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暗曳东
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2 从陆地酸性热泉获得的冷冻富集培养物中新型嗜热菌的探索和分离 IF:2.46

3 目录 Contents 第一章第二章第三章第四章 Introduction Materials and methods Results Discussion

4 1Introduction

5 Introduction our results indicate that the last common ancestor of extant life was a thermophile that flourished at a very high temperature. 现存生命的最后一个共同祖先是在极高温度下繁殖的嗜热菌 HT hyperthermophiles (HT)

6 Introduction Taq 聚合酶美国黄石公园里热泉中发现并成功分离嗜热细菌海栖热袍菌 (Thermus aquaticus) Taq 聚合酶是从嗜热细菌海栖热袍菌 (Thermus aquaticus) 中分离出的 DNA 聚合酶

7 Introduction 宏基因组可培养的微生物全部微生物为什呢这么多培养不出来?

8 Introduction 阻碍嗜热菌的生长 : 缓慢的自然生长速率培养基成分引起的抑制群体中其它细胞产生的抗菌物质缺乏群体感应信号所提供的营养物质的过度浓缩专性厌氧或兼性厌氧严格的生长条件 ( 高分压 CO 2 ) 需要两种其它辅助菌株 frozen enrichment cultures (ENFE)

9 2Materials and methods

10 Sampling 采样地点 Ohwaku-dani, Hakone, Japan (35 14'22 'N,139 01'07 E) 样品类型表面沉积物地热通风口下游约 50cm 处的小型热池温度 ph 68 C,pH 1.4 采样时间 2014 年 6 月样品运送将大约 200 ml 样品收集在无菌玻璃瓶中, 并在环境温度下运送到实验室

11 Enrichment culture 三种不同温度 , 0.10, 1.00 % (w/v) 三种不同浓度的 YE Modified Brock s basal salt 四种不同 ph % (w/v) H 2 SO 4 or 1.0 M NaOH 调节 ph (NH 4 ) 2 SO 4 1.3g KH 2 PO g MgSO 4.7H CaC1 2.2H yeast extract 1.0 数字表示所用的富集条件 ( 例如,68_1.4_001 表示富集文化在 68 C,pH 1.4 和存在 0.01%(w / v)ye) 下孵育

12 Enrichment culture 100μL 热泉样品 10ml 各种培养基孵育 1-6 周进行至少四次亚培养离心储存在亚培养后, 将 5mL 处于指数后期的培养物在 15,880 g 和 25 下离心 20 分钟将细胞沉淀储存在 -25 直至 DNA 提取, 并且将 1mL 补充有 10%(v / v) DMSO 的培养物储存在 -80 作为用于分离微生物的接种物

13 Construction of 16S rrna gene clone libraries of the enrichment cultures 将富集的细胞沉淀物重新悬浮在含有 Triton X-100(0.2%,w / v) 的 200μLTE 缓冲液中在 75 持续 5 分钟使用 DNA 提取试剂 Mag DEA DNA 200,DNA 提取机提取 DNA 孵育重悬 DNA 提取 Construction of 16S rrna gene clone libraries S 扩增转化连接 94 3min s s min pt7blue T-vector 30 个循环 Escherichia coli DH5α c 对每个插入的 16S rrna 基因的 5' 区域大约 750bp 进行测序

14 Identification of 16S rrna gene clones and phylogenetic analysis 分离物 :68_1.4_0.1 and 83_6.0_0.01 引物 : A21F U1492R (5 -TTCCGGTTG ATCCYGCCGGA) (5 -GGYTACCTTGTT ACGACTT)

15 3Results

16 Microbial communities of enrichment cultures Table 1 Microbial growth of enrichment cultures and 16S rrna gene

Fig. 1 Microbial community structures of growthobserved enrichment cultures. a Enrichment cultures supplemented with 0.10 % yeast extract, b enrichment cultures supplemented with 0.

17 Fig. 1 Microbial community structures of growthobserved enrichment cultures. a Enrichment cultures supplemented with 0.10 % yeast extract, b enrichment cultures supplemented with 0.01 % (w/v) yeast extract. anumbers indicate the enrichment conditions used (e.g., 53_1.4_01 indicates the enrichment culture incubated at 53, ph 1.4, and in the pres- ence of 0.10 % yeast extract)

18 Acidianus brierleyi (AB) Metallosphaera hakonensis (MH) M. sedula (MS) Sulfolobus shibatae (SS) Sulfurisphaera ohwakuensis (SO) Thermogymnomonas acidicola (TGA) Thermoplasma acidophilum (TPA) Uncultured Sulfolobales I (US-I) Uncultured Sulfolobales II (US-II) Uncultured Sulfolobus I (S-I).

19 Microbial communities of enrichment cultures

20 Isolation of novel archaea detected in the enrichment cultures 68_1.4_0.1 83_6.0_0.01 (US-I) (US-II) (S-I). 68_1.4_0.1 83_6.0_ 倍稀释液 (10ml) 培养 21 天将浑浊培养物再次稀释 1010 倍培养 13 天平板纯化三次 HS-3 HS-1 HS bp 16S rrna S. shibatae (88.6 %) S. acidocaldarius (88.3 %) S. solfataricus (88.3 %) HS bp 16S rrna S. shibatae (96.2 %) S. solfataricus (96.1 %) S. ohwakuensis (92.9 %)

21 Microbial communities of enrichment cultures Fig.2 Neighbor-joining tree of representative clones and novel strains obtained in this study (archaea). Bootstrap values (n = 1000) greater than 50 % are indicated at the nodes. The scale bar indi cate the representative clones and novel strains obtained in this study. Each color indicates clones from enrichment cultures conducted

22 4Discussion

23 Discussion 这些结果表明,ENFE 策略可以使用现有的培养条件恢复以前未培养的微生物使用苛刻的条件可能使我们有机会分离出少量新型微生物, 因为这些条件很少用于分离 53_4.0_01未检测到古细菌 53_1.4_0016S rrna 基因, 但 53_4.0_001) 检测到细菌克隆因此, 如果分离目标是古细菌, 并且孵化温度相对较低 ( 约 50 C), 则应考虑防止富集培养中细菌繁殖的措施, 包括添加抗生素如氨苄西林

24 Discussion 培养环境样品中微生物的一个障碍, 无法预测合适的生长条件在这项研究中, 我们使用了广泛的丰富培养方式, 而不是试图重现自然环境我们假设, 在四次亚培养之后, 如果在浓缩物中检测到以前未培养的微生物, 它们应该能够在相同条件下增殖基于这一假设, 试图从含有以前未培养的微生物的富集物中分离以前未培养的微生物

25 Discussion 据了解, 一些古菌和细菌不能单独分离, 并且需要与特定物种共同培养才能生长在某些情况下, 这些需求可以通过将来自另一物种的废培养基或细胞提取物添加到分离培养基中来实现尽管创新的分离方法在分离先前未培养的微生物方面发挥了战略性作用, 但 ENFE 策略显示出使用常规培养基和技术表征和分离这些微生物的潜力

26 谢谢聆听! T h a n k y o u f o r l i s t e n i n g

第一编总则第一条为保障煤矿安全生产和职工人身安全, 防止煤矿事故, 根据煤炭法矿山安全法和煤矿安全监察条例, 制定本规程第二条在中华人民共和国领域从事煤炭生产和

第一编总则第一条为保障煤矿安全生产和职工人身安全, 防止煤矿事故, 根据煤炭法矿山安全法和煤矿安全监察条例, 制定本规程第二条在中华人民共和国领域从事煤炭生产和煤矿安全规程国家安全生产监督管理局国家煤矿安全监察局第一编总则第一条为保障煤矿安全生产和职工人身安全, 防止煤矿事故, 根据煤炭法矿山安全法和煤矿安全监察条例, 制定本规程第二条在中华人民共和国领域从事煤炭生产

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