国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 1 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 1 1 北京市流感非药物干预措施指南 标准与指南 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心通信作者 : 杨鹏,

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1 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 北京市流感非药物干预措施指南 标准与指南 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心通信作者 : 杨鹏, yangpengcdc@63.com, 电话 : 摘要 流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病, 起病急, 传染性强, 极易在人与人之间传播 除使用流感疫苗或抗病毒药物外, 非药物干预措施是针对流感最容易实现的防控措施, 能够用来减缓甚至防止流感的传播 通常使用的非药物干预措施包括个人措施 环境措施 社会措施和旅行措施 本指南适用于社区 学校 家庭和个人在日常和流感流行期的防护 关键词 流感 ; 非药物干预措施 ; 北京基金项目 : 首都卫生发展科研专项 ( ) DOI: /cma.j.issn Non-pharmaceutical interventions on influenza in Beijing, China Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Center for Preventive Medicine Research Corresponding author: Yang Peng, yangpengcdc@63.com, Tel: Abstract Influenza is the acute respiratory infectious disease caused by influenza virus. It is characterized by quick onset, highly contagious and transmitting easily from human to human. In addition to influenza vaccination or antiviral therapy, non-pharmaceutical interventions (NPIs) are the most possible prevention and control measures to be implemented against influenza. NPIs can be used to slow down or even prevent the spread of influenza. The commonly used NIPs include personal measures, environmental measures, social measures and travel measures. The present guideline could be used to guide the routine protection against influenza or during influenza epidemic period for communities, schools, families and for individuals. Key words Influenza; Non-pharmaceutical interventions; Beijing Fund program: Capital s Funds for Health Improvement and Research ( ) DOI: /cma.j.issn 流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病, 其起病急, 传染性强, 极易在人与人之间传播 除使用流感疫苗或抗病毒药物外, 非药物干预措施 (non-pharmaceutical interventions, NPIs) 是针对流感最容易实现的防控措施, 能够用来减缓甚至防止流感的传播 世界卫生组织 (world health organization,who) 在 全球流感战略 中将 NPIs 纳入预防和控制规划, 作为扩大季节性流感预防和控制政策与规划, 以保护易感人群的行动之一 [] WHO 在 减轻流感流行和大流行风险和影响的非药物公共卫生措施 中述及 NPIs 对流感流行或大流行的潜在影响, 主要包括 4 个方面 : () 推迟大流行病毒向人群的传入 ;(2) 如果 大流行已经开始, 则延缓大流行的进程, 降低大 流行强度和高峰 ;(3) 通过个人或环境防护措施 减少传播 ;(4) 减少感染的总数, 从而减少重症 住院和死亡病例的总数 [2] 通常使用的非药物干预 措施包括个人措施 环境措施 社会措施和旅行 措施 本指南参考 WHO [2] 美国疾病预防控制中心 [3] 中国香港特别行政区卫生署卫生防护中心 [4] 的流 感非药物干预措施, 结合北京市实际情况制定, 适用于社区 学校 家庭和个人在日常和流感流 行期的防护 使用该指南来确定最适当的使用措 施, 以减轻流感流行和大流行的传播和最大限度 地减少其不利后果

2 2 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 一 个人措施 ( 一 ) 手部卫生 流感病毒可通过直接接触污染物或接触被污 染的物体表面而污染人的手部, 进而传播流感 保持手部卫生是预防流感的重要措施 掌握正确 的洗手时机和方法, 可以有效灭活或减少手部的 流感病毒, 防止流感的接触传播. 需要洗手的情况 () 在手被呼吸道分泌物污染时, 如在擤鼻 涕 咳嗽或打喷嚏之后 (2) 触摸过公共设施, 例如电梯扶手 升降 机按钮及门柄后 (3) 使用 清理厕所之后 (4) 在家照顾呕吐或腹泻病人前后 (5) 探访医院或护理病人前后 (6) 处理被污染的物品后 (7) 接触动物 动物饲料或动物粪便后 (8) 处理垃圾后 (9) 任何时候当发现双手变脏时 2. 正确的洗手步骤 () 用干净的自来水 ( 温水或冷水 ) 打湿双 手, 关上水龙头, 然后涂上普通肥皂或洗手液 ( 不 推荐使用药皂或抗抑菌洗手液 ) (2) 两手心对搓, 擦出泡沫, 并在手背 手 指间和指甲缝中涂上泡沫 (3) 按照 7 步洗手法的步骤, 揉搓双手至少 20 秒 ( 约为哼唱两遍 生日快乐 歌的时长 ) 干净 (4) 洗擦后用干净的自来水将双手彻底冲洗 (5) 用干净的毛巾或抹手纸擦干双手, 或者 用干手机将双手吹干 3. 7 步洗手法 () 掌心相对, 手指并拢, 相互揉搓 (2) 手心对手背沿指缝相互搓擦, 交换进行 (3) 掌心相对, 双手交叉沿指缝相互搓擦 (4) 卷曲手指关节在另一手掌心旋转搓擦, 交换进行 (5) 一手握另一手大拇指旋转搓擦, 交换进行 (6) 将五个手指尖并拢在另一手掌心旋转搓 擦, 交换进行 (7) 一手握另一手手腕, 螺旋式擦洗手腕, 交换进行 4. 应用策略 建议在季节性流感流行期间, 将手部卫生措施 作为一般卫生措施和感染预防措施的一部分 ( 二 ) 咳嗽礼仪 咳嗽是一种常见的突发性情况, 是流感的最 常见症状之一 属于人体保护性措施, 能清洁和 通畅呼吸道 当流感患者咳嗽 打喷嚏时, 流感 病毒会随气道分泌物 ( 飞沫 ) 扩散到周围空间中, 导致周围健康人吸入后发生感染 咳嗽或要打喷 嚏时按照咳嗽礼仪进行, 可避免将流感等呼吸道 传染病传染给他人. 咳嗽或打喷嚏时的正确做法 () 经常随身携带手帕或纸巾, 咳嗽或打喷 嚏时用它来捂住口鼻 (2) 将使用后的纸巾丢入就近的垃圾箱内 (3) 如一时来不及取纸巾, 可采取 袖口遮 挡法, 即用肘部或衣服袖管的内侧遮掩住口鼻部, 不能用手捂住口鼻 (4) 接触呼吸道分泌物和受污染的物品 / 材 料后应立即洗手 ( 例如, 用非抗菌肥皂和水 酒 精洗手液或消毒洗手液洗手 ) 2. 应用策略 建议在季节性流感流行期间, 随时保持咳嗽 礼仪 ( 三 ) 佩戴口罩 流感主要通过呼吸道飞沫传播, 口罩具有阻隔 液体与飞沫微粒通过的功能 如果佩戴得当, 口 罩可以阻挡含有病原体的飞沫喷溅, 防止其接触 到你的口鼻 佩戴口罩也有助于减少唾液和呼吸 道分泌物对他人的暴露. 常用口罩介绍 () 纱布口罩是保护呼吸道免受有害粉尘 气溶胶 微生物及灰尘伤害的防护用品 此种口 罩一般较厚重, 佩戴时闷热, 其结构与人面部的 密合性差, 且防止病毒传染的效率低 (2) 外科口罩用于覆盖住使用者的口 鼻及 下颌, 为防止病原体微生物 体液 颗粒物等的 直接透过提供物理屏障 标准外科口罩的结构由 三层材料组成, 由外向内分别是阻水层 过滤层 和吸湿层 (3)N95 级别的医用防护口罩是一种一次性 的颗粒防护口罩, 用于降低佩戴者吸入有害空气 颗粒物 ( 包括粉尘颗粒物和传染性微粒 ) 的风险 应用最具穿透力的颗粒, 滤过至少 95% 的空气颗

3 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 3 粒物定义为 95 等级 ;N 代表不防油性颗粒物 2. 预防流感推荐佩戴口罩的类型 预防流感推荐使用外科口罩进行防护, 由于纱 布口罩不能有效阻止传染性微粒的传播, 不推荐 使用 日常防护不必要使用 N95 级别的医用防护 口罩 3. 佩戴口罩的要点 () 选择合适尺寸的口罩, 儿童建议选择儿 童口罩 (2) 佩戴口罩前, 应洗手 (3) 使用口罩时, 需依照使用建议操作, 包 括如何存放及佩戴口罩 ( 如分辨外科口罩的前后 ) 一般而言, 有颜色或褶皱向下的一面向外, 有金 属条的一边向上 (4) 佩戴时, 拉开外科口罩, 使口罩完全覆 盖口 鼻和下巴 要让口罩紧贴面部 同时用左 右手的手指按压鼻两侧的铝片, 以减少四周的空气 泄漏 (5) 佩戴口罩后, 应避免触摸口罩 若必须 触摸口罩, 在触摸前 后都要洗手 (6) 适时更换口罩 一般情况下, 口罩不可 重复使用 ; 口罩如有破损或弄污, 应立即更换 ; 如果感到呼吸困难, 应摘下口罩 (7) 摘下口罩时, 尽量避免触摸口罩的外面 ; 摘下的口罩应丢进有盖的垃圾桶内, 然后立即洗 手 4. 应用策略 () 保护他人免受感染 : 当自身出现流感样 症状, 如发烧 咳嗽 流涕或打喷嚏等, 在就医, 或身处拥挤的环境时, 或与其他家庭成员共处一 室时应佩戴口罩 (2) 保护自身免受感染 : 需要照顾呼吸道感 染患者的人在与病人密切接触时可佩戴口罩以避 免感染 在流感重度期间, 可考虑在人员拥挤的 场所佩戴口罩 (3) 医疗机构的医务人员在距离流感样病例 患者 2 m 以内时应佩戴口罩 ( 四 ) 病例管理. 方法 发热或流感样病例发病期间避免带病上课上 班, 避免参加集体活动和进入公共场所, 可采取 居家或住院治疗 待体温恢复正常 其他流感样 症状消失 48 h 后, 患者可正常上课或上班 为了 确保已退热, 患者应在未使用退热药 ( 如, 对乙 酰氨基酚或布洛芬 ) 的情况下测量体温 2. 应用策略 在季节性流感流行期间, 均推荐针对病例采取 以上措施 ( 五 ) 其他个人措施. 一日三餐规律进食, 主食 蔬果和禽鱼肉蛋 比例要合理搭配, 多吃新鲜蔬菜水果, 平衡膳食 2. 注意保暖, 根据温度适时增减衣物 ; 适当体 育锻炼 ; 保证充足睡眠 二 环境措施 ( 一 ) 增加通风. 方法 在流感高发季节应根据具体天气情况自然通风 2~3 次, 每次不少于 30 min 出现流感样症状病人 时, 在条件允许的情况下尽量增加自然通风的频 次和时间, 并选择在病人离开房间时进行 虽然流感病毒通过呼吸道飞沫传播, 但存在机 会性空气传播的可能, 主要发生在开展可产生气 溶胶的高风险操作时 在医疗机构内, 自然通风 应满足下列最低每小时平均通风率 : () 用于预防空气传播疾病的病房 :60 L/s/ 病人 ( 每小时平均通风率 )( 最低 80 L/s/ 病人 )( 仅 适用于新医疗设施和重大翻新 ) (2) 普通病房和门诊部 :60 L/s/ 病人 (3) 走廊和其他无固定人数的短暂停留空间 : 2.5 L/s/m 3 ; 紧急情况或其他情况下, 在走廊进行 病人护理时, 要求达到和预防空气传播疾病病房 或普通病房同样的通风率 2. 应用策略 建议在所有环境中增加通风, 以减少流感病毒 的传播 ( 二 ) 物体及表面清洁消毒 人可能通过接触带有流感病毒的物体表面, 然 后触摸眼睛 鼻子或口而感染流感 物体及表面 清洁措施能够去除物体表面的病原体, 从而避免 感染. 预防流感常见物体及表面的清洁方法 () 地面 墙壁 : 使用有效氯浓度为 500 mg/l 的消毒液 ( 配制方法举例 : 某含氯消毒液, 有效 氯含量为 5%, 配制时取 份消毒液, 加入 99 份 水 ) 消毒, 消毒作用时间应不少于 5 min 可采 用喷洒消毒或擦拭消毒, 喷洒消毒喷湿即可, 擦

4 4 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 拭消毒时, 用抹布或拖布沾取上述消毒液后进行擦拭 (2) 桌椅 门把手 桌椅扶手 楼梯扶手 水龙头 饮水机把手 马桶盖 玩具等高频接触物体表面是消毒的重点区域, 应定期进行清洁消毒 使用有效氯浓度为 500 mg/l 的消毒液 ( 配制方法举例 : 某含氯消毒液, 有效氯含量为 5%, 配制时取 份消毒液, 加入 99 份水 ), 进行浸泡 喷洒或擦拭消毒, 消毒作用 5 min, 然后用清水擦拭干净 (3) 毛巾等织物 : 毛巾等织物浸在 250 mg/l 的含氯消毒剂溶液内 ( 配制方法举例某含氯消毒液, 有效氯含量为 5%, 配制时取 份消毒液, 加入 99 份水 ) 浸泡 5 min, 然后清洗 也可用流通蒸汽或煮沸消毒 5 min 暴晒应选择阳光强烈的时候进行, 一般暴晒 2 h, 可起到杀菌的作用 (4) 水杯 碗筷等食品用具 : 清除食物残渣 煮沸或流通蒸汽消毒 5 min; 或也可用有效氯为 250 mg/l 含氯消毒液 ( 例如某含氯消毒液, 有效氯含量为 5%, 配制时取 份消毒液, 加入 99 份水 ) 浸泡, 作用 5 min 后, 再用清水洗净 (5) 用吸水力强的一次性抹布清理可见的污物, 如呼吸道分泌物, 然后用 000 mg/l 含氯消毒液 ( 配制方法举例某含氯消毒液, 有效氯含量为 5%, 配制时取 份消毒液, 加入 49 份水 ) 消毒被污染的地方及临近各处, 待 5~30 min 后, 用水清洗并抹干 金属表面则可用 70% 酒精消毒 (6) 定时清洁地面, 视情况增加清洁次数, 并保持地面干爽 (7) 每日吸尘及定期清洗地垫, 保持地垫清洁 (8) 定时更换及清洗床单 枕套 毛巾及衣服 (9) 若有饲养宠物 ( 如猫和狗 ), 需增加清洁的次数 (0) 垃圾要包好并放在有盖的垃圾桶内 每天应清理垃圾桶 次 2. 应用策略物体及表面清洁一直作为公共卫生策略的重要措施之一 尽管涉及接触传播的流感病例的比例 ( 即手将流感病毒从被病毒污染的物体传播到眼睛 鼻子或口 ) 是未知的, 但此种传播方式是公认的流感病毒传播途径 经常使用对污染物体 及表面清洁措施可能会减少流感病毒的传播 建 议在所有情境下, 使用安全消毒产品对物体及表 面进行清洁消毒, 以减少流感传播, 包括家庭 学校 工作场所 医疗机构 公共交通工具等 另外, 出于可行性和安全原因, 不建议在封闭 和拥挤的场所 ( 如教育机构和工作场所 ) 安装紫 外线灯 三 社会措施 ( 一 ) 停课或关闭学校 / 托幼机构 停课或关闭学校主要包括两种类型 : 被动 停课或关闭学校 ;2 主动停课或关闭学校 停课 时校园向教职工开放, 关闭学校时校园不向教职 工开放. 被动停课或关闭学校 / 托幼机构 当大量学生和教职工因发病不能到校, 或当 大量学生和教职工到达学校时患病而返回家中时, 即发生流感暴发疫情时, 可考虑采取被动停课或 关闭学校 在学校发生流感暴发疫情时, 原则上, 停课的 范围应根据疫情波及的范围和发展趋势, 由小到 大, 如由班级到年级, 由年级到全校, 由一个学 校 / 托幼机构到多所学校 / 托幼机构等 停复课标 准建议如下 : () 班级停课 : 达到以下标准之一者, 经评 估疫情存在进一步扩散可能, 该班可实施停课 停课期限一般为 4 d 上 ; ) 该班级当天新发现流感样病例达 5 例及以 2) 该班级现症流感样病例达 30% 及以上 ; 3) 一周内发生 2 例及以上实验室确诊流感住 院或死亡病例 ( 不包括门诊留观病例 ) 复课标准 : 停课期限届满可复课 仍有流感样 症状的学生, 需体温恢复正常 其他流感样症状 消失 48 h 后或根据医生建议方可恢复上课 (2) 年级 / 学校停课 : 疫情如持续发展影响 学校 / 托幼机构正常教学活动时, 教育或相关主管 部门应组织对疫情风险进行评估, 可逐级实施停 课措施 停课期限一般为 4 d 停课期限届满后, 经评估来确定是否复课 2. 协调主动停课或关闭学校 / 托幼机构 在许多学生和工作人员发病之前, 采取协调主 动停课或关闭学校 / 托幼机构, 以阻断流感的传播 采取此措施时, 应充分考虑对社区的不利影响 ( 如

5 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 5 家庭负担 经济因素等 ) 时机和持续时间 3. 应用策略 被动停课关闭学校通常在发生流感暴发 出现 大量流感样病例后采取, 对于降低流感社区传播 效果通常有限 协调主动停课或关闭学校通常在 大量规模传播发生前采取, 无论是否存在流感暴 发, 可在流感极严重流行时期采取 ; 主动关闭学 校和有计划的放假对于降低传播可起到中等的效 果 ( 二 ) 社交距离措施 增加社交距离措施可通过减少各年龄段人群 之间的社会接触频率和持续时间来减少病毒传播 增加社交距离措施可以在多个的社区环境中实施, 包括学校托幼机构 工作场所和人群聚集的公共 场所. 学校 在学校内可采取的减少近距离接触的措施包 括 : 严格确保病例不带病上课 ; 将学校班级分成 更小的学生群体 ; 取消不同班级间学生混合上课 ; 重新布置课桌, 使学生在教室里彼此之间至少间 隔 ( 课桌间距 ) m; 取消或延期课后活动 ; 限制 进入公共区域 ; 错峰上学和放学 ; 发生流感疫情 的学校 / 托幼机构应减少或停止组织集体活动, 减 少和避免与发病学生 员工接触, 限制外来人员 进入 以上措施可以扩大学生之间的社交距离 降低学生的密度 2. 工作场所 在工作场所内减少面对面接触的措施包括 : 鼓 励远程工作或居家办公 轮岗 休病假和带薪休 假政策等 ); 提供视频或电话会议代替工作场所 的面对面会议 更为极端的措施包括关闭工作场 所 3. 人群聚集场所 按照策略分级与严重程度相匹配原则适当减 少或避免人群聚集 ( 大型聚会 交通枢纽 ), 以 增加人际距离并降低人群密度 4. 应用策略 () 如果学校在流感重度流行时期仍然开放, 可采取社会距离措施 (2) 在特殊情况下 ( 极其严重的流感流行时 期 ), 可在工作场所采取社会距离措施, 其中工 作场所关闭是最后考虑采取的措施 (3) 在流感中 重度流行期间, 即可采取减 少或避免人群聚集的措施 四 旅行建议措施 由于不同国家和地区流感流行的特征和规律 不同, 权威部门可利用多种传播方式, 向旅行者 提供出行前的流感防控建议, 以减少在旅行地潜 在的暴露和传播 编写专家组 : 北京市疾病预防控制中心北京 市预防医学研究中心传染病地方病控制所 ( 张莉 郑阳 马春娜 吴双胜 王全意 ); 北京市疾病 预防控制中心北京市预防医学研究中心全球健康 中心办公室 ( 杨鹏 ); 首都医科大学公共卫生学 院 ( 杨鹏 ) 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] World Health Organization (WHO). Global influenza strategy Geneva: WHO; 209 [EB/OL]. [ ]. who.int/iris/bitstream/handle/0665/384/ eng. pdf?ua=. [2] World Health Organization (WHO). Non-pharmaceutical public health measures for mitigating the risk and impact of epidemic and pandemic influenza. Geneva: WHO; 209 [EB/ OL]. [ ]. le/0665/329438/ eng.pdf?ua=. [3] Qualls N, Levitt A, Kanade N, et al. Community mitigation guidelines to prevent pandemic influenza - United States, 207 [J]. MMWR Recomm Rep, 207, 66(): -34. DOI: /mmwr.rr660a. [4] 香港特别行政区卫生署卫生防护中心. 一般个人家居环境卫 生之注意事项. [EB/OL]. [ ]. tc/static/39530.html. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 吴文婷 )

6 6 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 中国 年法定报告流感确诊发病和死亡病例分析 郑建东张慕丽彭质斌秦颖冯录召 中国疾病预防控制中心传染病管理处, 北京 通信作者 : 冯录召, fenglz@chinacdc.cn, 电话 : 摘要 目的分析 年全国法定报告流行性感冒 ( 简称 流感 ) 确诊发病和死亡病例的特征, 为流感监测和病例诊治提供依据 方法对全国法定报告传染病信息系统报告的发病日期在 204 年 月 日至 208 年 2 月 3 日的流感病例数据进行描述分析 结果 年, 全国共报告流感病例数 例, 包括 例确诊病例和 例临床诊断病例, 其中死亡病例为 30 例 ( 确诊病例 253 例, 临床诊断病例 48 例 ) 确诊病例中 0~4 岁儿童报告发病数最多, 为 例 (35.66%), 65 岁组报告发病数最少, 为 例 (5.40%); 确诊死亡病例集中在 8~49 岁和 65 岁组, 分别为 90 例 (35.02%) 与 72 例 (28.02%), 最低为 5~7 岁组, 报告 9 例 (7.39%) 确诊死亡病例的发病至确诊时间间隔中位数为 6(3,0)d, 长于确诊存活病例的 3(,7)d 西部地区确诊存活病例的发病 - 确诊时间间隔中位数为 6(2,)d, 长于东部的 2(,6)d 和中部的 3(,7)d; 年间隔中位数从 4(,8)d 缩短至 2(,5)d 确诊病例中流感病毒感染集中在 7 岁儿童, 其中乙型流感构成比高 ; 确诊死亡病例中甲型 HN 感染占 79.20%(03/30) 结论以中国人口和 WHO 发布的流感罹患及死亡数据进行推算, 我国每年法定报告的流感发病和死亡病例数远低于公认的流感发病和死亡水平 流感高危人群一旦出现流感样症状, 应尽早开展实验室检测并实施针对性的治疗, 以降低出现严重结局的风险 关键词 流感 ; 甲型流感病毒 ; 乙型流感病毒 ; 法定报告基金项目 : 中国疾病预防控制中心应急反应机制运行项目 ( ) 国家科技重大专项 (208ZX ) DOI: /cma.j.issn Analysis of reported confirmed notifiable influenza cases and deaths in China, Zheng Jiandong, Zhang Muli, Peng Zhibin, Qin Ying, Feng Luzhao Division of Infectious Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 02206, China Corresponding author: Feng Luzhao, fenglz@chinacdc.cn, Tel: Abstract Objective To analyze the characteristics of reported confirmed notifiable influenza cases and deaths from 204 to 208, so as to provide scientific evidences for surveillance and diagnosis of influenza cases. Methods Descriptive analysis was performed for the data of influenza cases with the onset dates within the period between January, 204 and December 3, 208 collected from the National Notifiable Infectious Diseases Reporting System. Results A total of influenza cases were reported nationwide from 204 to 208, including confirmed cases and clinically diagnosed cases, of which 30 cases died (253 confirmed cases and 48 clinically diagnosed cases). The highest number of confirmed influenza cases was reported among children aged 0-4 years old ( cases) and the lowest was among the elderly aged 65 years old (34 07 cases), accounted for 35.66% and 5.40%, respectively. The confirmed deaths mainly distributed among those aged 8-49 years old with 90 cases (35.02%) and the elderly 65 years old with 72 cases (28.02%). Nineteen cases (7.39 %) of confirmed deaths were reported among patients of 5-7 years old and was the lowest. The median of interval between onset and diagnosis (MIOD) of confirmed deaths is 6 (3, 0) days, which was longer than the 3 (, 7) days of confirmed survival cases. The MIOD in the Western Region was 6 (2, ) days,

7 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 7 which was longer than 2 (, 6) days in the East Region and 3 (, 7) days in the Middle Region. From 204 to 208, the MIOD was shortened from 4 (, 8) to 2 (, 5) days. Most influenza virus infected children aged 7 years old and more influenza B than influenza A were detected in children. For the confirmed death cases, 79.20% (03/30) were infected by influenza A (HN) virus. Conclusions According to the general population of China, the data of influenza incidence and deaths released by the WHO, the notifiable influenza morbidity and deaths were far lower than the well-recognized level in China. For the high risk group of serious influenza complications, once having influenza-like symptoms, laboratory testing should be performed for effective treatment to reduce the risk of serious outcomes. Key words Influenza; Influenza A virus; Influenza B virus; Notifiable cases Fund program: Emergency Response Mechanism Operation Program, Chinese Center for Disease Control and Prevention ( ); National Key Science and Technology Program of China (208ZX ) DOI: /cma.j.issn 流感的季节性流行每年导致全球大量的发病 重症和死亡 造成严重的疾病负担 [] 流感在我国 是丙类法定报告传染病 自 204 年起 引发 2009 年流感大流行的原乙类传染病甲型 HN 流感纳入 丙类传染病流感统计 本文通过对 年 全国传染病报告信息管理系统报告的流感发病和 死亡数据进行分析 了解流感的法定报告情况及 其存在的问题 为流感监测和防治策略的完善提 供科学依据 资料与方法. 资料来源 全国传染病报告信息管理系统中 发病日期在 204 年 月 日至 208 年 2 月 3 日之间报告的 流感病例数据.2 研究方法 采用 Excel 整理数据 用 SAS 9.4 对流感确诊 病例报告数据进行统计分析 采用 ArcGIS 0.3 制 作地图 数据为非正态分布 统计描述采用中位 数 P25 P75 表示 统计分析采用秩和检验 定 性资料分析指标为无序分类资料时采用卡方检验 分析指标为有序分类资料时 两组用 Wilcoxon 秩 和检验 多组用 Kruskal-Wallis 检验 双侧检验 以 P<0.05 为差异有统计学意义 本研究西部地区包括重庆 四川 贵州 云南 西藏 陕西 甘肃 青海 宁夏和新疆等 0 省 自 治区 直辖市 中部地区包括山西 内蒙古 吉林 黑龙江 安徽 江西 河南 湖北和湖南等 9 省 自 治区 直辖市 东部地区包括北京 天津 河 北 辽宁 上海 江苏 浙江 福建 山东 广东 广西和海南等 2 省 自治区 直辖市 2 结果 2. 报告病例概况 年全国累计报告流感病例 例 包括 例临床诊断病例和 例 确诊病例 其中死亡病例为 30 例 包括临床诊 断病例 48 例和确诊病例 253 例 本文对病例特征 的分析以确诊病例 包括确诊存活病例和确诊死 亡病例 为研究对象 2.2 病例特征 年每 2.2. 报告病例的时间分布 年均有冬春季报告高峰 204 年 205 年和 207 年夏季也呈现一个高峰 报告发病数和死亡病例 数最多的均为 208 年 分别为 例 53 例 报告数最低的均为 205 年 发病 死亡病例数分 别为 例 8 例 死亡报告高峰基本出现在 每年的冬季 月至 2 月 图 图 2 图 年全国法定报告流感发病病例的时间分布 图 年全国法定报告流感死亡病例的时间分布

8 8 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 确诊病例的基本人口学特征 年全国共报告流感确诊病例 例 报告的确 诊 存 活 病 例 为 63 8 例 男 例 女 例 确诊死亡病例为 253 例 男 65 例 女 88 例 确诊病例中 0~4 岁组报告发病数最多 为 例 35.66% 65 岁组报告最少 为 例 5.40% 确诊死亡病例中 8~49 岁 组 报 告 最 多 为 90 例 35.02% 其 次 为 65 岁 组 为 72 例 28.02% 5~7 岁 组 最 少 为 9 例 7.39% 确诊存活病例组与确诊死亡病例 组在性别 年龄组 报告地区以及年份等方面存 在差异 表 从 年 确诊病例的空间分布 各省上报的流感确诊病例的空间分布来看 报告 病例从早年的集中在东部省份逐渐扩展至中 西 部地区 图 确诊病例病毒型别的年龄分布 例确诊病例和 30 例死亡病例报告实验室检测结 果 整体来看 确诊病例中流感病毒感染集中在 7 岁儿童 其中乙型流感构成比高于甲型 8 岁成年人报告发病人数显著减少 死亡病例 中流感病毒感染大多发生在 8 岁成年人 以甲 型 HN 感 染 为 主 占 79.2% 03/30 其 次 为乙型 占 0.8% 4/30 图 4 图 5 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 表 年报告的流感确诊存活和死亡病例情况 特征 确诊病例 确诊存活病例 确诊死亡病例 N= N=63 8 N=253 n % n % n % P值 性别 男 (54.03) (54.03) 女 (45.97) (45.97) 65 (65.22) < (34.78) 22 (0.2) <0.0 年龄组 岁 0~ (35.66) (35.67) 5~ (32.8) (32.9) 9 (7.39) 8~ (9.7) (9.70) 90 (35.02) 50~ (7.06) (7.05) 50 (9.46) (5.40) (5.39) 72 (28.02) 东部 (65.70) (65.7) 中部 (20.43) (20.43) 37 (4.62) 西部 (3.87) (3.86) 59 (23.32) (4.69) (4.69) 37 (4.62) < (.85) 74 8 (.85) 4 (.58) (9.44) (9.44) 45 (7.79) (22.43) 4 57 (22.43) 33 (3.04) (3.59) (34.58) 34 (52.96) 报告地区 57 (62.06) <0.0 时间 年 图 年各省报告的流感确诊发病 死亡病例数

9 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 9 表 年确诊存活病例 确诊死亡病例的发病 - 确诊时间间隔比较 : 中位数 (P 25,P 75 ) 特征 确诊存活病例发病 - 确诊时间间隔 (d) 确诊死亡病例发病 - 确诊时间间隔 (d) P 值 性别 男 3(,7) 6(3,) <0.0 a 女 3(,7) 6(3,9) <0.0 a 图 年不同年龄法定报告流感确诊发病病例的病毒亚型分布 P 值 b b 年龄组 ( 岁 ) 0~4 3(,6) 4(2,8) 0.3 a 5~7 3(,6) 3(2,5) a 8~49 3(,7) 6(3,9) <0.0 a 50~64 4(,7) 9(5,2) <0.0 a 65 3(,7) 6(3-2) <0.0 a P 值 <0.0 b <0.0 b 报告地区东部 2(-6) 5(2,9) <0.0 a 中部 3(-7) 9(4,0) <0.0 a 图 年不同年龄法定报告流感确诊死亡病例的病毒亚型分布 西部 6(2-) 7(3,) 0.90 a P 值 <0.0 b 0.07 b 时间 ( 年 ) 2.3 确诊病例的发病 - 确诊时间间隔分析 以发病 - 确诊时间间隔中位数来看, 确诊存 活病例为 3 d, 确诊死亡病例为 6 d; 8 岁成人 组确诊死亡病例均长于确诊存活病例 ; 确诊存活 病例中, 西部地区的时间间隔长于东部和中部地 区 ; 确诊死亡病例中, 东部 中部地区的时间间 隔均长于确诊存活病例 年时间间隔 呈现逐年减小的趋势 见表 2 3 讨论 年全国法定报告流感发病 死亡 数据分析结果显示, 我国每年报告 7 万 ~20 万流 感确诊病例 4~34 例死亡, 冬春季是报告高峰, 在报告发病人数增高的年度, 报告死亡病例也相 应增加并集中在每年的 至 2 月 各年龄组中, 0~4 岁儿童发病数构成比最高, 为 35.7%,5~7 岁 儿童发病数构成比次之, 为 32.2%, 这与其他国家 及我国北京市 广东省珠海市的研究一致 [2-5] 本 研究的病毒亚型年龄分布也显示, 流感病毒感染 集中在 7 岁儿童 儿童发病多的原因可能有儿 童经常在学校 托幼机构等人群聚集场所 免疫 系统尚未完全发育成熟, 以及通过自然感染流感 病毒或接种疫苗获得免疫的机会相对少有关 老年人罹患流感后导致并发症 重症乃至死 204 4(,8) 5(3,9) 0.36 a 205 4(,8) (,5) a 206 3(,8) 7(4,) <0.0 a 207 3(,6) 6(3,0) <0.0 a 208 2(,5) 6(3,0) <0.0 a P 值 0.0 b b 合计 3(,7) 6(3,0) <0.0 a 注 : a 表示确诊存活病例与确诊死亡病例组间比较的 P 值, b 表示 确诊存活病例或确诊死亡病例各个特征人群组内比较的 P 值 亡风险高 [6], 我国流感导致的超额死亡病例中超过 86% 是 65 岁的老年人 [7], 年美国 65 岁老年人占流感死亡人数的 7%~85% [8] 本 研究发现, 流感确诊死亡病例中 65 岁老年人不 足 /3 我国开展流感病毒检测的医疗机构仍然 有限, 流感相关死亡的判定规则在临床实践中尚 不统一, 大部分流感病毒检测阳性的死亡病例, 往往归因于并发症或慢性基础性疾病急性发作或 加重死亡, 死亡原因通常不判定为流感感染, 这 种情形在老年人或慢性基础性疾病患者中尤为常 见 从发病 - 确诊时间间隔来看, 本研究显示, 西部地区显著长于东部 中部地区,

10 0 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 年间隔呈逐年缩短 确诊死亡病例的发病 - 确诊 时间间隔长于存活病例, 说明及早就诊 及时开 展流感病毒检测, 并给予针对性的抗病毒药物治 疗, 将会大大降低流感并发症 重症及死亡的风 险 目前临床检测多用胶体金法 ( 快速抗原检测 ), 速度快 易操作 成本低, 是世界上大多数临床 病毒学实验室的首选检测方法, 但其灵敏性和特 异性有待进一步评价 [9] 从地区报告情况看, 位 居报告流感确诊发病和流感死亡数前列的省份均 在东部, 这与经济发达地区开展流感监测的临床 机构多及医务人员的流感诊断意识强有关 近几 年, 中西部省份的报告也呈现出逐年增多的趋势 年流感确诊病例总数为 例, 而北京市 项研究显示, 仅 流行 季发病人数达到 例 [0] 年 确诊死亡病例总数为 253 例, 显著低于我国香港 特区通过法定报告的同期确诊死亡病例总数 55 例 [], 也低于美国同期法定报告的 <8 岁儿童流 感确诊死亡病例 473 例 [2], 与美国疾控中心经数 学模型估算的流感超额死亡总数 例相比 [3], 法定报告的死亡更是 冰山一角 鉴于流感无 特异性的临床表现, 临床特征难与其他急性呼吸 道疾病区分, 病例的准确诊断需要开展病原学检 测, 而我国目前临床机构较少开展, 临床医生报 告的流感病例主要为临床诊断病例, 且大部分为 轻症病例, 流感高峰季节报告负荷重, 导致流感 报告病例准确性低 漏报情况严重 因此, 难以 通过 传染病报告信息管理系统 报告的流感病 例数据来反映流感的真实发病水平和严重程度 建议在进行 中华人民共和国传染病防治法 修 订和法定报告传染病病种调整时, 取消流感病例 的常规报告, 重点报告流感重症和死亡病例的数 据 本研究存在以下局限性 : 首先, 法定报告包 含的信息少, 基于现有的可用数据, 不能完整展 示流感确诊病例的特征 ; 另外, 该系统关于流感 实验室检测结果的上报只能在备注一栏自行填写 上报, 可能存在提取实验室检测结果不准确或遗 漏提取的情况 目前亟需优化和扩展监测系统来 得到完整全面的流感疾病负担和严重性数据, 可 适时选择若干试点地区开展基于人群的流感发病 住院和死亡监测, 摸索积累经验并择机推广, 以 形成可估算全国水平的监测体系 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参 考文献 [] WHO. Influenza(seasonal)[EB/OL]. ( )[ ]. (seasonal). [2] Webster RG, Monto AS, Braciale TJ, et al. Textbook of influenza[j]. 205, 29: DOI: 0.06/j.meegid [3] Somes MP, Turner RM, Dwyer LJ, et al. Estimating the annual attack rate of seasonal influenza among unvaccinated individuals: a systematic review and meta-analysis[j]. Vaccine, 208, 36(23): DOI: 0.06/j.vaccine [4] Guo RN, Zheng HZ, Huang LQ, et al. Epidemiologic and economic burden of influenza in the outpatient setting: a prospective study in a subtropical area of China[J]. PLoS One, 202, 7(7): e4403. DOI: 0.37/journal.pone [5] Wu S, Van Asten L, Wang L, et al. Estimated incidence and number of outpatient visits for seasonal influenza in in Beijing, China[J]. Epidemiol Infect, 207, 45(6): DOI:0.07/S [6] 冯录召, 杨鹏, 张涛, 等. 中国季节性流感疫苗应用技术指 南 ( )[J]. 中华流行病学杂志, 204, 35(2): DOI: /cma.j.issn [7] Feng L, Shay DK, Jiang Y, et al. Influenza-associated mortality in temperate and subtropical Chinese cities, [J]. Bull World Health Organ, 202, 90(4): B. DOI: 0.247/ BLT [8] Reed C, Chaves SS, Daily Kirley P, et al. Estimating influenza disease burden from polulation-based surveillance data in the United States[J]. PLos One, 205,0(3): e DOI: 0.37/ journal.pone ecollection 205. [9] 朱汝南, 钱渊. 流感病毒检测方法研究进展 [J]. 中华实用儿科 临床杂志, 209, 34(2): DOI: /cma.j.issn X [0] 张惺惺, 吴双胜, 王全意, 等. 北京市 流行季流 感感染率和发病率研究 [J]. 国际病毒学杂志, 209, 26(2): DOI: /cma.j.issn [] 流感速递 [EB/OL]. ( ) [ ]. chp.gov.hk/files/pdf/flux_wk9_7_3_209_chi.pdf. [2] Weekly U.S. Influenza surveillance report [EB/OL]. ( ) [ ]. [3] Disease burden of influenza[eb/ol]. ( ) [ ]. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杜丹 )

11 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 年流感流行季北京市中小学校流感疫苗接种对流感聚集性疫情的影响 张莉 2 杨鹏 2 段玮 王全意 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心传染病地方病控制所 0003 ; 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心全球健康中心办公室 0003 通信作者 : 杨鹏, yangpengcdc@63.com, 电话 : 摘要 目的分析北京市 年流感流行季期间发生流感聚集性疫情的中小学校的流感疫苗接种情接况和保护效果, 为流感疫苗接种策略提供进一步的科学依据 方法收集北京市 207 年 0 月 208 年 月期间报告的流感聚集性疫情资料, 分析流感聚集性疫情的流行病学特征和流感疫苗接种情况, 计算疫苗保护率 结果北京市 207 年 0 月 208 年 月期间共报告流感病毒导致的中小学校聚集性疫情 47 起, 涉及 6 所中小学, 累计发病 例, 平均罹患率 3.7% 乙型 Yamagata 系流感病毒为引起聚集性疫情的主导株 (88 起,59.9%); 其中主要发生在小学 ~2 年级 (62 起,70.5%) 疫情学校的流感疫苗总体接种率(37.5%) 低于全市中小学校总体接种率 (46.8%) 接种率 50% 的学校流感聚集性疫情发生率低于接种率 < 50% 的学校 疫情班级中, 总体流感疫苗保护率为 29.3%, 对甲型流感病毒疫情保护率为 43.6%, 对乙型 Yamagata 系流感病毒疫情保护率为 3.2%; 小学 3~6 年级保护率 (49.0%) 高于小学 ~2 年级 (0.5%) 结论虽然 年度流感疫苗不包含乙型 Yamagata 系流感病毒组分, 集体接种流感疫苗依然能减少中小学流感聚集性疫情的发生, 提高流感疫苗接种率能更有效的降低学校聚集性疫情的发生 关键词 流感 ; 中小学校 ; 流感疫苗 ; 聚集性 ; 北京基金项目 : 首都卫生发展科研专项 ( ) DOI: /cma.j.issn Effects of influenza vaccination among primary and secondary schools in Beijing on influenza outbreaks during influenza season Zhang Li, Yang Peng 2, Wang Quanyi Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Center for Preventive Medicine Research, Beijing 0003, China; 2 Office of Beijing Center for Global Health, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China Corresponding author: Yang Peng, yangpengcdc@63.com, Tel: Abstract Objective To examine the influenza vaccination and protective effectiveness among primary and secondary schools in Beijing where the influenza outbreaks were reported during influenza season, so as to provide further scientific evidences for the influenza vaccination strategy. Methods The data of influenza outbreaks reported from October 207 to January 208 were collected. The epidemiological characteristics and influenza vaccination status were described and the vaccine protection rate was calculated. Results A total of 47 influenza outbreaks in primary and secondary schools were reported, affecting cumulatively case in 6 schools. The average incidence was 3.7%. Influenza B/Yamagata-Lineage virus was the predominant strain (88 outbreaks, 59.9%), and most of outbreaks occurred among students of grade and grade 2 (62 outbreaks, 70.5%) in primary schools. The overall influenza vaccination rate of schools where outbreaks occurred (37.5%) was lower than that of all schools in Beijing (46.8%). Schools with the vaccination rate of 50% had less influenza outbreaks than those with the vaccination rate <50%. For classes involving in the outbreaks, the overall protection rate of

12 2 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. influenza vaccine was 29.3%, and the protection rate against influenza A virus and influenza B/Yamagata- Lineage virus were 43.6% and 3.2%, respectively. The protection rate among grade 3 to grade 6 (49.0%) was higher than that among grade and grade 2 (0.5%). Conclusions Even though influenza B/Yamagata- Lineage virus was not included in the vaccine formula of influenza season, collective influenza vaccination still reduced influenza outbreaks in schools. Elevated influenza vaccination rate should be more effective in decreasing influenza outbreaks in schools. Key words Influenza; School; Influenza vaccine; Outbreak; Beijing Fund program: Capital s Funds for Health Improvement and Research ( ) DOI: /cma.j.issn 流行性感冒 ( 简称 流感 ) 是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病, 具有传染性强 传播速度快 波及范围广和抗原易变性等特点, 人群普遍易感, 每年可引起季节性流行 [-2] 学校是人员高度聚集的场所, 人员密度大, 相互间接触时间长且较为密切, 是出现流感聚集性疫情的主要场所 每年接种流感疫苗是预防流感及其并发症的最有效手段 [3-4] 北京市自 2007 年开始对本市在校中小学生和中等专业学校学生实施流感疫苗免费接种 [5] 对北京市连续十年流感疫苗接种效果的回顾性评价研究结果显示, 在流感病毒疫苗株与流行主导株匹配的流行季, 北京市在中小学校开展流感疫苗大规模集中接种可使流感集中发热疫情的发生风险降低约 90%, 而在流感疫苗与流行主导株匹配度较低的流行季, 学校流感聚集性疫情数量显著增多 [6] 北京市在 207 年 9 月 20 日至 月 30 日期间为在校中小学生集中接种了三价流感疫苗 北京市流感监测数据显示, 年流感流行季流感流行强度是自 2009 年流感大流行以来最高的一年, 且流行主导株乙型 Yamagata 系流感病毒不包含在世界卫生组织推荐的 年北半球三价流感疫苗组分中 [7] 全市中小学校发生流感聚集性疫情的数量远超往年 因此, 本研究针对 年流感流行季期间发生流感聚集性疫情的中小学校的流感疫苗接种情况进行分析, 以了解流感疫苗接种对疫情的影响, 为流感疫苗接种策略提供进一步的科学依据 材料与方法. 资料来源 本研究收集 207 年 0 月至 208 年 月期间北京市各区疾控中心报告的流感病毒导致的中小学校聚集性疫情, 包括集中发热及流感样病例暴发疫情, 以及相关流行病学调查资料 通过校医报告和对本流行季原始接种记录查询的方式, 收集全市 203 所中小学校流感疫苗接种信息.2 病例定义和疫情报告标准.2. 病例定义 () 发热病例 : 体温 37.5, 即可确定为发热病例 (2) 流感样病例 : 发热 ( 腋 下体温 38 ), 伴咳嗽或咽痛之一者.2.2 疫情报告标准参照 北京市流感监测与疫情处置工作方案 (207 年版 ) 要求进行疫情报告, 即 :() 集中发热疫情 : 学校在同一班级 2 d 内出现集中发热病人 0 例以上 ( 含 0 例 ) (2) 流感样病例暴发疫情 : 周内, 在同一学校出现 0 例及以上流感样病例.3 标本采集及检测 每起疫情至少采集 0 份咽拭子标本 ( 如果病例数在 0 例以下的, 全部采样 ), 在 4 条件下, 于 2 h 内运送至辖区疾控中心实验室 各辖区疾控中心实验室接收到疫情标本后, 在 2 h 内利用 Real-time RT-PCR 检测方法进行流感病毒核酸检测和亚型鉴定.4 统计学分析 采用 Excel 2003 SPSS 20.0 等软件进行数据处理, 对聚集性疫情的发生时间 地区 场所分布 病原学以及流感疫苗接种情况等进行描述性流行 病学分析, 率的比较及风险估计采用 x 2 检验, 流感疫苗保护效率 (%)=(-OR) 00 以 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 流感聚集性疫情的流行病学特征 2.. 疫情总体情况 207 年 0 月至 208 年 月期间, 北京市共报告流感病毒导致的中小学校聚集性疫情 47 起, 涉及 6 所中小学, 累计发病 例, 无死亡病例, 波及 人, 平均罹患率 3.7% 平均每起疫情发病 5 例 ( 范围 : 0~38 例 ) 2..2 时间分布流感聚集性疫情高峰出现在 207 年第 5 周 (207 年 2 月 8 日至 2 月 24 日 ), 报告疫情 42 起, 发病数为 64 例 见图 2..3 年级分布小学为流感聚集性疫情的主要发生场所, 报告疫情 3 起, 占比 89.%, 中学报告疫情 6 起, 占比 0.9% 小学 ~2 年级共报告疫情 07 起, 占比 72.8%, 明显高于其他年级疫情数 见图 病原学分布乙型 Yamagata 系流感病毒

13 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 3 流感聚集疫情数 ( 起 ) 混合感染乙型 Victoria 系乙型 Yamagata 系甲型 H3N2 亚型甲型 HN 亚型 0 图 207 年 0 月 -208 年 月期间北京市流感聚集性疫情时间分布及病原学分布 0 年级 2 年级 3 年级 4 年级 5 年级 6 年级 小学年级 中学 图 207 年 0 月至 208 年 月期间北京市流感聚集性疫情时间分布及病原学分布 图 年 0 月至 208 年 月期间北京市流感聚集性疫情的不同学校种类 / 年级病原学分布 为引起聚集性疫情的主导株, 报告 88 起, 占疫情总数的 59.9%; 其次为甲型 HN 流感病毒引起的聚集性疫情, 报告 4 起, 占疫情总数的 9.5%; 再次为甲型 H3N2 亚型和乙型 Victoria 系流感病毒引起的聚集性疫情, 均报告 0 起, 均占疫情总数的 6.8%; 混合感染引起的聚集性疫情 25 起, 占疫情总数的 7.0% 对主导株乙型 Yamagata 系流感病毒引起的聚集性疫情进一步分析, 发现乙型 Yamagata 系流感疫情主要发生在小学, 共报告 8 起, 占乙型 Yamagata 系流感疫情的 92.0%, 且以 ~2 年级为主, 共报告 62 起, 占小学疫情的 76.5%, 占乙型 Yamagata 系流感疫情总数的 70.5% 见图 流感疫苗接种对疫情的影响 全市 203 所中小学校流感疫苗总体接种率为 46.8%, 高于 6 所发生流感聚集性疫情学校的流感疫苗总体接种率 (37.5%) 流感疫苗接种率 50% 的学校为 52 所, 其中 35 所学校出现流感聚集性疫情 (3.0%), 流感疫苗接种率 <50% 的 学校为 86 所, 其中 8 所学校出现流感聚集性疫情 (9.4%), 二者疫情发生率差异具有统计学意义 (OR=0.302,95%CI:0.20~0.453;P<0.0) 在所有发生疫情的班级中, 病例的平均接种率为 33.6%, 非病例的接种率为 4.7%, 非病例接种率显著高于病例接种率 (P<0.0), 总体流感疫苗保护率为 29.3% 由甲型流感病毒引起的疫情中, 病例的平均接种率为 3.7%, 非病例的接种率为 45.%, 非病例接种率显著高于病例接种率 (P<0.0), 流感疫苗保护率为 43.6% 由乙型 Yamagata 系流感病毒的疫情中, 病例的平均接种率为 35.5%, 非病例的接种率为 38.8%, 流感疫苗保护率为 3.2%(P=0.03) 进一步对由乙型 Yamagata 系流感病毒引起的小学疫情进行年级分层分析, 小学 ~2 年级的病例与非病例接种率无显著差异 (P=0.948), 流感疫苗保护率为 0.5%; 小学 3~6 年级的非病例接种率显著高于病例接种率 (P<0.0), 流感疫苗保护率为 49.0% 见表 表 流感聚集性疫情中病例与非病例流感疫苗接种情况 类型 流感疫苗接种 病例 ( 接种率 ) 非病例 ( 接种率 ) P 值 OR 值 (95%CI) 总体 84(33.6%) 2 24(4.7%) < (0.639~0.783) 甲型流感疫情 28(3.7%) 358(45.%) < (0.438~0.725) 乙型 Yamagata 系流感疫情 56(35.5%) 229(38.8%) (0.763~0.987) 小学 ~2 年级 397(40.%) 864(40.2%) (0.853~.60) 小学 3~6 年级 8(24.4%) 266(38.8%) < (0.380~0.684) 3 讨论全国监测数据显示, 年度报告的流感样病例数远高于前三个年度水平, 且发病年龄主要集中在 5 岁以下的群体, 儿童 学生发病数占大部分 (65.4%) [8], 这与北京市及我国其他地区的流感流行特征一致 [9-], 说明 5 岁以下儿童 学生仍是流感防控工作最重要的群体 本研究结果显示, 年流感流行季北京市中小学流感聚集性疫情的高峰出现在 207 年 5 周, 报告的场所以小学为主, 且呈现出以小学 ~2 年级聚集性疫情为主的显著特征, 两个年级的流感聚集性疫情报告数达到疫情总报告数的 72.8%, 明显高于其

14 4 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 他年级疫情数 乙型 Yamagata 系流感病毒为引起 年流感流行季中小学流感聚集性疫情的主导株, 且主要引起小学一 二年级聚集性疫情 (70.5%) 对流感疫苗接种情况分析结果显示, 发生流感聚集性疫情学校的流感疫苗总体接种率 (37.5%) 低于全市中小学校流感疫苗接种率 (46.8%) 流感疫苗对甲型流感病毒引起的聚集性疫情的保护率 (43.6%) 明显高于由乙型 Yamagata 系流感病毒引起的聚集性疫情 (3.2%) 对乙型 Yamagata 系流感病毒引起的聚集性疫情进一步分析发现, 流感疫苗对中高年级学生有一定的保护效果 (49.0%), 而对低年级学生无明显保护效果 (0.5%) 出现这种现象的主要原因可能是近两个流行季我市未出现过乙型 Yamagata 系流感病毒流行, 并且小学 ~2 年级学生既往未大规模接种过含有乙型 Yamagata 系流感病毒组分的流感疫苗 ( 流感流行季至 流感流行季三价流感疫苗中均包含乙型 Yamagata 系流感病毒组分 ), 因此本流行季小学低年级学生通过既往感染或疫苗接种获得针对乙型 Yamagata 系流感病毒残留免疫水平低于其他高年级学生 另外, 由于世界卫生组织推荐的 年北半球三价流感疫苗组分中不包含乙型 Yamagata 系流感病毒组分, 因此小学低年级学生发生乙型 Yamagata 系流感病毒集中发热疫情的风险相对高于其他高年级学生 与此同时, 本流行季全市中小学校甲型 HN 流感和甲型 H3N2 亚型流感疫情相对较少, 且流感疫苗有一定的保护效果, 表明我市在中小学校开展的流感大规模接种对于流感疫苗组分包含的病毒具有较好的预防效果 有研究表明, 学校流感疫苗覆盖率达到 50% 以上不但能够有效保护接种疫苗的学生, 而且能够对未接种流感疫苗的学生起到群体保护效果 [2] 本研究结果显示, 流感疫苗接种率 50% 的学校流感聚集性疫情报告率 (3.0%) 明显低于接种率 < 50% 的学校 (9.4%), 疫情风险减少 70%, 提示当流感疫苗覆盖率达到 50% 以上时, 可形成群体免疫屏障, 有效降低学校流感聚集性疫情的发生 虽然流感疫苗上市多年, 流感疫苗的安全性和有效性均已得到证实 [3-4], 但我市学校集体接种率并不理想 研究显示, 流感疫苗接种率受到多种因素影响, 如学生及家长对流感及流感疫苗相关知识的认知 [5], 家 [6] 长对孩子患病风险及对接种疫苗的必要性的认识等 因此, 未来我市应进一步加强流感及疫苗接种知识宣传和健康教育, 提高学生及家长防病意识, 提高流感疫苗接种率 综上所述, 虽然北京市 年度三价流感疫苗不包含乙型 Yamagata 系流感病毒组分, 集体接种流感疫苗依然能减少中小学流感聚集性疫情的发生, 提高流感疫苗接种率能更有效的降低学校聚集性疫情的发生 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] Cox NJ, Subbarao K. Influenza[J]. Lancet, 999, 354(986): DOI: 0.06/S (99) [2] 王小莉, 吴双胜, 吴晓娜, 等. 基于气象及流感病毒活动度的流感流行预测研究 [J]. 国际病毒学杂志, 207, 24(5): DOI: /cma.j.issn [3] Stephenson I, Nicholson KG. Influenza: vaccination and treatment[j]. Eur Respir J, 200, 7(6): DOI: 0.83/ [4] WHO. Influenza (seasonal): fact sheet [EB/OL]. ( ) [ ] [5] Zhang Y, Muscatello D J, Wang Q, et al. Overview of influenza vaccination policy in Beijing, China: current status and future prospects[j]. J Public Health Policy, 207, 38(3): DOI: 0.057/s [6] Pan Y, Wang Q, Yang P, et al. Influenza vaccination in preventing outbreaks in schools: a long-term ecological overview[j]. Vaccine, 207(35): DOI: 0.06/j.vaccine [7] WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the northern hemisphere influenza season[j]. Wkly Epidemiol Rec. 207, 92(): [8] 杨静, 陈涛, 祝菲, 等 年度中国大陆流行性感冒病例报告情况分析 [J]. 热带病与寄生虫学, 208(2): DOI: /j.issn [9] 康敏, 谭小华, 杨宇威, 等. 广东省 年冬季流感流行特征研究 [J]. 中华流行病学杂志, 208, 39(8): DOI: /cma.j.issn [0] 孙皎琳, 刘韩韩, 张琳, 等. 207~208 年冬季西北地区某站点流感流行特征分析 [J]. 国际呼吸杂志, 209, 39(): DOI: /cma.j.issn X [] 李岩, 韩光跃, 姜彩肖, 等 年河北省流感流行特征分析 [J]. 国际病毒学杂志, 209, 26(2): DOI: / cma.j.issn [2] Pannaraj PS, Wang HL, Rivas H, et al. School-located influenza vaccination decreases laboratory-confirmed influenza and improves school attendance[j]. Clin Infect Dis, 204, 59(3): DOI: 0.093/cid/ciu340. [3] 段玮, 杨鹏, 石伟先, 等. 流感疫苗的安全性和效果效益研究 [J]. 国际病毒学杂志, 204, 2(6): DOI: /cma. j.issn [4] 陈海平, 翟力军, 马燕丽, 等. 北京市流感病毒疫苗上市后接种率影响因素及安全性分析 [J]. 中国生物制品学杂志, 206, 29(7): [5] 刘海博, 吴波峰, 崔虹艳, 等. 北京市 年流感流行季一起流感暴发疫情分析 [J]. 国际病毒学杂志, 207, 24(): DOI: /cma.j.issn [6] 李美琴, 王磊, 彭明秋, 等. 北京市中关村地区家长风险认知与流感知识对小学生流感疫苗接种率的影响 [J]. 预防医学情报杂志, 205, 3(6): DOI: CNKI:SUN:YFYX ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 郑阳 )

15 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 5 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 健康教育 + 信息提示 对提高儿童流感疫苗接种率的效果 : 一项基于北京市 8 所幼儿园的社区试验 吴双胜马春娜 张海艳 孙瑛 2 初艳慧 张奕 3 张莉 王珺 2 杨鹏 肖征 4 3 王全意 张惺惺 段玮 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心传染病地方病控制所 0003; 2 北京市东城区疾病预防控制中心流行病科 00009; 3 北京市西城区疾病预防控制中心流行病科 000; 4 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心全球健康中心办公室 0003 通信作者 : 王全意, bjcdcxm@26.com, 电话 : 摘要 目的评估 健康教育 + 信息提示 对提高幼儿园儿童流感疫苗接种率的效果 方法 流感流行季在北京市东城区和西城区分别随机 4 所幼儿园, 将全部 名儿童的家长作为调查对象 将 8 所幼儿园随机分为干预组和对照组, 只给予干预组 健康教育 + 信息提示 的干预措施 主要结局为干预前后儿童接种流感疫苗行为的变化 应用 logistic 回归模型分析儿童接种流感疫苗行为变化的影响因素 结果两次均应答者 2 04 人, 有效应答率为 83.5% 在干预前后, 干预组接种率分别为 0.4%(4/ 067) 和 2.9%(3/ 067), 对照组分别为 0.8%(8/974) 和 0.9%(9/974) 干预组接种行为变好 不变和变差者分别占 2.8%(30/ 067) 96.9%( 034/ 067) 和 0.3%(3/ 067), 对照组分别占 0.7%(7/974) 98.7%(96/974) 和 0.6% (6/974) logistic 回归模型结果显示, 干预组 (OR=3.804,P=0.007) 家长知道接种时间地点 (OR=2.864,P<0.0) 的儿童流感疫苗接种行为变好的可能性更高 结论 健康教育 + 信息提示 的干预措施能够提高幼儿园儿童流感疫苗接种率, 但效果欠佳 关键词 流感疫苗 ; 接种率 ; 社区试验 ; 因素分析 ; 统计学基金项目 : 北京市优秀人才培养资助项目 ( G297) DOI: /cma.j.issn Effectiveness of health education plus message reminder to improve influenza vaccination coverage among children: a community trial in eight kindergartens in Beijing Wu Shuangsheng, Zhang Haiyan 2, Chu Yanhui 3, Wang Jun 2, Xiao Zheng 3, Zhang Xingxing, Duan Wei, Ma Chunna, Sun Ying, Zhang Yi, Zhang Li, Yang Peng, Wang Quanyi Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China; 2 Department of Epidemiology, Dongcheng District Center for Disease Prevention and Control, Beijing 00050, China; 3 Office of Global Health Center, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China Corresponding author: Wang Quanyi, bjcdcxm@26.com, Tel: Abstract Objective To access the effectiveness of health education plus message reminder to improve influenza vaccination coverage among children in the kindergarten. Methods From Dongcheng district and Xicheng district of Beijing, four kindergartens were randomly selected in each district, during the influenza season. The guardians of all children in the 8 kindergartens were recruited as research subjects. The kindergartens were randomly divided into the intervention group

16 6 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. and the control group. The measures of health education plus message reminder were only applied to the intervention group. The main outcome was the change of children s influenza vaccination behavior. Logistic regression model was used to identify influencing factors of the changes in influenza vaccination behaviors among children. Results A total of 2 04 participants completed the two surveys, with the response rate of 83.5%. The vaccine coverage rates before and after the intervention measures were 0.4% (4/ 067) and 2.9% (3/ 067) in the intervention group, and 0.8% (8/974) and 0.9% (9/974) in the control group, respectively. After the intervention, percentages of participants who had better, unchanged and worse behaviors in accepting influenza vaccine were 2.8% (30/ 067), 96.9% ( 034/ 067) and 0.3% (3/ 067) in the intervention group, and were 0.7% (7/974), 98.7% (96/974) and 0.6% (6/974) in the control group, respectively. The logistic regression model showed that higher possiblity of better influenza vaccination behaviors among children in the intervention group (OR=3.804, P=0.007) and parents knew the time and place of vaccination (OR=2.864, P<0.00). Conclusions The measures of health education plus message reminder improved influenza vaccination coverage among children in the kindergarten, but the effectiveness was unsatisfactory. Key words Influenza vaccine; Vaccination coverage; Community trial; Factor analysis; Statistics Fund program: Beijing Excellent Talents Training Fund ( G297) DOI: /cma.j.issn 流行性感冒 ( 简称 流感 ) 是影响公众健康的重大公共卫生问题, 每年导致严重的疾病负担 [-3] 流感应对困难 复杂, 接种流感疫苗是目前预防流感最有效的措施 世界卫生组织等官方机构均将孕妇 5 岁以下儿童 老年人 慢性病病人和医务人员等人群作为优先接种人群 [4] 5 岁以下儿童是流感发病的最高危人群, 在北京市 流行季发病率达到 32%, 远高于其他人群 [5] 北京市得益于户籍老年人和中小学生免费接种策略, 这两个人群接种率相对较高, 但是 5 岁以下儿童等其他重点人群需自费接种, 导致接种率极低 [6] 因此, 在其他重点人群中推广流感疫苗是下一步流感防控的重中之重 为此, 本研究在北京市 8 所幼儿园开展社区试验, 评价 健康教育 + 信息提示 对提高幼儿园儿童流感疫苗接种率的效果, 为制定流感疫苗接种策略提供科学依据 对象与方法. 研究对象 采取整群随机抽样方法, 在北京市东城区和西城区分别随机选择 4 所幼儿园作为调查地点, 调查对象为 8 所幼儿园的全部儿童的家长, 共计 人 要求两次调查对象为同一人.2 研究方法 本研究为社区试验, 将 8 所幼儿园随机分为干预组和对照组 205 年 0 月 5 日至 2 月 3 日, 对干预组幼儿园实施干预措施, 对照组不给予干预措施 干预措施为 健康教育 + 信息提示 的形式, 具体内容包括在幼儿园张贴海报, 海报内容包括流感及流感疫苗的知识 ; 给幼儿园园医和 接种点医生举办讲座, 讲解流感和流感疫苗的知识 ; 给儿童家长发放宣传折页, 折页内容包括流感及流感疫苗的知识, 并告知接种时间和地点 在干预前后 (205 年 9 月 20 日至 0 月 0 日 206 年 月 4 日至 3 月 7 日 ) 分两次应用自填式匿名调查问卷对调查对象进行现场调查, 问卷内容包括人口学特征和对流感及流感疫苗的认知 关于对流感及流感疫苗的认知的提问方式 : 您是否同意以下说法 : 儿童容易得流感 流感可以导致儿童住院 流感疫苗能有效保护儿童 儿童打流感疫苗是安全的 流感疫苗的副作用令人担心, 答案包括同意 不同意 不清楚 在北京市免疫决策系统查询所有儿童在 流行季和 流行季的流感疫苗接种现状.3 相关定义 关于流感疫苗接种行为, 是否接种的赋值分别为 和 0, 干预前后接种状态的差值为正值, 即为接种状态变好 ; 差值为负值, 即为变差 ; 差值为 0, 即为不变 对儿童容易得流感 流感可以导致儿童住院 流感疫苗能有效保护儿童 儿童打流感疫苗是安全的认知, 答案同意 不同意 不清楚的赋值分别为 - 和 0, 对流感疫苗引起的副作用令人担心的认知, 答案同意 不同意 不清楚的赋值分别为 - 和 0, 事件前后认知的差值为正值, 即为认知增强 ; 差值为负值, 即为降低 ; 差值为 0, 即为不变 流感认知赋值的变化等于所有 5 个认知相关问题的事件前后差值之和.4 统计学分析 采用 Epidata 3. 软件进行数据双录入和检错, 采用 SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析 主要结

17 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 7 局变量为干预前后儿童接种流感疫苗行为的变化 采用 Pearson x 2 检验进行单因素分析, 比较不同特征接种流感疫苗行为的变化 采用非条件多因素 logistic 回归模型分析接种流感疫苗行为变化的影响因素 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 人口学特征 205 年 9 月 20 日至 0 月 0 日发放问卷 份, 回收有效问卷 份 ;206 年 月 4 日至 3 月 7 日发放问卷 份, 回收有效问卷 份 两次均应答者 2 04 人, 有效应答率为 83.5%(2 04/ 2 443) 干预组儿童占 52.3%( 067/2 04); 女性占 49.0%( 000/2 04); 独生子女占 90.4% ( 798/ 988); 北京户籍占 88.3%( 783/2 020); 母亲 父亲文化程度以大学及以上为主, 分别占 85.6%( 73/2 023) 和 85.4%( 733/2 029); 母亲 父亲 35 岁以上分别占 3.%(266/2 025) 和 30.6% (69/2 023); 家庭月收入 元占 47.5% (875/ 843); 有慢性病占 5.5%(/2 006) 2.2 儿童接种流感疫苗率的干预前后比较 在干预前 ( 流行季 ), 干预组和对照组的接种率分别为 0.4%(4/ 067) 和 0.8%(8/974), 差异无统计学意义 (x 2 =.737,P=0.88); 在干预后 ( 流行季 ), 干预组和对照组的接种率分别为 2.9%(3/ 067) 和 0.9%(9/974), 接种率 (%) 3.5% 3.0% 2.5% 2.0%.5%.0% 0.5% 0.0% 干预组 对照组 图 实施干预措施前后流感疫苗接种率的干预组与对照组比较 差异有统计学意义 (x 2 =0.403,P=0.00) 见图 2.3 儿童接种流感疫苗行为改变的单因素分析 对比干预前后儿童接种流感疫苗的行为, 接种行为变好 不变和变差者分别占.8%(37/2 04) 97.7%( 995/2 04) 和 0.4%(9/2 04); 其中, 干预组接种行为变好 不变和变差者分别占 2.8% (30/ 067) 96.9%( 034/ 067) 和 0.3% (3/ 067); 对照组接种行为变好 不变和变差者分别占 0.7%(7/974) 98.7%(96/974) 和 0.6% (6/974) 单因素分析结果显示, 流感疫苗接种行为的变化与是否在干预组 有医务人员推荐和指导接种时间地点存在相关性 (P 值均 <0.05) 见表 表 影响儿童接种流感疫苗行为改变的单因素分析 影响因素 干预组 人数 干预前后接种状态 变差没变变好 x 2 值 P 值 否 974 6(0.6) 96(98.7) 7(0.7) <0.0 是 067 3(0.3) 034(96.9) 30(2.8) 性别 女 000 4(0.4) 975(97.5) 2(2.) 男 04 5(0.5) 020(98) 6(.5) 独生子女 否 90 (0.5) 85(97.4) 4(2.) 是 798 7(0.4) 759(97.8) 32(.8) 户口 外地 237 2(0.8) 233(98.3) 2(0.8) 北京 783 7(0.4) 74(97.6) 35(2) 母亲文化 大学及以上 73 8(0.5) 692(97.7) 3(.8) 高中及以下 292 (0.3) 285(97.6) 6(2.) 父亲文化 大学及以上 733 9(0.5) 694(97.7) 30(.7) 高中及以下 296 0(0) 289(97.6) 7(2.4) 家庭月收入 ( 元 ) (0.4) 943(97.4) 2(2.2) (0.5) 86(98.4) 0(.) 慢性病 否 895 9(0.5) 854(97.8) 32(.7) 是 0(0) 07(96.4) 4(3.6) 去接种点方便 否 38 0(0) 3(97.8) 7(2.2) 是 695 9(0.5) 657(97.8) 29(.7) 有医务人员推荐 否 30 6(0.5) 278(98.2) 7(.3) 是 707 3(0.4) 685(96.9) 9(2.7) 家长知道接种时间地点 否 445 4(0.3) 425(98.6) 6(.) 是 568 5(0.9) 543(95.6) 20(3.5) 流感认知赋值的变化 (0.4) 664(97.9) (.6) (0.3) 643(97.9) 2(.8) 599 3(0.5) 584(97.5) 2(2.0) 合计 (0.4) 995(97.7) 37(.8)

18 8 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 2.4 影响儿童接种流感疫苗行为变好的非条件多因素 logistic 回归分析 非条件多因素 logistic 回归分析的结果显示, 干预组 (OR=3.804,P=0.007) 家长知道接种时间地点 (OR=2.864,P<0.0) 的儿童接种流感疫苗行为变好的可能性更高 见表 2 表 2 影响儿童接种流感疫苗行为变好的非条件多因素 Logistic 回归分析 影响因素 β 值标准误 Wald x 2 值 P 值 OR 值 OR 值 (95%CI) 家长知道接种时间地点 干预组儿童 讨论对流感易感性和严重性认知不足 对流感疫苗效果和安全性的质疑是影响公众流感疫苗接种的重要原因 [7] 本研究显示, 北京市幼儿园儿童流感疫苗接种率极低 一项调查也显示, 当前我国 5 岁及以下儿童流感疫苗接种率很低, 对流感及其疫苗的认知不足是主要阻碍因素 [8] 本研究干预措施为 健康教育 + 信息提示, 内容主要包括流感和流感疫苗相关知识, 且干预组儿童接种流感疫苗行为变好的可能性是对照组的近 4 倍 研究结果提示, 在开展干预活动时应关注流感及流感疫苗相关知识 在我国, 流感疫苗属于二类疫苗 自 2007 年以来, 北京市为本市户籍老年人和中小学生免费接种流感疫苗, 政府部门每年组织接种单位统一提供接种服务 然而, 北京市幼儿园儿童等其他重点人群自费自愿接种 [9], 接种服务的可及性差于免费人群 本研究发现, 家长知道接种时间地点的儿童流感疫苗接种行为变好的可能性是其他儿童的近 3 倍 研究结果提示, 告知家长接种时间地点能够提高接种服务的可及性, 进而提高幼儿园儿童的接种率 虽然 健康教育 + 信息提示 能够提高幼儿园儿童流感疫苗接种率, 但是干预组接种率仅从 0.3% 提升到 2.9% 可能原因是这两种干预措施均属于非特异措施, 导致干预效果有限 其他研究也证实, 健康教育和信息提示仅能轻微提高接种率 (5.9% 比 4.4% [0] ) 此外, 幼儿园儿童接种流感疫苗还受到外部环境因素的影响, 如免费接种政策显著提升了北京市中小学生的流感疫苗接种率 [9], 但是本研究仅从健康教育和信息提示等两个方面实施了干预 研究结果提示, 在幼儿园儿童中推广流感疫苗较为困难, 还应从接种政策等其他方面着手 综上所述, 健康教育 + 信息提示 能够提高儿童流感疫苗接种率, 但总体效果欠佳 ; 告知 家长接种时间地点能够提高儿童流感疫苗接种率 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] Paules C, Subbarao K. Influenza[J]. Lancet, 207, 390(0095): DOI: 0.06/S (7) [2] Zhang Y, Muscatello DJ, Wang Q, et al. Hospitalizations for influenza-associated severe acute respiratory infection, Beijing, China, [J]. Emerg Infect Dis, 208, 24(): DOI: 0.320/eid [3] Wu S, Wei Z, Greene CM, et al. Mortality burden from seasonal influenza and 2009 HN pandemic influenza in Beijing, China, [J]. Influenza Other Respir Viruses, 208, 2(): DOI: 0./irv.255. [4] 冯录召, 彭质斌, 王大燕, 等. 中国流感疫苗预防接种技术 指南 ( )[J]. 中华流行病学杂志, 208, 39(): DOI: /cma.j.issn [5] Wu S, VAN Asten L, Wang L, et al. Estimated incidence and number of outpatient visits for seasonal influenza in in Beijing, China[J]. Epidemiol Infect, 207, 45(6): DOI: 0.07/S [6] Wu S, Su J, Yang P, et al. Factors associated with the uptake of seasonal influenza vaccination in older and younger adults: a large, population-based survey in Beijing, China[J]. BMJ Open, 207, 7(9): e DOI: 0.36/bmjopen [7] Nguyen T, Henningsen KH, Brehaut JC, et al. Acceptance of a pandemic influenza vaccine: a systematic review of surveys of the general public[j]. Infect Drug Resist, 20, 4: DOI: 0.247/IDR.S2374. [8] 孙秀玲, 张红. 学龄前儿童家长为儿童接种流感疫苗调查分 析 [J]. 中国医师杂志, 205, 7(z2): DOI: / cma.j.issn z2.05. [9] Zhang Y, Muscatello DJ, Wang Q, et al. Overview of influenza vaccination policy in Beijing, China: current status and future prospects[j]. J Public Health Policy, 207, 38(3): DOI:0.057/s [0] Borg K, Sutton K, Beasley M, et al. Communication-based interventions for increasing influenza vaccination rates among Aboriginal children: A randomised controlled trial[j]. Vaccine, 208, 36(45): DOI: 0.06/j.vaccine ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杜丹 )

19 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 9 北京市 年流感流行季集中发热疫情特征分析 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 孙瑛杨鹏张莉吴双胜张奕段玮王全意王华庆 中国疾病预防控制中心免疫规划中心, 北京 00050; 2 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心全球健康中心办公室 0003; 3 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心传染病地方病控制所 0003 通信作者 : 王华庆, hqwang@vip.sina.com, 电话 : 摘要 目的掌握北京市集中发热疫情的流行特征, 为流感防控提供科学依据 方法收集北京市 年流感流行季集中发热疫情资料, 对疫情的规模 时间 场所 病原以及防控措施进行描述和分析 结果北京市 年流感流行季, 共报告集中发热疫情 742 起,85.64% 由流感病毒导致 时间上呈现 2 个高峰 远郊区疫情的规模及罹患率均小于城区 (P<0.05), 托幼机构疫情的罹患率大于其他场所 (P<0.0) 经实验室检测, 疫情主要由乙型 Victoria 系流感病毒 (39.09%) 甲型 H3N2 亚型流感病毒 (2.82%) 和甲型 HN 流感病毒 (20.7%) 引起 不同型别流感病毒在不同场所和城郊的分布均不同 (P<0.05) 疫情介入时间越早规模越小(r=0.35,P<0.0) 结论北京市集中发热疫情主要分布在小学及托幼机构, 疫情的早期发现和处置可以降低疫情的规模 关键词 集中发热疫情 ; 流感 ; 流行病学特征 基金项目 : 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心科研培育专项 (209-BJYJ-03); 首都卫生发展科研专项 ( ); 首都卫生发展科研专项项目 ( ) DOI: /cma.j.issn Epidemiological characteristics of febrile outbreaks in Beijing during influenza season Sun Ying, Yang Peng 2, Zhang Li 3, Wu Shuangsheng 3, Zhang Yi 3, Duan Wei 3, Wang Quanyi 3, Wang Huaqing Department of National Immunization Program, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 00050, China; 2 Offce of Beijing Center for Global Health, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China; 3 Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing 0003, China Corresponding author: Wang Huaqing, hqwang@vip.sina.com, Tel: Abstract Objective To understand the epidemiology characteristic of febrile outbreaks in Beijing, so as to provide a scientific basis for influenza prevention. Methods The data of febrile outbreaks reported from 208 to 209 were collected. The epidemiological characteristics were described and analyzed by scales, time, places, pathogens and interventions of the outbreaks. Results In the influenza season, a total of 742 febrile outbreaks were reported, and 85.64% were caused by the influenza virus. Two peaks were observed in the demension of time. The scales and attack rates of outbreaks in outer suburbs districts were higher than those in urban districts (P<0.05). The attack rate in child care facilities was greater than those in other places (P<0.0). According to laboratory tests, the outbreaks were mainly caused by influenza B/Victoria-Linage virus (39.09%), influenza A (H3N2) virus (2.82%) and influenza A (HN)pdm09 virus (20.7%). The differences in the distribution of types of influenza viruses in places and districts were statistically significant (P<0.05). Earlier intervention reduced the scales of outbreaks (r = 0.35, P<0.0). Conclusions The febrile outbreaks mainly occurred in primary schools and child care facilities. Early detection and intervention may reduce the scale of the outbreaks. Key words Influenza; Febrile outbreaks; Epidemiological characteristics Fund Programs: Cultivation Fund of Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine (209-BJYJ-03); Capital s Funds for Health Improvement and Research ( ); Capital s Funds for Health Improvement and Research ( ) DOI: /cma.j.issn

20 20 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 流行性感冒 ( 简称 流感 ) 是由甲 乙和丙型流感病毒引起的一种呼吸道传染病, 在我国属于法定报告丙类传染病 [] 由于流感病毒传染性较强 抗原易变异 传播迅速等特点, 容易在学校 托幼机构和养老院等人群聚集的场所发生暴发疫情, 造成严重的疾病负担 [2-4] 近年来, 北京市流感流行情况屡创新高, 甚至达到了第 4 级橙色预警水平, 受到广泛关注 [5] 本文对北京市 年流感流行季集中发热疫情特征进行分析, 旨在掌握北京市近年来集中发热疫情的流行特征, 为防控政策提供依据 材料与方法. 资料来源 本研究收集 208 年 0 月至 209 年 6 月期间, 北京市集中发热疫情监测体系中报告的疫情信息, 包括疫情规模 发生场所 所在区 报告时间 波及人数 病原体 首发病例时间 疫情班级流感疫苗接种率等信息 其中城区包括 : 东城区 西城区 朝阳区 海淀区 丰台区和石景山区, 远郊区则为北京市其他区.2 病例定义与疫情标准 发热病例, 指腋下体温 37.5 的病例 流感样病例, 指发热 ( 腋下体温 38 ), 伴咳嗽或咽痛之一者 集中发热疫情的标准为 :() 同一班级或集体单位同一部门 2 d 内出现集中发热病人 5 例以上 ( 含 5 例 ), 或同一宿舍或同一办公室超过 3 例以上 ( 含 3 例 ) (2) 周内, 在同一集体单位出现 0 例及以上流感样病例 上述标准中, 符合任意一条即可判定为集中发热疫情.3 疫情调查与检测 当集体单位报告集中发热疫情后, 由辖区疾控中心开展核实 调查与处置, 并采集发热病例的咽拭子标本, 立即送辖区疾控中心实验室进行检验, 从发热病例咽拭子标本中提取病毒 RNA 后, 采用实时荧光 PCR 方法进行甲型 H3N2 亚型 (A (H3N2)) 流感病毒 甲型 HN(A (HN) pdm09) 流感病毒以及乙型 Victoria 系 (B (Victoria)) 流感病毒 乙型 Yamagata 系 (B (Yamagata)) 流感病毒的检测.4 统计与分析 使用 Excel 203 软件和 SAS 软件 (SAS Institute, Inc,Cary,NC) 进行数据核对 管理和分析 对疫情的规模 时间 场所 病原以及防控措施进行分析 对于服从或经数据转换服从正态分布的定量资料, 采用均数和标准差进行描述, 使用方 差分析对比各组间的差异 否则, 采用中位数和四分位间距以及构成比进行描述, 使用秩和检验或卡方检验对比各组的差异 ; 采用 Spearman 相关分析疫情介入时间和流感疫苗接种率对最终疫情规模的影响 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 疫情概况 北京市 年流感流行季, 共报告 742 起集中发热疫情 ( 其中 起疫情发热人数不详 ), 累计报告发热病例 8 2 人, 疫情共波及 人, 平均罹患率为 27.8% 其中 0 人以下规模的疫情 338 起, 占比 45.6%;~20 人规模的疫情 364 起, 占比 49.2%;20 人以上规模的疫情 39 起, 占比 5.26% 见表 表 疫情规模 ( 人 ) 北京市 年流感流行季集中发热疫情场所分布表 托幼机构小学中学 其他集体 单位 合计 0~ ~ 合计 流行特征 2.2. 时间分布北京市 年流感流行季, 流感疫情呈现 2 个高峰 第一个高峰出现在 208 年第 52 周至 209 年第 2 周, 主要由 (A(H3N2)) 和 A(HlNl)pdm09 流感病毒导致 ; 第二个高峰出现在 209 年 2 周至 6 周, 主要由 B(Victoria) 流感病毒导致的疫情 见图 地区分布北京市 年流感流行季各区疫情较多的区为 : 通州 (43 起, 占 9.27%) 朝阳 (2 起, 占 6.3%) 西城 (80 起, 占 0.78%) 大兴 (66 起, 占 8.89%) 和海淀区 (64 起, 占 8.63%) 在北京城区疫情规模和罹患率中位数分别为 0 人 (8~3 人 ) 和 30.86%(23.25%~40.00%), 远郊区疫情规模和罹患率中位数分别为 9 人 (7~3 人 ) 和 25.58% (9.5%~35.3%), 经 Wilcoxon 秩和检验, 城区的疫情规模 (Z=3.28,P<0.0) 和罹患率 (Z=5.28, P<0.0) 均大于远郊区 场所分布北京市 年流感流行季, 集中发热疫情主要分布在小学 (404 起, 占 54.52%) 托幼机构 (206 起, 占 27.80%) 和中学 (3 起, 占 5.25%), 其余发生在医院 大学等集体单位 (8 起, 占 2.43%) 经

21 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No A(HN)pdm09 A(H3N2) B(Victoria) B(Yamagata) 流感病毒混合其他病原体阳性率 70.00% 60.00% 疫情数 ( 起 ) % 40.00% 30.00% 20.00% 0.00% 核酸阳性率 周次 流感病毒混合疫情为 2 种及以上流感病毒导致的疫情 ; 其他病原体疫情为非流感病毒导致的疫情 图 北京市 流感流行季集中发热疫情时间分布 ( 周 ) 0.00% Kruskal-Wallis 秩和检验, 不同场所发生的疫情规 模差异无统计学意义 (x 2 =3.39,P=0.34), 而不同场所疫情的罹患率差异有统计学意义 (x 2 =67.9, P<0.0) 其中托幼机构的罹患率最高 ( 中位数为 34.48%), 且与小学 (25.64%) 中学 (28.57%) 以及其他集体单位 (7.89%) 的疫情罹患率差异有统计学意义 病原学检测报告的集中发热疫情 742 起, 其中 724 起疫情共采集了 件发热病例咽拭子标本进行流感病毒核酸检测其中阳性标本 件, 阳性率为 55.82% 经实验室检测,85.64% 的疫情由流感病毒引起, 具体为 B(Victoria) 疫情 283 起 (39.09%),A(H3N2) 疫情 58 起 (2.82%),A(HlNl)pdm09 疫情 46 起 (20.7%),BY 疫情 4 起 (0.55%), 流感病毒混合疫情 29 起 (4.0%) 不同型别流感病毒导致的集中发热疫情, 在不同场所分布不同 (P<0.0) 由 B(Victoria) 和 (A(HlNl)pdm09) 导致的集中发热疫情, 主要发生在低龄儿童组成的小学和托幼机构,A(H3N2) 疫情则主要发生在中学和小学, 且所有流感病毒型别在不同场所的分布差异均有统计学意义 见表 2 表 2 北京市 年流感流行季不同病原体的疫情场所分布 a 病原体托幼机构小学中学其他 B(Victoria) 68 (24.03%) 20 (7.02%) 0 (3.53%) 4 (.4%) 283 (39.09%) A(HlNl)pdm09 78 (53.42%) 5 (34.93%) (7.53%) 6 (4.%) 46 (20.7%) A(H3N2) 2 (7.59%) 73 (46.2%) 7 (44.94%) 2 (.27%) 58 (2.82%) 其他 40 (29.2%) 76 (55.47%) 6 (.68%) 5 (3.65%) 37 (8.92%) 合计 98 (27.35%) 40 (0.55%) 08 (0.5%) 7 (0.02%) 724 (00.00%) 注 : a : 其他为不明确病原体 合计 不同型别流感病毒导致的集中发热疫情在城 区和远郊区的分布不同 (x 2 =2.92,P<0.0) (A(HlNl)pdm09) 和 B(Victoria) 导致的集中发热疫情主要发生在郊区 ( 占比 58.90% 和 64.3%); 而 A(H3N2) 导致的集中发热疫情主要发生在城区 (59.49%) 其中 A(H3N2) 的疫情与其他型别的疫情在城郊分布比较, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) 不同型别流感病毒导致的集中发热疫情规模 的中位数均为 0 人, 差异无统计学意义 (x 2 =5.6, P=0.6); 罹患率在 27.63%~28.20% 之间, 差异 无统计学意义 (x 2 =3.65,P=0.30) 2.3 干预措施 2.3. 疫情介入时间从疫情的首发病例到疫情报告时间中位数为 3 d(2~4 d), 疫情规模的中位数为 0 人 (8~3 人 ), 经 Spearman 秩相关检验, 二者之间存在正相关 (r=0.35,p<0.0) 流感疫苗接种发生疫情的班级流感疫苗接种率中位数为 29.27%(8.82%~46.67%), 经 Spearman 秩相关检验, 流感疫苗接种率与疫情规模之间关联性不具有统计学意义 (r=-0.02, P=0.58)

22 22 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 3 讨论北京市 流感流行季, 集中发热疫情形成两个高峰, 第一个峰出现在 208 年冬季, 主要以甲型流感病毒导致 ; 第二个峰出现在 209 年春季, 主要以 B(Victoria) 导致, 这与中国流感中心监测的结果类似 [6] 然而在近年中国北方地区 [2, 的同一流感季中, 未出现两波高峰的的情况 6-8] 其中的可能原因是 B(Victoria) 在北京市近五年均未成为优势株流行, 导致人群中普遍缺乏抗体, 且 流行季中 B(Victoria) 导致的疫情主要累及托幼机构和小学等低龄儿童 [3-4] 集中发热疫情在城区的规模和罹患率均高于远郊区, 可能与流感病毒的传播方式有关, 远郊区人口密度较低, 不易形成较大规模的疫情 [] 集中发热疫情在托幼机构中罹患率远高于中小学校, 可能与北京市对中小学生免费流感疫苗的政策, 导致北京中小学校具有较高的疫苗接种率 (42%) [4, 有关, 从而减少疫情的进一步扩散和发生 9] 在集中发热疫情的病原学构成中,B(Victoria) 是最主要的毒株, 然而同时期流感病原学监测中最主要的毒株是 A(HlNl)pdm09 可能原因是该流行季采用的疫苗中,A(HlNl)pdm09 具有良好的匹配性, 而 B(Victoria) 和 A(H3N2) 并不十分匹配, 并且在最易出现集中发热疫情的中小学中具有较高的疫苗接种率, 从而改变了集中发热疫情的病原学 [3-4, 构成 6] 这也可能是 A(HlNl)pdm09 疫情在托 [7, 幼机构中比中小学中更多的原因 0-] 远郊区疫情以 A(HlNl)pdm09 和 B(Victoria) 为主, 而城区以 A(H3N2) 为主, 不同病毒型别在地区的分布差异可能需要进一步分析 首发病例到疫情介入时间间隔与疫情最终人数呈正先关, 即越早介入, 疫情最终规模越小, 与其他研究结果类似 [2-3] 本研究中, 流感疫苗接种率与疫情最终规模的关联无统计学差异, 但有研究显示流感疫苗能够有效避免疫情的发生 [3-4] 可能原因是发生疫情班级疫苗接种率普遍较低 (29%), 不足以防止疫情规模进一步扩大 ; 或者还有其他混杂因素未纳入考虑影响其结果, 需要进一步分析 本研究作为监测数据分析存在一定的局限性 : () 作为横断面数据, 且未对诸多混杂因素进行调整, 结论仅可为未来研究提供假设 (2) 报告的集中发热疫情主要集中在学校 托幼机构等场所, 数据收集可能存在一定偏倚, 结论可能主要反映上述场所的情形 (3) 数据收集过程存在数据缺失等情形, 需要进一步加强培训, 提高数据质量 (4) 疫情检测的病原体为流感病毒, 不能 反映疫情的病原谱 综上所述, 北京市 流感流行季的集中发热疫情具有 2 个高峰 疫情的规模在城区和郊区以及不同的场所之间具有一定的差异 北京市流感疫苗免费接种政策可能改变了集中发热疫情的病原学构成 疫情的早期发现和处置可以降低疫情的规模 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] 彭文伟. 传染病学 [M]. 北京 : 人民卫生出版社, 2003: [2] 刘丽军, 杨静, 祝菲, 等 年中国流感样病例暴发 疫情分析 [J]. 中华预防医学杂志, 209, 53(0): DOI: /cma.j.issn [3] 冯录召, 彭质斌, 王大燕, 等. 中国流感疫苗预防接种技术 指南 ( )[J]. 中华流行病学杂志, 208, 39(): DOI: /cma.j.issn [4] 国家免疫规划技术工作组流感疫苗工作组. 中国流感疫 苗预防接种技术指南 ( )[J]. 中华流行病学杂志, 209, 40(): DOI: /cma.j.issn [5] 张莉, 吴双胜, 石伟先, 等. 综合指数法建立北京市流感流行 水平分级评价体系的研究 [J]. 中华流行病学杂志, 208, 39(8): DOI: /cma.j.issn [6] 中国国家流感中心. 209 年第 25 周第 549 期中国流感监测周 报 [EB/OL]. [ ]. lgzb/20906/t _20362.htm. [7] 吴双胜, 杨鹏, 石伟先, 等 年北京市流感样病例 和流感病原学监测 [J]. 国际病毒学杂志, 203, 20(): -6. DOI: /cma.j.issn [8] 段玮, 孙瑛, 杨鹏, 等 年北京市流感监测分析 [J]. 首都公共卫生, 206, 0(2): DOI: CNKI:SUN:SDGW [9] Pan Y, Wang Q, Yang P, et al. Influenza vaccination in preventing outbreaks in schools: a long-term ecological overview[j]. Vaccine, 207, 35(5): DOI: 0.06/j.vaccine [0] Zhang Y, Cao Z, Costantino V, et al. Influenza illness averted by influenza vaccination among school year children in Beijing, [J]. Influenza Other Respir Viruses, 208, 2(6): DOI: 0./irv [] Zhang L, van der Hoek W, Krafft T, et al. Influenza vaccine effectiveness estimates against influenza A(H3N2) and A(HN) pdm09 among children during school-based outbreaks in the season in Beijing, China[J]. Hum Vaccin Immunother, 209: -7. DOI: 0.080/ [2] 陆剑云, 陈艺韵, 马钰, 等. 广州市 年流感样病 例暴发疫情特征分析 [J]. 实用预防医学, 209, 26(): DOI: /j.issn [3] 汪鹏, 孔德广, 王英, 等. 武汉市 年流感样病例暴 发疫情流行特征分析 [J]. 国际病毒学杂志, 209, 26(): DOI: /cma.j.issn ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 郑阳 )

23 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 23 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 北京市 流行季流感的发病率和住院率研究 张代涛刘重程赵小娟张奕杨鹏王全意 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心传染病地方病控制所 0003; 2 北京市昌平区疾病预防控制中心传染病与地方病控制科 02200; 3 北京市怀柔区疾病预防控制中心传染病地方病控制科 0400; 4 北京市疾病预防控制中心北京市预防医学研究中心全球健康中心办公室 0003 通信作者 : 王全意, bjcdcxm@26.com, 电话 : 摘要 目的估算北京市 流行季流感的发病率和住院率 方法基于北京市昌平区和怀柔区的流感样病例 (influenza like illness, ILI) 监测 流感病原学监测 住院严重急性呼吸道感染 (severe acute respiratory infection, SARI) 病例监测和医疗卫生服务利用调查的数据, 采用乘法模型估算流感的发病率和流感相关的 SARI 住院率 结果北京市昌平区和怀柔区 流行季流感的发病率为 5.4%(95%CI:4.5%~7.4%), 流感相关的 SARI 住院率为 3/0 万 (95% CI: 22/0 万 ~44/0 万 ), 住院发病比约为 : 74 发病率最高的为 5~4 岁组儿童, 住院率 住院发病比最高的均为 < 5 岁儿童 北京市 流行季甲型 HN 流感导致的发病率 (2.3%,95%CI:.9%~3.2%) 住院率(7/0 万,95% CI:/0 万 ~28/0 万 ) 住院发病比( : 37) 高于其他亚型 结论流感导致的疾病负担在儿童中尤为严重, 建议制订针对儿童的免疫策略, 预防流感传播 关键词 流感 ; 发病率 ; 住院率 ; 乘法模型基金项目 : 首都卫生发展科研专项 ( ) DOI: /cma.j.issn The incidence rate and hospitalization rate of seasonal influenza in Beijing, Zhang Daitao, Liu Zhongcheng 2, Zhao Xiaojuan 3, Zhang Yi, Yang Peng 4, Wang Quanyi Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China; 2 Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Changping Center for Disease Prevention and Control, Beijing 02200, China; 3 Institute for Infectious Disease and Endemic Disease Control, Huairou Center for Disease Prevention and Control, Beijing 0400, China; 4 Office of Global Health Center, Beijing Center for Diseases Prevention and Control, Beijing Research Center for Preventive Medicine, Beijing 0003, China Corresponding author: Wang Quanyi, bjcdcxm@26.com, Tel: Abstract Objective To estimate the incidence rate and hospitalization rate of seasonal influenza in Beijing, Methods A multiplier model was used to estimate the incidence rate of influenza and hospitalization rate of influenza-associated severe acute respiratory infection (SARI) based on influenza surveillance data in Changping district and Huairou district of Beijing, including influenza-like illness (ILI) surveillance, pathogenic surveillance of influenza, SARI surveillance, as well as the data of health care service utilization. Results In influenza season, the incidence rate of seasonal influenza was 5.4% (95%CI: 4.5%-7.4%) in Changping district and Huairou district. The influenza-associated SARI hospitalization rate was 3/ (95%CI: 22/ /00 000). The ratio of hospitalization rate to incidence rate was about :74. The incidence was the highest among children aged 5-4 years old. Both hospitalization rate and the ratio of hospitalization rate to incidence

24 24 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. rate were the highest among children aged < 5 years old. The incidence rate (2.3%, 95%CI:.9%-3.2%), influenza-associated SARI hospitalization rate (7/00 000, 95%CI: / /00 000) and the ratio of hospitalization rate to incidence rate (:37) related to influenza A (HN) pdm09 were higher than those related to any other subtype of influenza. Conclusions The disease burden of influenza was substantial among children. It is recommended to provide specific immunization program for children to prevent transmission of influenza. Key words Influenza; Incidence; Hospitalization rate; Multiplier model Fund program: Capital s Funds for Health Improvement and Research ( ) DOI: /cma.j.issn 疾病负担的估算是了解疾病严重程度 优化 医疗卫生资源配置 调整免疫接种策略的重要参 考数据 [] 流感的发病负担和住院负担估算是流 感疾病负担评估的重要组成部分 本研究基于 北京市两个区的流感监测数据, 采用乘法模型, 估算我市 流行季流感的发病率与流 感相关的住院严重急性呼吸道感染 (severe acute respiratory infection,sari) 住院率, 为卫生决策 提供数据支持 资料与方法 本研究中 流行季指 208 年第 27 周至 209 年第 26 周 首先, 基于流感样病例 (influenza like illness,ili) 监测数据和流感病原 学监测数据推算流感的发病率 然后, 基于住院 SARI 监测数据, 估算流感相关的 SARI 住院率 最后, 计算该流行季住院率与发病率的比例关系. 数据来源 ILI 病例监测 : 根据 北京市流感监测与疫情 处置工作方案, 在我市全部一级及以上医疗机 构开展 ILI 监测 本研究选取昌平区和怀柔区的监 测数据, 分 < 5 岁,5~4 岁,5~24 岁,25~59 岁 和 60 岁 5 个年龄组记录全部哨点医院每周报告 的 ILI 病例数 流感病原学监测 : 根据 北京市流感监测与 疫情处置工作方案, 在我市 23 家哨点医院开展 ILI 病例的病原学监测 选取昌平区和怀柔区的监 测数据, 分 5 个年龄组和周次记录每周 ILI 病例标 本中流感的阳性率, 以及每种亚型 / 系流感病毒在 阳性标本中所占构成比 住院 SARI 病例监测 : 根据 北京市住院严重 急性呼吸道感染 (SARI) 病例监测工作方案 (206 版 ), 在北京市 0 家哨点医院的住院科室开 展 SARI 监测 选取昌平区和怀柔区两家 SARI 监 测哨点医院, 分年龄组和周次记录 SARI 病例数 SARI 病例采样数 SARI 病例中流感病毒的阳性率 和各亚型流感病毒所占构成比.2 研究方法 流感发病率的估算, 根据乘法模型 [2], 估算 流行季各年龄组流感的发病率以及不同 亚型 / 系流感病毒导致的发病率 从已发表文献中 获得乘法模型中所需参数的参考范围 [2], 其中, 流 感显性感染者中 ILI 病例的比例为 26.2%~42.0%, ILI 病例到哨点医院就诊的比例在 5 个年龄组分别 为 69.2%~76.2% 57.2%~62.2% 48.2%~52.8% 49.6%~5.4% 和 69.5%~72.9%, 采样的成功率为 80%~90%, 实验室检测的灵敏度为 95%~00% 流感的发病率 =ILI 病例数 ILI 病例中流感的阳 性率 ( 流感显性感染者中 ILI 病例的比例 ILI 病例到哨点医院就诊的比例 实验室检测的灵敏 度 采样的成功率 ) 流感相关 SARI 住院率的估算 : 根据世界卫 生组织 202 年发布的 季节性流感疾病负担评估 手册 [3] 中述及的方法进行估算 () 通过调取 哨点医院 流行季全部住院病例的住址 信息, 获得 80% 以上的病例居住的街道 / 乡镇, 将其界定为哨点医院的服务范围 通过卫生统计 年鉴, 获得服务范围内各年龄组的常住人口数, 5 å = 即哨点医院的服务人口数 M i i,i 为年龄组, i=,2,3,4,5 (2) 通过调查, 获知在哨点 医院服务范围内可为肺炎病例提供住院服务的医 疗机构, 即哨点医院的竞争医院 通过调取医院 信息系统数据, 获知在各年龄组哨点医院及竞争 医院在 流行季的肺炎住院病例数 ( 排 除非服务范围内的肺炎住院患者 ), 由此得到在 服务人口中, 哨点医院提供的肺炎住院服务的比 例 P i (3) 通过 SARI 监测数据, 获得 流行季各年龄组的 SARI 病例数 N i ( 排除非 服务范围内的 SARI 住院患者 ) 和各年龄组 SARI 病例中流感病毒阳性率 F i 若流感相关的 SARI 住院率为 r, 则 r 的 95% 可信区间计算公式为 : EF= r e. 96,95% 可信区间下限为 r/ef,95% 可信区间上限为 r EF

25 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 25 流感相关的 SARI 住院率 (/0 万 ) = 2 结果 2. 流感的发病率 N Fi P 5 i å i= M i i 流行季, 昌平区和怀柔区共报告 ILI 病例 例, 其中 < 5 岁组报告最多 ( 例 ), 其次为 25~59 岁组 (305 3 例 ) 5~4 岁组 ( 例 ) 5~24 岁组 ( 例 ), 报告 ILI 病例数最少的为 60 岁组 ( 例 ) 两个区共采集 ILI 病例呼吸道标本 956 件, 流感病毒阳性率为 2.2% (205/956), 其中 25~59 岁组阳性率最高 (30.4%), 其次为 60 岁组 (25.6%),5~24 岁组 (24.9%), 5~4 岁组 (24.%), 阳性率最低的为 < 5 岁组 (.%) 经估算 流行季, 流感的发病率为 5.4%(95%CI:4.5%~7.4%), 最高的为 5~4 岁组, 最低的为 60 岁组 甲型 HN 流感, 甲型 H3N2 亚型流感, 乙型 Victoria 系流感的发病率分别为 2.3%(95%CI:.9%~3.2%),.0%(95%CI: 0.8%~.4%),2.%(95%CI:.7%~2.8%) 见表 年龄组 ( 岁 ) 表 北京市 流行季各年龄组人口流感发病率估算 (%) 甲型 HN 流感 发病率 (95%CI) 甲型 H3N2 亚型流感 乙型 Victoria 系流感 合计 < 5 6.(5.~7.9).2(.0~.6) 0 7.3(6.~9.5) 5~4 0.4(8.8~6.7) 4.7(4.0~7.6) 2.8(2.4~4.5) 8.0(5.2~28.9) 5~24 0.8(0.7~.0) 0.5(0.4~0.7).3(.~.8) 2.6(2.2~3.5) 25~59 2.2(.8~2.9) 0.9(0.7~.) 2.5(2.0~3.2) 5.5(4.5~7.2) 60.5(.3~2.0) 0.6(0.5~0.8) 0.(0.~0.2) 2.3(.9~2.9) 合计 2.3(.9~3.2).0(0.8~.4) 2.(.7~2.8) 5.4(4.5~7.4) 2.2 流感相关的 SARI 住院率 经估算, 北京市 流行季流感相关的 SARI 住院率为 3/0 万 (95%CI:22/0 万 ~44/0 万 ), 其中 < 5 岁组的住院率最高, 其次为 5~4 岁组,5~24 岁组的住院率最低 甲型 HN 流感, 甲型 H3N2 亚型流感和乙型流感导致的 SARI 住院率分别为 7/0 万 (95% CI:/0 万 ~28/0 万 ),5/0 万 (95% CI:2/0 万 ~3/0 万 ), 8/0 万 (95%CI:4/0 万 ~6/0 万 ) 见表 流行季, 昌平怀柔两区监测到的 SARI 病例中无死亡病例 年龄组 ( 岁 ) 表 2 北京市 流行季各年龄组人口流感相关的 SARI 住院率 (/0 万 ) 甲型 HN 流感 住院率 (95%CI) 甲型 H3N2 亚型流感 乙型 Victoria 系流感 合计 < 5 80(56~209) 53(40~69) 79(64~99) 33(280~349) 5~4 24(6~36) - 52(40~68) 76(6~95) 5~24 2(0~8) - - 2(0~8) 25~59 4(2~) (0~7) 2(0~8) 7(3~4) 60 33(23~46) 7(~28) 3(~0) 53(4~70) 合计 7(~28) 5(2~3) 8(4~6) 3(22~44) 2.3 流感的住院发病比 流行季流感相关的 SARI 住院率与发病率之比为 74, 其中 < 5 岁组 5~4 岁组 5~24 岁组 25~59 岁组和 60 岁组的住院发病比分别为 和 42 甲型 HN 流感的住院发病比为 37, 甲型 H3N2 亚型流感的住院发病比为 98, 乙型 Victoria 系流感的住院发病比为 讨论研究结果显示, 流行季北京市流感的发病率约为 5.4%, 与我市 流行季水平相当 [2], 高于 流行季 [4] 研究结果提示儿童的流感发病负担较高 不同于以往, 本研究结果显示流感发病率最高的为 5~4 岁儿童, 而非 < 5 岁儿童, 这可能与本研究的样本来源为北京市北部郊区, 疾病的流行情况和不同年龄组人口的免疫水平与全市总体存在差异有关 研究结果显示, 流感相关的 SARI 住院率约为 3/0 万, 与 205 年的水平近似 [5], 住院发病比约为 74 住院率和住院发病比最高的均为 < 5 岁儿童, 提示 < 5 岁儿童感染流感后住院的风险高于其他年龄组人群 值得注意的是, 本研究未调查哨点医院服务人口在服务范围外医院住院的情况 而昌平区靠近城区,SARI 患者选择城区医院住院的可能性较高, 因此昌平区 SARI 哨点医院的实际服务人口数要小于当前估算的数值, 从而导致本研究中流感相关的 SARI 住院率可能被低估 其次, 本研究估算的为流感导致的 SARI 住院率, 但是一些患者, 尤其是老年患者感染后不表现为高热, 即不符合 SARI 病例定义, 因此流感导致的住院率要高于本流感导致的 SARI 住院率, 尤其是在老年人中 流行季为甲型 H3N2 亚型流感 甲型 HN 流感 乙型流感共同流行, 与该流行季

26 26 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 北半球的总体流行特点一致 [6] 其中甲型 HN 流感导致的发病率 SARI 住院率 住院发病比均最高, 提示北京市该流行季甲型 HN 流感导致的疾病负担高于其他亚型 / 系的流感病毒 本研究的结果存在一定的局限性 首先, 在估算流感发病率时, 研究选用了与估算住院率相同的数据来源, 以提高发病率与住院率的可比性 但昌平区和怀柔区均为北京市北部郊区, 通过比较该两区与全市的流感监测数据, 发现以这两个区的估算结果代表北京市总体的流感发病率存在低估研究结果的可能 因此, 北京市 流行季的发病率可能较当前估算值和前几个流行季水平更高 第二, 在估算流感发病率时, 本研究沿用了既往北京市流感发病负担估算研究中使用的参数, 参数值有待根据近年来新发表的研究结果进行更新, 以获得更准确的估算结果 第三, 在住院率估算中, 由于没有考虑患者至其他区的医院住院治疗的情况, 存在低估住院率的可能 第四, 由于 SARI 监测的哨点医院少, 监测样本量较小, 导致在个别年龄组无法估算各亚型流感导致的 SARI 住院率 扩大 SARI 监测的覆盖范围, 提高监测的质量有助于获得更准确的估算结果 尽管研究结果存在一定的局限性, 但鉴于目前全球流感相关疾病负担的数据多来自于发达国家, 发展中国家的相关数据十分有限, 本研究的结果为了解流感相关的疾病负担提供了重要的数据, 研究结果显示儿童的流感发病率和流感相关的 SARI 住院率均高于成人 [7], 加强儿童的流感 防控对于降低流感总体的疾病负担具有重要的意义 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] 李文娟, 王大燕. 我国流感疾病负担相关研究进展 [J]. 中国 人兽共患病学报, 209, 35(0): DOI: /j.issn [2] 张惺惺, 吴双胜, 王全意, 等. 北京市 流行季 流感感染率和发病率研究 [J]. 国际病毒学杂志, 209, 26(2): DOI: /cma.j.issn [3] World Health Organization. A manual for estimating disease burden associated with seasonal influenza [EB/OL].( ) [ ]. le/0665/7880/ _eng.pdf; jsessionid=e879ee4c 5BCD555E885BAD2B54BFCB?sequence=. [4] Wu S, VAN Aslen L, Wang L, et al. Estimated incidence and number of outpatient visits for seasonal influenza in in Beijing, China[J]. Epidemiol Infect, 207, 45(6): DOI: 0.07/S [5] 张奕, 李超, 唐雅清, 等. 205 年北京哨点医院严重急性呼 吸道感染病例流感病毒感染情况及其住院率研究 [J]. 中华预 防医学杂志, 207, 5(2): DOI: /cma.j.issn [6] World Health Organization. Review of the influenza season in the northern hemisphere-august 209 [J]. Wkly Epidemiol Rec, 209, 94(32): [7] 王胤, 张涛, 赵根明. 儿童及孕期妇女流感疾病负担及预防 进展 [J]. 疾病监测, 205, 30(): DOI: /j.issn ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 马春娜 ) 中华医学会系列杂志对来稿的要求 ( 摘录 ) 读者. 作者. 编者 文稿应具创新性 科学性 导向性 实用性 来稿文字务求准确 精炼 通顺 重点突出 论著类稿件一般不超过 字 ( 包括摘要及图 表和参考文献 ), 并附 400 字左右的中 英文摘要 ( 包括英文题名 工作单位和汉语拼音书写的作者姓名 ); 讲座 综述 会议纪要 临床病理 ( 例 ) 讨论类文稿字数可视情况而定 国家标准或行业规范, 具体要求可参照 中华医学会系列杂志编排规范 医学名词应使用全国科学技术名词审定委员会公布的名词 尚未通过审定的学科名词, 可选用最新版 医学主题词表 (MeSH) 医学主题词注释字顺表 中医药主题词表 中的主题词 对没有通用译名的名词术语于文内第一次出现时应注明原词 中西药名以最新版本 中华人民共和国药典 和 中国药品通用名称 ( 均由中国药典委员会编写 ) 为准 确需使用商品名时应先注明其通用名称 中医名词术语按 GB/T 中医临床诊疗术语疾病部分 证候部分 治法部分 执行, 经络针灸学名词术语按 GB/T 经穴部位 和 GB/ T 耳穴名称与部位 执行 中药应采用正名, 药典未收录者应附注丁文名称

27 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 27 流感流行特征 疾病负担及疫苗效果 年辽宁省甲型 HN 流感病毒抗原性改变株耐药性检测及 HA 基因分析 孙海波刘双王璐璐孙佰红宋亦春张倩毛玲玲孙英伟姚文清辽宁省疾病预防控制中心感染与传染性疾病预防控制所, 沈阳 0005 通信作者 : 姚文清, wenqingyao@sina.com, 电话 : 摘要 目的对辽宁省 年抗原性发生改变的甲型 HN 流感毒株进行耐药性及血凝素 (hemagglutinin,ha) 基因分析, 了解其耐药性及抗原性变化情况, 为流感的防控及临床治疗提供依据 方法选取 275 株甲型 HN 流感毒株进行抗原性分析, 将低反应株进行神经氨酸酶 (neuraminidase,na) 抑制剂类药物耐药性检测及 HA 基因分析 结果本研究共检测到参考株的低反应株 32 株, 经 NA 抑制剂类药物耐药性分析,0 株毒株对 NA 抑制剂类药物奥司他韦敏感性降低 部分毒株 HA 蛋白中涉及抗原决定簇 Sa 和 Ca 的多个位点发生突变 8 株毒株糖基化位点与当年疫苗参考株存在差异 检出 株毒株位于 220 环的氨基酸位点发生 R222K 的突变, 提示蛋白结构可能会发生变化, 导致流感病毒的受体结合能力改变 结论流感病毒的抗原性对于病毒的致病性及传播均具有重要的影响, 关注其发生改变的毒株, 对流感病毒的及时防控及临床治疗具有重要的实践意义及指导作用 关键词 甲型 HN 流感病毒 ; 耐药性分析 ; 抗原性分析 ;HA 基因基金项目 : 国家科技重大专项 (207ZX ZX ) DOI: /cma.j.issn Analysis on the characteristics of HA gene of influenza A (HN)pdm09 from 207 to 209 in Liaoning province Sun Haibo, Liu Shuang, Wang Lulu, Sun Baihong, Song Yichun, Zhang Qian, Mao Lingling, Sun Yingwei, Yao Wenqing Institute for Prevention and Control of Infection and Infectious Diseases, Liaoning Center for Disease Prevention and Control, Shenyang 0005, China Corresponding author: Yao Wenqing, wenqingyao@sina.com, Tel: Abstract Objective To analyze the antiviral resistance and hemagglutinin (HA) gene of the influenza A (HN)pdm09 strains with antigenicity mutations in Liaoning province from 207 to 209, so as to understand the changes in the antiviral resistance and antigenicity and to provide evidences for the prevention and control as well as clinical treatment of influenza. Methods Antigenicity analysis was performed for 275 influenza A (HN)pdm09 strains. The low-response strains were tested for resistance to neuraminidase (NA) inhibitors and the HA genes were analyzed. Results In this study, 32 low-response strains comparing to the reference strains were detected. The analysis of resistance to NA inhibitors showed that ten stains were less sensitive to oseltamivir. Mutations in the antigendetermining clusters Sa and Ca of HA in some strains were observed. The glycosylation sites of eight strains were different from the reference strains of the corresponding years. The amino acid mutation of R222K in loop 220 of one strain was detected, suggesting possible change in protein structure, leading to the change in binding ability of the influenza virus to the receptor. Conclusions As the antigenicity of influenza virus has an important impact on the pathogenicity and transmission of the virus, attention to the changed strains is greatly significant for timely prevention and control as well as clinical treatment of influenza virus.

28 28 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. Key words Influenza A (HN)pdm09 virus; Antiviral resistance analysis; Antigenicity analysis; HA gene Fund programs: National Key Science and Technology Major Project of China (207ZX ZX ) DOI: /cma.j.issn 流感病毒是威胁全球公众健康的主要病原体, 每年约有 5%~0% 的成年人以及 20%~30% 的儿童感染流感病毒, 给全人类的健康及社会发展造成了无法估量的损失和巨大影响 甲型流感病毒是引起流感大范围流行及暴发的主要型别, 由于其具有高突变率和高复制率的特点, 从而导致抗原性及耐药性不断改变以快速适应环境变化 [], 给流感的预防控制及临床治疗带来了极大困难和挑战 由于奥司他韦等神经氨酸酶 (neuraminidase, NA) 抑制剂类药物是目前流感治疗的首选药物, 因此对 NA 抑制剂类药物的耐药性监测具有重要意义 流感疫苗是目前为止预防流感最有效的手段, 流感疫苗的保护性主要取决于疫苗株与流行株血凝素 (hemagglutitin,ha) 和 NA 的匹配性 HA 在流感病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用 在人类进化过程中,HA 抗原位点不断积累基因突变, 从而能够绕过先前存在的免疫 [2], 上一年接种的流感疫苗往往在下一年不再有效 [3-4] 因此, 需要实时监控并分析本年度流行株的 HA 基因特点, 从而为评估疫苗有效性提供依据 为了解辽宁省流感病毒变异情况, 本研究选取部分甲型 HN 流感毒株进行抗原性分析, 对参考株的低反应株进行 NA 抑制剂类药物耐药性检测, 并对 HA 基因的变异情况进行分析, 为流感疫情的防控及临床治疗提供实验基础和理论依据 材料与方法. 样本采集及病毒分离 采集 年辽宁省各哨点医院流感样病例标本 按流感监测方案规定, 采样日期为 207 年 3 月 26 日至 209 年 3 月 3 日 实验采用狗肾细胞 (MDCK) 及鸡胚进行流感病毒分离 细胞发生病变或接种鸡胚 3 d 后, 收取培养液, 采用红细胞凝集法进行病毒滴度检测, 滴度大于 8 的毒株进行红细胞凝集抑制试验分型 ( 试剂由国家流感中心提供 ) 所有毒株均经过国家流感中心复核鉴定后用于研究分析.2 抗原性及耐药性分析 按样本采集时间随机选取 年流感流行时期全省 4 家哨点医院采集的流感样病例标本分离到的甲型 HN 流感毒株 275 株 以 年度及 年度的疫苗株 A/Michigan/45/205 作为标准参考抗原, 其免疫的雪貂血清为标准参考抗体 ( 均由国家流感中心提供 ), 对所选病毒株进行抗原性检测 当待检病毒与参考雪貂抗血清的红细胞凝集抑制试验 (hemaggltination inhibition test,hi) 效价低于参考病毒与参考抗血清自身 HI 效价的 8 倍 ( 含 8 倍 ) 或以上时, 认为待检病毒是该参考抗血清检测到的低反应株 ; 若相差 8 倍以内, 则认为待检病毒是参考病毒的类似株 对抗原性检测检出的参考株免疫血清的低反应株, 采用荧光发光法检测流感毒株的 NA 抑制剂类药物耐药性 检测试剂使用 NA-Flour TM Influenza Neuraminidase Assay Kit 试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, 货号 ) 以 A/California/2/202 (H275) 作为敏感株参考株,A/Texa/23/202 (H275Y) 作为耐药株参考株 实验用药物标准品及参考毒株均由国家流感中心提供.3 基因分析 吸取 200 μl 处理后的样本, 用 EZ Advanced XL 全自动核酸提取仪和 EZ Virus Mini Kit V2.0 (Qiagen, 货号 95534) 核酸提取试剂盒, 提取核酸 60 μl 对 年流感样病例标本进行荧光定量 PCR 检测并分型 使用甲型 ( 货号 D0703) 乙型 Bvictoria/Yamagata 系 ( 货号 D073) 甲型 HN( 货号 D304) 及季节性流感病毒 H3 亚型 ( 货号 D0) 流感病毒核酸检测试剂盒为检测试剂 试剂盒均为达安基因生物科技有限公司生产 使用仪器仪为 ABI Viia7 型荧光定量 PCR 仪 对 HA 基因进行扩增, 扩增引物为 Pdm-F32: 5 - TGTAAAACGACGGCCAGTATGAAGGCAAT ACTAGTAG-3 ;Pdm-R977:5 - CAGGAAA CAGCTATGACCGATCGGATGTATATTCTGAAAT GG-3 ; Pdm-F9035 -TGTAAAACGACGGCCAG TGATTGCAATACAACTTGTC-3 ;Pdm-R730: 5 -CAGGAAACAGCTATGACCAATACATATTCTA CACTGTAGAGACCCA-3 ; 引物均由 invitrogen 生物公司合成 使用 Qiagen one-step PCR kit 进行基因扩增 ( 货号 2022) 反应设置阴 阳性对照

29 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 29 扩增产物通过 2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测 扩增产物送 invitrogen 公司进行测序 采用 Bioedit DNAstar 和 MegaX 分析软件及在线分析网站对 HA 基因进行拼接 分析核酸序列和氨基酸序列 2 结果 2. 流感病毒流行情况 辽宁省 年度共采集流感样病例标本 份, 分离流感病毒 724 株, 其中甲型流感病毒 232 株 ( 甲型 HN 共 02 株,H3N2 亚型 2 株 ); 乙型流感毒株 492 株 (B-Yamagata 系 443 株,B-Victoria 系 49 株 ) 对全省哨点医院采集的流感样病例标本进行 PCR 检测, 分析不同时期流感病毒的流行情况 见图 样本量 ( 株 ) 图 新型 HN H3 B-Yamagata B-Victoria 年 - 月 年辽宁省流感病毒流行情况 表 甲型流感病毒耐药性检测结果 毒株名称 检测 方法 半抑制浓度值 (IC50) ( 待检病毒 / 敏感株参考株 ) 结果分析 A/ 辽宁白塔 /swl632/208 FL / 敏感性降低 A/ 辽宁连山 /swl52/208 FL 0.86/ 敏感性降低 A/ 辽宁铁西 /swl95/208 FL 0.327/ 敏感性降低 A/ 辽宁兴隆台 /SWL633/208 FL 3.447/ 敏感性高度 降低 A/ 辽宁西岗 /SWL27/208 FL / 敏感性降低 A/ 辽宁西岗 /SWL288/208 FL 0.224/ 敏感性降低 A/ 辽宁连山 /SWL647/208 FL / 敏感性降低 A/ 辽宁西岗 /SWL58/209 FL 0.249/ 敏感性降低 A/ 辽宁西岗 /SWL50/209 FL / 敏感性降低 A/ 辽宁连山 /SWL646/208 FL 0.453/ 敏感性降低 注 :FL 为荧光发光法 (fluorescence-based assay) 当 0 倍神经 氨酸酶抑制剂 (nueraminidase inhibitor,nai) 敏感株参考株 IC50 值 待检病毒 IC50 值 00 倍 NAI 敏感株参考株 IC50 值时, 待 检病毒敏感性降低 ; 待检病毒 IC50 值 > 00 倍 NAI 敏感株参考株 IC50 值时, 待检病毒敏感性高度降低 年流感季乙型流感病毒以 B-Yamagata 系为主 208 年 月至 209 年 2 月以甲型 HN 为主,209 年 3 月开始逐渐出现季节性 H3N2 亚型及乙型流感病毒, 甲型 HN 流感病毒减少, 呈现多种型别共流行的情况 A/Liaoning-Xinglongtai/swlswl5/209 A/Liaoning-Xigang/swl58/209 A/Liaoning-Xigang/swl50/209 A/Liaoning-Lianshan/swl647/208 A/Liaoning-inglongtai/swl03/209 A/Liaoning-Xinglongtai/swl25/209 A/Liaoning-Xigang/swl65/209 A/Liaoning-Xinglongtai/swl633/208 A/Liaoning-Xigang/swl27/208 A/Liaoning-Lianshan/swl2/209 A/Liaoning-Mingshan/swl35/209 A/liaoning-Heping/swl642/208 A/Liaoning-Xilongtai/swl20/209 A/Liaoning-Xigang/swl7/209 A/Liaoning-Xigang/swl4/209 A/Liaoning-Xigang/swl243/208 A/Liaoning-Xigang/swl288/208 A/Liaoning-Lianshan/swl646/208 A/Liaoning-Haizhou/swl29/209 A/Liaoning-Haizhou/swl2/209 A/Liaoning-Haizhou/swl/209 A/Liaoning-Haizhou/swl5/209 A/Hunan-Yueyanglou/SWL362/208 A/Guangdong-Zhongshan/swl75/208 A/Switzerlang/3330/207 A/Liaoning-Xigang/swl277/208 A/Liaoning-Xigang/swl6/209 A/liaoning-Xigang/swlswl3/209 A/Liaoning-Xigang/swl54/209 A/Liaoning-Xigang/swl43/209 A/Liaoning-Baita/swl32/209 A/New Jersey/56/208 A/Louisiana/62/207 A/Hubei-Zengdou/SWL247/208 A/Beijing-Xicheng/swl633/208 A/Shanghai-Pudongxin/swl476/208 A/Guangdong-Zhenjiang/swl593/208 A/Fujian-Siming/swl332/208 A/Shanghai-Baoshan/SWL343/208 A/Guangdong-Futian/swl583/208 A/Guangdong-Duanzhou/swl224/208 A/Liaoning-Lianshan/swl52/208(H) A/Shaanxi-Hantai/swl92/208 A/Liaoning-Jinpuxin/SWL34/208 A/Liaoning-Lianshan/swl649/207(H) A/Liaoning-Lianshan/swl632/207(H) A/Jilin-Taobei/SWL320/208 A/Heilongjiang-Jiagedaqi/SWL245/208 A/Beijing-Chaoyang/swl327/208 A/Victoria/897/207 A/Macao/SWL6003/208 A/KANAGAWA/IC729/208 A/Guangxi-Yuzhou/SWL489/208 A/Shanghai-Jinshan/swl608/208 A/Jiangsu-Tinghu/SWL50/208 A/Guizhou-Qingzhen/SWL33/207 A/Singapore/GP908/205 A/Michigan/45/ A/Yunnan-Wuhua/swl938/206 A/Liaoning-Tiexi/swl95/208(H) Shanghai-Jiading/swl970/205 A/Iowa/53/205 Nov A/Minnesota/32/205 A/Washington/24/202 A/St. Petersburg/00/20 A/Texas/77/2009 A/Christchurch/6/200 A/California/07/2009 注 : 为选取的 年流感毒株 ; 为选取的 年流感毒株 ; 为 年及 年 WHO 推荐的北 半球疫苗株 图 年新型 HN 流感毒株 HA 基因核酸进化分析 6B. 6B.2

30 30 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 2.2 抗原性分析 对选取的 275 株甲型 HN 流感毒株进行抗原性分析, 检出 32 株病毒株与参考血清的 HI 效价低于参考病毒与参考抗血清自身 HI 效价的 8 倍及以上, 为参考血清的低反应株, 提示部分病毒株可能发生抗原性改变 2.3 耐药性检测 选取低反应株 32 株进行奥司他韦耐药性检测, 检出 0 株病毒对奥司他韦的敏感性有不同程度的降低 2.4 HA 基因分析 2.4. HA 基因进化分析对 32 株低反应株进行核酸种系分析, 并以 207 年及 208 年 WHO 推荐的北半球疫苗株 A/Michigan/45/205 全球及国内其他地区部分毒株作为参考株, 用邻近链接法 (N-J 法 ) 构建进化树 见图 2 经分析, 辽宁省流行株与参考株之间的同源性为 96.5%~99.9% 近两年的甲型 HN 流感毒株均属于 6B. 分支 年分离得到的毒株与 年分离的毒株位于不同子分支上 HA 蛋白分析分析株 HA 蛋白氨基酸与疫苗株 A/Michigan/45/205 相比, 在多个位点发生改变, 包括 S9R S27L N46D S8T S200P T202I D239G/N N277D I32V K39T I42M N53S 和 E523D 与疫苗株相比, 抗原决定簇相关位点发生突变的毒株及突变位点见表 表 HA 氨基酸抗原决定簇相关位点突变情况 毒株名称 Sa 氨基酸突变位点 Ca A/Michigan/45/205 * H S L D Q A/Liaoning-Xinglongtai/swl633/208 H S L D R A/Liaoning-Xigang/swl43/209 H S L G Q A/Liaoning-Xigang/swl4/209 H S L N Q A/Liaoning-Xigang/swl288/208 H S L G Q A/Liaoning-Xigang/swl243/208 H S I N Q A/Liaoning-Xigang/swl27/208 H S L D R A/Liaoning-Mingshan/swl35/209 H R L D Q A/Liaoning-Lianshan/swl649/207 Y S L D Q A/Liaoning-Lianshan/swl52/208 Y S L D Q A/liaoning-Heping/swl642/208 H R L D Q 注 : * 标注 年疫苗参考株 受体结合位点变异分析 209 年分离毒 株 A/Liaoning-Xinglongtai/swl20/209 发生 R222K 突变, 即 220 环的相关位点及构象有可能随之发 生了改变 糖基化位点分析经分析, 疫苗株 A/Michigan/45/205 在第 79 位增加 个糖基化位点 所分析毒株中共有 8 株发生了不同糖基化位点缺 失, 其中 A/Liaoning-inglongtai/swl03/209 第 04 位 糖基化位点缺失 ;A/Liaoning-Xigang/swl277/208 和 A/Liaoning-Xigang/swl288/208 第 79 位糖基 化位点缺失 ;A/Liaoning-Xigang/swl6/209 第 293 位糖基化位点缺失 ;A/Liaoning-Lianshan/ swl52/208 A/Liaoning-Xigang/swl243/208 A/liaoning-Xigang/swlswl3/209 和 A/Liaoning- Haizhou/swl5/209 第 557 位糖基化位点缺失 但 全部毒株并未发现新的糖基化位点 3 讨论 辽宁省作为北方省份, 流感流行期为每年 0 月至次年 3 月, 每年的流行型别存在一定差异 进化树显示, 本研究选取的 32 株毒株均位于 6B. 分支, 与 A/Michigan/45/205 位于同一分支 但 年和 年的流行株位于不同 分支上, 说明本年度毒株是既往流行株进一步发 生突变而来, 但尚未形成新的进化分支, 提示在 近两年的流行过程中并未发生大的突变 流感病毒的 HA NA 抗原位点 受体结合位 点和糖基化位点等关键氨基酸突变是引起流感病 毒致病性及传播能力的重要因素 [5-6] HA 蛋白 的受体结合特异性决定流感病毒的传播能力 ; 糖 基化状态的改变与病毒的抗原性和免疫逃避有 关 [7-8] 若抗原决定簇上发生多处位点变异, 将 造成特异抗体对病毒粒识别和清除困难, 引起抗 原性漂移 甲型 HN 流感病毒的 5 个抗原决定簇包 含 4 组氨基酸残基, 分别为 Ca 区 (Ca 区包含 69~73 206~208 和 238~240 位点,Ca2 区包括 40~45 和 224~225 位点 );Cb 区 (78~83 位点 ); Sa 区 ( 包括 28~29 56~60 和 63~67 位点 ); Sb 区 ( 包括 87~98 位点 ) [9-0] 通过 HA 蛋白 序列比对, 发现多处氨基酸位点发生突变, 其中 0 株在抗原决定簇 Sa 和 Ca 位点发生了突变 一 般认为 HA 蛋白发生 4 个以上氨基酸位点替换并 分布在 2 个以上抗原决定簇内具有流行病学意义 本研究毒株虽未发生大的突变, 但由于突变易于

31 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 3 积累, 仍有必要时刻关注变异情况 流感病毒的传播主要取决于 HA 蛋白的受体 结合特异性, 受体结合位点主要包括 及 227 位点 [] 受体结合特 异性与单体头部的受体结合位点 (RBS) 有关 RBS 主要由 220 环 (28~225 位 ) 30 环 (32~35 位 ) 和 90 螺旋 (87~95 位 ) 构成 [2] 曾有报道, 222 位氨基酸是 Ca 抗原决定簇上的受体结合位点, 该位点突变将会影响病毒与受体结合能力 [8] 209 年毒株 A/Liaoning-Xinglongtai/swl20/209 发生了 R222K 的突变, 将对蛋白质的构象产生影响, 从 而可能影响病毒的受体结合能力 流感病毒糖基化位点既能够稳定血凝素蛋白 结构并防止其水解, 又能够阻碍抗体对病毒的识 别和清除 甲型 HN 流感病毒 HA 蛋白有 8 个糖基化位点, 分别为 和 557 位 本文大多数毒株的糖基化位 点与疫苗参考株保持一致, 部分毒株糖基化位点 缺失, 但未发现新增的糖基化位点 综上所述, 辽宁省 年流感病毒逐 年发生变化, 因此, 有必要加强病毒的基因特征 监测, 密切观察其变异趋势及流行动向, 以准确 作出流感疫苗的预测和流行情况的预警, 从而更 好地对流感进行预防, 减轻流感所造成的疾病负 担和社会影响, 同时为临床治疗奠定实验基础 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] Plegchka S. Overview of influenza virus[j]. Curr Top Microbiol Immunol, 203, 370: -20. DOI: 0.007/82_202_272. [2] Baker SF, Nogales A, Finch C, et al. Influenza A and B virus intertypic reassortment through compatible viral packaging signals[j]. J Virol, 204, 88(8): DOI: 0.28/ JVI [3] Gao J, Couzens L, Burke DF, et al. Antigenic drift of the influenza A (HN) pdm09 virus neuraminidase results in reduced effectiveness of A/California/7/2009 (HNpdm09)-specific antibodies[j]. MBio, 209, 0(2): e DOI: 0.28/ mbio [4] 杨静, 陈涛, 祝菲, 等 年度中国大陆流行性感冒 病例报告情况分析 [J]. 热带病与寄生虫学, 208, 6(2): DOI: /j.issn [5] 王晓亮, 王静静, 李如新, 等. 宁夏地区 HN 亚型猪流感病 毒基因组遗传进化分析 [J]. 中国兽医学报, 207, 37(): 23-28, 39. DOI: /j.cnki [6] 杨鹏飞, 燕清丽, 马雪征, 等. 聚集性感染甲型 HN 流感 病毒的 HA 基因特征分析 [J]. 中华实验和临床病毒学杂 志, 207, 3(): DOI: /cma.j.issn [7] Skehel JJ, Stevens DJ, Daniels RS, et al. A carbohydrate side chain on hemagglutinins of Hong Kong influenza viruses inhibits recognition by a monoclonal antibody[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 984, 8(6): DOI: 0.073/pnas [8] York IA, Stevens J, Alymova IV. Influenza virus N-linked glycosylation and innate immunity[j]. Biosci Rep, 209, 39(): BSR DOI: 0.042/BSR [9] Stuart-Harris CH. Immunity to influenza[j]. J Infect Dis, 972, 26(4): DOI: 0.093/infdis/ [0] Nicholson KG, Wood JM, Zambon M. Influenza[J]. Lancet, 2003, 362(9397): DOI: 0.06/S (03) [] Weis W, Brown JH, Cusack S, et al. Structure of the influenza virus hemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid[j]. Nature, 988, 333(672): DOI: 0.038/333426a0. [2] Pariani E, Amendola A, Zappa A, et al. Molecular characterization of influenza virus circulating in Northern Italy during two seasons (2005/2006 and 2006/2007) of low influenza activity[j]. J Med Virol, 2008, 80(): DOI: 0.002/jmv ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 田祎 ) 声 明 国际病毒学杂志 为中华医学会系列杂志, 中华医学会远程稿件处理系统 ( cn) 为本刊唯一的投稿系统 本刊未与任何第三方网站合作, 也未设置编辑部之外的代理机构 所有声称与本刊合作能够为作者提供绿色通道快速发稿的, 均属于欺诈行为 如有作者收到疑似冒用本刊编辑部信息进行的征稿信函 代发文章 审稿费通知时, 均为虚假信息, 请勿轻信 有任何问题可直接与编辑部联系核实, 联系电话 : , gjbdxzz@26.com 特此声明

32 32 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 柯萨奇病毒 B4 型江苏地方株的病毒分离与基因进化分析 基础研究 2 夏志强宋芹芹宋娟薛庆凯王衍海韩俊 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室, 北京 02206; 2 皖南医学院公共卫生学院, 芜湖 通信作者 : 韩俊, hanjun_sci@63.com, 电话 : 摘要 目的建立柯萨奇病毒 B4 型病毒的分离方法, 并对已分离到的江苏地方株进行基因进化分析 方法使用荧光定量 PCR 方法检测江苏省哨点医院收治的呼吸道感染患者咽拭子样本中肠道病毒感染情况, 使用 HeLa 细胞对阳性样本进行病毒分离, 然后进行 VP4 基因测序与进化树分析 结果荧光定量 PCR 检测肠道病毒阳性 2 例, 份样本经病毒分离后呈现细胞病变效应, RT-PCR 扩增出特异性的 VP4 基因, 测序显示该病毒株与其他 20 株 CVB4 病毒株的 VP4 核苷酸同源性都在 86.56%~93.59% 之间, 确诊为 CVB4 江苏地方株 进化树分析显示, 该病毒株只与 CVB4 病毒 KY 株形成一个聚簇 结论本研究采用 HeLa 细胞分离与鉴定到了 株肠道病毒,VP4 基因进化分析判断为 CVB4 江苏地方株, 对预防与控制当地的肠道病毒感染具有重要价值 关键词 柯萨奇病毒 B4 型 ; 肠道病毒 ; 病毒分离 ; 细胞病变效应基金项目 : 国家重大科技专项 (208ZX00200,208ZX0700,208ZX ); 传染病预防控制国家重点实验室发展基金 (20SKLID04) DOI: /cma.j.issn Virus isolation and gene evolution analysis on Jiangsu local strain of coxsackievirus B4 type Xia Zhiqiang, Song Qinqin, Song Juan, Xue Qingkai 2, Wang Yanhai, Han Jun State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, National Institute of Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 02206, China; 2 School of Public Health, Wannan Medical College, Wuhu 24000, China Corresponding author: Han Jun, hanjun_sci@63.com, Tel: Abstract Objective To established the isolation method of coxsackievirus B4 (CVB4), and to perform genetic evolution analysis of the isolated Jiangsu local strain. Methods Fluorescence quantitative PCR was used to detect enteroviruses in the throat swabs from patients with respiratory infections admitted to the sentinel hospitals of Jiangsu province. The positive samples were used for virus isolation with HeLa cell line, followed by VP4 gene sequencing and phylogenetic analysis. Results Twelve samples were positive of enterovirus by fluorescence quantitative PCR. Cytopathic effect was observed in one sample during virus isolation. The VP4 gene were amplified by specific RT-PCR. The sequence analysis showed that the similarities of the VP4 gene sequence with the other 20 CVB4 strains ranged from 86.56% to 93.59%, and the strain was identified as a Jiangsu local strain of CVB4. The phylogenetic tree showed that the strain only clustered with CVB4 strain KY Conclusions HeLa cell line was used to isolate and identify one strain of enterovirus in the present study. The virus strain was identified as Jiangsu local strain of CVB4 using evolution analysis of VP4 gene. The work presented important value for the prevention and control of local enterovirus infections. Key words Coxsackievirus B4; Enterovirus; Virus isolation; Cytopathic effect Fund programs: National Key Science and Technology Program of China (208ZX00200, 208ZX0700, 208ZX ), Development Grant of the State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control (20SKLID04). DOI: /cma.j.issn

33 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 33 肠道病毒 (enterovirus,ev) 是一种常见的 可引起人类多种疾病的病原, 柯萨奇病毒属于小 RNA 病毒科 肠道病毒属, 其中柯萨奇病毒 B4 型 (coxsackievirus B4,CVB4) 可导致无临床症状的 隐性感染, 也可诱发病毒性心肌炎 发热出疹性 疾病 咽峡炎 糖尿病 脑炎等疾病 [-4] CVB4 基因为约 7.5 kb 的单股正链 RNA, 病毒的开放 阅读框编码 条多肽链, 随后该多肽链被病毒编 码的蛋白酶切割为结构蛋白 (VP4,VP2,VP3, VP) 和非结构蛋白 (2A, 2B,2C,3A,3B, 3C,3D) [5-6] 其中 VP4 可能最为保守, 其处于蛋 白外壳的内部, 可与 RNA 病毒的基因组 RNA 连 接, 了解 VP4 区域的基因序列变化能指导肠道病 毒的分型 [7] 本研究采用 HeLa 细胞从江苏省呼吸 道感染患者的咽拭子样本分离出 株 CVB4 病毒, 并进行了 VP4 基因鉴定与进化树分析 旨在为建 立 CVB4 的病毒分离鉴定体系提供参考, 也为当地 CVB4 感染预防提供一定的参考 材料与方法. 研究材料 67 份咽拭子样本采样时间为 208 年 4 月至 6 月, 咽拭子样本均来源于江苏省哨点医院诊治的 呼吸道感染人群, 纳入标准 : 经腺病毒 B9 病 毒 流感病毒 副流感病毒核酸筛查为阴性 ; 年 龄 6~50 岁 ; 发病到样本采集时间 3 d; 入院体 温 38 ; 伴有咳嗽或咽痛症状 其中男 37 例, 女 30 例 ; 年龄最小 8.00 岁, 最大 岁, 平均 年龄 24.59±3.9 岁.2 病毒检测 用专用采样棉签, 适度用力拭抹患者咽后 壁和两侧扁桃体部位, 然后将棉签放入装有 ml 生理盐水的采样管中, 旋紧管盖并密封, 标 记编号后在低温条件下送往实验室进行检查 实验室获得样本后, 离心 (2 000 rpm/min 离心 0 min) 后取上清 40 µl, 用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取病毒 RNA(Qiagen 公司 ), 取肠道病毒的通用引物进行荧光定量 PCR 扩增, 扩增程序 :95 5 min;95 0 s,55 30 s (45 个循环 ), 肠道病毒通用探针 [8] :FAM- 5 TCCTCCGGCCCCTGAATGYGGC-3 TAM, 正 向引物 :5 -AGCCTGCGTGGCKGCC-3, 反向 引物 :5 -GAAACACGGACACCCAAAGTA-3 反应体系 :2 qpcr mix 0 µl, 正向引物 0.5 µl, 反向引物 0.5 µl, 模板 2.0 µl,ddh µl 结合 Ct 值判读结果, 以 Ct 值 35 判断为阳性.3 病毒分离与培养 取咽拭子样本 50 µl, 离心后 (2 000 rpm/min 离心 0 min) 取上清, 用无血清的 DMEM 稀释到 200 µl, 接种于处于对数生长期的 HeLa 细胞 6 孔 板中 HeLa 细胞接种前 24 h 进行传代, 此时细胞密 度约为 个 /ml,33 5% CO 2 孵育 h 吸取孵育液, 加入含有 2% 胎牛血清的 DMEM 培 养液维持培养 ( 培养条件 :33 5% CO 2 ), 每 8~0 h 观察 次细胞病变效应 (cytopathic effect, CPE), 培养至 72 h 收获上清,-80 冰箱反复冻 融 3 次,4 离心 rpm/min 离心 0 min, 取 上清 50 μl, 按照同样方法再次接种 HeLa 细胞进 行 CPE 观察.4 VP4 基因扩增 收获具有有明显 CPE 的细胞上清液, 按照.2 的方法提取病毒 RNA, 逆转录后采用两轮多重反转 录巢式 PCR 扩增肠道病毒 VP4 基因 [8], 第一轮 PCR 反应条件为 :95 5 min,(94 min s 72 l min,40 个循环 ),72 延伸 0 min 正向引物 :5 -CGGCCCCTGAATGYGGCTAA -3, 反向引物 :5 -ATCHGGHARYTTCCAMC ACCA-3 取第一轮 PCR 产物 2 µl 作为模板, 进 行第二轮 PCR 扩增, 反应条件为 :95 5 min, (94 min s s,40 个循 环 ),72 延伸 0 min 正向引物 :5 -CTAC TTTGGGTGTCCGTGTTTC-3, 反向引物 : 5 -ATCHGGHARYTTCCAMCACCA-3 第二轮 扩增产物用.5% 琼脂糖凝胶电泳检测并送上海生 工公司进行基因双向测序.5 生物信息学分析 使用生物学软件 BioEdit 的 Sequence-Contig Express 程序对双向测序结果进行序列拼接, 采用 Mega 5.0 软件的 Maximum-Likelihood(bootstrap= 000) 进行序列比对 同源性分析和构建系统进化树, 对分离到的病毒株与其他代表株进行了系统进化 分析, 参比序列来自 GenBank 已公布序列 同时 对测序得到的序列提交 NCBI 进行注册登记 2 结果 2. 病毒分离结果 在 67 份咽拭子样本中, 荧光定量 PCR 检测肠 道病毒阳性 2 例 病毒分离结构显示只有 份样 本呈现出现 CPE, 表现为细胞变圆 聚集 脱落等 见图

34 34 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 A International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. B A HeLa 细胞 - 对照 B HeLa 细胞 - 阳性样本 200 图 病毒分离情况 2.2 VP4 基因鉴定结果 RT-PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见约 64 bp 片段 与预期肠道病毒 VP4 扩增大小一致 见图 生物信息学分析结果 将 VP4 基 因 扩 增 的 序 列 进 行 测 序 与 凭 借 后 提 交 GenBank 进 行 Blastn 同 源 性 分 析 结 果 显 示 该 病 毒 株 与 其 他 病 毒 株 都 无 00% 同 源 性 为此提交 NCBI 进行序列注册 得到的序列号为 MK MK ?report=GenBank 但 是 该 病 毒 株 与 其他具有代表性的 20 株 CVB4 病毒株的 VP4 核苷 酸同源性都在 86.56% CVB4 病毒 AB4560 株 ~93.59% CVB4 病 毒 KY 株 之 间 因 此 图3 3 注 M Marker VP4 基因 图2 肠道病毒 VP4 的 RT-PCR 鉴定 本研究分离得到的病毒可以确定为 CVB4 病毒 进 化树分析显示该病毒株只与 CVB4 病毒 KY 株 形 成 一 个 聚 簇 与 CVB4 病 毒 KY 株 KY 株共同形成一个大的聚簇 并且该病毒 株与其他肠道病毒比如 HRV A 型无进化上的交叉 性 见图 3 CVB4 病毒 MK 株 VP4 基因核苷酸序列的基因进化树分析 讨论 柯萨奇病毒属于肠道病毒的一种 病毒结构 无包膜 表现为衣壳二十面体对称结构 基因为 约 7.5 kd 的单股正链 RNA 基因具有 5 非编码区 一个开放阅读框和 3 非编码区 [7-8] 病毒的开放 阅读框编码 条多肽链 然后可切割成为 个结 构蛋白和非结构蛋白 CVB4 感染人体后 可以导 致无临床症状的隐性感染 也可引起多种临床疾 病 包括发热出疹性疾病 上呼吸道感染 脑膜炎 咽峡炎 胰腺炎等 [9] 虽然多数患者在 CVB4 病毒 感染后能够康复 但仍有约 5% 的患者因存在持 续感染状态而引发包括心肌炎 脑膜炎 胸腹痛

35 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 35 在内的慢性疾病, 严重影响患者的预后康复 [0] 作为肠道病毒的一员,CVB4 在感染与复制过程中容易发生变异, 这种变异可能会影响其病毒感染与传播能力 [] 本研究采用 HeLa 细胞分离到了 株 CVB4 病毒株, 样本接种 HeLa 细胞并传代 2 次后就可出现明显的 CPE 荧光定量 PCR 与常规 PCR 方法鉴别诊断 CVB4 感染的主要方法, 本研究显示在 67 份咽拭子样本中, 荧光定量 PCR 检测肠道病毒阳性 2 例, 其中分离出病毒的 个样本经 RT-PCR 也扩增出特异条带, 经过测序确认为 CVB4 感染 VP4 基因编码的蛋白位于肠道病毒内部, 其中 VP VP2 和 VP3 是病毒感染与宿主细胞相关受体结合的位点, 形成病毒表面峡谷样结构 ;VP4 位于病毒衣壳内部, 处于病毒 RNA 的核心位置, 在病毒感染和复制过程中发挥重要作用 并且 VP4 基因序列分析对肠道病毒也有一定的分型价值, 为此在快速应对肠道病毒引起的突发疫情的病原学诊断中也具一定的价值 [2-4] 本研究合成了基于 VP4 区的引物, 两轮扩增的片段长度约为 650 bp, 引物序列较为保守 本研究显示 MK 株 VP4 基因的 RT-PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳可见约 64 bp 片段, 与预期肠道病毒 VP4 扩增大小一致 进化树分析显示 MK 株 VP4 基因与 20 株具有代表性的 CVB4 病毒株的 VP4 核苷酸相似性在 86.56%~93.59% 之间 同时该病毒株只与美国 KY 株形成一个聚簇, 后者在 206 年被分离出来, 说明 CVB4 江苏地方株可能与美国 KY 株相关, 建议进行深一步的研究, 预测可能发生的肠道病毒感染情况, 加强监测, 从而为疾病的防控提供依据 不过患者是否感染 CVB4 也与病毒的致病力 发病机制相关, 还需要需要对病毒进行更为深入的研究, 才能明确 CVB4 的感染与传播特征 综上所述, 本研究采用 HeLa 细胞分离与鉴定到了 株肠道病毒,VP4 基因进化分析判断为 CVB4 江苏地方株, 对预防与控制当地的肠道病毒感染具有重要价值 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 作者贡献声明夏志强 宋芹芹负责样本检测 病毒分离与论文写作 ; 宋娟 王衍海负责样本收集 ; 薛庆凯负责序列分析 ; 韩俊负责研究总体设计与序列分析 参考文献 [] 许玉玲, 王海霞, 卫海燕, 等. 柯萨奇病毒 B 组 4 型河南分离 株 VP 区基因特征分析 [J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 207, 3(6): DOI: /cma.j.issn [2] 王莹, 汪颖楠, 钟照华. B 组柯萨奇病毒与宿主因素在心肌持 续感染中的作用 [J]. 国际病毒学杂志, 209, 26(3): DOI: /cma.j.issn [3] Nyalwidhe JO, Gallagher GR, Glenn LM, et al. Coxsackievirusinduced proteomic alterations in primary human islets provide insights for the etiology of diabetes[j]. J Endocr Soc, 207, (0): DOI: 0.20/js [4] 吉彦莉, 王永全, 崔海洋, 等. 一起由柯萨奇病毒 A4 引起 的聚集性发热的分子流行病学研究 [J]. 公共卫生与预防 医学, 209, 30(2): DOI:0.3969/j.issn [5] Alidjinou EK, Bertin A, Sane F, et al. Emergence of fluoxetineresistant variants during treatment of human pancreatic cell cultures persistently infected with coxsackievirus B4[J]. Viruses, 209, (6). DOI: /v [6] 张伟伟, 周宏, 李娟, 等. 柯萨奇病毒 B 组 4 型 VP 蛋白原核表达 及间接 ELISA 检测方法的建立 [J]. 中华实验和临床病毒学杂 志, 209, 33(3): DOI: /cma.j.issn [7] Zhang J, Zhang H, Zhao Y, et al. Molecular characterization of a new human coxsackievirus B2 associated with severe hand-footmouth disease in Yunnan province of China in 202[J]. Arch Virol, 207, 62(): DOI: / s [8] Piralla A, Rovida F, Baldanti F, et al. Enterovirus genotype EV- 04 in humans, Italy, [J]. Emerg Infect Dis, 200, 6(6): DOI: 0.320/eid [9] Alidjinou EK, Engelmann I, Bossu J, et al. Persistence of coxsackievirus B4 in pancreatic ductal-like cells results in cellular and viral changes[j]. Virulence, 207, 8(7): DOI: 0.080/ [0] Pennino F, Nardone A, Montuori P, et al. Large-scale survey of human enteroviruses in wastewater treatment plants of a metropolitan area of southern Italy[J]. Food Environ Virol, 208, 0(2): DOI: 0.007/s [] Sarmirova S, Borsanyiova M, Benkoova B, et al. Pancreas of coxsackievirus-infected dams and their challenged pups: a complex issue[j]. Virulence, 209, 0(): DOI: 0.080/ [2] Tian X, Zhang Y, Gu S, et al. New coxsackievirus B4 genotype circulating in inner Mongolia autonomous region, China[J]. PLoS One, 204, 9(3): e DOI: 0.37/journal.pone [3] 姚相杰, 陈龙, 王伟琪, 等 年深圳市重症手足口 病患儿柯萨奇病毒 A6 型 VP~VP4 基因特征分析 [J]. 中华微 生物学和免疫学杂志, 209, 39(): DOI: /cma. j.issn [4] Ratnamohan VM, Zeng F, Donovan L, et al. Phylogenetic analysis of human rhinoviruses collected over four successive years in Sydney, Australia[J]. Influenza Other Respir Viruses, 206, 0(6): DOI: 0./irv ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 吴文婷 )

36 36 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 悬浮细胞 SUS-MDCK 在人季节性流感病毒分离中的应用研究 技术与方法 王冰白丽娜李天宝陆莹王萍陈叶沈阳市疾病预防控制中心传染病科 003 通信作者 : 王冰, cdcwangbing@hotmail.com, 电话 : 摘要 目的比较 SUS-MDCK MDCK 和 SPF 鸡胚 3 种方法对流感样病例 (influenza-like illness,ili) 标本中不同型别流感病毒的分离培养敏感性差异, 初步评估 SUS-MDCK 在流感监测中的应用前景和改进方向 方法选取 208 年 0 月至 209 年 6 月沈阳市流感监测哨点医院采集的 ILI 标本中流感病毒核酸阳性的标本, 同时应用 SUS-MDCK MDCK 和 SPF 鸡胚 3 种方法进行病毒分离, 对分离结果资料进行比较分析 结果 296 份 ILI 标本中, 核酸阳性率为 5.35%(99/ 296); 毒株分离情况为 :SUS-MDCK 细胞毒株 72 株 MDCK 细胞毒株 60 株 鸡胚株 54 株 结论对于季节性流感病毒的分离培养, 细胞法优于鸡胚法 ;SUS-MDCK 和 MDCK 在分离人季节性流感临床标本的敏感性上, 因毒株型别不同而略有差异,H3N2 型前者好于后者, 甲型 HN 型两者相当, 而 B 型 victoria 系后者略优于前者 从病毒滴度来看,MDCK 细胞毒株和 SPF 鸡胚毒株相当, 但 SUS-MDCK 细胞毒株高于前两者 关键词 流感病毒 ; 悬浮细胞 ; 病毒分离 DOI: /cma.j.issn Application of suspension SUS-MDCK cells in isolation of human seasonal influenza virus Wang Bing, Bai Lina, Wang Ping, Li Tianbao, Lu Ying, Wang Ping, Chen Ye Department of Infectious Diseases, Shenyang Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 003, China Corresponding author: Wang Bing, cdcwangbing@hotmail.com, Tel: Abstract Objective To compare the sensitivities of the three culture methods using suspension MDCK (SUS-MDCK) cells, adherent MDCK cells and embryonated chicken egg in isolating different types of influenza virus from clinical specimens of influenza like illness (ILI) cases, so as to evaluate the trend on application and improvement of SUS-MDCK in influenza surveillance. Methods The ILI samples with positive results of influenza virus nucleic acids were selected from the samples collected in the sentinel hospitals in Shenyang from October 208 to June 209. The three culture methods with SUS- MDCK cells, adherent MDCK cells and embryonated chicken egg were performed in parallel to isolate the virus and the data of virus isolation were analyzed. Results For 296 ILI samples, the rate of nucleic acid positive was 5.35% (99/ 296). The numbers of influenza virus strains isolated by different culture methods were 72 by SUS-MDCK cells, 60 by adherent MDCK cells and 54 by embryonated chicken egg. Conclusions The cell culture methods were better for seasonal influenza virus isolation than the culture with embryonated chicken egg. The sensitivities of isolating different types of human seasonal influenza virus by SUS-MDCK cells and adherent MDCK cells were slightly different. The SUS-MDCK cells was better than adherent MDCK cells in the isolation of influenza A (H3N2) strains while both were suitable for influenza A (HN) strains. However, isolation of influenza B/Victoria-Lineage virus by adherent MDCK cells was slight better than SUS-MDCK cells. The titers of virus isolated by adherent MDCK cells and embryonated chicken egg were equal while the titer by SUS-MDCK cell was higher than both methods above. Key words Influenza virus; Suspension MDCK cell; Virus isolation DOI: /cma.j.issn

37 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 37 病毒分离是流感实验室诊断的金标准, 狗肾细胞 (madin-darby canine kidney,mdck) 因其感染率高 增殖快, 分离的毒株抗原性接近野毒株, 是目前世界公认分离流感病毒最敏感的细胞系 由于近年来季节性流感病毒的部分型别, 尤其 H3N2 型对其敏感性持续降低 [], 研究人员开展了其他敏感细胞系如 A549 Vero 和 MDCK-3306PF 等的应用研究, 但其对流感病毒的敏感性均无法取代 MDCK [2-6] SUS-MDCK 细胞系为经过改良的悬浮培养细胞, 为评估其在人季节性流感病毒分离培养中的应用价值, 同时采用经典的贴壁细胞 MDCK 细胞法和 SPF 鸡胚法, 对收检的核酸阳性流感样病例 (influenza like illness,ili) 标本进行病毒分离, 以探讨 SUS-MDCK 细胞系在人季节性流感病毒临床标本分离中的应用前景 材料与方法. 标本来源 选取 208 年 0 月至 209 年 6 月沈阳市两家国家级流感哨点监测医院的内科门诊 内科急诊 儿内科门诊 儿内科急诊和发热门诊, 每周采集 ILI 咽拭子 5~20 份,4 条件下 48 h 内送至实验室 ILI 病例定义为 : 体温 38, 伴有喉痛或咽痛症状之一, 缺乏其他实验室诊断依据的急性呼吸道感染患者.2 主要试剂与仪器 MDCK 细胞由国家流感中心提供,DMEM 培养基 ( 货号 : ) 胎牛血清 ( 货号 : ) 等细胞培养试剂均为 GIBCO 公司产品 ;SUS-MDCK 细胞由上海市黄浦区疾控中心提供, 流感病毒高效细胞分离培养试剂盒 ( 货号 : XB-BJ-00) 为上海伯杰公司产品,YRC20 型 CO 2 震荡培养箱为上海西雷公司产品 ;SPF 鸡胚购于北京梅里亚维通公司,BSS60 型孵化箱为德国 Grumbach 公司产品 ;AgPath-IDTM One-step RT- PCR 试剂 ( 货号 :AM005) 为美国 Ambion 公司产品,ABI 7500 型荧光定量 PCR 仪为美国 AB 公司产品 ; 核酸提取试剂 RNeasy Mini Kit( 货号 : 7404) 为德国 QIAGEN 公司产品.3 方法 实验室收样当日提取 RNA 并以 RT-PCR 方法检测 M 基因和 NS 基因, 核酸阳性标本经三抗处理 2 h 以上, 同时应用 MDCK SUS-MDCK 和 SPF 鸡胚进行病毒分离 MDCK 和 SPF 鸡胚分离方法, 以及实时荧光定量 PCR(real-time RT-PCR) 方法按 全国流感监测技术指南 (207 年版 ) 进行, SUS-MDCK 分离则采用试剂盒操作说明书进行 血凝试验检测病毒滴度, 三种方法均为第一代为阴性盲传二代, 仍为阴性则弃之 对血凝滴度 8 的阳性毒株以血凝抑制方法进行分型鉴定.4 统计学处理 用 SPSS 22.0 软件进行分析 用 x 2 检验对不同方法分离不同亚型流感病毒的结果进行比较, 以 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 核酸检测总体情况 208 年 0 月至 209 年 6 月, 共采集 ILI 标本 296 份, 流感病毒核酸阳性率为 5.35% (99/296) 其中甲型流感病毒 43 份 (H3N2 型 30 份 甲型 HN 型 3 例 ) 占 7.86%, 乙型流感病毒 56 份 ( 均为 B 型 Victoria 系 ) 占 28.4% 2.2 病毒分离总体情况 对 99 份核酸阳性标本同时采用 MDCK SUS-MDCK 和 SPF 鸡胚进行分离, 有 74 份分离到毒株, 病毒分离总阳性率为 87.00%(74/99), H3N2 型 甲型 HN 型和 B 型 Victoria 系分离率分别为 65.85%(27/4) 94.39%(0/07) 和 90.20%(46/5) 2.3 三种培养方式的方法学比较 与 MDCK 法相比,SUS-MDCK 法具有操作简便 耗材成本低 细胞浓度可控 操作简单省时 病毒分离短等优势 相比细胞法,SPF 鸡胚法操作时间长, 效率低 见表 2.4 不同型别不同 CT 值标本的三种分离方法结果比较 MDCK 细胞系 SUS-MDCK 细胞系 SPF 鸡胚对不同亚型样本的分离阳性率各有不同 H3N2 型毒株的分离率分别为 3.7%(3/4) 65.85%(27/4) 和 0(0/4), 鸡胚法未分离到毒株, 两种细胞 法分离阳性率差异具有统计学意义 (x 2 =9.57, P<0.0),SUS-MDCK 优于 MDCK; 甲型 HN 毒株的分离率分别为 94.39%(0/07) 94.39% (0/07) 和 40.9%(43/07), 两种细胞法分离率相同, 二者与 SPF 鸡胚法差异具有统计学意 义 (x 2 =5.99,P<0.0); B 型 victoria 系毒株分离率分别为 90.20%(46/5) 86.27%(44/5) 和 2.57%(/5), 细胞法间差异无统计学意义 (x 2 =0.38,P=0.54), 三者检测方法间差异具有统计学意义 (x 2 =67.53,P<0.0) 将各型别标本按照核酸检测的 CT 值 (cycle threshold,ct), 分为三组 :<30 组 30~34 组和 35 组 35 组中三种方法分离阳性率分别为 25.8(8/3)% 32.26%

38 38 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 表 三种培养方式分离人季节性流感病毒的方法学比较 比较项目 MDCK 细胞法 SUS-MDCK 细胞法 SPF 鸡胚法 细胞培养 生长形式 贴壁接触 周期性维持 均质悬液 状态稳定 受精卵 传代时间 3~4 d 3~4 d 孵育 9~0 d 传代方式 EDTA- 胰酶消化 稀释传代 细胞数量 载体表面积限制数量少, 控制难度大 液体体积限制数量多, 易控制 仪器设备 普通 CO 2 培养箱 CO 2 震荡培养箱 生物孵化箱 环境条件 5%CO %CO 2 37 恒温恒湿 (37 60%) 耗材 细胞瓶 细胞管 不需要 细胞生长液 基础液 (DMEM), 需加入胎牛血清基础液 (SUS) 为无血清培养基, L-Glu+PBS+NaHCO 3 +Hepes+PS a 复杂 (PS a ) 简单 不需要 病毒分离 一代培养时间 3~7 d 2~3 d 3 d 环境条件 5%CO %CO 2 34 恒温恒湿 (34 60%) 病毒生长液 基础液 (DMEM) L-Glu+NaHCO3+Hepes+PS+TPCK- 胰酶 基础液 (SUS)PS+TPCK- 胰酶 不需要 洗细胞 需要 不需要 不需要 吸附 需要 (~2 h) 不需要 不需要 注 : a 表示 PS 为双抗或三抗, 在细胞培养传代过程中视情况决定是否添加, 而在病毒分离过程中则必须添加 (0/3) 0(0/3);30~34 组中的分离阳性率分别为 85.54%(97/3) 94.69%(07/3) 26.55%(30/3);<30 组中的分离阳性率分别为 00.00%(4/4) 00.00%(4/4) 43.64%(24/4) 从所有型别病毒株几何平均滴度 (geometric mean titer,gmt) 看,MDCK 细胞毒株和 SPF 鸡胚毒株相当, 而 SUS-MDCK 毒株高于前两者分离到的毒株 见表 2 表 2 不同型别不同 CT 值标本的三种分离方法结果比较 型别 CT 值 PCR 阳性 MDCK 细胞系 SUS-MDCK 细胞系 SPF 鸡胚标本数 GMT a 毒株数分离率 (%) GMT a 毒株数分离率 (%) GMT a 毒株数分离率 (%) H3N2 < ~ 甲型 HN < ~ B 型 victoria 系 < ~ 合计 注 : a GMT 为几何平均滴度 3 讨论悬浮细胞的培养相对于贴壁细胞有较多优势, 如不需胰酶消化 传代操作简便, 对细胞损伤小, 易扩大培养等 贴壁细胞因单层生长形式所限, 生长到 80% 以上时因细胞接触抑制, 生长速度大大降低, 导致其浓度受限 [7] 因此, 近些年悬浮细胞越来越被广泛的应用在病毒学研究领域 研究表明, 甲 乙型流感病毒和宿主细胞表面唾液酸 (sialic acid,sa) 受体的识别结合, 是病毒能否进入不同宿主细胞进行自我复制的关键 一般来说, 人流感识别结合 SAα2, 6 Gal, 而禽流感识别结合 SAα2, 3 Gal [8] 研究人员通过细胞遗传学方法将 SAα2, 6 Gal 受体高表达于 MDCK 细 胞表面 (Hα2, 6-MDCK), 提高了人季节性流感病毒对宿主细胞的识别结合能力, 提高了病毒在该细胞系上的敏感性 [9-0] 同时, 对其进行悬浮驯化, 提高细胞密度的同时也使其有效病毒接触面积大幅增加, 最终形成 SAα2, 6 Gal 受体高表达的悬浮 MDCK 细胞即 SUS-MDCK 细胞系 我们在本流感监测季引进该细胞系, 与传统的贴壁 MDCK 细胞法和 SPF 鸡胚法比较, 对 SUS- MDCK 细胞系在人季节性流感病毒的分离效果进行了初步评估 从检测方法学看,SUS-MDCK 在细胞培养阶段, 只需简单计数和稀释传代, 不需胰酶消化等操作, 既减少了实验步骤和污染环节, 又避免了

39 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 39 因胰酶消化造成的细胞损伤 提高了细胞的活力 从检测成本看, 细胞培养的胎牛血清, 其来源进口受限, 而国产批间差较大, 导致其价格较高, 但 SUS-MDCK 培养中采用了无血清培养基, 使其成本降低 另外, 在病毒分离过程中, 使用传统的贴壁 MDCK 时需清洗残留的胎牛血清后才能用于病毒分离, 而悬浮细胞 SUS-MDCK 则只需稀释到 (.00~4.00) 0 6 cell/ml 的浓度即可用于病毒分离, 其浓度可控, 利于大量样本的质控, 操作更加省时省力 ; 再者,MDCK 分离流感病毒时, 标本需吸附 2 h 左右, 而后需要再次清洗细胞, 添加新配置的复杂病毒生长液进行培养, 而 SUS-MDCK 则只需在已有的细胞生长液中添加 TPCK- 胰酶和 PS, 将 200~400 µl 标本加入共培养即可 SPF 鸡 胚分离病毒, 其主要困难在于鸡胚的来源不稳定 个体差异大 供货周期长和运输成本高等问题, 且接种方法对实验人员技术要求较高, 故多数实验室该法病毒分离率一直较低 从分离时间来看, SUS-MDCK 法时间最短, 仅需要 2~3 d 时间即可获得高滴度病毒, 与 MDCK 法相比节省 2~3 d 时间, 时间缩短一半, 而 SPF 鸡胚法则需更长时间 可见 SUS-MDCK 法对病毒分离的实验操作人员技术难度降低, 提高了分离工作的效率, 因此该细胞系更省时更高效 从分离流感病毒的敏感性来看,MDCK SUS- MDCK 和 SPF 鸡胚等 3 种方法的分离率分别为 80.40%(60/99) 86.43%(72/99) 和 27.4% (54/99), 可见细胞法优于鸡胚法,SPF 鸡胚法对各亚型 CT > 35 标本均未分离到病毒 SUS- MDCK 和 MDCK 在分离人季节性流感临床标本的敏感性上, 总体前者优于后者, 但在不同型别毒株上略有差异, 本研究表明 H3N2 型前者好于后者, 甲型 HN 两者相当, 而 B 型 victoria 系则后者略好于前者 从 CT 值分组来看,3 种方法对不同型别 > 35 组的分离率都较低, 除了 MDCK 分离 B 型 victoria 系病毒为 55.56% 外, 其余均小于 50%, 单从监测的时效要求来看, 对此类标本不建议分离 从病毒滴度来看,SUS-MDCK 所有型别的分离毒株远高于 MDCK 和 SPF 鸡胚的毒株 但是, 由于分离到的病毒滴度过高, 对血凝单位配置和分型实验增加了难度 因此, 还应该对其细胞密度 TPCK- 胰酶浓度等进行优化, 将滴度控制在合理范围内, 便于下游实验的开展 另外, 作为用于病毒分离的新细胞系, 还应利用血清免疫学和分子生物学等方法, 对其抗原性进行研究, 研究分离到的毒株与临床标本间是否存在适应性突变, 能否在疫苗生产等 领域内推广 遗憾的是, 本流行季未监测到 B 型 yamagata 系标本, 无法对其在 SUS-MDCK 上的分离效果进行评价 综上所述, 悬浮细胞 SUS-MDCK 的实验操作简单高效, 提高了部分型别流感病毒的敏感性, 尤其是 H3N2 型病毒的分离成功率 采用高表达 SAα2, 6 Gal 受体的 SUS-MDCK 细胞系, 可提高人季节性流感病毒的分离率 缩短检测时间, 进一步优化检测策略 实验反应体系, 降低监测强度 提高监测质量, 利于更加实时有效监测流感的流行情况 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] 王冰, 王萍, 单良, 等. 沈阳市 203 年 204 年流感监测 结果分析 [J]. 中国卫生检验杂志, 205, 25(8): [2] Rourou S. Continuous cell lines as a production system for influenza vaccines.[j]. Expert Rev. Vaccines, 2009, 8(2): Doi: 0.586/erv [] 刘铮, 孙明波, 高菁霞, 等. 低血清培养 Vero 细胞和流感病毒条件的优化 [J]. 中国生物制品学杂志,2009, 22(6): doi: /j.cjb liuzh.00 [2] Roth B, Mohr H, Enders M, et al. Isolation of influenza viruses in MDCK 3306PF cells and clearance of contaminating respiratory viruses[j]. Vaccine, 202, 30(3): doi: 0.06/j.vaccine [3] Kessler N, Thomas-Roche G, L Gérentes, et al. Suitability of MDCK cells grown in serum-free medium for influenza virus production[j]. Dev Biol Stand, 999, 98: 3-2; discussion [4] Lohr V, Rath A, Genzel Y, et al. New avian suspension cell lines provide production of influenza virus and MVA in serum-free media: Studies on growth, metabolism and virus propagation[j]. Vaccine, 2009, 27(36): doi: 0.06/j.vaccine [5] Horníčková, Zuzana. Different progress of MDCK cell death after infection by two different influenza virus isolates[j]. Cell Biochem Funct, 205, 5(2): doi: 0.002/(SICI) (997060)5:2<87::AID-CBF726>3.0.CO;2-6 [6] Nicholls J M, Chan R W Y, Russell R J, et al. Evolving complexities of influenza virus and its receptors[j]. Trends Microbiol, 2008, 6(4): doi: 0.06/j.tim [7] Hatakeyama S, Sakai-Tagawa Y, Kiso M, et al. Enhanced Expression of an α2, 6-Linked Sialic Acid on MDCK Cells Improves Isolation of Human Influenza Viruses and Evaluation of Their Sensitivity to a Neuraminidase Inhibitor[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(8): doi: 0.28/ JCM [8] Oh D Y, Barr I G, Mosse J A, et al. MDCK-SIAT cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells.[j]. J Clin Microbiol, 2008, 46(7): doi: 0.28/JCM ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杜丹 )

40 40 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统的构建 技术与方法 邹旋王昕彭博武伟华刘慧孙颖房师松深圳市疾病预防控制中心病原生物研究所 通信作者 : 房师松, @qq.com, 电话 : 摘要 目的在 pmdt-8 克隆质粒载体的基础上, 构建实用型的能够稳定转染甲型流感病毒 RNPs 并且可体外定量检测的 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统 方法设计并人工合成人 RNA 聚合酶 I 启动子 小鼠终止子序列及毒株 A/Puerto Rico/8/34 的 NP 基因的 UTR, 利用嵌合 PCR 方法将绿色荧光蛋白 (egfp) 基因与上述元件体外连接, 形成小鼠终止子 -3 UTR-eGFP-5 UTR- 人 RNA 聚合酶 I 启动子报告元件, 将报告元件克隆至不携带任何启动子的 pmdt-8 质粒载体中, 构建实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告质粒, 转染稳定表达流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞, 观察荧光表达及测定相对荧光度 结果该系统在转染 HeLa 细胞后, 无任何荧光产生, 而转染稳定表达流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞后 24 h 36 h 48 h 和 60 h 均有荧光产生, 强度随时间逐渐增强 结论成功构建了实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统, 有助于提高流感病毒反向遗传系统的拯救效率 研究流感病毒聚合酶功能以及探索 UTR 多态性对特定基因的复制或转录的影响机制, 为流感工作者在病毒分子机制领域的研究搭建了可靠的技术平台 关键词 RNA 聚合酶 I; 流感病毒 ; 绿色荧光蛋白基金项目 : 国家自然科学基金 (88763); 深圳市科技计划项目 (JCYJ ) DOI: /cma.j.issn Construction of a practical RNA polymerase I fluorescence reporting system Zou Xuan, Wang Xin, Peng Bo, Wu Weihua, Liu Hui, Sun Ying, Fang Shisong Institute of Pathogenic Biology, Shenzhen Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 58055, China Corresponding author: Fang Shisong, @qq.com, Tel: Abstract Objective To construct an practical RNA polymerase I fluorescent reporting system with stable transfection of cells expressing influenza A virus RNPs and being quantifiable in-vitro based on pmdt-8 plasmid vector. Methods Human RNA polymerase I promoter, mice terminator and UTR of NP gene from A/Puerto Rico/8/34 were redesigned and synthesized respectively. Chimeric PCR was used to combine enhanced green fluorescent protein (egfp) with the above parts to form the reporting element consisting of Mice terminator-3 UTR-eGFP-5 UTR-human RNA polymerase I promoter. The reporting element was cloned into pmdt-8 plasmid vector without any promoter to build a practical RNA polymerase I fluorescent reporting plasmid. HeLa cells with stable expression of influenza A/Puerto Rico/8/34 virus RNPs were transfected. The expression of fluorescence was observed and the relative intensity of fluorescence was measured. Results The reporting system expressed no fluorescence after transfection of HeLa cells. After transfection of the HeLa cells with stable expression of influenza A/Puerto Rico/8/34 virus RNPs, fluorescence were expressed at 24, 36 and 48 hours after transfection with increasing fluorescence intensity over time. Conclusions A practical RNA polymerase I fluorescent reporting system was successfully constructed. The system may be used to increase the rescue efficiency of influenza reverse genetics system, to facilitate the researches on the mechanism of influenza RNA polymerase, to explore the effect of UTR gene polymorphism on gene duplication and transcription, and to provide a reliable platform for scientists in the fields of viral molecular mechanism research. Key words RNA Polymerase I; Influenza virus; Green fluorescent protein Fund programs: National Natural Science Foundation of China (88763); Science and Technology Planning Project of Shenzhen (JCYJ ) DOI: /cma.j.issn

41 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 4 流感病毒属正黏病毒科, 为常见的呼吸道病毒之一, 是导致人类流行性感冒的主要病原体 根据其核蛋白抗原性可将病毒分为甲 (A), 乙 (B) [] 和丙 (C) 三型,205 年 Collin 等首次在牛身上分离出丁 (D) 型流感病毒 其中, 甲型流感病毒根据病毒表面蛋白血凝素 (hemagglutinin,ha) 和神经氨酸酶 (neuraminidase,na) 的不同, 可将病毒分为抗原性不同亚型, 目前共有 8 种 HA 亚型及 种 NA 亚型 [2-3] 甲型流感病毒遗传物质为单股负链分节段 RNA 病毒, 其基因组 RNA 含多个开放阅读框, 并与 3 和 5 端的非编码区相连 [4], 目前已知可编码 7 种蛋白 [5] 由 vrna RNA 聚合酶复合体 (RdRp) 及核蛋白 (NP) 组成的核糖核蛋白 (vrnps) 是病毒复制的最小单位 [6] 目前, 国内外研究人员为了进一步研究流感病毒各基因片段 基因 - 表型 之间的关系, 绝大多数的 RNA 聚合酶 I 报告系统均需要辅助病毒或共转染流感病毒 vrnps 来实现荧光检测或体外添加荧光酶底物进行 ELISA 测定, 定量检测繁琐 为此, 本课题组构建实用型的 RNA 聚合酶 I 荧光 报告系统, 为流感病毒的分子机制研究提供更便利的研究平台 材料和方法. 材料来源 克隆载体 pmdt-8 HeLa 细胞系以及稳定表达流感病毒 vrnps 的 HeLa 细胞系由本课题组构建 ; 大肠杆菌 JM09 感受态细胞 PCR 扩增试剂盒 T4 DNA 连接酶为 TAKARA 公司产品 ; 无内毒素的质粒 DNA 抽提纯化试剂盒 限制性内切酶为 NEB 公司产品 ; 转染试剂盒 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司 ; 细胞培养基 DMEM Opti- MEM 胎牛血清 FBS 购自 Gibco 公司 ; 引物由大连宝生物公司合成.2 方法.2. 引物设计与合成为了保证 RNA 聚合酶 I 的 RNA 转录效率, 深入比对分析鼠源终止子序列, 实用型的鼠源终止子在起始端增加一个 A 实用型 RNA 聚合酶 I 启动子和终止子由大连宝生物人工合成 利用 Primer 5.0 重新设计引物 见表 ( 括号内为限制性内切酶 ) 表 本实验中所用引物 引物名称引物序列 (5 3 ) 鼠终止子引物人聚合酶 I 启动子引物 egfp 引物嵌合引物 (F) 5 TATTCTCGAGCGGACATCTGGTCGACCTC 3 (Xho Ⅰ) (R) 5 CTTTCAATATCTACCTGCTTTCGCTTTTTTTCCCCCCCAACT 3 (F) 5 AAAACTACCTTGTTTCTACTAATAACCCGGCGGCCC 3 (R) 5 TTCAAGCTTCGGGCCGGCCCCTGCGTGT 3 (Hind Ⅲ) (F) 5 CCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 3 (R) 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCAT 3 (F) 5 TAGATATTGAAAGCCACCGGTCGCCACC 3 (R) 5 GACGAGCTGTACAAGTAAAAAACTACCTTGTTTCTACTAATAACCC 实用型聚合酶 I 荧光报告质粒构建设计并人工合成人 RNA 聚合酶 I 启动子 小鼠终止子序列及毒株 A/Puerto Rico/8/34 的 NP 基因的 UTR, 利用嵌合 PCR 方法将 egfp 基因与上述元件体外连接 [7], 形成小鼠终止子 -3 UTR-eGFP- 5 UTR- 人 RNA 聚合酶 I 启动子报告元件 利用 Hind III 和 Xho I 双酶切, 构建基于 pmdt-8 的实用型聚合酶 I 荧光报告质粒 pmdt-8-flu-egfp 提取荧光报告质粒 DNA, 分别进行 PCR 和测序验证插入元件的正确性.2.3 细胞转染与荧光检测复苏 HeLa 细胞 稳定表达流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞 [8], 传代接种至 96 孔细胞培养板, 待细 胞密度为 80%~90% 时, 用 PBS 液洗 3 次, 按照转染试剂盒 Lipofectamine 2000 说明书进行操作, 将纯化的质粒 pmdt-8-flu-egfp 分别转染到 HeLa 细胞以及稳定表达流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞中, 以 pmdt-8 质粒做对照, 在转染后 24 h 36 h 和 48 h 分别用多功能酶标仪读取各孔荧光值 2 结果 2. 实用型 RNA 聚合酶 I 系统 (pmdt-8-fluegfp) 的构建构建实用型 pmdt-8-flu-egfp 荧光报告系统 ( 图 )

42 42 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 ti pmdt 图 3 NCR egfp 5 NCR PIh 实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统 pmdt-8-flu-egfp 的示意图 分别以质粒peGFP-N和人工合成的聚合酶 I启动子和终止子DNA为模板 PCR扩增eGFP 基因 750 bp 启动子 400 bp 和终止子 350 bp 取PCR产物5 μl进行.0 %琼脂糖凝 胶电泳 可见约750 bp和400 bp大小的条带 得到 的DNA片段与预期大小一致 图2 割胶回收三 个产物进行嵌合PCR反应 经.0 %琼脂糖凝胶电 泳检测 图3 其扩增片段 500 bp 与预期大 小一致 M Marker POL I 启动子 2 POL I 终止子 3 egfp 图2 PCR 扩增目的 DNA 片段 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 进行检测 图 4 扩增片段 500 bp 与目的 片段长度相符 说明 DNA 片段 ti-egfp-pih 已成 功插入 pmdt-8 载体中 初步判断重组质粒构建 成功 另外 挑选 2 号和 8 号重组子进行基因测序 测序结果完全正确 使用 2 号重组质粒进行后续 实验并实验室保存 注 M Marker -4 pmdt-8-flu-egfp 5 Negative control 图4 重组质粒 pmdt-8-flu-egfp 的菌液 PCR 2.2 实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统的荧光 检测 2.2. 实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统转染细 提 取 构 建 的 pmdt-8-flu胞后的荧光效果 egfp 质粒 DNA 分别转染 Hela 细胞以及稳定表达 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细 胞 在 转 染 后 48 h 利用荧光显微镜观察荧光 图 5 从图 5 可 以 看 出 pmdt-8-flu-egfp 荧 光 报 告 系 统 在 转 染稳定表达 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞 后 48 h 有报告荧光 图 5B 而转染 HeLa 细胞 无荧光 图 5A A M Marker 2 ti-egfp-pih 图3 嵌合 PCR 产物结果 限 制 性 内 切 酶 Hind III 和 Xho I 双 酶 切 ti-egfp-pih 定向插入同样经 Hind III 和 Xho I 双酶切的无任何启动子的质粒 pmdt-8 中 构建 pmdt-8-flu-egfp 转化大肠杆菌 JM09 感受态 细胞 从转化平板随机挑取 4 个单菌落进行菌液 PCR 的鉴定 PCR 产物经.0 % 琼脂糖凝胶电泳 B 图 5 pmdt-8-flu-egfp 荧光报告系统转染后 48 h 荧光 观察 A pmdt-8-flu-egfp 报告系统转染 HeLa 细胞 B pmdt-8-flu-egfp 报 告 系 统 转 染 稳 定 表 达 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞 实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统荧光定 提取构建的 pmdt-8-flu-egfp 质粒 量检测 DNA 以 pmdt-8 质粒 DNA 作为阴性对照 转 染稳定表达 A/Puerto Rico/8/34 RNPs 的 HeLa 细胞 在转染后 24 h 36 h 48 h 和 60 h 利用多功能酶 标仪 激发波长 450 nm 发射波长 520 mm 分别 测定荧光值 图 6

43 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 43 荧光值 转染时间 (h) pmdp-8 图 6 实用型聚合酶 I 荧光测定 pmdp-8-flu-egfp 3 讨论随着 RT-PCR 及全基因组测序技术的发展, 可获得甲型流感病毒 cdna 序列, 实现了对 RNA 病毒在基因水平上的改造, 以此可研究甲型流感病毒基因的作用机制 结合反向遗传学方法, 拯救出重组突变的子代病毒, 以此可快速获得新型甲型流感病毒疫苗候选株 越来越多的实验研究发现, 流感病毒聚合酶和 UTR 序列影响病毒的跨种传播 转录复制 包装及致病性等方面 科研人员在利用双向反向遗传学系统拯救甲型流感病毒过程中发现, 流感病毒基因组 UTR 的准确性及 [9] 完整性会显著影响病毒拯救的效率 Zhao L 等运用 WSN(HN) 反转录基因系统研究甲型流感病毒基因 HA-UTR(H-H7 和 H9) 发现, 3 -UTR 比 5 -UTR 在子代 HA vrna 进入新病毒起更关键作用, 特定的 UTR 核酸位点及 UTR 序列长度调控新产生的 HA vrna 进入子代病毒 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统是研究流感病毒聚合酶或 UTR 作用分子机制的有力工具 [0] Lutz [7] 等自主构建了由 A/WSN/33 NP 基因 UTR 序列驱动的含有萤火虫荧光素酶的 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统及含绿色荧光蛋白的 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统, 为检测病毒复制 病毒滴度测定和评估抗病毒敏感性及抗原亚型鉴定等提供了一种快 [8] 速的方法 中国疾病控制预防中心的朱闻斐等构建了由 UTR 序列驱动的海肾荧光素酶 (Gluc) RNA 聚合酶 I 荧光报告系统, 并将该报告系统与 PA PB PB2 和 NP 双向反向质粒共转染至 293T 及 A549 细胞中研究 RNPs 对病毒转录及复制的影响 已有的报告系统均需要辅助病毒感染, 荧光检测方法繁琐 近年来发现, 真核生物的 RNA 聚合酶 II 能反式识别 T7 启动子的顺式作用元件, 以启动启动子下游基因的转录, 导致原核生物的启动子被真核生物 RNA 聚合酶驱动基因的表达 在实用型的 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统的构建中, 我们更换为无任何启动子的 pmdt-8 质粒载体, 以消除本底荧光, 并且在 RNA 聚合酶 I 终止子序列增加一个 A, 增加 RNA 转录效率, 另外将流感病毒 RNPs 稳定转染到 HeLa 中, 避免辅助病毒的感染过程 实用型的 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统可以用多功能酶标仪直接检测荧光信号强度 为消除脂质体转染效率造成的系统误差, 在实际应用中可以同时转染红色荧光表达质粒作为内参 本课题组建立的实用型 RNA 聚合酶 I 荧光报告系统, 克服了已有报告系统的缺点, 可以用来定性定量检测甲型流感病毒聚合酶活性 UTR 多态性的分子机制及各基因分子突变的功能研究, 为流感病毒研究工作者提供了便利的工具 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] Collin EA, Sheng ZZ, Lang YK, et al. Cocirculation of two distinct genetic and antigenic lineages of proposed influenza D virus in Cattle[J]. J Virol, 205, 89(2): DOI: 0.28/JVI [2] Ciminski K, Thamamongood T, Zimmer G, et al. Novel insights into bat influenza A viruses[j]. J Gen Virol, 207, 98(0): DOI: 0.099/jgv [3] Tong S, Zhu X, Li Y, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[j]. PLoS pathog, 203, 9(0): e DOI: 0.37/ journal.ppat [4] Gerber M, Isel C, Moules V, et al. Selective packaging of the influenza genome and consequences for genetic reassortment[j]. Trends Microbiol, 204, 22(8): DOI: 0.06/j.tim [5] Jagger BW, Wise HM, Kash JC, et al. An overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response[j]. Science, 202, 337(609): DOI: 0.26/science [6] Vasin AV, Temkina OA, Egorov VV, et al. Molecular mechanisms enhancing the proteome of influenza A virus: an overview of recently discovered proteins[j]. Virus Res, 204, 85: DOI: 0.06/j.virusres. [7] 连孟洋, 王昕, 彭博, 等. 流感病毒两种反向遗传学操作系统 的初步构建 [J]. 中国人兽共患病学报, 205, 3(5): [8] 丁小满, 王昕, 俞若曦, 等. 稳定表达 HN 流感病毒核糖核蛋 白的 Hela 细胞株的建立 [J]. 热带医学杂志, 206, 6(2): [9] Zhao L, Peng Y, Zhou K, et al. New insights into the nonconserved noncoding region of the subtype-determiant hemagglutinin and neuraminidase segments of influenza A viruses[j]. J Virol, 204, 88(9): DOI: 0.28/JVI [0] Li X, Chen Y, Wang X, et al. U3 C3 mutation in the variable regionof the NA gene 3'UTR of H9N2 influenza virus influences the replication and transcription of NA and enhances virus infectivity[j]. Virus Genes, 209, 55(4): DOI: 0.007/ s ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杜丹 )

44 44 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 监测与流行病学研究 河北省散发腹泻病例诺如病毒基因特征分析 白雪张淑红申志新河北省疾病预防控制中心微生物检验所, 石家庄 通信作者 : 白雪, @qq.com, 电话 : 摘要 目的了解河北省散发腹泻病例诺如病毒的分子特征 方法收集 205 年 9 月至 206 年 2 月, 河北省 6 市哨点医院散发腹泻病例粪便标本, 用实时荧光反转录聚合酶链式反应 (realtime reverse transcription polymerase chain reaction,rt-pcr) 方法检测标本中的诺如病毒 阳性标本进行基因片段扩增, 并测序进行序列比对, 确定基因型 对测序所得序列与基因库中诺如病毒参考序列进行同源比对, 并做进化树分析 结果共采集腹泻便样本 240 份, 检出诺如病毒阳性样本 58 份, 其中 GI 型 5 份,GII 型 53 份 对诺如病毒阳性样品 RNA 进行测序, 得到 2 条主要衣壳蛋白 (VP) 区序列和 7 条 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA-polymerase,RdRP) 区序列 经过与 GenBank 中诺如病毒参考序列比对, 得到 VP 区 5 种基因型,GII.4 型最多 (0/2), 其次为 GII.7 型 (4/2), 其他还有 GII.2 型 (3/2) GII.3 型 (3/2) 和 GII.6 型 (/2) RdRP 区有 2 种基因型, 分别为 GII.P7 型 (4/7) 和 GII.Pe 型 (3/7) 结论河北省感染诺如病毒散发腹泻病例以 GII.4 型和 GII.7 型为主, 其他型别也有检出, 需要进一步加强监测, 及时发现新型毒株 关键词 诺如病毒 ; 腹泻病例 ; 基因分型基金项目 : 河北省科技支撑计划项目 ( D) DOI: /cma.j.issn Analysis on gene of norovirus from sporadic diarrhea cases in Hebei province Bai Xue, Zhang Shuhong, Shen Zhixin Institute of Microbiological Detection, Hebei Province Center for Disease Prevention and Control, Shijiazhuang 05002, China Corresponding author: Bai Xue, @qq.com, Tel: Abstract Objective To understand the molecular characteristics of norovirus strains from acute sporadic diarrhea cases in Hebei province. Methods From September 205 to December 206, stool specimens of sporadic diarrhea cases were collected from the sentinel hospitals of 6 cities in Hebei province. Norovirus was detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The gene fragments of the virus in positive samples were amplified and sequenced for sequence alignments to determine the genotypes. The sequences obtained by sequencing were used in similarity analysis with the reference sequences in norovirus gene database. The phylogenetic tree was used for the analysis. Results A total of 240 stool specimens of diarrhea cases were collected. Fifty-eight samples were positive for noroviruses, including 5 cases of genotype GI and 53 cases of GII. The norovirus RNA fragments in the positive samples were sequenced, and 2 sequences of capsid protein (VP) region and 7 sequences of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region were obtained. After comparing with the reference sequences of norovirus in Genbank database, the sequences of VP revealed five genotypes. The predominant type was GII.4 (0/2) followed by GII.7 (4/2) and other genotypes of GII.2 (3/2), GII.3 (3/2) and GII.6 (/2). Two genoytpes by RdRP sequences were discovered, including GII.P7 (4/7) and GII.Pe (3/7). Conclusions Norovirus GII.4 and GII.7 were predominant among sporadic diarrhea cases in Hebei province, and other types also existed. The surveillance should be enhanced for timely detection of new type of the virus. Key words Norovirus; Diarrheal case; Genotyping Fund program: Hebei Science and Technology Program ( D) DOI: /cma.j.issn

45 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 45 诺如病毒 (norovirus,nv) 是导致人非细菌性急性胃肠炎的重要病毒之一 目前可分为 GI~GVII 7 个基因型 根据其主要衣壳蛋白 (VP) 和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNApolymerase,RdRP) 区的序列, 进一步划分为不同亚型 GI GII 中的大部分亚型和 GIV 型可以感染人, 其中 GI 型 GII 型是导致急性肠胃炎的主要病毒类型 [] 诺如病毒变异很快, 并且可以发生基因重组 [2-3], 使病毒更加复杂多样 其在世界不同国家和地区 不同时期的流行型别不同, 约 2~4 年会出现新的导致全球性流行的主要感染亚型 我国自 204 年冬季以来,GII.7 变异株所致的暴发疫情大幅增加 [4-6] 河北省对于散发腹泻病例中诺如病毒基因型的研究较少, 缺乏分子特征数据 本研究对 205 年 9 月至 206 年 2 月收集的河北省 6 个市哨点医院腹泻病例的粪便标本诺如病毒阳性样品进行基因测序和分子分型, 初步了解了河北省腹泻病例诺如病毒的主要基因型, 为诺如病毒的监测和防控提供科学依据 材料与方法. 标本采集 在河北省选择 6 个市 ( 石家庄 邢台 沧州 秦皇岛 承德和廊坊 ), 每个市随机选择 2 个三甲医院肠道门诊, 进行腹泻病例粪便标本采集, 标本符合病例定义 (24 h 内腹泻次数 3 次或以上, 且大便性状有改变 ) 时间从 205 年 9 月至 206 年 2 月, 共采集腹泻便样本 240 份, 冷藏运送到实验室,-80 保存.2 主要仪器和试剂 CFX96 荧光定量 PCR 仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ); 天隆核酸自动提取仪 ( 西安天隆科技公司 ); 核酸电泳仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ); 病毒 RNA/DNA 提取试剂盒 ( 磁珠法 )( 西安天隆科技公司 ); 蛋白酶 K(Sigma 公司 ); 磷酸盐缓冲液 (PBS) ( 康宁公司 );RNA 一步法荧光 RT-PCR 检测试剂盒 (invitrogen);superscript Ⅳ 反转录试剂盒 (invitrogen);gotaq Colorless Master Mix 试剂盒 (Promega); 胶回收试剂盒 (Promega);T-9 simple vector 连接试剂盒 (TaKaRa);DH5α 感受态细胞 (TaKaRa) 阳性对照采用已知诺如病毒阳性样品.3 引物和探针 诺如病毒检测引物和探针序列采用国标中序列 [7] ( 表 ) 对粪便阳性样品进行序列片段 PCR 扩增, 扩增引物序列选自文献 [8] ( 表 ), 由华大基因公司合成 扩增片段纯化后直接测序 或连接到载体进行克隆后由华大基因公司进行测 序.4 实验方法.4. 样本处理水样便或粘液便用 ml PBS 混悬后,8 000 r/min 离心 0 min, 取上清做为粗提 样本 按核酸提取试剂盒说明进行核酸提取, 样本 体积为 200 μl, 提取后得到总核酸体积为 60 μl, 提取后的 RNA 于 -80 保存.4.2 诺如病毒检测诺如病毒核酸检测应用 实时荧光反转录聚合酶链式反应 (real-time reverse transcription polymerase chain reaction,rt-pcr) 方法, 分别检测 GI 型和 GII 型, 按试剂盒说明书 配制反应体系, 扩增条件为 min;95 5 min;95 5 s,60 20 s,65 30 s( 检测 荧光 ),45 个循环 结果判定 :Ct 值 36 时, 判 断结果为阳性.4.3 反转录 PCR 扩增及测序取阳性样 本 RNA 5 μl, 根据反转录酶试剂盒说明书合成 cdna 取 5 μl 合成的 cdna 用 PCR 试剂盒进行 扩增, 电泳扩增片段, 用回收试剂盒进行片段回 收, 回收产物进行测序 PCR 产物不能测序时, 取 5 μl 回收片段用 T-9 simple vector 试剂盒进行 连接, 然后转化 DH5α 感受态细胞, 在 LB 平板 上生长, 进行蓝白斑筛选, 白斑菌落进行 PCR 扩 增检测, 阳性菌落进行测序.4.4 序列分析将获得的病毒基因序列应用 BLAST 软件比对, 并在诺如病毒基因分型网站 输入片段序列进行序列比对, 确定基因型 同源 性比对及系统进化树构建均用 mega 7.0 软件 系 统进化树构建使用 N-J 模型, 并用 bootstrap 000 重复对进化树的可靠性进行评价 用于系统进化 树分析的诺如病毒参考株均来自于 GenBank 数据 库 荧光 表 本研究中引物和探针序列 用途名称序列 RT-PCR 测序 GI-f GI-r 探针 GⅡ-f GⅡ-r 探针 CoG2F CGCTGGATGCGNTTCCAT CCTTAGCCATCATCATTTAC FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA ATGTTCAGRTGGATGTTCTCWGA TCGACGCCATCTTCATTCACA FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG G2-SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT JV2Y JV3I ATACCACTATGATGCAGATTA TCATCATCACCATAGAAAGAG [9]

46 46 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 2 结果 2. 基因测序结果 对诺如病毒阳性样品 RNA 进行测序, 得到 2 份 VP 区序列和 7 份 RdRP 区序列, 均为 GII 型 经过与 GeneBank 中诺如病毒参考序列比对, 得到 VP 区 5 种基因型,GII.4 型最多 (0/2), 其次 为 GII.7 型 (4/2), 其他还有 GII.2 型 (3/2) GII.3 型 (3/2) 和 GII.6 型 (/2);RdRP 区有 2 种基因型, 分别为 GII.P7 型 (4/7) 和 GII.Pe 型 (3/7) 2.2 进化树分析把得到的 RdRP 区序列和 VP 区序列分别与 GeneBank 中的参考序列做同源比对, 并做进化树分析, 见图 和图 2 对 RdRP 区序列进行分析发现,4 株 GII.P7 毒株序列同源性为 93.7%~96.9%, 属于 GII.P7 三个组中的 Cluster III 组, 与湖州发现的参考株 KY34430 Norovirus GII strain GII/Hu/206/CHN/HuzhouNS6065 同源性达 95.7%~97.3%, 与俄罗斯发现的参考株 MK Norovirus GII isolate Hu/GII.P7- 图 诺如病毒 RNA 聚合酶区基因序列系统发生树 图 2 诺如病毒衣壳区基因序列系统发生树

47 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 47 GII.7/RUS/Novosibirsk/NS8-A603/208 同源性为 95.7%~97.3%, 与参考株 LC03745 Norovirus Hu/ GII/JP/205/GII.P7_GII.7/Kawasaki308 同源性为 94.9%~97.3% GII.Pe 型毒株组间同源性为 99.4%, 与参考株 JX Norovirus Hu/GII.4/Woonona/ NSW3309/202/AU 同源性为 99.2% 对 VP 区序列进行分析发现,0 株 GII.4 型 毒株同源性为 92.6%~ 96.4%, 与参考株同源 性为 95.2%~97.5% 3 株 GII.2 型毒株同源性为 9.7%~96.0%, 与参考株 MH _Norovirus_ GII_strain_Hu/NP/204/GII.P2-GII.2/ETR-NV-2 同源性为 90.9%~95.9% 3 株 GII.3 型毒株同源性 为 90.9%~95.%, 与参考株 KY Norovirus GII.3 strain Hu/US/972/GII.Pg_GII.3/ShippensburgC2 同源性为 87.7%~90.3% 株 GII.6 型毒株与参考株 GII.P7_GII.6b/886/5-BA7/205/ITA 同源性为 93.0% 4 株 GII.7 型毒株同源性为 94.5%~98.6%, 与韩国 参考株 KU Norovirus GII strain Norovirus GII/Hu/KR/205/GII.P7_GII.7/205032_ GL07LP6 同源性为 94.6%~98.0%, 与日本参考株 LC Norovirus GII Hu/GII.P7-GII.7/330067/ Tokyo/207/JPN 同源性为 98.6%~99.7%, 与安徽参 考株 MK Norovirus GII isolate AHFD-TL- NoV6036VP/CHN 同源性为 98.3%~00.0% 3 讨论 本研究发现, 河北省诺如病毒主要流行基因 型为 GII.Pe-GII.4, 该基因型病毒毒力较强, 在世 界范围内已造成多次大规模急性胃肠炎暴发疫情, 应继续加强对该型病毒的监测和防控 204 年冬季以来, 我国多个省份腹泻病例中 均检测到 GII.7 型诺如病毒, 河北省也曾在腹泻 暴发疫情中检测到该型毒株 [5-6] 近几年该亚型 毒株逐渐成为世界范围内新的流行株, 暴发数呈 上升趋势 本研究中检出 4 株 GII.P7-GII.7 型毒 株, 均为 206 年收集的样本 目前把 GII.7 分为 Cluster I~Cluster Ⅲ 三组,Cluster I 为 2003 年之前发 现的毒株, 其 RdRP 区序列与 GII.4 型同源性较高 ; 2005 年至 2009 年的毒株一般为 Cluster II 组 ;203 年 之后的毒株大部分为 ClusterⅢ 组, 我国近几年发 现的 GII.7 毒株大部分分到该组 [5-6] GII.7 型不断 发现变异株, 目前比较多见的有 GII.Pe-GII.7 型 GII.P3-GII.7 型 GII.P7-GII.7 等 [2], 应加强对该基因型病毒的监测和防控 本研究的不足之处, 一是采集标本时间相对较短 ; 二是没采集到未就诊的轻症腹泻病标本 ; 三是一些阳性样本测序失败 ; 四是 GⅠ 型阳性样本病毒含量较低, 没有得到基因序列 本研究对河北省散发腹泻病例中诺如病毒的基因型别流行状况进行了分析研究, 对今后诺如病毒感染的防控和研究具有一定的指示作用 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 [] 廖巧红, 冉陆, 靳淼, 等. 诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南 (205 版 )[J]. 中国病毒病杂志, 205, 5(6): DOI: /j [2] Fumian TM, Andrade J, Leite J, et al. Norovirus recombinant strains isolated from gastroenteritis outbreaks in Southern Brazil, [J]. PLoS One, 206, (4): e DOI: 0.37/ journal.pone [3] Lun JH, Hewitt J, Sitabkhan A, et al. Emerging recombinant noroviruses identified by clinical and waste water screening[j]. Emerg MicrobesInfect, 208, 7(): 50. DOI: 0.038/s [4] Jin M, Zhou YK, Xie HP, et al. Characterization of the new GII.7 norovirus variant that emerged recently as the predominant strain in China[J]. J Gen Virol, 206, 97(0): DOI: 0.099/ jgv [5] Fu J, Ai J, Jin M, et al. Emergence of a new GII.7 norovirus variant in patients with acute gastroenteritis in Jiangsu, China, September 204 to March 205[J]. Euro Surveill, 205, 20(24): DOI: / es [6] Chan MC, Lee N, Hung TN, et al. Rapid emergence and predominance of a broadly recognizing and fastevolving norovirus GII.7 variant in late204[j]. Nat Commun, 205, 6: 006. DOI: 0.038/ncomms006. [7] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. GB 食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验 [S]. [8] 龚黎明, 葛琼, 陈寅, 等. 浙江省 年三起诺如病毒胃肠炎暴发的病原分子特征分析 [J]. 中华流行病学杂志, 20, 32(5): DOI: /cma.j.issn [9] Kroneman A, Vennema H, Deforche K, et al. An automated genotyping tool for enteroviruses and noroviruses [J]. J Clin Virol, 20, 5(2): DOI: 0.06/j.jcv ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 杜丹 )

48 48 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No 年上海市人感染 H7N9 禽流感流行病学特征分析 监测与流行病学研究 韩若冰毛盛华姜晨彦潘浩郑雅旭孔德川袁政安陈健上海市疾病预防控制中心传染病防治所 通信作者 : 陈健, chenjian@scdc.sh.cn, 电话 : 摘要 目的了解上海市 年报告的人感染 H7N9 禽流感确诊病例的流行病学 临床 病原学特征, 分析流行现状, 评价防控效果并提出防控建议 方法收集整理确诊病例个案资料, 开展流行病学分析 结果 年共报告实验室确诊病例 55 例, 发病时间主要集中在冬春季 ;204 年起上海市开始实施季节性关闭活禽市场政策, 市场关闭期间仅报告 2 例, 均有且仅有外省市活禽接触史 60 岁及以上病例占报告病例总数 54.55%;80.0% 为男性 ; 职业分布以离退人员为主 (47.27%) 地区分布高度散发, 郊区多于市区 90.9% 病例有活禽暴露史,29.09% 的病例有吸烟喝酒等不良习惯,74.55% 病例有至少一项基础性疾病史 8.82% 病例发展至重症肺炎, 病死率 56.36% 结论上海市人感染 H7N9 禽流感病例高度散发, 病例多数发展成重症, 预后较差 感染的主要暴露因素为直接接触活禽或暴露于活禽市场 采取季节性关闭活禽市场等综合性防控策略, 可有效防控包括新型禽流感病毒感染在内的人禽流感疫情 关键词 H7N9 禽流感 ; 流行病学特征 ; 预防控制基金项目 : 上海市科委长三角区域重大突发性传染病跨境公共卫生安全保障技术的开发和示范应用 ( ); 上海市卫生计生委科研课题青年项目 (2074Y028) DOI: /cma.j.issn Epidemiological characteristics of human cases of avian influenza A (H7N9) virus infection in Shanghai Han Ruobing, Mao Shenghua, Jiang Chenyan, Pan Hao, Zheng Yaxu,2, Kong Dechuan, Yuan Zhengan, 2, Chen Jian, 2 Institute of Infectious Disease Prevention and Control, Shanghai Municipal Center For Disease Control and Prevention, Shanghai , China; 2 Key Laboratory of Ministry of Education on Public Health Security, School of Public Health, Fudan University, Shanghai , China Corresponding author: Chen Jian, chenjian@scdc.sh.cn, Tel: Abstract Objective To understand the epidemiological, clinical and etiological characteristics of confirmed cases of human avian influenza A (H7N9) virus infections reported in Shanghai from 203 to 208, so as to evaluate the effectiveness of current prevention and control measures and to provide relative recommendations. Methods Data of the laboratory confirmed human cases of influenza A (H7N9) virus infections in Shanghai from 203 to 208 were collected for epidemiological analysis. Result Fifty-five laboratory confirmed cases were reported from 203 to 208 in Shanghai. Most of the cases occurred during winter and spring. Since 204, the policy of seasonal closure of live poultry markets has been implemented in Shanghai. Only 2 cases were reported when the markets were closed, and both cases had and only had a history of exposure to live poultry in other provinces and cities. The cases of 60 years old and above accounted for 54.55% of all reported cases. Male cases accounted for 80% of all cases. In the occupational distribution, retiree was the main group (47.27%). For the geographical distribution, the cases were highly sporadic, with more cases in rural areas than urban areas. Of all cases, 90.9% had history of exposure to live poultry; 29.09% had unhealthy behaviors, including smoking and alcohol drinking; 74.55% had at least one underlying disease; and 8.82% developed severe pneumonia. The case fatality rate of 56.36%. Conclusions The human cases of influenza A (H7N9) virus infections in Shanghai were highly sporadic.

49 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 49 Most of the cases developed into the critical condition with poor prognosis. The main exposure factors for the infections were direct exposure to live poultry or in live poultry markets. Comprehensive prevention and control strategies, such as seasonal closure of live poultry markets, can effectively prevent and control human infections of avian influenza virus, including novel avian influenza viruses. Key words Avian influenza A (H7N9) virus; Epidemiological characteristics; Prevention and control Fund programs: Project of Shanghai Municiple Science and Technology Commission on the Innovation and Demonstration of Cross-regional Public Health Security Technology on Major Infectious Diseases in Yangtze River Delta ( ); Youth Project in Scientific Research Program of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2074Y028) DOI: /cma.j.issn 人感染 H7N9 禽流感是由甲型 H7N9 禽流感病毒感染引起的急性呼吸道传染病, 其中重症肺炎病例常并发急性呼吸窘迫综合征 脓毒性休克 多器官功能障碍综合征, 甚至导致死亡 [] 203 年 3 月底, 中国疾病预防控制中心从上海市一例重症肺炎死亡病例的送检标本中分离出 H7N9 禽流感病毒, 并宣布这是全球范围内首次发现人类感染 H7N9 病毒, 该病毒此前仅在禽间发现 [2] 本文对 年上海市报告的共 55 例病例的流行病学调查资料进行分析, 以掌握人感染 H7N9 禽流感病例在上海市的流行现状 危险因素, 并根据结果评价防控效果, 提出防控建议 对象和方法. 对象 数据来源于国家传染病报告信息管理系统, 以 年上海市医疗机构报告的 55 例人感染 H7N9 禽流感确诊病例为研究对象, 年份统计以发病日期为准.2 流行病学调查 对确诊病例进行流行病学调查, 主要涉及病例的一般情况调查 发病和就诊 报告情况, 居住地调查 禽类接触史 外出史 疫苗接种史 密切接触者调查和追踪, 实验室检测情况等.3 实验室检测方法 病例均采集咽拭子 血液, 部分病例采集痰液 下呼吸道分泌物肺组织标本等 全部标本均送往报告医院所在区疾控中心流感网络实验室开展核酸检测, 阳性样本送往上海市疾控中心实验室进行复核鉴定 病例密切接触者采集咽拭子送现住地所在区疾控中心进行检测.4 统计学分析 使用 Excel 200 与 SPSS 9.0 进行数据统计分 析, 病死率指标比较使用两独立样本 x 2 检验, 非正态分布资料分布比较使用两独立样本秩和检验, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 基本情况 2.. 发病时间分布 203 年 月 日至 208 年 2 月 3 日, 上海市共报告人感染 H7N9 实验室确诊病例 55 例, 首例病例于 203 年 2 月 9 日发病, 末例病例于 207 年 2 月 20 日发病 其中无高致病性 H7N9 禽流感病毒感染 确诊病例的发病时间集中在冬春季, 其中 年 33 例, 年 8 例, 年 6 例, 年 3 例, 年 5 例, 年无确诊病例 除 203 年因病例首次报告, 全部病例的发病时间集中于 2 4 月, 年发病高峰为每年 2 月至次年春节前, 占 年总发病数的 86.36%(9/22) 203 年疫情发生后, 上海市迅速采取了关闭活禽市场的防控策略, 活禽市场被关闭后, 仅出现 4 例病例, 且均在关闭后第一个潜伏期 (7 d) 内 自 204 年起上海市开始实施季节性关闭活禽市场的政策 ( 每年农历正月初一至公历 4 月 30 日 ), 活禽市场关闭期间仅 2 例发病, 均有且仅有其他省市活禽接触史 见图 2..2 人群分布报告病例中, 年龄范围 2 岁 ~88 岁, 中位数为 6 岁 60 岁以上病例占报告病例总数的 54.55%;80%(44/55) 为男性 离退人员 (47.27%), 涉禽人员 ( 从事禽类饲养 加工 宰杀 销售等工作 ) (9.09%) 构成比较高 见表 2..3 地区分布上海市报告的人感染 H7N9 禽流感病例呈高度散发, 全市 75% 的区 (2/6) 曾报告病例 ; 郊区病例 (39 例 ) 多于市区病例 (6 例 ), 其中浦东新区 2 例, 闵行区 例, 金山 宝山 松江 嘉定等区各 4 例 全市累计报告的人感染 H7N9 禽流感聚集性病例 2 起, 均报告于 203 年 2 起疫情各涉及 2 人, 其中 起为夫妻, 另 起为父子

50 50 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 图 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 上海市 5 个流行季人感染 H7N9 禽流感病例发病时间分布 A 流行季 B 流行季 C 流行季 D 流行季 E 流行季 2.2 流行病学史 流行病学调查发现 90.9% 病例有各种类型 的活禽暴露史 其中 22 例接触鸡 2 例接触鸭 2 例 接 触 鸽 子 例 接 触 鹅 6 位 29.09% 病 表 表2 上海市人感染 H7N9 禽流感病例人群分布 特征 合计 例有不良生活习惯 其中 5 人长期吸烟 3 人有 饮酒史 4 例 74.55% 病例有基础性疾病史 主要为高血压 糖尿病 心脏病等 见表 2 构成比 % 年龄 岁 3.64 上海市人感染 H7N9 禽流感病例流行病学特征 变量 合计 率 % 可疑暴露来源 接触可疑病例 a 直接接触可疑动物 居住地周围饲养 活禽 访问有活禽摊位的 农贸市场 多重可疑暴露 吸烟 饮酒 ~ ~ ~ ~ 男 无可疑暴露 女 不良生活习惯 公务人员及职员 基础性疾病 农民 高血压 工人 糖尿病 餐饮食品人员 心脏病 性别 职业 离退休人员 其他 a 可疑病例为有重症肺炎症状病例

51 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No 临床特点 2.3. 主要症状病例的症状表现以发热 咳嗽 肺炎为主, 其中 96.36% 出现发热, 最高体温达 39 ( 见表 3) 全部病例均住院治疗 因病例来源多为重症肺炎, 因此病例中 8.82% 进展至重症肺炎 重症肺炎病例中, 年, 68.8%(22/32) 病例发展至呼吸衰竭, 年,45.5%(5/) 的病例发展至呼吸衰竭, 差 异无统计学意义 (x 2 =.847,P=0.55); 年,3.25%(0/32) 的病例发展至 ARDS, 年 9.09% 的病例发展至 ARDS, 差异 无统计学意义 (x 2 =2.062,P=0.46) 临床救治情况与转归 55 例病例中, 8.82% 发展至重症肺炎, 并进入 ICU 治疗, 其中 3 例死亡, 病死率达 56.36% 发展至呼吸衰竭的病人病死率 (70.40%) 高于未发展至呼吸衰竭的病人 (4.90%), 差异有统计学意义 (x 2 =4.23,P=0.040) 男性病死率为 54.5%, 女性为 63.6%, 差异无统计学意义 (x 2 =0.042, P=0.838);60 岁以下年龄组病死率为 52.0%, 60 岁以上年龄组病死率为 60.0%, 差异无统计 学意义 (x 2 =0.355,P=0.55); 中心城区病死率为 66.7%, 郊区为 53.5%, 差异无统计学意义 (x 2 =0.662,P=0.46) 其中涉禽从业人员 5 人均死亡, 病死率为 00%, 与其他职业病死率间差 异无统计学意义 (x 2 =2.530,P=0.0) 55 例病例从发病到就诊 发病到住院 发病到转归 ( 出院或死亡 ) 的时间中位数分别为 2.0 d 6.0 d 以及 9.5 d 死亡病例的发病至死亡时间中位数为 4 d 使用了抗病毒药物磷酸奥司他韦的 48 例, 其发病至抗病毒药物使用 首诊至抗病毒药使用的时间中位数分别为 7.0 d 和 4.0 d; 转归情况为治愈的病例, 其发病至抗病毒药物使用 首诊至抗病毒药使用的时间中位数分别为 6.0 d 和 4.0 d; 转归情况为死亡的病例, 其发病至抗病毒药物使用 首诊至抗病毒药使用的时间中位数分别为 7.0 d 和 5.0 d 经两独立样本秩和检验, 治愈病例及死亡病例之间, 发病至抗病毒药物使用时间 (Z=-0.594,P=0.552) 首诊至抗病毒药使用时间 (Z=-.07,P=0.268) 的差异均无统计学差异 将病例进行年龄分组 (64 岁及以下 65~69 岁 70~74 岁 75~79 岁,80 岁及以上 ), 将性别 年龄组 是否有基础性疾病作为自变量, 结局 ( 治愈 / 死亡 ) 设为因变量进行多重 logistic 回归分析, 回归方程似然比检验 P 值为 0.540, 构建模型无统计学意义 表 3 上海市人感染 H7N9 禽流感病例临床特征 症状 人数 n(%) 合计 死亡数 n(%) 发热 (96.36) 30(55.45) 咳嗽 (8.82) 26(47.27) 肺炎 (94.55) 30(54.55) 进展为重症肺炎 进展为呼吸衰竭 进展为 ARDS (8.82) 25(45.45) (49.09) 9(34.55) (20.00) 9(6.36) 乏力 (30.9) 2(2.82) 肌肉酸痛 7 2 2(2.82) 5(9.09) 咽喉痛 (8.8) 6(0.9) 3 讨论上海市是全国首个发现人感染 H7N9 禽流感病例的省市, 在 203 年短时间内报告 30 余例, 引起社会广泛关注 年共报告人感染 H7N9 禽流感确诊病例 55 例, 病例主要集中在第一个流行季, 占全市报告总病例的 60.00%, 占当年全国报告总数的 24.63% [3] ; 第 2 个流行季发病数较第 个流行季下降明显, 但这 2 个流行季内上海市的报告病例数仍居于全国第 5 位 [4] ; 第 3 至第 5 个流行季发病数较少且相对稳定, 第 6 个流行季无病例报告 而全国数据显示, 第 2 个流行季 ( ) 及第 5 个流行季 ( ) 为 2 个小高峰, 尤其是第 5 个流行季从波及范围及发病数 2 个角度都超过前 4 个流行季的总和 [5] 上海市人感染 H7N9 禽流感主要发病时间为冬春季, 地区主要分布于郊区, 人群分布以 60 岁以上男性为主 有研究分析, 这可能与男性较女性有较高的呼吸道传染病患病率有关 [6] 病例分布以散发为主, 少有聚集性病例发生, 这与其他地区监测结果类似上海市发现的 2 起聚集性病例均不能排除存在共同可疑禽类暴露可能, 从后续发病情况来看也无证据表明存在广泛的人传人现象 近四分之三的病例有基础性疾病, 近三分之一病例有吸烟 饮酒等不良习惯, 其中多数为 60 岁以上男性, 职业上以离退人员为主 病例中从事涉禽产业相关的病例均死亡, 提示该职业在感染后预后较差, 是否与涉禽从业人员的禽流感病毒暴露风险及剂量较高有关仍需进一步研究证实 本市及其他地区的相关研究中均证实, 直接接触活禽或暴露于活禽市场是 H7N9 禽流感感染 [7-8],

52 52 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 的主要危险因素 [9-0] 春季关闭活禽市场则可降低禽流感传播风险 [9] 结果显示, 上海市报告的病例中多有明确的禽类或活禽市场暴露史, 其中间接暴露 ( 居住地附近饲养活禽 访问有活禽摊位的农贸市场 ) 居多, 直接接触较少 构建结局与年龄性别是否有基础疾病的模型无统计学意义, 无法得出高年龄 有基础性疾病 男性为死亡结局的危险因素的结论, 推测可能与样本量较小有关 203 年 4 月 6 日至 30 日上海在全市范围内采取关闭全部活禽市场的临时性防控措施, 并在 204 年后每年农历正月初一至公历 4 月 30 日采取季节性关闭活禽市场的后续防控策略 研究发现,89.09% 病例发病时间位于未采取关闭活禽市场期间,7.27% 病例发病时间在关闭活禽市场后 个潜伏期内, 仅 3.64% 病例发病时间在关闭活禽市场后 个潜伏期之后, 且该 2 例病例均有非上海市来源的活禽接触史 说明季节性关闭活禽市场政策对控制人感染 H7N9 禽流感疫情产生了良好的效果 207 年我国农业部门统一对禽类开展重组禽流感病毒二价灭活疫苗 (H5N Re-8 株 +H7N9Re- 株 ) 强制免疫策略, 禽间感染率大幅下降 208 年上海市涉禽场所监测结果显示, 未检出 H7N9 核酸阳性样本, 该年亦无人病例报告 虽在多部门有效合作及综合防控措施的落实下, 疫情得到有效控制, 但禽流感防控仍充满挑战 流感病毒本身具有较强的变异性, 且不同亚型间无交叉免疫, 人 禽类流感病毒在中间宿主 ( 猪 ) 进行重组, 可产生新的流感毒株 [] 近年来我国已陆续发现人感染 H5N6 H9N2 H0N8 和 H7N4 等亚型禽流感病例, 说明依靠活禽疫苗接种不能完全预防人感染禽流感疫情, 尤其是新型禽流感病毒 上海的经验表明, 通过采取季节性关闭活禽市场, 并在开放期加强活禽市场管理, 严格落实清洗消毒措施 严控禽类来源并适当降低储存活禽密度, 同时各级疾控部门加强病例和涉禽场所监测等综合管控措施, 可以有效地防控人感染 禽流感疫情 [2] 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突 参考文献 [] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 人感染 H7N9 禽流感诊疗方案 (207 年第一版 )[J]. 中华临床感染病杂 志, 207, 0(): -4. DOI: /cma.j.issn [2] Parry J. H7N9 avian flu infects humans for the first time[j]. BMJ, 203, 346: f25. DOI: 0.36/bmj.f25. [3] Wang X, Jiang H, Wu P, et al. Epidemiology of avian influenza A H7N9 virus in human beings across five epidemics in mainland China, 203-7: an epidemiological study of laboratory-confirmed case series[j]. Lancet Infect Dis, 207, 7(8): DOI: 0.06/S (7) [4] 任瑞琦, 周蕾, 向妮娟, 等. 中国内地人感染 H7N9 禽流 感疫情流行病学特征分析 [J]. 中华流行病学杂志, 204, 35(2): DOI: /cma.j.issn [5] 韩迪迪, 韩春霞, 李璐钰, 等. 中国 年人感染 H7N9 禽流感的流行病学特征 [J]. 中华流行病学杂志, 208, 39(): DOI: /cma.j.issn [6] Li J, Rao Y, Sun Q, et al. Identification of climate factors related to human infection with avian influenza A H7N9 and H5N viruses in China[J]. Sci Rep, 205, 5: DOI: 0.038/srep8094. [7] Huo X, Chen L, Qi X, et al. Significantly elevated number of human infections with H7N9 virus in Jiangsu in eastern China, October 206 to January 207[J]. Euro Surveill, 207, 22(3): pii= DOI: / ES [8] Kang M, Lau EHY, Guan W, et al. Epidemiology of human infections with highly pathogenic avian influenza A(H7N9) virus in Guangdong, 206 to 207[J]. Euro Surveill, 207, 22(27): DOI: / ES [9] Yu H, Wu JT, Cowling BJ, et al. Effect of closure of live poultry markets on poultry-to-person transmission of avian influenza A H7N9 virus: an ecological study[j]. Lancet, 204, 383(996): DOI: 0.06/S (3) [0] Li J, Chen J, Yand G, et al. Case-control study of risk factors for human infection with avian influenza A(H7N9) virus in Shanghai, China, 203[J]. Epidemiol Infect, 205, 43(9): DOI: 0.07/S [] 任瑞琦, 周蕾, 倪大新. 全球流感大流行概述 [J]. 中华流行病学 杂志, 208, 39(8): DOI: /cma.j.issn [2] 陈健, 毛盛华, 胡家瑜, 等. 人感染 H7N9 禽流感流行特征 与防控策略 [J]. 第二军医大学学报, 203, 34(6): DOI:0.3724/SP.J ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 马春娜 )

53 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No 年兰州市 5 岁以下住院腹泻儿童诺如病毒分子流行病学分析 监测与流行病学研究 闫玉晓周永康张会芳王芳靳淼章青孔翔羽李慧莹 李静欣刘娜李金松李宇宁段招军 兰州大学第一临床医学院,730000; 2 兰州大学第一医院儿科,730000; 3 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京 通信作者 : 李宇宁, tiger962962@63.com, 电话 : 方法 摘要 目的 探讨 年兰州市 5 岁以下住院腹泻儿童分子流行病学特征 收集 205 年 月至 208 年 2 月兰州市 5 岁以下腹泻住院儿童粪便标本和相应临床信息, 采用 RT-PCR 方法进行扩增 测序和序列分析 应用 SPSS 25.0 软件进行相关统计分析, 其中率的比较采 用 x 2 检验, 分析 年兰州地区诺如病毒分子流行特征 结果诺如病毒的检出率为 4.27% (2/785), 年的检出率为 7.8%~7.6%, 不同年份阳性率比较, 差异有统计学意义, 季节高峰分别出现在 月 5 月和 0 月 岁检出率最高,2 岁检出率最低, 差异无统计学意义 根 据基因分型结果,GII.4 Sydney[P3] 和 GII.3[P2] 为主要流行基因组合, 分别占 54.5%(6/2) 和 36.6%(4/2) 结论 Sydney[P3] 和 GII.3[P2] 为主要流行株 兰州市急性胃肠炎患儿诺如病毒基因型具有多样性, 其中以 GII.4 关键词 诺如病毒 ; 基因型 ; 流行病学 ; 序列分析 基金项目 : 国家科技重大专项 (207ZX ); 中美新发再发传染病合作项目 (U0GH002224) DOI: /cma.j.issn Molecular Epidemiology of norovirus infection among hospitalized children under 5 years with diarrhea in Lanzhou, Yan Yuxiao, Zhou Yongkang 2, Zhang Huifang 2, Wang Fang 2, Jin Miao 3, Zhang Qing 3, Kong Xiangyu 3, Li Huiying 3, Li Jingxin 3, Liu Na 3, Li Jinsong 3, Li Yuning 2, Duan Zhaojun 3 The First Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou , China; 2 Department of Pedistrids, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou , China; 3 National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 02206, China Corresponding author: Li Yuning, tiger962962@63.com, Tel: Abstract Objective To investigate the molecular epidemiological characteristics of diarrhea among hospitalized children under 5 years old in Lanzhou from 205 to 208. Methods The fecal specimens and related clinical information of hospitalized children with diarrhea under 5 years old in Lanzhou from January 205 to December 208 were collected. Amplifications were performed with RT- PCR followed by sequencing and sequence analysis. Statistical analyses were performed with SPSS 25.0 software, including chi-square test for the comparison of rates, to analyze the epidemiological characteristics of norovirus in Lanzhou from 205 to 208. Results The detection rate of norovirus was 4.27% (2/785), and the annual detection rates from 205 to 208 ranged from 7.8% to 7.6%. The differences in annual positive rates were statistically significant. Seasonal incidence peaks occurred in January, May and October, respectively. The highest and the lowest detection rates were among children of years old and 2 years old, respectively, and the difference was not statistically significant. According to genotyping results, GII.4 Sydney[P3] and GII.3[P2] were the predominant genetic combinations with

54 54 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. detection rates of 54.5% (6/2) and 36.6% (4/2), respectively. Conclusions Diversed genotypes of norovirus among children with acute gastroenteritis in Lanzhou were observed. The predominant genotypes were GII.4 Sydney[P3] and GII.3[P2]. Key words Norovirus; Genotype; Epidemiology; Sequence analysis Fund Programs: National Key Science and Technology Program of China (207ZX ); China-United State Cooperation Project on New Emerging and Reemerging Infectious Diseases (U0GH002224) DOI: /cma.j.issn 诺如病毒 noroviruses NoV 属于杯状病毒 科诺如病毒属 单股正链RNA病毒 其具有致病 性高 感染剂量低 对外界抵抗力强等特点 是 引起全世界非细菌性急性胃肠炎暴发流行的主要 [] min 50 退火 min 72 延伸 min 40 个 循环 72 后延伸 0 min 4 终止反应 [2].4 序列测定分析 PCR 扩增产物送至北京天一辉远生物科技有 病原体 NoV具有基因多样性 分为GI-GVII 7 限公司进行纯化测序 测序结果将引物序列去除 个组 其中GI与GII是引起人类急性胃肠炎的两个 后 采用软件 DNA Star 进行核苷酸序列比对分析 [2] 主要基因组 进一步分为9个和27个基因型 自 利用 Mega 7.0 生物学软件 应用 Neighbor-Joining 995年以来 全球范围内出现的胃肠炎大流行均 法构建系统进化树 所用参考毒株序列来自美国 [3] 与GII.4变种有关 95/96US 年 疾病预防控制中心 CDC CaliciNet 实验室 [2] 利 Farmington Hills 株 年 Hunter 2004 用美国 CDC 在线分型工具进行基因分型 株 年 Den Haag 2006b株 2006 norovirus.ng.philab.cdc.gov/.5 统计学分析 200年 New Orleans 2009株 年 和Sydney 202株 [4]是引起全球流行 采用 SPSS 25.0 统计学软件进行数据的描述统 的几个GII.4变异株 本研究对205年月至208年 计 率的比较采用 x2 检验 以 P<0.05 为差异有统 计学意义 2月兰州市5岁以下腹泻住院儿童腹泻标本进行诺 如病毒检测和分子流行病学分析 材料与方法. 样本来源 收集 205 年 月至 208 年 2 月兰州大学第 一医院 5 岁以下腹泻住院儿童标本共 785 份 每 份粪便标本约 3 ml 腹泻病例定义 24 h 内出现 排便 3 次且有性状改变 呈稀水样便 和 / 或 24 h 内出现呕吐 2 次者 [2] 患者粪便以无菌容器 收集 于 -70 冰箱保存备用.2 病毒 RNA 的提取 采用磷酸盐缓冲溶液将粪便标本制备成 0% 悬液 rpm /min 离心 5 min 取 200 μl 上清 采用磁珠法病毒 RNA/DNA 提取试剂盒 苏州天隆 科技公司 进行核酸提取 按试剂盒说明书操作 收集终体积为 70 μl 的核酸提取液 -80 保存.3 RT-PCR 检测 采 用 一 步 法 RT-PCR 商 品 化 试 剂 盒 Qiagen 公司 利用同时扩增聚合酶区 B 区 和衣壳区 C 区 的引物 Mon432/GSKR GI 和 Mon43/G2SKR GII 进 行 RT-PCR 扩 增 反 应 参 数 为 42 反转录 30 min 95 预变性 5 min 95 变性 2 结果 2. 不同性别 季节及年龄诺如病毒检出情况 兰 州 地 区 4 年 研 究 期 间 共 采 集 785 份 腹 泻 便 样 本 NoV 检 测 阳 性 样 本 2 份 检 出 率 为 4.27% 5 岁以下急性胃肠炎儿童检出 NoV 阳性 的 样 本 中 男 性 检 出 率 为 3.8% 72/522 女 性 检 出 率 为 5.2% 40/263 经 x2 检 验 不 同 图 年兰州市 5 岁以下急性胃肠炎患儿 诺如病毒感染季节分布

55 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 性别 NoV 检出率差异无统计学意义 x2=0.287 P= 年 的 NoV 检 出 率 分 别 为 7.6% 47/ % 26/46 2.3% 27/29 和 7.8% 2/53 经 x2 检验 不同年份阳性率 差异有统计学意义 x2=9.760 P= 年不 同月份间检出率差异有统计学意义 x2= P=0.003 月阳性率最高 26.92% 4/52 月 的 检 出 率 最 低 3.79% 5/32 图 0~6 月龄 7~2 月龄 岁 2 岁和 3~5 岁不同月 龄 / 年组的 NoV 检出率见表 经 x2 检验 不同 月龄组阳性检出率差异无统计学意义 x2=2.92 P= 讨论 NoV是造成全世界范围内非细菌性急性胃肠 炎的主要原因 可感染所有人群[5] 同时该病毒的 突变和重组导致其广泛传播和持续[6] 本研究中 GII.4 Sydney为优势毒株 与文献所报道的GII.4 是导致急性病毒性胃肠炎最常见的基因型结果一 致[7] GII.3[P2]在4年监测期间呈递减趋势 % 25/ % 6/ % 0/ % 0/53 同Lu等[8]的研究结果一致 另一方面 经x2检验 不同性别的阳性率差异无统计学意义 表明不同 性别易感性相同 不同年份 不同月份的阳性率 差异存在统计学意义 且优势株各异 表明NoV基 表 年龄分组 兰州市 5 岁以下急性胃肠炎患儿诺如病毒 感染年龄分布表 病例数 例 阳性数 例 检出率 % 因型水平流行性的差异可能受到抗原变异 重组 及气候等多种因素影响[9] 本研究获得 2 份 NoV 阳性样本的聚合酶区 0~6 月 ~2 月 岁组 市 5 岁以下急性胃肠炎患儿感染的 NoV 具有基因 2 岁组 多态性 多种型别同时流行 GII.4 Sydney 于 岁组 年 3 月在澳大利亚被首次发现 随后在法国 新 西兰 日本 英国 美国及中国等地区陆续发现 [0] 合计 和衣壳蛋白区基因序 根据序列分析表明 兰州 且一直是优势毒株 [] 本研究中 年 2.2 基因型分布 对2份NoV阳性样本的聚合酶区及衣壳区 进行扩增及测序 根据基因分型表明 7种基因 型组合被发现 GII.4 Sydney[P3] 和GII.3[P2] 为主要流行基因组合 分别占54.5% 6/2 和36.6% 4/2 GII.6[P7]6株 GII.4 New Orleans [GII.P4] GII.2[P6] GII.7[P7]和 GI.6[P6]各株 图2 数据分析表明 GII.4 Sydney 是其 4 年的优势型别 进一步说明了自 GII.4 全球流行以来 其一直是导 致暴发及散发感染的主要基因型 [5] GII.3 自 975 年发现以来 陆续成为日本 澳大利亚及加拿大 等地区的优势基因型 [2] 然而本研究中 GII.3 数量 呈递减趋势 同上海地区研究发现一致 [8] 另有 GII.6 GI.6 GII.7 及 GII.4 在 205 年仅呈低频率 偶发 本 研 究 表 明 GII.3[P2] 多 集 中 发 生 于 冬 春 季 而 GII.4 Sydney[P3] 除个别月份 2 月 8 月 外 全年散发 本研究结果与中国湖州地区统计 数据所示相似 冬季主要基因型为 GII.3[P2] 而 春季 夏季及秋季主要流行基因型以 GII.4 为主相 差异 [3] 这可能是由于气候 地理等因素差异所 导致 GII.4 Sydney[P3] 在 202 年首次在澳大利 亚被报道 自此之后 逐渐在南非 年 韩国 203 年 博茨瓦纳 年 伊朗 年 和中国等部分城市广泛存 在 [8] 本研究进一步证实其广泛传播及持续性 图2 兰州市 5 岁以下急性胃肠炎患儿诺如病毒 基因型年份分布 近年来 NoV 导致的急性胃肠炎散发 暴发 事件在全国乃至世界范围内屡见不鲜 因此 对

56 56 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 其进行地区散发病例监测对于暴发疫情的防治具有重大意义 NoV 基因组全长为 7 400~7 700 bp, 包含 3 个开放阅读框架 (open reading frames, ORF) ORF 编码一种具有 RNA 多聚酶性质的非结构蛋白前体进而参与病毒复制过程 ORF2 编码主要结构蛋白 (VP),ORF3 编码次要结构蛋白 (VP2) [3] 重组和抗原变异是推动 NoV 进化的两个主要机制, 重组主要发生在 ORF/ORF2 重叠区域附近, 而抗原变异主要由衣壳蛋白 (VP) 的氨基酸变异导致, 集中于突出区 (P), 使病毒能够逃避宿主免疫, 同时也导致 NoV 的分子流行病学不断发生变化 [9] 除了对 GII.4 Sydney [P3] 继续加强监测, 同时需密切注意检测 GII.6 [P7] 4 年监测数据表明,208 年 GII.6 [P7] 时隔一年后再次出现, 并呈低频率偶发 由于本研究集中于连续 4 年在兰州大学第一医院就诊的 5 岁以下急性胃肠炎患儿人群, 并不包括本地区社区医院及其他中心医院就诊的同人群, 故不能全面评估及预测整个兰州市 5 岁以下急性胃肠炎患儿 NoV 的感染情况 全面了解并掌握兰州市急性胃肠炎患儿诺如病毒感染情况, 需继续加强对兰州市全覆盖监测以进一步明确 NoV 感染 利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 [] Wang A, Huang Q, Qin L, et al. Epidemiological characteristics of asymptomatic norovirus infection in a population from oyster (ostrea rivularis gould) farms in southern China[J]. Epidemiol Infect, 208, 46(5): DOI: 0.07/ S [2] Chhabra P, de Graaf M, Parra GI, et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes[j]. J Gen Virol, 209, 00(0): DOI: 0.099/jgv [3] Cannon JL, Barclay L, Collins NR, et al. Genetic and epidemiologic trends of norovirus outbreaks in the United States from 203 to 206 demonstrated emergence of novel GII.4 recombinant viruses[j]. J Clin Microbiol, 207, 55(7): DOI: 0.28/JCM [4] Boon D, Mahar JE, Abente EJ, et al. Comparative evolution of GII.3 and GII.4 norovirus over a 3-year period[j]. J Virol, 20, 85(7): DOI: 0.28/JVI [5] Xue L, Cai W, Gao J, et al. The resurgence of the norovirus GII.4 variant associated with sporadic gastroenteritis in the post-gii.7 period in South China, 205 to 207[J]. BMC Infect Dis, 209, 9(): 696. DOI:0.86/s [6] Volpini LPB, Barreira DMPG, Almeida PLDs, et al. An outbreak due to a norovirus GII.Pe-GII.4 Sydney_202 recombinant in neonatal and pediatric intensive care units[j]. J Infect Public Health, 2020, 3(): DOI: 0.06/ j.jiph [7] Tohma K, Lepore CJ, Ford-Siltz LA, et al. Evolutionary dynamics of non-gii genotype 4(GII.4) noroviruses reveal limited and independent diversification of variants[j]. J Gen Virol, 208, 99(8): DOI: 0.099/jgv [8] Lu L, Zhong H, Xu M, et al. Genetic diversity and epidemiology of genogroup II noroviruses in children with acute sporadic gastroenteritis in Shanghai, China, [J]. BMC Infect Dis, 209, 9(): 736. DOI: 0.86/s [9] Lun JH, Hewitt J, Yan GJH, et al. Recombinant GII.P6/GII.4 Sydney 202 was the dominant norovirus identified in Australia and New Zealand in 207[J]. Viruses, 208, 0(0): 548. DOI: /v [0] Shen Z, Qian F, Li Y, et al. Novel norovirus GII.4 variant, Shanghai, China, 202[J]. Emerg Infect Dis, 203, 9(8): DOI: 0.320/eid [] Mabasa VV, Meno KD, Taylor MB, et al. Environmental surveillance for noroviruses in selected South African wastewaters : emergence of the novel GII.7[J]. Food Environ Virol, 208, 0(): DOI: 0.007/s [2] Lu QB, Huang DD, Zhao J, et al. An increasing prevalence of recombinant GII norovirus in pediatric patients with diarrhea during in China[J]. Infect Genet Evol, 205, 3: DOI: 0.06/j.meegid [3] Fu JG, Ai J, Zhang J, et al. Molecular epidemiology of genogroup II norovirus infection among hospitalized children with acute gastroenteritis in Suzhou (Jiangsu, China) from 200 to 203 [J]. J Med Virol, 206, 88(6): DOI: 0.002/ jmv ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 田祎 )

57 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No 年上海市普陀区手足口病病原谱及柯萨奇病毒基因特征分析 监测与流行病学研究 李晓君唐海丰何鑫胡焰顾文超 上海市普陀区疾病预防控制中心微生物检验科 通信作者 : 唐海丰, etang80028@63.com, 电话 : 摘要 目的研究 年上海市普陀区手足口病病原谱, 并对鉴定为柯萨奇病毒 A6 型 (coxsackievirus A6,CVA6) 的 VP 基因特征进行分析, 以掌握本地区 CVA6 的分子流行病学特征 方法采用实时荧光定量 PCR 法对收集的标本进行肠道病毒通用基因和分型基因检测, 对鉴定为 CVA6 型病毒进行 VP 基因测序并分析 结果 年共检测 943 份手足口标本, 肠道病毒通用基因阳性 522 份 (55.36%), 其中 CVA6 阳性 332 份 (63.60%), 柯萨奇病毒 A6 型 (coxsackievirus A6,CVA6) 阳性 0 份 (2.07%), 肠道病毒 7 型 (enterovirus 7,EV7) 阳性 56 份 (0.73%), 柯萨奇病毒 A0 型 (coxsackievirus A0,CVA0) 阳性 份 (2.%), 其他肠道病毒 3 份 (2.49%) 20 株 CVA6 型病毒的 VP 基因之间核苷酸同源性为 92.9%~00.0%, 氨基酸同源性为 98.4%~00.0%, 都属于 D3 亚型 结论 年上海市普陀地区引起手足口病的病原体主要有 CVA6 CVA6 EV7 和 CVA0,CVA6 已成为上海市普陀地区手足口病的主要病原体, 其中优势基因型为 D3 亚型 关键词 手足口病 ; 病原谱 ;CVA6;VP 基因基金项目 : 上海市普陀区科技计划项目 ( 普 KW533) DOI: /cma.j.issn Pathogen spectrum of hand, foot, and mouth disease and genetic characteristics of the VP gene of coxsackievirus A6 in Putuo district of Shanghai, Li Xiaojun, Tang Haifeng, He Xin, Hu Yan, Gu Wenchao Shanghai Putuo Center for Disease Control and Prevention, Shanghai , China Corresponding author: Tang Haifeng, etang80028@63.com, Tel: Abstract Objective To investigate the pathogenic spectrum of hand, foot, and mouth disease in Putuo district of Shanghai from 205 to 208, and to analyze the genetic characteristics of the VP gene of coxsackievirus A6 (CVA6), so as to understand the molecular epidemiological characteristics of CVA6 in this region. Methods Real-time RT-PCR methods were used to detect enteroviruses (EV) and virus genotypes in the collected samples. The VP genes of identified CVA6 were sequenced and analyzed. Results From 205 to 208, 942 specimens of hand, foot, and mouth disease were analyzed among which 522 (55.36%) were EV positive, 332 (63.60%) were coxsackievirus A6, 0 (2.07%) were coxsackievirus A6 (CVA6), 56 (0.73%) were enterovirus 7 (EV7), (2.%) were coxsackievirus A0 (CAV0) and 3 (2.49%) were other enteroviruses. The nucleotide and amino acid sequence similarities of VP gene in 20 CVA6 strains ranged from 92.9% to 00.0% and 98.4% to 00.0%, respectively. All strains belonged to genotype D cluster 3. Conclusions The pathogens causing hand, foot, and mouth disease in Putuo district of Shanghai from 205 to 208 were mainly CVA6, CVA6, EV7 and CVA0. CVA6 was the predominant pathogen of hand, foot, and mouth disease in Putuo district of Shanghai, especially D3 sub-genotype. Key words Hand, foot, and mouth disease; Pathogen spectrum; CVA6; VP gene Fund program: Project for Science and Technology in Putuo District of Shanghai (KW533) DOI: /cma.j.issn

58 58 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 手足口病是由多种肠道病毒引起的丙类传染病, 以 5 岁及以下儿童感染为主, 同一儿童可因感染不同血清型的肠道病毒而多次发病 大多数患者症状轻微, 少数患者可出现重症表现, 个别重症患儿如果病情发展快, 容易导致死亡 可引发手足口病的肠道病毒有 20 多个型别, 肠道病毒 7 型 (enterovirus 7,EV7) 和柯萨奇病毒 A6 型 (coxsackievirus A6,CVA6) 一直被认为是引起手足口病的主要病原体, 近年来柯萨奇病毒 A6 型 (coxsackievirus A6,CVA6) 感染呈现上升趋势, 逐渐取代 EV7 和 CVA6 成为优势型别 [-2] 自 202 年起 CVA6 便持续在上海普陀地区流行, 并成为上海地区手足口病的主要致病原 [3] 为研究本区手足口病的流行趋势和发病特征, 阐明本区手足口病病原构成的动态变化, 掌握 CVA6 的基因特征及其变化规律, 本研究对 年普陀区手足口病病原谱进行分析, 并对引起手足口的主要型别 CVA6 的 VP 基因进行序列测定及基因特征分析, 为该病的预防控制提供依据 材料和方法. 标本来源 采集上海市普陀区 年报告的临床诊断为手足口病病例的咽拭子标本或粪便标本, 诊断依据为 2009 年版手足口病诊疗指南 普陀区中心医院负责采集散发病例标本,0 家社区卫生服务中心负责采集暴发病例标本 标本的采集和运送依据 全国手足口病监测方案 (204 年版 ) 中要求进行, 在患者发病早期 ( 自发病起 3 d 内 ) 且抗生素使用前采集标本并放入病毒采样管中, 所有标本在 4 冷链运输至上海市普陀区疾病预防控制中心微生物实验室, 暂存于 4, 于 -70 长期保存, 以用于病原检测.2 核酸提取 使用罗氏诊断产品有限公司的高通量核酸自动提取仪 (MagNA Pure 96) 和核酸提取试剂盒 (DNA and Viral NA Small Volume Kit) 提取标本核酸, 严格按照仪器使用指南和试剂盒说明书进行操作, 最终得到 00 μl 产物.3 核酸检测 使用肠道通用型 EV7 CVA6 CVA6 CVA0 荧光定量 PCR 检测试剂盒进行检测, 根据 PCR 检测试剂盒说明书对结果进行判读 所用实时荧光定量 PCR 检测试剂盒由江苏硕世生物技术有限公司生产, 所用的 PCR 仪为罗氏诊断产品有限公司的 LightCycler 480 Ⅱ.4 CVA6 VP 基因测序 随机选取 年鉴定为 CVA6 型的 23 个标本进行 VP 基因序列扩增和测定 扩增引物序列由上海伯杰生物科技有限公司设计合成, 利用 TakaRa 公司的 One Step RT-PCR 反应试剂盒进行反转录扩增, 反转录反应条件为 50 下 30 min, 扩增反应条件为 94 下 3 min 预变性, 然后在 s s 72 min 条件下进行 35 个循环, 最后在 72 延伸 0 min PCR 产物通过 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定, 阳性扩增产物进行切胶回收, 然后送至上海伯杰生物科技有限公司进行双向测序.5 CVA6 VP 区序列同源性和系统进化树分析 使用 SeqMan 软件对测序成功的 VP 区正反向序列进行拼接, 使用 DNA Star MegAlign 软件对 VP 区核苷酸序列和其编码的氨基酸同源性进行分析 从 GenBank 下载国内外具有代表性的 CVA6 VP 区序列, 使用 MEGA 软件, 采用邻接法对本研究的 CVA6 及下载的 CVA6 代表株构建系统进化树, 建树的可靠性通过 000 bootstrap 评估 2 结果 年上海市普陀区手足口病病原谱 年共对 943 份手足口标本进行检测, 每年的样本数及检测阳性率见表 4 年共检测出肠道病毒通用阳性标本 522 份 (55.36%,522/943) CVA6 阳性标本 332 份 (63.60%,332/522),CVA6 阳性标本 0 份 (2.07%,0/522),EV7 阳性标本 56 份 (0.73%,56/522), 柯萨奇病毒 A0 型 (coxsackievirus A0,CVA0) 阳性标本 份 (2.%, /522), 其他肠道病毒 3 份 (2.49%,3/522) ( 表 ) 每年均以 CVA6 为主, 其次为 CVA6 和 EV7, 每年各血清型肠道病毒的构成比相似 年上海市普陀区手足口病病原体时间分布 基于 年的监测结果, 以月份为时间进行统计 ( 图 ),CVA6 的阳性检出较多, 除了 205 年 3 月 206 年的 3 6 月 207 年的 4 5 月和 208 年的 3 4 月未检出 CVA6 外, 其他月均有不同程度的检出 CVA6 检出仅次于 CVA6, 每年出现 个流行高峰, 并与 CVA6 交替流行 EV7 的阳性检出较少, 无明显流行高峰 CVA0 在 年仅有个别阳性检出, 但在 208 年阳性检出增多, 且在 208 年 4 月出现 个小高峰

59 国际病毒学杂志 2020 年 2 月第 27 卷第 期 International Journal of Virology, February 2020, Vol. 27, No. 59 表 年上海市普陀区手足口病病原分布 年份 样本数 阳性数 (n,%) CVA6(n,%) CVA6(n,%) EV7(n,%) CVA0(n,%) 其他肠道病毒 (n,%) (50.7) 0(69.66) 24(6.55) 8(2.4) (0.69) (0.69) (58.97) 65(47.0) 44(3.88) 27(9.57) 0(0) 2(.45) (47.66) 33(54.0) 3(2.3) 9(4.75) (.64) 5(8.20) (60.96) 33(74.72) 29(6.29) 2(.2) 9(5.06) 5(2.8) 合计 (55.35) 332(63.6) 0(2.07) 56(0.73) (2.) 3(2.49) 年 - 月 图 年上海市普陀区手足口病病原体时间分布 注 : 表示 年普陀区流行株 SHPT SHPT LC03456-YN-CHN-204 KF SH-CHN-203 KJ74325-FJ-CHN-202 KU70865-HN-CHN-205 KP SHZH-CHN-203 KJ57733-JS-CHN-203 KU70868-HN-CHN-204 LC0347-YN-CHN-204 KJ57740-MJ-CHN-203 SHPT SHPT SHPT KJ84830-TJ-CHN KJ TJ-CHN-203 KP JB-CHN-203 KF GD-CHN-203 KU HN-CHN-203 KJ FJ-CHN-203 KF SH-CHN SHPT SHPT SHPT KU70867-HN-CHN SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT SHPT JQ TW SHPT KM GD-CHN-200 KJ60987-JS-CHN-20 JX4952-SH-CHN-20 KM GD-CHN-200 KJ56349-HN-CHN-202 KJ56352-HN-CHN-202 KC SH-CHN-202 JX SHZH-CHN-20 KJ JS-CHN-202 KF GD-CHN-203 KU22279-SH-CHN-204 KU22274-SH-CHN-204 KU70869-HN-CHN-205 AB64929-JPN-20 JX49549-SH-CHN-20 KC44756-SH-CHN-202 HE FRA-200 HE57293-FRA-200 HE FRA-200 FR ESP FR ESP HE57292-FRA-200 HE FRA-200 FR ESP-2008 HE57290-FRA-200 HE FRA-200 图 2 上海市普陀区 年 CVA6 VP 基因全长系统进化分析 D D3 JQ SD-CHN-2008 JX SHZH-CHN-20 JX5492-SHZH-CHN-200 JX49530-SH-CHN-20 JX49532-SH-CHN-20 JN20357-IND-2007 JQ SD-CHN-996 JQ SD-CHN-992 B AF08297-USA-2003 AY42764-USA Gdula-USA-949 A D2 D 2.3 CVA6 VP 基因序列特征分析 对 年普陀区不同年份的 23 份 (205 年 5 份 206 年 5 份 207 年 6 份 208 年 7 份 ) CVA6 型阳性标本进行 VP 基因测序,20 份测序 成功 经拼接获得 CVA6 型病毒的 VP 基因全长 核苷酸序列, 长度均为 95 bp, 编码 305 个氨基酸 20 株 CVA6 型病毒 VP 基因之间核苷酸同源性为 92.9%~00.0%, 氨基酸同源性为 98.4%~00.0% 根据 Oberste 等 [4] 提出的基于肠道病毒 VP 区序列 的分子生物学定型方法以及借鉴国际上 EV7 的分 型标准,CVA6 分为 A B C D 共 4 个基因型, 其中 D 型又分为 D~D3 3 个亚型 将 年普陀区 20 株 CVA6 与 GenBank 中 CVA6 参考株 进行比对, 采用邻接法构建系统进化树结果显示, 20 株 CVA6 均属于 D3 基因亚型 见图 2 3 讨论 上海市普陀区 年手足口病监测结 果显示,CVA6 取代 CVA6 和 EV7 成为本区引 起手足口病流行的最主要病原体, 每年 CVA6 的 阳性率远高于 CVA6 和 EV7 这与广东 江苏 湖南 湖北等地 [5-8] 近年来的研究结果一致 普陀 地区引起手足口病流行的优势型别 CVA6 CVA6 和 EV7 呈现交替或共同流行状态 长期以来, 对手足口病的研究主要集中在 CVA6 和 EV7,