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菘吉
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1 使用安捷倫 Poroshell 12 管柱獲得最佳效能使用串聯管柱技術, 便能在分鐘內, 得到個理論板數應用註解食品環境化學藥品作者 Angelika Gratzfeld-Hüsgen Edgar Naegele Agilent Technologies Waldbronn, Germany 摘要採用表面多孔性顆粒技術充填的管柱, 為 2 µm 以下顆粒充填管柱的替代選擇這些管柱搭配使用安捷倫 129 無限系列 (Infinity) LC 系統, 便能產生高效率的分離效果安捷倫 Poroshell 12 管柱提供 : 低背壓高效率相同的管柱容量緒論由小於 2 µm 粒子充填的管柱, 效率相當可觀, 因而在最近引起各界注意在高於 van Deemter 方程式計算的流速下, 仍能使用這種管柱相較於以最佳流速使用的效率, 在這種較高流速下的使用效率, 減損程度非常小, 但分離時間與循環時間卻得以縮短, 更快獲得結果只是此類管柱的缺點在於背壓明顯較高, 畢竟其充填粒子較小許多情況下,LC 儀必須能承受 >4 bar 的背壓, 尤其使用 2 µm 以下顆粒充填的長管柱更應注意背壓過高表面多孔性粒子技術, 能大幅減低背壓, 成為極高分離率分析的替代方案 1 此類管柱的效率, 僅微微低於 2 µm 以下顆粒充填的管柱, 加上背壓較低, 可串聯管柱, 大幅增加了理論板數

2 應用手冊顯示, 串聯 3 個長型安捷倫 Poroshell 12 管柱, 可將效率提升得極高應用手冊也顯示, 背壓可保持低於 4 bar, 除非使用特殊的 LC 儀器, 否則一般 LC 系統皆可以達到要求如此一來, 便能採用較高的流速, 以節省分析和平衡的時間最後則比較 2.7 µm 表面多孔性顆粒充填的管柱, 與 2 µm 以下粒子充填的管柱實驗實驗加上多孔性外殼, 對於質量傳遞的阻力也較小, 升高流速也不會減損效率 1,2 設定系統以下實驗評估安捷倫 Poroshell 12 管柱的效能所有管柱的內徑均為 4.6 mm, 長度為 mm 評估以 1. ml/ 分的流速沖提時, 單一管柱的理論板數評估以 1. ml/ 分的流速沖提時, 串聯 3 個管柱的理論板數以等位沖提及梯度沖提精確測量滯留時間比較以表面多孔性顆粒充填的管柱, 與 2 µm 以下顆粒充填的管柱管柱效率 ( 理論板數 ) 一般以等位沖提方式測量使用下列方程式, 計算對稱波峰的理論板數 (N): N =.4 (RT/W) 2 其中 RT 為滯留時間,W 為半波峰寬實驗中使用安捷倫 129 無限系列評估以更高的流速沖提時, 串聯 3 個管 (Infinity) LC 系統, 其內建一個二元幫浦柱的理論板數一部自動注射器一個恆溫管柱室, 及一部光二極體陣列偵測器偵測器, 其中偵測器配有 mm 光徑液槽使用 4.6 mm mm 1.8 µm 的安捷倫 ZORBAX 快速分離 HT 管柱, 及 4.6 mm mm 2.7 µm 的 Poroshell 12 管柱, 兩種管柱均能承受最多 6 bar k Acetophenone Benzene Toluene 的壓力使用 ChemStation B.4.2 版軟體結果及討論表面多孔性顆粒充填管柱潛在的優勢表面多孔性粒子充填管柱技術, 採用以多孔性外殼包覆實心核的顆粒這類粒子內為 1.7 µm 的實心核, 外層包覆. µm 的多孔性矽膠外層, 整個粒徑的大小約為 2.7 µm, 可減少 4-% 的背壓, 效率則為 2 µm 以下全多孔性顆粒的 8 9% 表面多孔性顆粒的粒子大小分佈範圍, 較全多孔性粒子窄, 因此管柱充填得較均質, 減少了管柱內的擴散現象此外, 粒徑小管柱 : 安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱, mm 4.6 mm 2.7 µm Thiourea Acetophenone Benzene Toluene 移動相 : 水 :ACN = 3:7 流速 : 1. ml/ 分鐘管柱溫度 : C 偵測器 : 光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm, 參考標準 (Ref) 36/ nm, 2 Hz, 標準液槽圖 1 層析圖, 評估 mm 4.6 mm 安捷倫 Poroshell 12 管柱的理論板數 (N) 2

3 評估單一管柱的理論板數使用下列化合物評估單一管柱的理論板數 :uracil acetophenone benzene toluene 獲得的層析圖及計算而得的理論板數, 列於圖 1 在規定的層析條件下,toluene 的理論板數約為 3 個 / 管柱評估串聯 3 個管柱的理論板數單一管柱的理論板數約為 3 個, 預計 3 個管柱串聯後的理論板數約為個以 9 mm.12 mm 的不鏽鋼毛細管串聯管柱, 並以不同流速測量理論板數測得的層析圖列於圖 2 若使用 4 bar 的 LC 系統, 施予 1 ml/ 分的流速, 可測得約 8 個理論板數, 不過此 LC 系統最高可承受 12 bar 的壓力, 因此流速和效率仍能再提高以 1. ml/ 分的流速沖提, 測得的理論板數約為 3 個, 極為接近預測值 Toluene 在流速 1.8 ml/ 分時, 測得最佳理論板數個, 滯留時間 < 分鐘 ( 表 1) ml N bar 圖 2 2 張層析圖, 以不同流速評估串聯 3 個 mm 4.6 mm 安捷倫 Poroshell 12 管柱的理論板數 1. ml N bar ml N 4 73 bar Thiourea Acetophenone Benzene Toluene 管柱 : 串聯 3 個 mm 4.6 mm 2.7 µm 的安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱移動相 : 水 :ACN = 2:8 流速 : ml/ 分管柱溫度 : 6 C 偵測器 : 光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm, 參考標準 (Ref) 36/ nm, 2 Hz, 標準液槽化合物理論板數 k Acetophenone Benzene Toluene 表 1 流速 1.8 ml/ 分的理論板數 3

4 若要提高 k 值, 則串聯 3 個管柱流速為 1.2 ml/ 分 ( 圖 3) 以等位沖提的滯留時間精確度以 1. ml/ 分的流速進行等位沖提的滯留時間精確度結果顯示於圖 4, 並重疊連續沖提 6 次的結果除了 uracil 之外, 滯留時間精確度的相對標準偏差 (RSD) 均 <.34%, 其積分面積精確度的相對標準偏差 (RSD) 均 <.66% bar N= k = N= k = N= 7239 k = Thiourea + 測試9 種化合物一組, 濃度各為 ng/ul, 溶於 ACN (6/3) 1. Acetanilide,2. Acetophenone,3. Propiophenone, 4. Butyrophenone (2 ng/µl),. Benzophenone,6. Valerophenone, 7. Hexanophenone,8. Heptanophenone,9. Octanophenone 管柱 : 串聯 3 個 mm 4.6 mm 2.7 µm 的安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱移動相 : ACN/ 水 = 6/4 管柱溫度 : 6 C 流速 : 偵測器 : 1.2 ml/ 分鐘光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm,ref 36/ nm,2 Hz, 標準液槽圖 3 串聯 3 個管柱, 在壓力 28 bar 及流速 1.2 ml/ 分下, 以較高的 k 值得到的理論板數 n = 6 RT RSD (%) RSD (%) Uracil Acetophenone Benzene.22.3 Touene Uracil Acetophenone Benzene Toluene 管柱 : 串聯 3 個 mm 4.6 mm 2.7 µm 的安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱移動相 : 水 :ACN = 2:8 流速 : 1. ml/ 分鐘管柱溫度 : 6 C 偵測器 : 光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm, 參考標準 (Ref) 36/ nm, 2 Hz, 標準液槽圖 4 連續等位沖提 6 次疊圖的結果, 及滯留時間與積分面積的精確數據 4

5 以梯度沖提時滯留時間與積分面積的精確度以 3% 到 9%ACN 分鐘梯度沖提, 精確度結果顯示於圖, 並重疊連續沖提 6 次的結果除了 Thiourea 之外, 所有化合物均有極佳的滯留時間精確度 (RSD <.4%) ( 圖 ); 注入 1-µL 後, 所有化合物的積分面積, RSD 均小於.38% n = 6 (%) (%) Thiourea Thiourea + 測試9 種化合物一組, 濃度各為 ng/µl, 溶於水 / ACN (6/3) 1. Acetanilide,2. Acetophenone,3. Propiophenone,4. Butyrophenone (2 ng/µl),benzophenone,6. Valerophenone,7. Hexanophenone, 8. Heptanophenone,9. Octanophenone 管柱 : 安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱, mm 4.6 mm 2.7 µm 移動相 : 水加上 ACN 梯度沖提 : 流速 : 1. ml/ 分鐘第分鐘為 3% ACN, 第分鐘為 9% ACN 管柱溫度 : 6 C 偵測器 : 光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm,ref 4/ nm,2 Hz, 標準液槽圖重疊連續梯度沖提次的結果, 及滯留時間與積分面積的精確度數據

6 比較以表面多孔性顆粒充填的管柱, 與 2 µm 以下顆粒充填管柱峰容量以表面多孔性顆填充管柱與 2 µm 以下顆粒填充管柱 ( 皆為內徑 mm 4.6 mm 長的管柱 ) 分析一組種化合物的結果, 說明其差異 ( 圖 6) 安捷倫 Poroshell 12 管柱的沖提時間較短, 波峰寬度較小, 因此表面多孔性顆粒充填的管柱, 峰容量較大安捷倫 Poroshell 12 管柱的峰容量為 133, 高於 2 µm 以下顆粒填充管柱的 1, 表示在此條件下, 安捷倫 Poroshell 12 管柱的效率, 高於 2 µm 以下顆粒填充管柱 3% ZORBAX RRHT SB-C18 mm 4.6 mm 1.8 µm PW sigma =.1 = 1 = 296 bar Poroshell 12 SB-C18 mm 4.6 mm 2.7 µm PW sigma = 76 = % = 226 bar 管柱 : 移動相 : 梯度沖提 : Thiourea + 測試9 種化合物一組, 濃度各為 ng/µl, 溶於水 /ACN (6/3) 1. Acetanilide,2. Acetophenone,3. Propiophenone, 4. Butyrophenone (2 ng/µl),benzophenone, 6. Valerophenone,7. Hexanophenone,8. Heptanophenone, 9. Octanophenone 安捷倫 ZORBAX RRHT SB-C18 管柱, mm 4.6 mm 1.8 µm; 安捷倫 Poroshell 12 SB-C18, mm 4.6 mm 2.7 µm 水加上 ACN 流速 : 1. ml/ 分鐘第分鐘為 3% ACN, 第分鐘為 9% ACN 管柱溫度 : 6 C 偵測器 : 光二極體陣列偵測器 (DAD) 24 nm/ nm,ref 4/ nm,2 Hz, 標準液槽圖 6 以表面多孔性顆粒充填管柱, 及 2 µm 以下粒子充填管柱, 分析苯酮類混合物的層析圖 6

7 體積容量比較注入濃度極高的樣品, 測試表面多孔性顆粒充填管柱的體積容量, 是否與 1.8 µm 顆粒充填管柱相同注入 µl 的樣品, 其濃度約為 2 µg/ µl( 圖 7) 以指定條件沖提, 主波峰並無顯著差異, 但 Poroshell 12 管柱的主波峰較快沖提出來, 因此波寬較窄些 Poroshell 12 管柱的波寬一般較窄比較訊號 - 雜訊 (S/N) 比分析藥品中的雜質, 以評估訊號 - 雜訊 (S/N) 比雜質含量約為.2.3% 層析條件列於圖 ZORBAX RRHT SB-C18 mm x 4.6 mm 1.8 µm PW1/2 =.792 Poroshell 12 SB-C18 mm 4.6 mm 2.7 µm PW1/2 sigma = 測試 Tramadol 2,22 ml/ml, 含雜質, 管柱 : 安捷倫 Poroshell 12 SB-C18 管柱, mm 4.6 mm 2.7 µm 安捷倫 ZORBAX RRHT SB-C18 管柱, mm 4.6 mm 1.8 µm 幫浦 : 溶劑 A: 水 +.2 % TFA, 溶劑 B:ACN +.16% TFA 梯度沖提 : 分鐘內自 17% B 調高至 4% B, 第 7 分鐘停止調整, 駐留時間 3 分鐘流速 : 1. ml/ 分鐘自動注射器注入量 : µl 沖洗時間 : 秒恆溫管柱室溫度 : 3 C 光二極體陣列偵測器 (DAD):129 27/ nm,ref. 36/ nm,2 Hz, mm 光徑的標準流動液槽圖 7 比較表面多孔性顆粒充填管柱, 與 2 µm 以下粒子充填管柱的容積, 注入量為 µl = 2 µg 7

8 圖 8 重疊整個層析圖 ; 紅線為 Poroshell 12 管柱的層析圖, 黑線為 2 µm 以下顆粒充填管柱的層析圖兩種管柱的訊號 - 雜訊比 (S/N) 計算值, 一併列於表 2 雜質 1 及雜質 2 皆以 Poroshell 12 管柱及 2 µm 以下顆粒充填的管柱分析結論表面多孔性顆粒充填的管柱, 確實能替代 2 µm 以下粒子充填的管柱, 加上背壓低, 因此能以 1 ml/ 分的流速, 沖提 4.6 mm x mm 2.7 µm 的管柱, 而壓力卻不過超過 4 bar 的上限此例的理論板數可達 3 個, 每公尺甚致超過 23 個板數串聯 3 個 4.6 mm mm 的管柱後, 沖提分鐘的理論板數可達個, 而壓力並未超過 6 bar 的上限安捷倫 Poroshell 12 管柱進行等位沖提及梯度沖提分析時具有極佳精確度 _ _ 圖 8 比較訊號 - 雜訊比 (S/N), 紅線為多孔性外層粒子充填管柱, 黑線為 1.8 µm 粒子充填管柱有使用 TFA 調整波峰 Poroshell 12 管柱的 1.8 µm 訊號 - 雜訊比 (S/N) 管柱的 S/N 表 2 比較表面多孔性顆粒充填管柱, 及 1.8 µm 顆粒充填管柱的訊號 - 雜訊比在相同的層析條件下, 安捷倫 Poroshell 12 管柱的沖提時間, 通常少於類似的 2 µm 以下顆粒結合相沖提時間越短, 波峰寬度越小, 峰容量越大參考資料 1. J. M. Cunliffe T. D. Maloney 替代 2 µm 以下粒子的熔融核顆粒技術, 達到高分離效率及低背壓的效果 (Fusedcore particle technology as an alternative to sub-2-µm particles to achieve high separation efficiency with low back pressure) 分離科學期刊 (J. Sep. Sci.), 3, 年 2. F. Griiti A. Cavazzini N. Marchetti G. Guiochon 針對鍵結 C18 鏈的全多孔與部分多孔性顆粒充填的矽膠管柱, 比較其效率 (Comparison between the efficiencies of columns packed with fully and partially porous C18-bonded silica materials) 層析法期刊 A (Journal of Chromatography A) 17, ,27 年安捷倫科技公司,2 年 2 年月 1 日出版號碼 99-62CHTW

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CHTW.indd HPLC HPLC UHPLC Poroshell 12 The Mea sure of Confidence Poroshell 12 (LC) (LC/MS) Poroshell 12 HPLC 6 12 UHPLC Poroshell 3 Poroshell 12 2 µm % HPLC UHPLC ph 6-7 Poroshell 12 2 µm Poroshell 12 Poroshell