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1 第 38 卷第 2 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2016 年 2 月 Vol 38 No 2 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Feb 2016 DOI: /j cnki xdzk 藏药材牛尾蒿中总黄酮提取 1 工艺优化及质量分数测定杨正明 1, 滕云 1, 王景富 1, 李波 1, 刘圆 2 1 西南民族大学化学与环境保护工程学院, 成都 ;2 西南民族大学民族医药研究院, 成都摘要 : 采用紫外分光光度法, 以芦丁为对照品测定牛尾蒿中总黄酮的质量分数. 通过单因素试验考察乙醇体积分数提取时间提取温度和料液比对总黄酮提取率的影响, 并采用 L9(3 4 ) 正交试验优化藏药材牛尾蒿中总黄酮的提取工艺, 测定各样品中总黄酮质量分数. 结果表明 : 最佳提取工艺为乙醇体积分数 20%, 提取温度 90, 提取时间 1 0h, 料液比 1 50(g/mL), 在此条件下, 牛尾蒿中总黄酮提取率为 67 88mg/g; 不同植株部位总黄酮质量分数差异有统计学意义, 以叶中质量分数最高 ; 煅烧成炭后, 总黄酮质量分数明显降低. 优化后的提取工艺合理可行, 可用于牛尾蒿总黄酮的提取 ; 牛尾蒿炭 ( 闷煅 ) 工艺的科学性和必要性有待进一步综合评价. 关键词 : 牛尾蒿 ; 牛尾蒿炭 ; 总黄酮 ; 正交试验 ; 提取工艺中图分类号 :R931 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) 藏药材牛尾蒿为菊科植物牛尾蒿 Artemisiasubdigitata Matf 的干燥地上部分, 是藏药普尔芒类药材来源之一, 被藏族人民视为止咳祛痰圣药 [1-3], 具有止咳平喘祛痰抗炎抗菌抗病毒杀虫抗疟疾 [4-5] 抗肿瘤抗氧化性和保肝等作用. 普尔芒可以直接研磨药用煎膏药用或煅灰 ( 明煅和闷煅 ) 药用, 常配方用药 : 煎膏或直接入药常用于清热解毒消炎以及瘟疫等症 ; 煅灰常用于虫病疮疖止血干脓水或黄 [6-7] 水等症. 牛尾蒿全草主要有效成分为挥发油黄酮香豆素单萜类倍半萜类三萜类苯丙素类酚 [8-9] 类皂苷鞣质蛋白质糖类油脂等化学成分. 作为许多传统药材中的有效成分, 黄酮类化合物具 [10-11] 有抗氧化抗衰老抗炎镇痛免疫调节降血脂抗肿瘤抗辐射等药理作用. 本试验以总黄酮提取率为考察指标, 在单因素试验的基础上, 采用正交试验优选牛尾蒿中总黄酮的回流提取工艺, 并测定牛尾蒿和牛尾蒿炭 ( 闷煅 ) 中总黄酮的质量分数, 以期为藏药材牛尾蒿的进一步开发研究及牛尾蒿和牛尾蒿炭的化学成分差异的研究奠定基础. 1 材料与方法 1 1 仪器与材料 TUG1950 型双光束紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器有限责任公司 ;ESJ200G4 电子天平, 沈阳龙腾电子有限公司. 牛尾蒿 ( 炭 ) 药材分别于 2013 年 7 月 3 日采自于四川省阿坝州松潘县水晶乡川盘村 ( 川主寺药泉山庄, 海拔 3300m),2014 年 7 月 9 日购于四川省阿坝藏族羌族自治州藏医院, 所有样品均经西 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 西南民族大学研究生创新型科研项目 (CX2015SZ061). 作者简介 : 杨正明 (1990 ), 男, 云南丽江人, 硕士研究生, 主要从事少数民族药物的研究. 通信作者 : 刘圆, 博士, 教授.

2 2 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb swu edu cn 第 38 卷南民族大学刘圆教授鉴定为菊科植物牛尾蒿 A subdigitata Matf, 粉碎, 过 3 号筛, 备用 ; 芦丁对照品 ( 批号 :100080G201408), 中国食品药品检定研究院 ; 水为纯净水 ; 试剂均为分析纯溶液试验方法对照品溶液的制备精密称取 7 8mg 的芦丁对照品, 用 70% 乙醇定容至 50mL, 摇匀, 即得 0 156mg/mL 的芦丁对照品供试品溶液的制备取 0 5g 牛尾蒿药材粉末 ( 注 : 单因素和正交试验所用药材均为采于川主寺药泉山庄的牛尾蒿地上部分 ), 精密称定, 在设定的试验条件下按一定的乙醇体积分数提取温度提取时间和料液比提取, 过滤, 并用少量提取液洗涤, 定容至 50mL 容量瓶中, 摇匀, 即得牛尾蒿总黄酮供试液 [12] 标准曲线的绘制精确量取 1 4,1 8,2 2,2 6,3 0,3 4,3 8 ml 芦丁对照品溶液, 置于 10 ml 比色管中, 分别加入 0 4mL 的 5% 亚硝酸钠溶液, 摇匀, 放置 6min 加入 0 4mL 的 10% 硝酸铝溶液, 摇匀,6min 后加入 5mL 4% 的氢氧化钠溶液, 并用水定容至刻度, 摇匀, 放置 15min. 以试剂空白作参比, 于 510nm 处测定其吸光度, 以芦丁质量浓度 (C) 为横坐标, 吸光度 (A) 为纵坐标, 绘制标准曲线, 得到线性回归方程 : A =11 407C 其线性相关系数为 R 2 =0 9992, 结果表明芦丁对照品溶液在 21 84~59 28μg/mL 线性关系良好. 2 结果与分析方法学考察精密度试验精密量取 6 份项下对照品溶液 2mL, 按项下方法显色, 于 510nm 处测定 A, 计算相对标准偏差 (RSD) 为 0 85%, 表明仪器精密度好重复性试验取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 按项下方法制备供试品溶液, 按项下方法于 510nm 处测定 A, 计算 RSD 为 0 56%, 表明本方法重复性较好稳定性试验取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 按项下方法制备供试品溶液, 按项下方法显色, 每隔 15min(n=6) 测定 1 次,RSD 为 1 12%, 表明在 90min 内稳定性良好加样回收率试验取 6 份 0 05g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 加入适量的芦丁对照品溶液, 按项下方法制备供试品溶液, 按项下方法显色, 于 510nm 处测定 A, 计算平均回收率为 98 53%,RSD 为 1 86%, 表明该方法准确可靠单因素试验考察乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 分别加入体积分数为 10% ~60% 的乙醇水溶液 15 ml, 70 水浴加热 1 5h, 提取 1 次. 过滤, 用少量提取液洗涤, 滤液定容至 50 ml 容量瓶中, 取 0 8 ml 于 10mL 具塞比色管中, 按项下方法显色测定, 计算总黄酮提取率, 结果如图 1 所示. 由图 1 可知, 乙醇体积分数为 30% 时, 总黄酮提取率最高. 随着乙醇体积分数的增加, 产生较大的渗透压, 一些醇溶性杂 [13-14] 质色素等成分溶出增多, 导致黄酮类化合物提取率下降提取时间对总黄酮提取率的影响取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 加入 30% 的乙醇 15mL,70 水浴分别加热 0 5,1 0,1 5,

3 第 2 期杨正明, 等 : 藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定 3 2 0,2 5,3 0h, 提取 1 次. 过滤, 用少量提取液洗涤, 滤液定容至 50 ml 容量瓶中, 取 0 8 ml 于 10 ml 具塞比色管中, 按项下方法显色测定, 计算总黄酮提取率, 结果如图 2 所示. 由图 2 可知, 提取时间为 1h 时, 总黄酮提取率最高. 随着提取时间的延长, 未溶出的总黄酮量已经很少, 其他杂质可能会增多, [15] 从而导致提取率的降低. 图 1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响图 2 提取时间对总黄酮提取率的影响提取温度对总黄酮提取率的影响取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 加入 30% 的乙醇 15 ml, 分别于 40~90 下水浴加热 1 0h, 提取 1 次. 过滤, 用少量提取液洗涤, 滤液定容至 50mL 容量瓶中, 取 0 8 ml 于 10 ml 具塞比色管中, 按项下方法显色测定, 计算总黄酮提取率, 结果如图 3 所示. 由图 3 可知, 提取温度为 80 时, 总黄酮提取率最高. 随着提取温度的升高, 加快了分子的扩散能力, 总黄酮的提取率增大, 当达到一定温度时, 总黄酮提取率达到最大, 但继续升高温度, 提取率反而下降, 这可能是因为高温引起了黄酮类物 [13,16] 质结构的变化, 亦或是温度达到溶剂沸点以后, 造成溶剂的损失, 总黄酮得率降低料液比对总黄酮提取率的影响取 6 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 加入的料液比为 20~70 倍量的 30% 乙醇,80 水浴加热 1 0h, 提取 1 次. 过滤, 用少量提取液洗涤, 滤液定容至 50mL 容量瓶中, 取 0 8 ml 于 10 ml 具塞比色管中, 按项下方法显色测定, 计算总黄酮提取率, 结果如图 4 所示. 料液比较低时, 牛尾蒿药材得不到完全浸润, 使得黄酮不能很好地溶出 ; 当料液比为 1 40(g/mL) 时, 总黄酮提取率达到最大, 随着料液 [17] 比的继续增加, 总黄酮提取率反而降低, 可能是某些脂溶性杂质的溶出量增加, 干扰因素增多所致. 图 3 提取温度对总黄酮提取率的影响图 4 料液比对总黄酮提取率的影响 2 3 正交试验根据单因素试验的结果, 选取影响牛尾蒿总黄酮质量分数的 4 个因素 : 乙醇体积分数 (A), 提取时间 (B), 提取温度 (C), 料液比 (D) 作为考察因素, 因素水平安排见表 1. 每个因素设定 3 个水平, 按 L9(3 4 ) 表设计试验, 并计算总黄酮质量分数. 试验结果见表 2, 方差分析见表 3.

4 4 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb swu edu cn 第 38 卷表 1 因素水平表水平因乙醇体积分数 A/% 提取温度 B/ 提取时间 C/h 料液比 D/(g ml -1 ) 素表 2 正交试验设计和结果试验号 A B C D 总黄酮得率 /(mg g -1 ) K K K R 表 3 方差分析结果方差来源 SS df MS F p 校正模型截距 B <0 01 C <0 05 D <0 01 A( 误差 ) 总计校正的总计注 :F0 01(1,2)=99,F0 05(1,2)=19. 由表 3 数据分析可知 : 各因素的影响程度依次为料液比, 提取温度, 提取时间, 乙醇体积分数. 乙醇体积分数对牛尾蒿总黄酮的提取率影响最小, 所以将其作为误差进行方差分析, 提取温度和料液比各水平间差异有统计学意义 (p<0 01), 提取时间各水平间差异有统计学意义 (p<0 05). 结合直观分析结果, 最佳提取工艺为 A1B3C1D3, 即乙醇体积分数 20%, 提取温度 90, 提取时间 1 0h, 料液比 1 50 (g/ml). 2 4 验证试验取 3 份 0 5g 牛尾蒿药材粉末, 精密称定, 采用上述优化条件进行提取, 并计算总黄酮提取率. 结果显示, 总黄酮平均提取率为 67 88mg/g,RSD=0 58%(n=3), 表明该提取工艺稳定可行. 2 5 各样品中总黄酮质量分数测定牛尾蒿各样品中总黄酮质量分数测定结果如表 4 所示. 由表 4 可知, 牛尾蒿不同植株部位总黄酮质量

5 第 2 期杨正明, 等 : 藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定 5 分数差异有统计学意义, 以叶中质量分数为最高, 可达 ±2 20mg/g; 煅烧成炭后, 总黄酮质量分数明显降低. 表 4 各样品中黄酮质量分数测定结果 (x±s,n=3) 样品编号产地 ( 来源 ) 药材不同部位总黄酮质量分数 /(mg g -1 ) S1 阿坝州川主寺药泉山庄牛尾蒿茎 12 77±0 19 S2 叶 ±1 50 S3 地上部分 67 88±0 39 S4 阿坝州藏医院牛尾蒿茎 24 79±0 65 S5 叶 ±2 20 S6 地上部分 87 10±2 71 S7 阿坝州藏医院牛尾蒿炭茎 2 94±0 09 S8 地上部分 10 78± 结论黄酮类化合物与铝盐络合后会产生特征吸收, 本试验采用铝盐络合比色法, 方法学考察结果表明该方法合理准确. 各样品中总黄酮质量分数测定结果表明 : 叶中总黄酮质量分数较高于茎 ; 牛尾蒿烧炭后, 总黄酮质量分数明显降低, 可能是因为高温炭化引起黄酮类物质结构发生变化, 破坏了黄酮物质, 使总黄酮 [13,18] 的质量分数降低, 藏医临床煅烧前后化学成分的变化有待进一步试验研究, 因此, 牛尾蒿炭 ( 闷煅 ) 工艺的科学性和必要性有待进一步综合评价. 参考文献 : [1] 李衍文, 黄云晖, 黄月中, 等. 汉拉英中草药名称辞典 [M]. 广州 : 广东科技出版社,1998:224. [2] 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志 [M]. 青海 : 青海人民出版社,1991: [3] 向佳. 藏药天下第一蒿实现工业化生产 [N]. 中国中医药报, (1). [4] 刘小珍. 藏药牛尾蒿和臭蒿的质量标准及有效成分提取工艺研究 [D]. 成都 : 西南交通大学,2014. [5] 黄正胜. 药用植物牛尾蒿和鸡肉参的化学成分研究 [D]. 沈阳 : 沈阳药科大学,2009. [6] 登巴达吉. 略论藏药普尔芒的识别及应用 [J]. 中国藏学,2014(2): [7] 土旦次仁. 中国医学百科全书藏医学 [M]. 上海 : 上海科学技术出版社,1999. [8] CHUSS,LIUZL,DUSS,etal.ChemicalCompositionandInsecticidalActivityAgainstSitophiluszeamaisoftheEsG sentialoilsderivedfrom ArtemisiagiraldiandArtemisiasubdigitata [J].Molecules,2012,17(6): [9] 陈伟民. 青海几种蒿属植物挥发油的化学成分及其药性与用途 [J]. 青海科技,2004,11(4):7-9. [10] 方一杰, 徐岩成, 安毛毛, 等. 黄酮类化合物的药动学和药理作用研究进展 [J]. 药学服务与研究,2015,15(1):6-9. [11] 黄河胜, 马传庚, 陈志武. 黄酮类化合物药理作用研究进展 [J]. 中国中药杂志,2000,25(10): [12] 邓泽丽,OH YJ, 李洪军, 等. 响应面分析法优化超声辅助提取山楂中总黄酮的工艺 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ),2014,36(8): [13] 刘艳清, 汪洪武, 蔡璇, 等. 响应面法优化栀子总黄酮提取工艺研究 [J]. 中药材,2014,37(2): [14] 陈志伟, 陈坤, 胡银川, 等. 响应面法对苦丁茶总黄酮提取工艺的优化 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ),2012, 34(5): [15] 吴萍萍, 赖曼萍, 尹艳艳, 等. 响应面法优化山稔叶总黄酮提取工艺的研究 [J]. 食品工业科技,2014,35(4): ,233. [16] 卞京军, 程密密, 刘世尧, 等. 皱皮木瓜皮渣齐墩果酸熊果酸和总黄酮连续提取工艺研究 [J]. 西南大学学报 ( 自然科学版 ),2015,37(3): [17] 罗艳, 苏志恒, 蒋艳萍. 六堡茶中总黄酮的提取工艺研究 [J]. 食品工业,2014,35(1):

6 6 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb swu edu cn 第 38 卷 [18] 郭辉, 罗宇倩, 章华伟, 等. 响应面法优化超声波辅助提取荷叶黄酮工艺研究 [J]. 中国食品学报,2011,11(1): OptimizationoftheExtractionTechnologyforTotalFlavonoids fromthetibetan MedicineArtemisiasubdigitata Matf anddeterminationoftheircontent YANGZhengGming 1, TENG Yun 1, WANGJingGfu 1, LI Bo 1, LIU Yuan 2 1 SchoolofChemistryandEnvironmentalProtectionEngineering, SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China; 2 EthnicMedicineInstitute,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China Abstract:UltravioletspectrophotometrywasemployedtodeterminethetotalflavonoidsinArtemisiasubG digitata Matf,withrutinasthecontrol.Theefectsofethanolconcentration (v/v),extractiontime, extractiontemperatureandratioofsolidtoliquidontheextractionrateoftotalflavonoidswereevaluated insinglegfactorexperiments,andanl9(3 4 )orthogonaltestwasusedtooptimizetheextractiontechnology. Theresultsshowedthattheoptimumextractionconditionswere20% ethanol,extractiontemperature90,extractiontime60min,ratioofsolidtoliquid1 50(g/mL),andtheaverageextractionyieldoftotal flavonoidswas67 88mg/gundertheoptimumconditions.Thecontentoftotalflavoniodsshowedalarge diferenceindiferentplantparts,beingthehighestintheleaves,andtotalflavoniodscontentdecreased significantlyaftercarbonization.thisoptimizedextractiontechnologyprovedtobereasonableandfeasible andis,therefore,recommendedforuseintheextractionoftotalflavonoidsina subdigitata.whether theprocessofcarbonizinga subdigitataisnecessaryandsciencegbasedistobefurtherevaluated. Keywords:Artemisiasubdigitata Matf ;carbonizedartemisiasubdigitata Matf;totalflavonoids;orG thogonaltest;extractiontechnology 责任编辑周仁惠

7 第 2 期杨正明, 等 : 藏药材牛尾蒿中总黄酮提取工艺优化及质量分数测定 7

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖