph 值 影 响 底 物 的 带 电 状 态 遥 这 些 都 直 接 影 响 酶 和 底 物 的 亲 和 力 袁 影 响 酶 解 反 应 速 度 ( 王 静,2003 曰 李 险 峰,2000) 遥 据 文 献 报 道 袁 很 多 酶 的 最 适 酶 解 ph 值 都 在 3.0 耀 6.0 之 间 (NAKAMURA T, 12

13 酶 制 剂 汤 海 鸥 等 : 关 于 饲 用 酶 制 剂 活 性 测 定 影 响 因 素 的 分 析 1997 冤 遥 研 究 不 同 ph 值 对 嗜 热 毛 壳 菌 木 聚 糖 酶 活 性 的 影 响 发 现 袁 在 ph 值 3.6 以 前 袁 随 着 ph 值 的 增 大 袁 木 聚 糖 酶 的 活 性 逐 渐 升 高 曰 ph 值 为 3.6 时 袁 木 聚 糖 酶 的 活 性 最 高 袁 且 在 3.2~4.4 范 围 内 木 聚 糖 酶 的 活 性 维 持 较 高 浓 度 袁 维 持 嗜 热 毛 壳 菌 木 聚 糖 酶 活 性 的 适 宜 ph 值 范 围 应 为 3.2~4.4 渊 王 爱 娜 等 袁 2006 冤 遥 杨 会 涛 等 渊 2006 冤 研 究 ph 值 对 木 聚 糖 酶 活 性 影 响 的 结 果 表 明 袁 该 酶 的 关 曰 当 底 物 浓 度 升 高 到 g/ml 以 上 时 袁 酶 活 性 随 底 物 浓 度 的 升 高 幅 度 趋 缓 ( 聂 国 兴 等 袁 2002) 遥 研 究 底 物 对 纤 维 素 酶 活 性 测 定 影 响 袁 结 果 表 明 袁 以 Sigma 公 司 生 产 的 C5678 为 底 物 袁 纤 维 素 酶 活 性 测 定 值 明 显 高 于 以 上 海 产 的 羧 甲 基 纤 维 素 钠 为 底 物 的 测 定 值, 且 C5678 浓 度 大 于 3 豫 后, 其 浓 度 对 纤 维 素 酶 活 性 测 定 值 无 明 显 影 响 ( 顾 赛 红 等,2006) 遥 最 适 反 应 ph 值 为 6.0 遥 洪 枫 等 渊 2000 冤 在 研 究 木 聚 糖 酶 最 适 ph 值 时 指 出 袁 里 氏 木 霉 RutC30 合 成 的 木 聚 糖 2 影 响 饲 用 酶 制 剂 活 性 测 定 的 非 定 义 要 素 在 进 行 酶 制 剂 检 测 的 过 程 中 袁 除 了 以 上 分 析 的 几 酶 的 最 适 ph 值 范 围 在 4.0 耀 5.0 之 间 袁 ph 值 对 木 聚 糖 酶 的 酶 活 性 影 响 很 大 遥 点 酶 活 性 定 义 中 规 定 影 响 饲 用 酶 制 剂 测 定 结 果 的 因 素 外 袁 酶 活 性 测 定 方 法 中 还 存 在 许 多 对 酶 活 性 测 定 结 1.3 作 用 时 间 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 酶 催 化 反 应 的 动 力 学 表 明 袁 酶 解 是 一 个 有 一 定 时 果 影 响 很 大 的 非 定 义 因 素 袁 这 其 中 包 括 样 品 酶 的 稀 释 度 尧 标 准 曲 线 的 制 作 尧 显 色 剂 的 配 置 尧 缓 冲 液 的 离 子 强 间 差 的 过 程 袁 当 酶 解 产 物 达 到 一 定 浓 度 后 会 对 酶 产 生 度 等 遥 反 馈 抑 制 作 用 袁 因 而 反 应 速 度 随 着 时 间 延 长 会 越 来 越 慢 袁 所 以 酶 解 并 非 酶 解 时 间 越 长 越 好 遥 测 定 木 聚 糖 酶 2.1 酶 液 稀 释 度 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 测 定 酶 样 时 进 行 稀 释 可 能 带 来 两 种 效 应 袁 一 是 影 酶 促 反 应 从 开 始 至 30 min 内 的 产 物 生 成 量 袁 结 果 表 明 袁 13 min 内 产 物 的 吸 光 度 随 反 应 时 间 几 乎 呈 线 性 增 加 袁 其 斜 率 可 以 代 表 酶 促 反 应 的 初 速 度 袁 此 后 速 度 减 慢 ( 单 位 时 间 内 产 生 的 还 原 糖 量 呈 下 降 趋 势 ) 袁 相 对 酶 活 逐 渐 降 低 渊 费 笛 波 等 袁 2004 冤 遥 用 DNS 法 测 定 纤 维 素 酶 活 性 时 袁 反 应 1min 后 袁 酶 作 用 底 物 产 生 的 还 原 糖 量 随 时 间 延 长 呈 直 线 上 升 曰 5min 后 还 原 糖 量 的 增 加 变 得 比 较 缓 慢 曰 10 min 后 袁 曲 线 呈 现 水 平 状 态 袁 还 原 糖 量 不 再 增 加 袁 以 后 随 着 时 间 的 延 长 相 对 酶 活 性 逐 渐 降 低 渊 王 琳 等 袁 1998 冤 遥 响 酶 的 稳 定 性 曰 二 是 降 低 样 品 中 原 有 抑 制 因 素 和 辅 助 因 素 的 浓 度 遥 目 前 测 定 酶 活 性 的 方 法 通 常 是 先 把 酶 稀 释 袁 然 后 测 定 稀 释 酶 的 活 性 袁 所 得 到 的 结 果 乘 以 稀 释 倍 数 即 为 原 酶 的 活 性 遥 但 是 袁 事 实 上 许 多 酶 的 活 性 和 稀 释 倍 数 并 不 成 比 例 关 系 遥 据 陆 文 清 等 (2002) 分 析, 选 择 酶 样 的 稀 释 倍 数 实 质 上 是 选 择 酶 分 子 与 底 物 分 子 之 间 的 数 量 比 例, 二 者 的 比 例 只 有 在 适 当 的 范 围 内 酶 蛋 白 的 活 性 才 与 产 物 的 生 成 量 呈 线 性 正 比 例 关 系 遥 酶 样 稀 释 倍 数 过 大 会 影 响 酶 活 的 稳 定 性, 稀 释 倍 数 不 同 最 终 获 得 的 酶 活 性 测 定 值 有 很 大 差 异 ( 顾 赛 红 等, 1.4 底 物 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 底 物 的 选 择 对 酶 活 性 的 测 定 影 响 也 很 大 遥 米 氏 方 2006) 遥 费 笛 波 等 (2004) 为 探 讨 稀 释 率 对 木 聚 糖 酶 测 定 结 果 的 影 响, 将 酶 样 稀 释 度 从 1000 倍 升 至 程 表 达 了 酶 反 应 速 度 与 底 物 浓 度 之 间 的 定 量 关 系 袁 其 反 应 方 程 式 可 表 示 为 院 E 垣 S 饮 寅 ES 寅 PE 袁 首 先 酶 渊 E 冤 和 底 物 渊 S 冤 作 用 形 成 中 间 产 物 渊 ES 冤 袁 然 后 形 成 产 物 渊 P 冤 并 释 放 出 酶 渊 E 冤 遥 在 此 平 衡 反 应 中 袁 底 物 的 浓 度 将 影 响 反 应 速 度 遥 当 底 物 浓 度 较 低 时 袁 底 物 浓 度 与 酶 活 性 成 倍 袁 结 果 表 明 袁 稀 释 度 的 改 变 明 显 影 响 酶 活 性 的 测 定 结 果 袁 稀 释 度 低 袁 因 吸 光 值 太 大 使 结 果 大 大 偏 低 曰 但 稀 释 度 过 大 因 A 值 过 小 袁 结 果 也 偏 低 遥 因 此 袁 测 定 时 应 规 定 合 理 的 吸 光 值 范 围 ( 以 0.2 耀 0.5 为 宜 ) 袁 以 获 得 相 对 稳 定 的 测 定 结 果 遥 正 比 关 系 曰 当 底 物 浓 度 增 加 到 一 定 浓 度 时 袁 酶 活 将 趋 于 一 个 极 限 值 袁 这 时 酶 已 被 底 物 所 饱 和 袁 所 以 在 测 定 2.2 标 准 曲 线 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 标 准 曲 线 是 酶 制 剂 检 测 过 程 中 能 求 出 检 测 值 的 酶 活 性 时 袁 底 物 浓 度 应 大 于 这 个 极 限 值 袁 这 样 酶 活 性 直 接 正 比 于 酶 浓 度 而 与 底 物 浓 度 无 关, 否 则 会 极 大 地 影 响 测 定 结 果 遥 研 究 底 物 浓 度 对 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 的 影 响 袁 结 果 表 明 院 底 物 浓 度 对 测 定 结 果 有 较 大 影 响 袁 底 物 浓 度 越 高 袁 测 定 结 果 也 越 高 曰 底 物 浓 度 在 耀 g/ml 时, 酶 活 性 的 升 高 与 底 物 浓 度 呈 显 著 正 相 唯 一 对 照 依 据 袁 曲 线 方 程 的 大 小 直 接 影 响 换 算 出 来 的 测 定 值 遥 为 了 减 少 系 统 误 差 给 测 定 带 来 的 影 响 袁 标 准 曲 线 制 作 时 应 尽 可 能 和 样 品 在 同 一 条 件 下 反 应 遥 标 准 曲 线 的 制 作 一 般 可 以 采 用 相 对 法 和 绝 对 法 两 种 形 式 袁 相 对 法 是 借 助 已 知 准 确 含 量 的 酶 标 准 对 照 品 作 标 准 曲 线 曰 绝 对 法 则 是 用 一 些 酶 活 性 定 义 中 规 定 的 反 应 产 13

14 汤 海 鸥 等 : 关 于 饲 用 酶 制 剂 活 性 测 定 影 响 因 素 的 分 析 酶 制 剂 物 来 衡 量 酶 解 产 物 作 标 准 曲 线 遥 相 对 于 绝 对 法 袁 相 对 法 测 定 结 果 精 度 高 尧 速 度 快 尧 费 用 低 遥 分 析 来 自 不 同 实 验 室 的 测 定 结 果 表 明 袁 两 种 方 法 的 精 确 度 有 近 3 倍 的 差 异 渊 张 若 寒 袁 2001 冤 遥 绝 对 法 适 用 于 法 定 的 质 量 认 证 及 仲 裁 机 构 标 定 植 酸 酶 标 准 品 含 量 袁 为 一 般 单 位 常 规 测 定 提 供 基 准 物 质 袁 相 对 法 适 用 于 一 般 有 日 常 测 定 需 要 的 机 构 或 企 业 遥 2.3 显 色 剂 的 配 置 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 在 酶 制 剂 检 测 反 应 的 最 后 都 要 对 反 应 产 物 进 行 显 色 袁 并 以 不 同 的 方 式 对 比 产 物 的 生 成 量 袁 一 般 应 用 分 光 光 度 计 法 较 多 袁 也 有 用 滴 定 法 等 其 它 方 法 遥 其 中 袁 显 色 剂 类 型 的 不 同 尧 相 同 显 色 剂 但 其 中 物 质 配 比 的 不 同 尧 显 色 剂 在 反 应 中 添 加 量 的 不 同 以 及 显 色 时 间 的 不 同 袁 都 会 产 生 不 同 的 反 应 结 果 袁 对 酶 活 性 检 测 的 值 也 会 产 生 一 定 的 影 响 遥 植 酸 酶 酶 活 性 测 定 的 机 理 都 是 利 用 酶 水 解 植 酸 钠 底 物 形 成 无 机 磷 袁 然 后 测 定 无 机 磷 的 释 放 量 袁 采 用 4 种 显 色 方 法 对 比 测 定 植 酸 酶 反 应 产 生 的 无 机 磷 袁 分 别 是 院 丙 酮 磷 钼 酸 铵 法 尧 钒 钼 酸 铵 法 尧 维 生 素 C 钼 蓝 法 尧 钼 蓝 法 袁 对 比 结 果 表 明 袁 丙 酮 磷 钼 酸 铵 法 较 其 它 3 种 方 法 更 具 有 优 势 ( 黄 遵 锡 等 袁 1999) 遥 聂 国 兴 渊 2002 冤 研 究 了 DNS 量 对 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 的 影 响 袁 结 果 表 明 袁 由 于 DNS 用 量 变 化 袁 测 定 结 果 也 发 生 了 明 显 变 化 袁 DNS 用 量 在 3ml 时 测 得 的 酶 活 性 最 高 遥 王 琳 等 渊 1998 冤 研 究 DNS 法 测 定 纤 维 素 酶 活 性 最 适 条 件 袁 结 果 表 明 袁 DNS 显 色 5min 比 较 适 宜 遥 2.4 缓 冲 液 的 离 子 强 度 对 酶 活 性 测 定 的 影 响 反 应 体 系 中 缓 冲 液 的 离 子 强 度 影 响 酶 制 剂 的 蛋 白 空 间 结 构 袁 从 而 影 响 其 催 化 能 力 遥 所 以 袁 测 定 酶 活 性 时 应 尽 可 能 统 一 反 应 缓 冲 液 的 种 类 和 离 子 强 度 遥 研 究 植 酸 酶 测 定 所 用 缓 冲 液 时 发 现 袁 使 用 柠 檬 酸 缓 冲 液 测 定 商 业 植 酸 酶 渊 真 菌 植 酸 酶 和 细 菌 植 酸 酶 冤 的 酶 活 性 仅 相 对 于 使 用 乙 酸 缓 冲 液 的 65 豫 耀 70 豫 渊 Nelson E. Ward 等 袁 2007 冤 遥 Dalsgaard 等 渊 2007 冤 研 究 发 现 袁 用 柠 檬 酸 缓 冲 液 检 测 两 种 大 肠 杆 菌 植 酸 酶 的 酶 活 性 只 相 当 于 用 乙 酸 缓 冲 液 得 到 的 酶 活 性 的 三 分 之 一 遥 3 结 语 酶 活 性 的 测 定 在 饲 用 酶 制 剂 产 品 的 质 量 检 验 尧 产 品 标 签 和 酶 活 性 保 证 方 面 是 必 不 可 少 的 遥 酶 活 性 测 定 是 一 种 非 常 细 致 的 工 作 袁 以 上 分 析 了 一 些 影 响 酶 制 剂 检 测 的 主 要 影 响 因 素 袁 但 在 酶 制 剂 检 测 的 过 程 中 袁 有 些 细 节 问 题 对 酶 制 剂 检 测 也 会 产 生 一 定 的 影 14 响 袁 如 一 些 操 作 细 节 尧 离 心 速 度 尧 摇 匀 力 度 和 次 数 尧 搅 拌 时 间 尧 移 液 器 的 正 确 使 用 以 及 玻 璃 仪 器 的 清 洁 度 等 遥 这 些 细 节 可 能 不 是 酶 制 剂 研 究 工 作 者 非 常 关 注 和 研 究 的 焦 点 袁 但 对 一 些 性 质 不 稳 定 的 酶 制 剂 进 行 检 测 时 袁 这 些 细 节 问 题 的 疏 忽 也 会 对 结 果 产 生 较 大 的 影 响 遥 所 以 袁 在 饲 用 酶 制 剂 活 性 检 测 过 程 中 袁 不 但 要 注 意 影 响 酶 制 剂 活 性 测 定 的 主 要 因 素 袁 正 确 把 握 各 影 响 因 素 的 关 键 点 袁 对 于 一 些 其 它 的 细 小 影 响 因 素 也 同 样 要 关 注 袁 尽 量 把 酶 制 剂 检 测 过 程 中 每 一 个 要 点 和 步 骤 做 好 遥 参 考 文 献 1 李 卫 芬, 孙 建 义, 许 梓 荣, 等. 木 聚 糖 酶 的 稳 定 性 研 究 [J]. 云 南 农 业 大 学 学 报,1999,14(3):250 耀 王 琳, 刘 国 生, 王 林 嵩, 等.DNS 法 测 定 纤 维 素 酶 活 力 最 适 条 件 研 究 [J]. 河 南 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ),1998,26(3):66 耀 69 3 王 静.Aspergillus ficuum 菊 粉 酶 及 其 酶 解 菊 芋 制 备 低 聚 果 糖 的 研 究 [D]. 博 士 学 位 论 文, 无 锡 : 江 南 大 学, 李 险 峰. 猪 肾 氨 基 酰 化 酶 纯 化 及 性 质 研 究 [D]. 硕 士 学 位 论 文, 大 连 : 大 连 理 工 大 学, NAKAMURA T, SHITARA A, MATSUDA S, et al. Production, pu 原 rification and properties of an endoinulinase of Penicillium sp. TN88 that liberates inulinase[j]. J. Ferment. Bioeng., 1997, 84(4): 313 耀 王 爱 娜, 杨 在 宾, 杨 维 仁, 等. 温 度 和 ph 值 对 嗜 热 毛 壳 菌 木 聚 糖 酶 活 性 影 响 的 研 究 [J]. 家 畜 生 态 学 报,2006,27(3):35 耀 38 7 杨 会 涛, 陈 代 文, 余 冰.pH 对 木 聚 糖 酶 活 性 的 影 响 [J]. 饲 料 博 览, 2006(7):42 耀 44 8 洪 枫, 陈 牧, 余 世 袁. 木 聚 糖 酶 最 适 ph 值 的 研 究 [J]. 纤 维 素 科 学 与 技 术,2000,8(2):13 耀 17 9 费 笛 波, 冯 观 泉, 袁 超. 饲 用 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 方 法 的 研 究 [J]. 浙 江 农 业 学 报,2004,16(2):53 耀 聂 国 兴, 李 春 喜, 张 建 新, 等. 底 物 浓 度 DNS 量 对 木 聚 糖 酶 活 性 测 定 结 果 的 影 响 [J]. 饲 料 工 业,2002,23(11):24 耀 顾 赛 红, 赵 志 辉, 陈 海 燕, 等. 底 物 和 酶 液 稀 释 对 黑 曲 霉 纤 维 素 酶 活 性 测 定 的 影 响 [J]. 中 国 饲 料,2006(7):9 耀 陆 文 清, 李 德 发. 影 响 饲 料 酶 活 力 测 定 的 因 素 分 析 [J]. 饲 料 研 究, 2002(5):15 耀 张 若 寒. 植 酸 酶 含 量 测 定 的 必 要 性 与 两 步 测 定 方 法 的 评 价 [J]. 饲 料 工 业,2001,22(9):1 耀 5 14 黄 遵 锡, 章 克 昌, 徐 柔. 植 酸 酶 活 测 定 不 同 方 法 的 比 较 研 究 [J]. 饲 料 工 业,1999,20(12):20 耀 Nelson E. Ward, Donnie R. Campbell. Phytase activity expression requires understanding [J]. FEED AND LIVESTOCK TECHNICAL BULLETIN, 2007(9):10 耀 15 ( 编 辑 : 高 雁,snowyan78@tom.com)

15 酶 制 剂 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 朱 建 平 陈 明 孙 伟 鹏 魏 敏 吴 广 兵 汝 应 俊 摘 要 选 用 2880 只 樱 桃 谷 M3 肉 鸭, 分 为 6 组 ( 每 组 6 个 重 复, 每 个 重 复 80 只 肉 鸭 ), 对 植 酸 酶 在 不 同 的 营 养 浓 度 下 对 肉 鸭 饲 料 中 的 潜 在 营 养 价 值 ( 磷 钙 代 谢 能 和 氨 基 酸 ) 进 行 生 产 应 用 评 估 结 果 表 明 : 淤 降 低 日 粮 中 磷 钙 代 谢 能 和 氨 基 酸 的 量 而 不 添 加 植 酸 酶, 肉 鸭 的 生 长 发 育 明 显 受 阻, 料 重 比 升 高, 并 伴 有 较 严 重 的 腿 病 发 生 ; 于 降 低 日 粮 中 磷 钙 代 谢 能 和 氨 基 酸 后, 添 加 植 酸 酶 可 显 著 改 善 料 重 比 提 高 体 重 和 成 活 率 降 低 腿 病 率, 各 个 生 产 指 标 达 到 了 正 对 照 组 的 水 平, 而 经 济 效 益 高 于 正 对 照 组 关 键 词 植 酸 酶 ; 养 分 利 用 率 ; 料 重 比 ; 肉 鸭 中 图 分 类 号 S 材 料 与 方 法 1.1 试 验 时 间 和 地 点 本 试 验 于 2006 年 4 耀 5 月 在 山 东 呱 呱 鸭 食 品 有 限 公 司 进 行 遥 1.2 试 验 分 组 试 验 选 用 2880 只 1 日 龄 樱 桃 谷 M3 肉 鸭 袁 分 为 6 组 袁 每 组 6 个 重 复 袁 每 个 重 复 80 只 肉 鸭 遥 试 验 分 3 个 阶 段 院 0 耀 14 d 为 前 期 尧 12 耀 28 d 为 中 期 尧 29 耀 42 d 为 后 期 袁 由 于 植 酸 酶 不 耐 制 粒 温 度 袁 而 且 没 有 后 喷 涂 设 备 袁 故 试 验 料 饲 料 全 部 为 粉 料 遥 1.3 分 组 依 据 按 我 国 南 尧 北 方 肉 鸭 养 殖 水 平 不 同, 试 验 饲 料 分 成 二 大 类 别, 一 种 按 北 方 养 鸭 模 式 设 计 配 方 曰 另 一 种 按 南 方 养 殖 模 式 设 计 配 方 袁 并 在 每 一 大 类 配 方 类 别 中 设 正 对 照 组 尧 加 植 酸 酶 试 验 组 与 不 加 植 酸 酶 负 对 照 组, 其 中 植 酸 酶 添 加 量 为 每 千 克 饲 料 加 入 500 FTU, 具 体 分 组 情 况 见 表 1 遥 1.4 试 验 配 方 设 计 表 1 试 验 设 计 与 分 组 营 养 水 平 低 营 养 浓 度 渊 南 方 地 区 冤 高 营 养 浓 度 渊 北 方 地 区 冤 组 别 试 验 1 组 ( 正 对 照 组 ) 试 验 2 组 ( 植 酸 酶 组 ) 试 验 3 组 ( 负 对 照 组 ) 试 验 4 组 ( 正 对 照 组 ) 试 验 5 组 ( 植 酸 酶 组 ) 试 验 6 组 ( 负 对 照 组 ) 日 粮 设 计 低 营 养 正 常 日 粮 负 对 照 组 植 酸 酶 低 营 养 日 粮 渊 调 低 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 氨 基 酸 冤 不 加 植 酸 酶 高 营 养 正 常 日 粮 负 对 照 组 植 酸 酶 高 营 养 日 粮 渊 调 低 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 氨 基 酸 冤 不 加 植 酸 酶 按 南 方 养 鸭 模 式 与 北 方 养 鸭 模 式 袁 参 照 南 尧 北 方 肉 鸭 配 方 与 原 料 特 点 袁 设 计 与 南 方 低 营 养 浓 度 模 式 和 北 方 高 营 养 浓 度 模 式 配 方 相 类 似 的 正 对 照 组 日 粮 配 方 见 表 2 遥 利 用 丹 尼 斯 克 Phycheck 誖 禽 畜 潜 在 营 养 价 值 模 型 袁 在 添 加 植 酸 酶 后 对 肉 鸭 前 期 尧 中 期 尧 后 期 配 合 饲 料 中 各 营 养 指 标 的 潜 在 提 高 值 为 基 础 渊 如 表 3 冤 袁 在 试 验 正 对 照 组 基 础 上 降 低 相 应 潜 在 营 养 提 高 量 袁 设 计 负 对 照 组 配 方 如 表 4 遥 植 酸 酶 试 验 组 则 在 每 千 克 负 对 照 组 日 粮 中 添 加 500 FTU 植 酸 酶 袁 加 酶 后 由 于 潜 在 营 养 提 高 而 与 相 应 的 正 对 照 组 营 养 水 平 接 近 遥 朱 建 平, 江 南 大 学 食 品 学 院, 副 教 授,214122, 江 苏 省 无 锡 市 蠡 湖 大 道 1800 号 陈 明 孙 伟 鹏 魏 敏, 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一 作 者 吴 广 兵 汝 应 俊, 丹 尼 斯 克 动 物 营 养, 广 州 收 稿 日 期 : 项 目 表 2 原 料 (%) 玉 米 花 生 粕 豆 粕 菜 粕 棉 粕 磷 酸 氢 钙 石 粉 食 盐 前 期 预 混 料 中 期 预 混 料 后 期 预 混 料 油 脂 合 计 营 养 水 平 代 谢 能 (MJ/kg) 粗 蛋 白 (%) 钙 (%) 总 磷 (%) 可 利 用 磷 (%) 赖 氨 酸 (%) 蛋 氨 酸 胱 氨 酸 (%) 正 对 照 组 日 粮 配 方 及 营 养 水 平 低 营 养 浓 度 前 期 中 期 后 期 高 营 养 浓 度 前 期 中 期 后 期

16 朱 建 平 等 : 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 酶 制 剂 表 3 不 同 营 养 水 平 日 粮 中 添 加 植 酸 酶 500 FTU 可 提 高 的 潜 在 营 养 值 项 目 可 利 用 磷 渊 % 冤 钙 (%) 代 谢 能 (kj/kg) 粗 蛋 白 (%) 赖 氨 酸 (%) 蛋 氨 酸 (%) 胱 氨 酸 (%) 蛋 氨 酸 胱 氨 酸 (%) 前 期 低 营 养 浓 度 中 期 后 期 前 期 高 营 养 浓 度 中 期 后 期 项 目 表 4 原 料 (%) 玉 米 花 生 粕 豆 粕 菜 粕 棉 粕 磷 酸 氢 钙 石 粉 食 盐 前 期 预 混 料 中 期 预 混 料 后 期 预 混 料 沸 石 粉 油 脂 合 计 营 养 水 平 代 谢 能 (MJ/kg) 粗 蛋 白 (%) 钙 (%) 总 磷 (%) 可 利 用 磷 (%) 赖 氨 酸 (%) 蛋 氨 酸 胱 氨 酸 (%) 负 对 照 组 日 粮 配 方 及 营 养 水 平 低 营 养 浓 度 前 期 中 期 后 期 高 营 养 浓 度 前 期 中 期 后 期 饲 养 管 理 肉 鸭 全 程 采 用 网 上 平 养 袁 全 天 24 h 光 照 袁 1 耀 10 日 龄 采 用 育 雏 棚 温 室 饲 养 袁 11 日 龄 转 入 大 棚 袁 棚 内 自 然 通 风 袁 室 温 下 养 殖 袁 温 度 基 本 保 证 在 20 益 左 右 遥 每 天 饲 喂 2 次 袁 早 晚 各 1 次 袁 基 本 保 证 肉 鸭 自 由 采 食 袁 同 时 保 证 饮 水 供 应 袁 以 不 影 响 采 食 为 准 遥 1 耀 14 日 龄 饲 喂 肉 鸭 前 期 粉 料 曰 15 耀 28 日 龄 饲 喂 肉 鸭 中 期 粉 料 曰 29 耀 42 日 龄 饲 喂 肉 鸭 后 期 粉 料 遥 换 料 时 过 渡 喂 料 袁 按 照 3 1 尧 1 1 尧 1 3 过 渡 饲 喂 遥 试 验 过 程 中 采 用 正 常 的 免 疫 程 序 进 行 免 疫 遥 每 天 观 察 记 录 鸭 的 生 长 情 况 尧 耗 料 量 尧 腿 病 情 况 尧 死 亡 情 况 等 袁 及 时 对 死 鸭 进 行 处 理 袁 保 证 不 影 响 大 群 的 生 长 遥 于 12 日 龄 时 对 所 有 肉 鸭 绞 嘴 袁 防 止 30 日 龄 后 啄 羽 影 响 肉 鸭 中 后 期 生 长 袁 并 于 0 尧 14 尧 28 尧 42 日 龄 对 每 重 复 称 总 重 袁 同 时 对 各 期 饲 料 进 行 结 算 遥 2 结 果 与 分 析 2.1 生 产 性 能 对 肉 鸭 各 期 饲 养 试 验 数 据 进 行 处 理 与 分 析 袁 添 加 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 结 果 见 表 5 遥 表 5 添 加 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 项 目 入 试 鸭 数 ( 只 ) 雏 鸭 均 重 (g/ 只 ) 前 期 (0 耀 14 d) 均 重 (g/ 只 ) 料 重 比 成 活 率 (%) 冤 腿 病 率 (%) 中 期 (15 耀 28 d) 均 重 (g/ 只 ) 料 重 比 成 活 率 (%) 腿 病 率 (%) 后 期 (29 耀 42 d) 均 重 (g/ 只 ) 料 重 比 成 活 率 (%) 腿 病 率 (%) 全 期 (0 耀 42 d) 均 重 (g/ 只 ) 料 重 比 成 活 率 (%) 试 验 1 组 依 依 10.6 b 1.59 依 0.07 b 98.8 依 依 1.05 a 依 50.4 b 2.34 依 0.08 b 99.4 依 0.7 ab 1.04 依 0.94 a 依 72.0 b 3.58 依 0.15 b 99.8 依 依 0.65 b 依 72.0 b 2.61 依 0.03 b 97.9 依 1.7 试 验 2 组 依 依 14.0 b 1.58 依 0.03 b 98.8 依 依 0.65 a 依 37.8 b 2.36 依 0.07 b 99.8 依 0.5 a 0.63 依 0.68 a 依 70.2 b 3.59 依 0.11 b 依 依 0.65 ab 依 70.2 b 2.61 依 0.04 b 98.5 依 1.5 试 验 3 组 依 依 8.7 c 1.66 依 0.08 c 98.3 依 依 2.04 c 依 31.3 c 2.55 依 0.04 c 99.4 依 0.7 ab 4.17 依 1.51 b 依 33.5 c 3.87 依 0.10 c 依 依 1.84 c 依 33.5 c 2.79 依 0.05 c 97.7 依 1.8 试 验 4 组 依 依 10.0 a 1.51 依 0.02 a 97.7 依 依 1.02 a 依 34.1 a 2.25 依 0.05 a 99.8 依 0.5 a 0.83 依 0.65 a 依 36.1 a 3.01 依 0.09 a 99.8 依 依 0.65 ab 依 36.1 a 2.39 依 0.02 a 97.3 依 0.9 试 验 5 组 依 依 5.8 a 1.50 依 0.02 a 97.5 依 依 0.65 a 依 48.4 a 2.17 依 0.10 a 依 0.0 a 0.83 依 0.65 a 依 53.7 a 3.04 依 0.08 a 99.8 依 依 0.79 ab 依 53.7 a 2.36 依 0.05 a 97.3 依 0.9 注 院 同 行 数 据 肩 标 相 邻 字 母 表 示 差 异 显 著 渊 P<0.05 冤 袁 相 隔 字 母 表 示 差 异 极 显 著 渊 P<0.01 冤 遥 下 表 同 遥 试 验 6 组 依 依 12.1 b 1.55 依 0.04 ab 98.1 依 依 2.04 c 依 53.9 b 2.35 依 0.03 b 98.7 依 1.1 b 3.96 依 1.66 b 依 28.8 b 3.56 依 0.07 b 依 依 1.46 c 依 28.8 b 2.62 依 0.04 b 96.9 依

17 酶 制 剂 朱 建 平 等 : 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 前 期 均 重 和 料 重 比 试 验 各 组 存 在 差 异, 高 营 养 浓 度 饲 料 的 料 重 比 和 生 长 明 显 优 于 低 营 养 浓 度 (P<0.05), 在 低 营 养 与 高 营 养 浓 度 条 件 下, 添 加 植 酸 酶 组 与 正 对 照 组 相 比 生 长 与 料 重 比 差 异 不 显 著, 而 正 对 照 与 试 验 组 的 生 产 性 能 高 于 负 对 照 组 (P<0.05) 遥 对 14 日 龄 腿 病 率 进 行 统 计 结 果 表 明, 试 验 各 组 与 负 对 照 组 存 在 极 显 著 差 异 (P<0.01) 遥 两 营 养 浓 度 条 件 下 的 正 对 照 组 与 添 加 植 酸 酶 组 之 间 的 腿 病 发 病 率 无 差 异, 而 各 负 对 照 组 腿 病 率 极 显 著 地 高 于 正 对 照 组 与 添 加 植 酸 酶 组 (P<0.01) 遥 试 验 中 期 尧 后 期 及 对 全 期 均 重 尧 料 重 比 和 腿 病 率 结 果 基 本 同 前 期 遥 试 验 各 组 的 成 活 率 无 显 著 差 异 (P>0.05) 遥 2.2 经 济 收 益 分 析 试 验 结 束 后 对 试 验 各 组 每 重 复 进 行 经 济 收 益 测 算 袁 其 结 果 见 表 6 遥 组 别 试 鸭 渊 只 冤 前 期 耗 料 渊 kg 冤 中 期 耗 料 渊 kg 冤 后 期 耗 料 渊 kg 冤 毛 鸭 重 渊 kg 冤 前 期 料 价 渊 元 /t 冤 中 期 料 价 渊 元 /t 冤 后 期 料 价 渊 元 /t 冤 毛 鸭 单 价 渊 元 冤 苗 鸭 单 价 渊 元 冤 苗 鸭 总 价 渊 元 冤 总 料 价 渊 元 冤 总 鸭 价 格 渊 元 冤 收 益 渊 元 冤 试 验 1 组 依 依 依 依 b 表 6 试 验 2 组 依 依 依 依 b 试 验 各 组 每 个 重 复 组 的 经 济 收 益 试 验 3 组 依 依 依 依 c 试 验 4 组 依 依 依 依 b 试 验 5 组 依 依 依 依 a 注 院 1. 饲 料 价 格 院 饲 料 原 料 成 本 /0.98 渊 2% 损 耗 计 冤 200 元 渊 加 工 尧 包 装 尧 销 售 等 费 用 冤 袁 其 中 已 包 含 植 酸 酶 成 本 曰 2. 鸭 苗 单 价 院 鸭 苗 价 格 药 费 人 工 管 理 等 费 用 遥 试 验 6 组 依 依 依 依 c 在 高 营 养 浓 度 条 件 下 袁 添 加 植 酸 酶 组 经 济 收 益 高 于 正 对 照 组 渊 P<0.05 冤 和 负 对 照 组 渊 P<0.01 冤 遥 添 加 植 酸 酶 在 高 营 养 浓 度 配 方 中 袁 通 过 挖 掘 植 酸 酶 可 释 放 的 潜 在 营 养 价 值 渊 磷 尧 钙 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 冤 袁 经 济 效 益 可 以 比 正 对 照 组 配 方 提 高 元 遥 在 低 营 养 浓 度 条 件 下 袁 添 加 植 酸 酶 组 经 济 收 益 与 正 对 照 组 相 似 袁 但 显 著 高 于 负 对 照 组 渊 P<0.05 冤 遥 在 低 营 养 浓 度 配 方 中 添 加 植 酸 酶 通 过 挖 掘 植 酸 酶 可 释 放 的 潜 在 营 养 价 值 渊 磷 尧 钙 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 冤 袁 经 济 收 益 可 以 比 正 对 照 组 配 方 提 高 9.01 元 遥 因 此 袁 充 分 利 用 植 酸 酶 可 释 放 的 潜 在 营 养 价 值 渊 磷 尧 钙 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 冤 可 以 较 大 幅 度 的 降 低 饲 料 成 本 袁 这 对 原 料 渊 如 玉 米 和 磷 酸 氢 钙 冤 成 本 不 断 攀 升 的 市 场 情 况 如 何 帮 助 饲 料 生 产 厂 家 提 高 经 济 效 益 具 有 实 际 意 义 遥 平 袁 而 不 添 加 植 酸 酶 袁 会 明 显 影 响 肉 鸭 的 生 长 发 育 袁 增 加 料 重 比 袁 并 伴 有 较 严 重 的 腿 病 发 生 袁 出 现 较 严 重 的 缺 磷 症 状 遥 这 表 明 正 对 照 组 日 粮 的 营 养 水 平 设 置 接 近 肉 鸭 的 临 界 水 平 袁 在 此 基 础 上 袁 使 植 酸 酶 的 评 价 更 具 实 际 意 义 遥 在 降 低 日 粮 中 的 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 的 基 础 上 添 加 植 酸 酶 使 料 重 比 尧 均 重 尧 腿 病 率 和 成 活 率 均 达 到 了 正 对 照 组 的 水 平 遥 这 一 结 果 表 明 袁 添 加 植 酸 酶 能 够 提 高 磷 尧 钙 和 矿 物 质 元 素 的 消 化 和 利 用 率 遥 并 且 提 高 的 幅 度 与 Phycheck 软 件 估 测 的 数 值 接 近 遥 一 些 研 究 也 证 明 袁 添 加 植 酸 酶 可 提 高 磷 尧 钙 和 矿 物 质 元 素 的 消 化 和 利 用 率 袁 从 而 改 善 肉 鸭 生 长 性 能 袁 降 低 腿 病 率 和 死 亡 率 渊 王 润 等 袁 2000 曰 陈 伟 等 袁 2004 曰 花 薇 等 袁 2006) 遥 袁 缨 等 渊 2003 冤 的 试 验 数 据 表 明 袁 添 加 植 酸 酶 3 讨 论 提 高 肉 鸭 营 养 水 平 能 够 促 进 肉 鸭 生 长 袁 降 低 料 重 能 提 高 肉 鸭 饲 料 中 的 钙 尧 磷 尧 锰 和 锌 的 利 用 率 遥 尽 管 对 植 酸 酶 在 肉 鸭 上 的 潜 在 营 养 价 值 还 没 有 比 袁 在 本 试 验 基 础 上 袁 不 论 饲 料 原 料 价 格 与 毛 鸭 价 格 如 何 变 化 袁 均 显 示 出 高 营 养 浓 度 所 具 有 的 较 好 的 经 济 收 益 遥 降 低 日 粮 中 的 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 水 确 定 袁 但 Jalal 等 (1999) 尧 Ravindran 等 (2006) 和 Cowieson 等 渊 2006a 冤 报 道 袁 使 用 植 酸 酶 在 肉 鸡 饲 料 中 可 提 高 能 量 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 的 消 化 率 遥 植 酸 对 氮 消 化 的 影 响 主 要 是 由 于 植 酸 和 蛋 白 结 合 (Selle 等 袁 2006) 袁 植 酸 酶 通 17

18 朱 建 平 等 : 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 的 影 响 酶 制 剂 过 降 解 植 酸 袁 减 少 植 酸 和 蛋 白 结 合 来 提 高 蛋 白 的 利 用 率 遥 Jalal 等 (1999) 和 Cowieson 等 (2006b) 发 现 袁 植 酸 对 半 胱 氨 酸 的 消 化 率 的 影 响 比 其 它 氨 基 酸 更 大 遥 本 试 验 的 结 果 表 明 袁 通 过 添 加 植 酸 酶 可 降 低 大 约 kj 代 谢 能 袁 并 保 持 肉 鸭 正 常 的 生 长 性 能 遥 Ravindran 等 (2006) 和 Cowieson 等 (2006b) 的 试 验 结 果 表 明 袁 在 肉 鸡 饲 料 中 使 用 植 酸 酶 可 提 高 能 量 的 消 化 遥 这 些 研 究 有 力 的 支 持 了 我 们 的 试 验 结 果 遥 由 于 全 世 界 范 围 的 玉 米 价 格 的 上 涨 袁 饲 料 配 方 中 能 量 的 成 本 不 断 的 攀 升 袁 因 此 添 加 植 酸 酶 也 为 降 低 能 量 的 成 本 提 供 了 一 条 途 径 遥 本 试 验 中 每 千 克 日 粮 的 植 酸 酶 添 加 量 是 500 FTU 遥 因 为 不 同 的 植 酸 酶 添 加 量 对 营 养 指 标 的 潜 在 提 高 值 是 不 一 样 的 遥 如 果 要 发 挥 植 酸 酶 的 最 佳 效 果 袁 最 好 要 根 据 饲 料 的 原 料 和 动 物 的 对 植 酸 酶 生 长 反 应 模 型 来 决 定 最 佳 添 加 量 遥 但 要 确 定 植 酸 酶 在 肉 鸭 不 同 类 型 日 粮 的 最 佳 添 加 量 袁 还 需 要 做 更 多 的 消 化 代 谢 和 饲 养 试 验 遥 4 小 结 降 低 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 水 平 而 不 添 加 植 酸 酶 袁 能 明 显 影 响 肉 鸭 的 生 长 发 育 袁 提 高 料 重 比 袁 并 伴 有 较 严 重 的 腿 病 发 生 袁 出 现 较 严 重 的 缺 磷 症 状 曰 添 加 植 酸 酶 降 低 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 的 试 验 组 和 正 对 照 组 在 料 重 比 尧 均 重 尧 腿 病 率 和 成 活 率 等 各 个 指 标 上 无 显 著 差 异 曰 降 低 日 粮 钙 尧 磷 尧 代 谢 能 尧 蛋 白 质 与 氨 基 酸 水 平 后 添 加 植 酸 酶 袁 不 影 响 肉 鸭 生 长 性 能 袁 且 降 低 腿 病 率 袁 并 增 加 经 济 收 益 遥 参 考 文 献 1 陈 伟, 李 浩 棠, 胡 国 梁. 植 酸 酶 对 肉 鸭 生 产 性 能 及 钙 磷 代 谢 影 响 研 究 [J]. 江 西 农 业 大 学 学 报,2004(6):830 耀 花 薇, 魏 时 来, 孟 婕, 等. 饲 粮 中 植 酸 酶 钙 磷 不 同 水 平 组 合 对 肉 仔 鸡 生 长 和 屠 宰 性 能 的 影 响 [J]. 饲 料 工 业,2006(10):37 耀 42 3 王 润, 杨 茂 动. 低 磷 日 粮 添 加 植 酸 酶 对 肥 育 期 肉 鸭 营 养 水 平 的 影 响 [J]. 云 南 农 业 大 学 学 报,2000(3):216 耀 袁 缨, 李 菊 娣, 杨 桂 芹. 植 酸 酶 对 樱 桃 谷 肉 鸭 矿 物 元 素 利 用 率 的 影 响 [J]. 中 国 家 禽,2003(7):74 耀 77 5 Cheryan M. Phytic acid interactions in food systems[j]. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1980(13):297 耀 Cowieson AJ, T. Acamovic, M. R. Bedford. Phytic acid and phytase: implications for protein utilization by poultry [J]. Poultry Science, 2006a(85):878 耀 Cowieson A J, T. Acamovic, M. R. Bedford. Supplementation of cornsoybased diets with an Eschericia coliderived phytase: ef 原 fects on broiler chick performance and the digestibility of amino 18 acids and metabolizability of minerals and energy [J]. Poultry Sci 原 ence, 2006b(85):1 389 耀 de Rham O, T. Jost. Phytateprotein interactions in soybean extracts and lowphytate soy protein products [J]. Journal of Food Science, 1979(44):596 耀 Jalal MA, S. E. Scheideler, C. Wyatt. Effects of phytase supplemen 原 tation on egg production parameters and amino acid digestibilities[j]. Poultry Science, 1999, 78(1):74(Abstr.) 10 Lim HS, H. Namkung, I. K. Paik. Effects of phytase supplementa 原 tion on the performance, egg quality, and phosphorous excretion of laying hens fed different levels of dietary calcium and nonphytate phosphorous[j]. Poultry Science, 2003(82):92 耀 Oberleas D. Phytates. In: Toxicants Occurring Naturally in Foods. National Academy of Sciences, Washington, DC, 耀 Onyango EM, M. R. Bedford, O. Adeola. Efficacy of an evolved Escherichia coli phytase in diets of broiler chicks [J]. Poultry Sci 原 ence, 2005(84):248 耀 Panda AK, S. V. R. Rao, M. V. L. N. Raju, et al. Effect of micro 原 bial phytase on production performance of White Leghorn layers fed on adiet low in nonphytate phosphorus [J]. Br. Poultry Sci 原 ence, 2005(46):464 耀 Ravindran V, S. Cabahug, G. Ravindran, et al. Effects of phytase supplementation, individually and in combination with glycanase, on the nutritive value of wheat and barley[j]. Poultry Science, 1999 (78):1 588 耀 Ravindran V, P. C. Morel, G. G. Partridge, et al. Influence of an Escherichia coliderived phytase on nutrient utilization in broiler starters fed diets containing varying concentrations of phytic acid [J]. Poultry Science, 2006(85):82 耀 Rutherfurd SM, T. K. Chung, P. C. Morel, et al. Effect of microbial phytase on ileal digestibility of phytate phosphorus, total phospho 原 rus, and amino acids in a lowphosphorus diet for broilers[j]. Poultry Science, 2004(83):61 耀 Selle PH, V. Ravindran, W. L. Bryden, et al. Influence of dietary phytate and exogenous phytate on amino acid digestibility in poul 原 try: Areview[J]. Poultry Science, 2006(43):89 耀 Wu G, Z. Liu, M. M. Bryant, et al. Comparison of Natuphos and Phyzyme as phytase sources for commercial layers fed cornsoy di 原 et[j]. Poultry Science, 2006(85):64 耀 69 ( 编 辑 : 高 雁,snowyan78@tom.com)

19 酶 制 剂 饲 料 工 业 圆 园 园 7 年 第 圆 8 卷 第 24 期 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 基 因 的 克 隆 及 其 在 毕 赤 酵 母 中 的 表 达 研 究 权 志 中 张 丞 斌 余 荣 刘 长 江 摘 要 研 究 从 鸡 输 卵 管 组 织 提 取 细 胞 总 RNA, 根 据 Gene Bank 中 已 发 表 的 鸡 溶 菌 酶 基 因 序 列, 设 计 合 成 特 异 引 物, 合 成 cdna 序 列, 并 以 此 为 模 版,PCR 扩 增 鸡 溶 菌 酶 基 因 用 Xho I 和 Xba I 对 LYZ 基 因 的 PCR 产 物 和 真 核 表 达 载 体 ppic6 琢 A 进 行 双 酶 切 后 转 化 到 大 肠 杆 菌 (DH5 琢 ) 中, 构 建 成 为 真 核 重 组 表 达 载 体 ppic6 琢 ALYZ 该 载 体 经 PstX I 酶 切 线 性 化 后, 以 电 击 转 化 方 法 导 入 到 毕 赤 酵 母 宿 主 菌 X33 中, 经 Blasticidin 抗 性 筛 选, 得 到 鸡 溶 菌 酶 基 因 重 组 毕 赤 酵 母 菌 株 ; 甲 醇 96 h( 发 酵 罐 诱 导 100 h) 诱 导 表 达, 经 Weternblot 检 测 分 析, 基 因 重 组 工 程 菌 株 摇 瓶 诱 导 表 达 溶 菌 酶 的 表 达 量 约 为 4mg/l, 发 酵 罐 诱 导 表 达 的 表 达 量 约 为 10 mg/l 关 键 词 溶 菌 酶 ; 克 隆 ; 表 达 ; 毕 赤 酵 母 中 图 分 类 号 Q55 溶 菌 酶 渊 lysozyme 冤 是 由 英 国 细 菌 学 家 Fleming 于 1922 年 首 先 在 人 的 眼 泪 和 唾 液 中 发 现 的 袁 因 其 具 有 溶 菌 作 用 袁 被 命 名 为 溶 菌 酶 遥 它 广 泛 存 在 于 动 物 尧 植 物 和 微 生 物 中 袁 是 一 种 天 然 的 抗 菌 剂 袁 能 特 异 性 地 作 用 于 细 胞 壁 N 乙 酰 葡 萄 糖 胺 渊 Nacetylglucosamine 袁 NAG 冤 和 N 乙 酰 胞 壁 酸 渊 Nacetylmuramic acid 袁 NAM 冤 之 间 的 茁 1 袁 4 糖 苷 键 袁 破 坏 肽 聚 糖 支 架 袁 使 微 生 物 细 ppic6 琢 A 真 核 表 达 载 体 中 含 有 的 琢 factor 袁 可 实 现 胞 外 分 泌 表 达 袁 而 毕 赤 酵 母 自 身 分 泌 极 少 的 胞 外 蛋 白 袁 非 常 有 利 于 表 达 蛋 白 的 分 离 纯 化 遥 毕 赤 酵 母 表 达 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 袁 在 国 外 虽 有 报 道 袁 但 国 内 还 没 有 这 方 面 的 研 究 遥 本 研 究 将 鸡 的 溶 菌 酶 基 因 通 过 克 隆 尧 重 组 尧 诱 导 等 手 段 在 毕 赤 酵 母 中 成 功 地 表 达 了 有 活 性 的 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 遥 胞 在 内 部 渗 透 压 的 作 用 下 涨 裂 袁 细 胞 质 外 泄 袁 最 终 导 1 材 料 与 方 法 致 细 胞 死 亡 遥 溶 菌 酶 对 革 兰 氏 阳 性 菌 和 部 分 革 兰 氏 阴 性 菌 有 很 好 的 抑 菌 作 用 袁 对 人 和 动 物 的 细 胞 则 不 发 生 1.1 试 验 材 料 成 年 产 蛋 鸡 购 自 农 贸 市 场 曰 质 粒 ppic6 琢 A 尧 E.Coli 溶 菌 作 用 袁 被 WHO 和 许 多 国 家 认 定 为 无 毒 尧 无 害 尧 安 全 的 添 加 剂 袁 被 越 来 越 广 泛 地 应 用 于 医 药 尧 生 物 技 术 尧 食 品 以 及 动 物 生 产 中 遥 目 前 溶 菌 酶 主 要 从 蛋 清 中 提 取 袁 由 于 来 源 有 限 袁 生 产 工 艺 复 杂 袁 溶 菌 酶 产 量 十 分 有 限 袁 而 且 价 格 居 高 不 下 袁 难 以 满 足 越 来 越 大 的 市 场 需 求 遥 利 用 分 子 生 物 技 术 构 建 基 因 工 程 菌 袁 通 过 发 酵 手 段 生 产 溶 菌 酶 袁 将 是 提 高 溶 菌 酶 产 量 袁 降 低 成 本 的 有 效 手 段 之 一 遥 毕 赤 酵 母 表 达 系 统 是 近 年 发 展 迅 速 的 高 效 真 核 表 达 系 统 袁 其 表 达 载 体 上 有 一 个 醇 氧 化 酶 强 启 DH5 琢 及 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 渊 Pichia pastoris 冤 菌 株 X33 均 购 自 Invitrogen 公 司 曰 RTPCR 试 剂 盒 购 自 Promega 公 司 曰 PCR 引 物 由 上 海 桑 尼 生 物 公 司 合 成 曰 各 种 限 制 性 内 切 酶 和 T4 DNA 连 接 酶 购 自 Takara 公 司 曰 小 量 质 粒 DNA 抽 提 试 剂 盒 购 自 QIAGEN 公 司 曰 QIAprep spin 质 粒 DNA 纯 化 试 剂 盒 购 自 上 海 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 曰 PCR 产 物 凝 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 北 京 博 大 泰 克 生 物 基 因 技 术 有 限 责 任 公 司 曰 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 标 准 品 购 自 上 海 生 物 工 程 公 司 遥 动 子 AOX1 袁 可 以 甲 醇 作 为 唯 一 碳 源 诱 导 外 源 蛋 白 的 高 效 表 达 遥 到 目 前 为 止 袁 已 经 成 功 地 表 达 了 近 百 种 外 1.2 试 验 设 备 PTC100PCR 仪 购 自 美 国 BioRad 公 司 ;Eppendorf 源 蛋 白 遥 centrifuge 5415D 和 Eppendorf centrifuge 5417R 低 温 高 速 离 心 机 购 自 德 国 Eppendorf 公 司 曰 Backman 低 温 高 速 离 心 机 购 自 美 国 Backman 公 司 曰 电 泳 仪 购 自 天 龙 权 志 中, 沈 阳 农 业 大 学 食 品 学 院, 博 士,110161, 沈 阳 市 东 陵 区 东 陵 路 120 号 张 丞 斌, 浙 江 工 业 大 学 生 物 与 环 境 工 程 学 院 余 荣, 杭 州 康 德 权 科 技 有 限 公 司 刘 长 江, 单 位 及 通 讯 地 址 同 第 一 作 者 收 稿 日 期 : 生 物 技 术 有 限 公 司 曰 恒 温 摇 床 购 自 美 国 New Brunswick Scientific 公 司 曰 恒 温 培 养 箱 购 自 上 海 恒 科 有 限 公 司 曰 凝 胶 成 像 仪 为 TANON GIS 2010 袁 连 接 反 应 仪 为 ASTEC Block Incubator BI515A 曰 脱 色 摇 床 购 自 江 苏 海 门 麒 麟 医 用 仪 器 厂 曰 转 膜 仪 购 自 美 国 BioRad 公 司 曰 30 L 发 酵 罐 购 自 镇 江 东 方 生 物 工 程 设 备 技 术 公 19

20 权 志 中 等 : 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 基 因 的 克 隆 及 其 在 毕 赤 酵 母 中 的 表 达 研 究 酶 制 剂 司 曰 溶 氧 探 头 购 自 梅 特 勒 公 司 曰 ph 探 头 购 自 梅 特 勒 公 司,10 kda 和 50 kda 聚 砜 树 脂 膜 购 自 丹 麦 DDS 公 司 遥 1.5 cdna 测 序 与 分 析 对 上 述 重 组 质 粒 进 行 限 制 性 酶 切 分 析 袁 插 入 片 段 1.3 溶 菌 酶 基 因 的 克 隆 与 扩 增 大 小 正 确 的 重 组 质 粒 袁 上 海 桑 尼 生 物 技 术 公 司 分 别 用 鸡 输 卵 管 组 织 样 品 的 采 集 将 用 无 菌 剪 刀 采 集 1cm 3 左 右 的 新 鲜 的 尧 健 康 的 5 忆 AOX1 和 3 忆 AOX1 引 物 对 cdna 作 正 向 和 反 向 测 序 分 析 遥 所 获 序 列 用 BioEdit 软 件 进 行 分 析 和 拼 接 袁 并 鸡 输 卵 管 组 织 袁 以 无 菌 尧 ph 值 为 7.0 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 冲 洗 袁 液 氮 冷 冻 袁 置 70 益 低 温 冰 箱 保 存 袁 参 考 叶 分 子 克 用 BLAST 程 序 与 Gene Bank 中 已 报 道 的 鸡 输 卵 管 LYZ 序 列 进 行 比 对 遥 隆 试 验 指 南 曳 中 的 方 法 提 取 鸡 输 卵 管 组 织 总 RNA 袁 并 通 过 RTPCR 反 应 制 备 cdna 遥 1.6 毕 赤 酵 母 基 因 工 程 菌 株 的 筛 选 将 ppic6 琢 ALYZ 质 粒 DNA 经 PstX I 酶 切 线 性 化 设 计 引 物 根 据 Gene Bank 中 报 道 的 鸡 输 卵 管 溶 菌 酶 渊 LYZ 冤 后, 以 电 击 转 化 方 法 导 入 到 毕 赤 酵 母 宿 主 菌 X33 中, 电 击 条 件 为 : 使 用 0.2 cm 电 击 杯 袁 2.0 kv,5.5 ms 遥 电 击 后 mrna 序 列 渊 序 列 号 院 CR 冤 设 计 正 尧 反 向 PCR 引 物 袁 并 在 引 物 两 端 分 别 引 入 Xho 玉 酶 切 位 点 和 Xba I 酶 切 位 点 袁 其 序 列 分 别 为 院 LYZXho I 院 5 忆 GGGCTCGAGAAAAGAAAAGTC TTTGGACGATGTGAG3 忆 迅 速 加 入 1ml 冰 冷 的 1mol/l 山 梨 醇, 转 入 15 ml 离 心 管,28 益 温 箱 内 静 置 孵 育 1 耀 2h, 然 后 分 别 取 50 尧 100 尧 200 滋 l 涂 布 含 有 100 滋 g/ml Blasticidin 抗 性 的 YPAD 平 板,28 益 温 箱 内 培 养 2 耀 3d, 每 天 观 察 菌 落 生 长 情 况, 筛 选 生 长 快 速 且 抗 Blasticidin 的 阳 性 克 隆 菌 株 遥 LYZXba I 院 5 忆 CCCTCTAGATCACAGCCGGCAG 1.7 诱 导 表 达 鸡 蛋 清 溶 菌 酶 CCTCTGAT3 忆 摇 瓶 诱 导 表 达 重 组 溶 菌 酶 PCR 扩 增 鸡 溶 菌 酶 基 因 以 LYZXho I 和 LYZXba I 为 引 物 袁 以 制 备 的 挑 选 1.5 中 的 阳 性 克 隆 菌 落 袁 置 于 装 有 100 ml BMGY 培 养 基 (1% 酵 母 提 取 物 尧 2% 蛋 白 胨 尧 1.34% YNB 尧 cdna 为 模 版 扩 增 鸡 溶 菌 酶 基 因 遥 PCR 扩 增 条 件 为 94 益 预 变 性 5min 后, 然 后 分 为 两 个 阶 段, 条 件 分 别 为 95 益 变 性 1min 尧 52 益 退 火 1min 尧 72 益 延 伸 45 s,10 个 循 环 曰 95 益 变 性 1min 尧 62 益 退 火 1min 尧 72 益 延 伸 45 s, 共 30 个 循 环 遥 PCR 产 物 经 1.2% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 后, 参 照 PCR 产 物 凝 胶 回 收 试 剂 盒 方 法 回 收 目 的 片 段 遥 4 伊 10 5 豫 生 物 素 尧 1% 甘 油 尧 100 mmol/l ph 值 6.0 磷 酸 盐 缓 冲 液 ) 的 500 ml 摇 瓶 中 袁 28 益 尧 200 r/min 振 荡 培 养 12 耀 14 h 曰 室 温 下 1500~3 000 g 离 心 5min 袁 收 集 并 用 BMMY 重 悬 菌 体 袁 使 OD 600 达 到 1.0 左 右 渊 约 100~ 200 ml 冤 曰 加 入 50 ml 无 菌 水 洗 涤 菌 体 沉 淀 重 复 收 集 菌 体 1 次 曰 加 入 20 ml BMMY 培 养 基 培 养 收 集 的 菌 体 袁 1.4 重 组 表 达 载 体 ppic6 琢 ALYZ 的 构 建 用 Xho I 和 Xba I 对 LYZ 基 因 的 PCR 产 物 和 真 28 益 振 荡 培 养 袁 200 r/min 袁 诱 导 表 达 96 h 曰 每 24 h 取 0.5 ml 诱 导 培 养 液,1 500~3 000 g 离 心 5min, 收 集 上 核 表 达 载 体 ppic6 琢 A 进 行 双 酶 切 后, 纯 化 回 收 目 的 片 段 袁 在 T 4 噬 菌 体 DNA 连 接 酶 的 作 用 下 进 行 连 接 袁 转 化 到 大 肠 杆 菌 (DH5 琢 ) 中, 涂 布 含 100 滋 g/ml Blasticidin 清 液, 同 时 向 剩 余 的 发 酵 液 中 补 加 0.5% 发 酵 初 始 体 积 的 无 水 甲 醇, 以 添 加 甲 醇 诱 导 作 为 计 时 零 点, 测 定 每 次 取 样 的 溶 菌 酶 表 达 水 平, 以 确 定 最 佳 表 达 时 机 遥 抗 性 的 LB 平 板 上 袁 37 益 温 箱 内 生 长 过 夜 袁 挑 取 20 株 克 隆 作 cloning PCR 检 测 遥 PCR 反 应 体 系 为 院 ddh 2 O 发 酵 罐 诱 导 表 达 重 组 溶 菌 酶 按 1 豫 的 比 例 将 过 夜 培 养 于 BMG 培 养 基 中 的 高 7.3 滋 l 尧 10 伊 PCR Buffer 渊 Mg 2 冤 1 滋 l 尧 25 mmol/l dntp 0.5 滋 l 尧 10 滋 mol/l LYZXho I primer 0.5 滋 l 袁 10 滋 mol/l LYZ Xba Iprimer 0.5 滋 l 尧 Taq polymerase 0.2 滋 l 袁 挑 取 少 量 克 隆 作 为 模 版 遥 PCR 条 件 为 院 95 益 预 变 性 4min 袁 然 后 95 益 变 性 45 s 尧 58 益 退 火 45 s 尧 72 益 延 伸 45 s 袁 共 30 个 循 环 袁 最 后 维 持 在 4 益 遥 挑 选 5 株 cloning PCR 检 测 为 阳 性 的 克 隆 菌 株 分 别 接 种 到 含 有 100 滋 g/ml Blasticidin 抗 性 的 LB 液 体 培 养 基 中 袁 37 益 尧 250 r/min 振 荡 过 夜 袁 按 照 常 规 方 法 少 量 抽 提 质 粒 DNA 袁 经 酶 切 鉴 定 确 定 为 阳 性 克 隆 遥 效 表 达 溶 菌 酶 酵 母 菌 株 接 种 至 已 经 灭 菌 的 装 有 上 罐 发 酵 基 本 培 养 基 渊 每 升 含 院 85 豫 磷 酸 26.7 ml 尧 硫 酸 钙 0.93 g 尧 硫 酸 钾 18.2 g 尧 七 水 硫 酸 镁 14.9 g 尧 氢 氧 化 钾 4.13 g 尧 甘 油 40.0 g 尧 PTM1 trace salts 4.35 ml 冤 的 发 酵 罐 中 袁 在 充 分 消 耗 发 酵 培 养 基 中 的 甘 油 后 袁 流 加 补 料 培 养 基 1 渊 含 1.2%PTM1 培 养 基 的 50 豫 甘 油 溶 液 冤 袁 流 加 量 为 18 ml/ 渊 l 窑 h 冤 持 续 约 6h 至 湿 细 胞 重 约 385 g/l 袁 开 始 流 加 补 料 培 养 基 2 渊 含 1.2%PTM1 培 养 基 的 100 豫 甲 醇 溶 液 冤 诱 导 表 达 袁 在 开 始 的 3h 内 袁 流 加 量 控 制 在 1ml/(l 窑 h), 接 下 来 的 2h 内 流 加 量 控 制 在 7.2 ml/(l 窑 h), 20