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1 第 33 卷第 5 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2011 年 5 月 Vol.33 No.5 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) May 2011 文章编号 : (2011) 蝎子草醇提浸膏对 1 金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究江震献 1, 彭霞 1, 张晓林 1, 朱玲 1, 李海霞 1, 陈章宝 1,2 1. 西南大学药学院, 重庆 ;2. 重庆市兽药工程技术研究中心, 重庆摘要 : 目的 : 研究蝎子草醇提浸膏 (Girardiniasuborbiculata C.J. Chenethanolextract,GSEE) 对金黄色葡萄球菌的抗菌机制. 方法 : 测定蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度 (MIC), 通过 GSEE 对菌体生长曲线菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸合成等的影响来对 GSEE 的抗菌机制进行研究. 结果 :GSEE 对金黄色葡萄球菌的 MIC 为 100mg/mL, 可明显抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂 ;SDS-PAGE 电泳表明, 金黄色葡萄球菌的可溶性蛋白含量在 GSEE 作用后的条带明显少于对照组 ; 同时, 通过 DAPI 染色显示,GSEE 对菌体的核酸合成具有显著抑制作用. 结论 :GSEE 对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌作用, 其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长. 关键词 : 蝎子草 ; 抗菌机制 ; 抗菌活性中图分类号 :R285.5;Q93 文献标志码 :A 蝎子草 (Girardiniasuborbiculata), 为荨麻科 (Urticaceae) 一年生多年生草本或半灌木植物. 蝎子草, 别名红藿毛草火麻草, 是民间常用药荨麻的主要来源之一. 其味苦辛, 性凉, 有小毒 ; 全草祛风除痰利湿解毒利气消痰, 治小儿惊风中风不语. 目前对蝎子草的研究主要集中在抗炎 [1-2] 抗风湿 [3] [1-2] 镇静作用的研究, 但对其抗菌机制方面的报道较少, 本研究主要从菌体生长曲线菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合成对 GSEE 的抗菌机制进行探讨, 为深度开发蝎子草的利用提供基础资料. 1 材料 1.1 蝎子草采自重庆, 经鉴定确认品种为荨麻科蝎子草属植物蝎子草 (Girardiniasuborbiculata C.J. Chen). 1.2 菌种金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, 菌种号 :CMCC26003), 菌种购于国家医学菌种保藏管理中心. 1.3 试剂 4,6 二脒基 2 苯基吲哚 (DAPI)( 重庆奥哲科技有限公司 ); 其余试剂均为分析纯. 1 收稿日期 : 基金项目 : 重庆市科委重点攻关资助项目 (CSTC;2009AB1181). 作者简介 : 江震献 (1986 ), 男, 福建永定人, 硕士研究生, 主要从事微生物与生化药学. 通信作者 : 陈章宝, 副教授, 硕士生导师.

2 第 5 期江震献, 等 : 蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究培养基肉汤液体培养基 : 蛋白胨 10g, 牛肉膏 5g, 氯化钠 5g, 定容至 1000mL,121 灭菌 30min. 肉汤固体培养基 : 肉汤液体培养基中加入 2% 的琼脂粉. 1.5 主要仪器 RE-2000 旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂 ; 高速台式冷冻离心机,SIGMA3K15;SW-CJ-1D 型超净工作台, 苏州净化 ;LDZX-50FBS 高压灭菌锅, 上海申安医疗器械厂 ;DYCZ-24DN 型电泳仪, 北京市六一仪器厂 ;F-4500 荧光分光光度计, 日本 HITACHI;FA2104A 分析天平, 上海精天电子仪器厂 ;U-1800 分光光度计, 日本 HITACHI;BX51 荧光显微镜, 日本 OLYMPUS. 2 方法 2.1 GSEE 的制备取干燥蝎子草全草 1kg, 用 70% 乙醇 5L 回流提取 1.5h, 过滤, 药渣再加入 5L70% 乙醇回流提取 1h, 过滤, 合并 2 次滤液, 减压浓缩至粗浸膏. 粗浸膏加水 5L, 无水乙醇 8L, 放置 24h 沉淀浸膏中的叶绿素, 在 8500r/min,4 下离心 10min, 取上清液减压浓缩至浸膏 (1g 浸膏相当于生药 10g), 得到 GSEE. 2.2 GSEE 最低抑菌浓度 (MIC) 测定 [4] 用两倍稀释法将 GSEE 稀释成浓度分别为 400,200,100,50mg/mL 的溶液. 分别移取 1mL 菌悬液 ( 菌体浓度为 10 8 个 /ml), 加入温度在 60 左右的肉汤固体培养基, 充分混匀, 迅速倒入培养皿, 待培 [5-6] 养基完全冷凝后, 用打孔琼脂扩散法测定最低抑菌浓度. 2.3 GSEE 的抗菌机制金黄色葡萄球菌生长曲线测定将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌菌液, 按 1% 的接种量 ( 菌体浓度为 10 8 个 /ml) 分别接种至含 100mg/mLGSEE 的肉汤液体培养基中, 于 37,150r/min 摇床振荡培养, 每 4h 取样, 用分光光度计在 540nm 下测 OD 值, 连续测 24h, 以时间为横坐标,OD 值为纵坐标, 绘制生长曲线. 以不加 GSEE 的菌体培养液作对照 GSEE 对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌液, 按 1% 的接种量 ( 菌体浓度为 10 8 个 /ml) 分别接种至含 100mg/mLGSEE 的肉汤液体培养基中, 于 37,150r/min 摇床振荡培养, 以不加 GSEE 的菌体培养液作对照. 分别于 0,8,12,16,24h 取样. 将样品于 8000r/min 离心 10min, 收集的菌体用 100μL 无菌水重悬, 再加入 50μL 的 5 SDS 上样缓冲液, 煮沸 5min,12000r 离心 10min, 取 10μL 上清液上样进行 SDS-PAGE 电泳 (15%PAGE 分离胶 ) GSEE 对金黄色葡萄球菌核酸的影响 GSEE 对金黄色葡萄球菌菌体荧光强度变化的检测将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌, 按 1% 的接种量 ( 菌体浓度为 10 8 个 /ml) 分别接种至含 100mg/mLGSEE 的肉汤液体培养基中, 于 37,150r/min 摇床振荡培养 24h, 取菌液 10μL 稀释 200 倍后, 取 100μL 稀释后的菌液滴加到载玻片上, 同时滴加等体积的 DAPI 染色液, 混匀后在黑暗中静置 10min, 在倒置荧光显微镜下观察照相. 以不加 GSEE 的菌体培养液作对照菌体 DNA 及 RNA 含量变化的测定 [7] 参照王海涛等的做法测定菌体 DNA,RNA 含量, 对其作了略微修改. 将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌, 按 1% 的接种量 ( 菌体浓度为 10 8 个 /ml) 分别接种至含 100 mg/ml GSEE 的肉汤液体培养基中, 于 37,150r/min 摇床振荡培养. 分别取经 GSEE 作用 0,4,8,12,16,20,24h 后的菌体样液 0.4mL, 加入 20μL 的 DAPI 染色液, 振荡 10min, 使其混匀, 然后立即在荧光分光光度计下测定. 当测定 DNA 含量变化时, 其荧光参数为 ex=364nm,em=450nm, 狭缝 5nm; 当测定 RNA 含量变化时, 其荧光参数为 ex=400nm,em=465nm, 狭缝 5nm. 每组试验重复 3 次. 以不加 GSEE 的菌体培养液为对照.

3 186 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷 3 结果 3.1 GSEE 的 MIC 测定不同浓度的 GSEE 对金黄色葡萄球菌的 MIC 试验结果见表 1. 由表 1 可知,GSEE 对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,GSEE 浓度为 400mg/mL 时, 抑菌作用最强, 抑菌圈直径达到 15mm, 随着 GSEE 浓度降低, 抑菌圈直径逐渐减小, 抑菌效果减弱. 当 GSEE 浓度为 50mg/mL, 抑菌圈直径只有 6 mm, 因打孔琼脂扩散法用的打孔器直径为 6 mm, 表明在此浓度下没有抑菌效果 ; 当 GSEE 浓度为 100 mg/ml 时, 抑菌圈直径为 10mm, 因此,GSEE 的 MIC 为 100mg/mL. 表 1 GSEE 对金黄色葡萄球菌的 MIC GSEE 浓度 /(mg ml -2 ) 对照抑菌圈直径 /mm GSEE 对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 GSEE 对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图 1. 从图 1 中可知, 对照中金黄色葡萄球菌迅速进入了对数生长期, 而加入了 GSEE 后, 金黄色葡萄球菌的生长明显受到抑制, 菌体的生长一直处于较低的水平, 表明 GSEE 能够抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂生长. 3.3 GSEE 对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响 GSEE 对菌体细胞可溶性蛋白表达的影响见图 2. 从图 2 结果可知,GSEE 作用后的金黄色葡萄球菌图 1 蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响可溶性蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱与对照的金黄色葡萄球菌可溶性蛋白 SDS-PAGE 电泳图谱, 呈现明显的差别. 经 GSEE 作用后, 金黄色葡萄球菌可溶性蛋白含量在 SDS-PAGE 电泳图中条带稀少, 而对照组中的金黄色葡萄球菌可溶性蛋白含量在逐渐增加, 条带也越来越深. 上述分析可表明,GSEE 对金黄色葡萄球菌的可溶性蛋白表达具有明显抑制作用. 3.4 GSEE 对金黄色葡萄球菌核酸的影响 GSEE 对金黄色葡萄球菌菌体荧光强度变化的影响 GSEE 作用 24h 后的金黄色葡萄球菌的荧光显微镜观察结果见图 3. 由图 3 可知, 对照的核酸注 :M 为 Marker; 泳道 1,3,5,7,10 分别为对照的 0,8,12,16,24 h; 泳道 2,4,6,8,9 分别为 GSEE 作用 0,8,12,16,24h. 图 2 GSEE 作用后的金黄色葡萄球菌的 SDS-PAGE 电泳图含量明显高于 GSEE. 这表明 GSEE 抑制了金黄色葡萄球菌菌体核酸的合成, 从而 GSEE 的核酸含量明显低于对照菌体 DNA 和 RNA 含量变化的影响菌体 DNA 含量变化见图 4, 菌体 RNA 含量变化见图 5. 由图 4 图 5 可知, 经 GSEE 作用后的金黄色葡萄球菌的核酸含量受到了明显抑制, 均小于对照, 其一直处于较低的水平.GSEE 的核酸含量明显低于对照, 表明 GSEE 可抑制金黄色葡萄球菌核酸的合成.

第 5 期江震献, 等 : 蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究 187 注 :A: 对照组 ;B:GSEE 组. 图 3 GSEE 作用的金黄色葡萄球菌 24h 后的荧光显微镜图谱 ( 400) 图 4 GSEE 作用后金黄色葡萄球菌 DNA 含量图 5 GSEE 作用后金黄色葡萄球菌 RNA 含量 4 讨论本文研究 GSEE 对金黄色葡萄球菌的抗菌作用.

4 第 5 期江震献, 等 : 蝎子草醇提浸膏对金黄色葡萄球菌抗菌机制的研究 187 注 :A: 对照组 ;B:GSEE 组. 图 3 GSEE 作用的金黄色葡萄球菌 24h 后的荧光显微镜图谱 ( 400) 图 4 GSEE 作用后金黄色葡萄球菌 DNA 含量图 5 GSEE 作用后金黄色葡萄球菌 RNA 含量 4 讨论本文研究 GSEE 对金黄色葡萄球菌的抗菌作用.GSEE 显示出对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌作用, 其 MIC 为 100mg/mL. 微生物 OD 值是反映菌体生长状态的一个指标 [8],OD 值越高, 代表其菌体密度越大.GSEE 能够抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂, 对数生长期是细菌细胞分裂的主要时期, 也是核酸蛋白质合成的主要时期, 因此, 根据本研究结果可以推测 GSEE 对金黄色葡萄球菌的抑制作用可能通过抑制菌体核酸或可溶性蛋白质的合成来实现. 由于试验采用紫外分光光度计测菌体 OD540 值, 只能测定菌体的总量, 因此活菌数和死菌数未能分别体现出来. 可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类, 测其含量是了解生物体内总代谢的一个重要指标. GSEE 对金黄色葡萄球菌可溶性蛋白具有抑制作用.SDS-PAGE 图谱表明 GSEE 对金黄色葡萄球菌的可溶性蛋白含量具有明显的抑制作用, 这可能是由于 GSEE 影响了菌体可溶性蛋白的正常表达或影响了其功能, 导致部分蛋白酶不能正常合成或失去原有的酶活性, 从而影响了菌体的生长繁殖. 该结果与 XinKe [9] 等关于壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体蛋白表达的影响结果相似. DAPI 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料, 能与 DNA 和 RNA 结合 [10-11], 核酸量越大, 荧光亮度 [12] 越强.DAPI 染色常用于细胞凋亡检测, 染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测.DAPI 染色结果显示,GSEE 能明显抑制金黄色葡萄球菌菌体核酸的合成, 以致可能影响菌体繁殖生长. 该试验结果与王海 [7] 涛等关于大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌菌体的核酸变化影响结果相似, 也与 Ulanowska [13] 利用放射性同位素研究染料木素抑制 E.coli 和 V.harveyi 的核酸结果相似. 对 GSEE 的抗菌机制作了初步探讨, 其抗菌机制可能通过抑制菌体可溶性蛋白的表达和菌体核酸的合成等方面来实现抑制金黄色葡萄球菌的生长. 但有关 GSEE 的分子抗菌机制还有待进一步深入研究.

5 188 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷参考文献 : [1] 陶玲, 支娜, 柏帅, 等. 大蝎子草抗炎镇痛活性部位研究 [J]. 时珍国医国药,2009,20(6): [2] 向少能, 刘媛, 王洁, 等. 蝎子草浸膏的抗炎抗痛风及镇静作用研究 [J]. 西南师范大学学报 : 自然科学版, 2010,35(3): [3] 郑庆霞, 李洪庆. 大蝎子草提取物抗风湿活性的初步研究 [J]. 山地农业生物学报,2009,28(5): [4] HEFENG,YANG YING,YANG GUANG,etal.StudiesonAntibacterialActivityandAntibacterialMechanismofa NovelPolysaccharidefromStreptomycesvirginia HO3 [J].FoodControl,2010(21): [5] 周英, 王慧娟, 段震, 等. 民族药响铃草的体外抑菌活性研究 [J]. 时珍国医国药,2009,20(1): [6] 姜延伟, 王懿萍, 吴玉娟, 等. 黄连多糖抑菌活性初探 [J]. 时珍国医国药,2009,20(1): [7] 王海涛, 王倩, 谢明杰. 大豆异黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌机制研究 [J]. 中国农业科学,2009,42(7): [8] 沈萍, 范秀容, 李广武. 微生物学实验 [M]. 北京 : 高等教育出版社,1999:97. [9] XIN Ke,CHEN Xi-guang,KONG Ming,etal.EfectofOleoyḻChitosanNanoparticlesasaNovelAntibacterialDispeṟ sionsystemonviability,membranepermeabilityandcelmorphologyofescherichiacoliandstaphylococcusaureus [J].CarbohydratePolymers,2009(76): [10]LIM,WU RS,TSAIJSC.DAPIDerivative:AFluorescentDNA DyeThatCanbeCovalentlyAtachedtoBiomolecules[J].Bioorganic& MedicinalChemistryLeters,2003(13): [11]DECASTRO LFP,ZACHARIAS M.DAPIBindingtotheDNA MinorGroove:aContinuum SolventAnalysis [J]. JournalofMolecularRecognition,2002(15): [12]STCHIARA HOSP,DEPTPATHOL,TRENT,etal.FlowCytometricAssessmentofSpermatogenesisinInfertileMenby DAPI-SulphorodamineStainingandVimentin/DNABiparametricAnalysis[J].CytometryPartA,2004(59A): [13]ULANOWSKA K,TKACZYK A,KONOPA G,etal.DiferentialAntibacterialActivityofGenistein Arisingfrom GlobalInhibitionofDNA,RNAandProteinSynthesisinSomeBacterialStrains [J].ArchivesofMicrobiology,2006 (184): StudiesonAntibacterialMechanismofEthanolExtractfrom Girardiniasuborbiculata C.J. ChenonStaphylococcusaureus JIANGZheṉxian 1, PENG Xia 1, ZHANG Xiaoḻin 1, ZHU Ling 1, LIHai-xia 1, CHENZhangḇao 1,2 1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2. ChongqingEngineeringTechnologyResearchCenterofZoopharmaceuticals,Chongqing400715,China Abstract:Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)oftheethanolextractfromGirardiniasuborbiculata C.J. Chen (GSEE)againstStaphylococcusaureus wasdeterminedandtheinfluencesofgseeonthe growthcurve,solubleproteinsexpressionandcelularnucleicacidsynthesisofthebacterium weredetected soastostudytheantibacterialmechanismofgseeons.aureus.theresultsshowedthatmicofgsee againsts.aureus was100 mg/ml.sds-pageindicatedthatthecontentofcelularsolubleproteinsin GSEEtreatmentdecreasedmarkedlycomparedwiththatinthecontrolgroup.DAPI(4 6-diamidino-2-phenylindole)stainingassaydemonstratedthatGSEEhadasignificantinhibitoryefectonthesynthesisof celularnucleicacid.itisconcludedthatgseehasagoodantibacterialactivityons.aureusandthatthe antibacterialmechanismisthatgseeinhibitsthegrowthofs.aureusbyinhibitingthesynthesisofsolubleproteinsandnucleicacid. Keywords:Girardiniasuborbiculata C.J. Chen;antibacterialmechanism;antibacterialactivity 责任编辑陈绍兰

实验室常用培养基的配制方法

实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin( 氨卡青霉素 )(100 mg/ml) 100 mg/ml Ampicillin 50 ml 配制方法 1. 称量 Ampicillin 置于 50 ml 离心管中 ; 2. 加入 40 ml 灭菌水, 充分混合溶解后, 定容至 50 ml; 3. 用 0.22 µm 过滤膜过滤除菌 ; 4. 小份分装 (1 ml/ 份 ) 后,-20 保存 IPTG(