2015 年 9 月第 38 卷第 5 期湖南师范大学自然科学学报 JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversity Vol.38 No.5 Sep.,2015 DOI: /j.isn mir 14

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1 2015 年 9 月第 38 卷第 5 期湖南师范大学自然科学学报 JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversity Vol.38 No.5 Sep.,2015 DOI: /j.isn mir 146a! "# 1,2#, 1,2#, 1, 1, 1, 2, 1, 1 (1. 长沙学院生物与环境工程系, 中国长沙 ;2. 湖南农业大学动物医学院, 中国长沙 ) $ % 为了解翘嘴鳜胚胎发育中 mir 146a 的表达规律以及温度对 mir 146a 表达的影响, 将翘嘴鳜受精卵分别在 22 和 25 水温下孵化, 并利用实时荧光定量方法检测 mir 146a 在各个发育阶段的表达. 结果显示, 在 22 孵化时,miR 146a 的表达在原肠期前处于较高水平且各时期表达没有显著性差异 (P>0.05), 在尾芽期后出现显著性降低 (P<0.05), 并在出膜时达到最低值 ; 在 25 孵化时,miR 146a 的表达直到神经胚期仍处于较高水平且各时期表达没有显著性差异 (P>0.05), 发育进入尾芽期后表达显著降低 (P<0.05), 在肌效期达到最低值 ; mir 146a 在 25 水温孵化时的表达较 22 孵化同时期的表达都出现显著降低 (P<0.05). 研究表明,miR 146a 可能主要在胚胎发育后期起到调控胚胎发育的作用, 在尾芽期后通过下调表达来促进胚胎的发育 ; 并且温度能影响 mir 146a 的表达, 温度升高会降低 mir 146a 在胚胎发育各个时期的表达, 将有利于胚胎的发育. &' 翘嘴鳜 ;mir 146a; 发育性表达 ; 胚胎发育 ; 温度调节 Q752;S917.4 ()*+ A, (2015) ExpressionAnalysisofSinipercaChuatsiMiR 146aDuringEmbryonic DevelopmentandEfectofTemperatureonMiR 146aExpression ZHUXin 1,2#,YITan 1,2#,CHENLin 1,WUPing 1,WANGJian hua 1, CHENTao 2,ZHANGJian she 1,CHUWu ying 1 (1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China; 2.ColegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China) Abstract ToinvestigatetheexpresionpaternofmiR 146ainembryonicdevelopmentalstageandtheefect oftemperatureontheexpresionofmir 146ainSinipercachuatsi,theembryoswereincubatedunderdiferenttem peraturesandtheexpresionofmir 146aduringembryonicdevelopmentalstagewasdetectedbyRT qpcr.there sultsshowedthattheexpresionsofmir 146awereatahigherlevelandthereisnosignificantdiferencebefore gastrulastagewhentheembryosincubatedunder22 (P>0.05).AndthentheexpresionsofmiR 146ade creasedaftertail budstageanddecreasedtothelowestlevelatlarvalstage(p<0.05).whentheembryosincuba tedunder25,theexpresionsofmir 146awereatahigherlevelandthereisnosignificantdiferencetilneuru lastage(p>0.05).onceattail budstage,theexpresionofmir 146asignificantlydecreased(P<0.05)and tothelowestlevelatmuscularefectstage.itwasinterestingthattheexpresionsofmir 146aweresignificantlyde creasedateachdevelopmentalstageincubatedunder25 whencomparedwith22 incubation(p<0.05).the resultsindicatedthatmir 146amainlyinvolvedinregulatingembryonicdevelopmentduringlaterembryonicdevel./01: : 国家自然科学基金资助项目 ( , ); 湖南省自然科学基金资助项目 (14J2135) # 本文同等贡献作者. 23,E mail:chuwuying18@sina.com

2 2 湖南师范大学自然科学学报第 38 卷 opmentalstagesandpromotedembryonicdevelopmentbydownregulationitsexpresion.inaddition,theexpres sionsofmir 146acoulddecreasewhentheincubationtemperatureincreased,andmiR 146amightinvolveinthe efectoftemperatureonembryonicdevelopmentofsinipercachuatsi. Keywords Sinipercachuatsi;miR 146a;developmentalexpresion;embryonicdevelopment;temperature regulation 上世纪 80 年代, 随着鳜鱼人工繁殖获得成功, 我国开始大规模推广鳜鱼养殖, 使之成为我国主要名贵养殖鱼类之一. 翘嘴鳜因其肉质细嫩而鲜美, 无小刺, 且富含蛋白质, 现已成为水产品市场的紧俏商品和水产养殖业的重要品种 [1]. 深入探索翘嘴鳜的发育机制能够为鱼类发育生物学研究和水产养殖提供一些有价值的参考资料. microrna(mirna) 是真核生物中一类进化上保守的参与调控基因表达的非编码小分子 RNA. 它通过与靶基因 3 端非翻译区互补配对来促进靶 mrna 降解或翻译抑制, 在基因表达中起着负调控作用 [2 3].miR NA 在胚胎发育细胞增殖与分化肿瘤发生和新成代谢等一系列生物过程中发挥重要的作用 [4 5], 但是有关 mirna 在胚胎的表达特性及其在鱼类早期发育中的功能研究还很少. 早期的研究表明 mirna 对胚胎发育起到重要作用. 鼠和人的胚胎干细胞在发育形成胚胎小体时, 胚胎干细胞中一些特定的 mirna 的表达会下调 [6 7], 缺失 mirna 的鼠和斑马鱼胚胎在原肠胚形成神经发育体节形成时出现发育畸形甚至停滞 [8 9]. [10] Kuang 等发现 mir 146a 能够与 Numb 基因的 3 端非翻译区互补配对, 并且验证了 mir 146a 能够抑制 Numb 的表达, 而 Numb 调控的靶基因 Notch 参与一系列胚胎发育和形态形成过程, 如成肌细胞的增殖神经发育和体节形成 [11], 因此可以推断 mir 146a 很可能参与调控胚胎的发育. 水温可以改变胚胎发育所需时间, 较高的孵化温度能加速鱼类胚胎的发育速率, 缩短孵化所需的时间 [12] [13]. 何利君的研究显示, 翘嘴鳜胚胎发育在 21,25 和 27 下, 分别经过 74.05,56.73 和 48.37h 孵育后出膜. 在适宜温度范围内, 适当升温可以加快胚胎发育的进程, 但 mirna 是否参与到水温影响翘嘴鳜胚胎发育的分子机制中尚不明确. 在本研究中, 我们分别在 22 和 25 水温下孵化翘嘴鳜的受精卵, 并利用实时荧光定量的方法检测 mir 146a 在几个重要发育阶段的表达, 以此了解 mir 146a 在胚胎发育进程中的表达模式及水温对 mir 146a 表达的影响 :; 实验用亲鱼为湖南省水产科学研究所无病无伤体格健壮性腺成熟度好的翘嘴鳜, 雌性个体为体质量 1.0kg 以上的 2~4 龄鱼, 雄性个体为体质量 0.75kg 以上的 2~4 龄鱼 !"#$%&' 使用宁波市激素制品有限公司生产的绒毛膜促性腺激素 (HCG) [14] 促黄体生成素释放激素类似物和鲤鲫鱼脑垂体 (PG) 对亲鱼进行人工催产, 操作方法参考刘希良等文献报导. 将受精卵置于直径 15cm 的玻璃培养皿中, 每个培养皿放 200~300 颗, 分别在 22 和 25 的水温中孵化. 期间, 每半小时更换一次曝气水以保证溶氧充足. 自受精后定时将翘嘴鳜鱼卵置于显微镜下观察翘嘴鳜胚胎的发育进程, 当所有鱼卵半数以上达到某个时期时确定为到达该时期. 当受精卵进入二细胞囊胚原肠神经尾芽肌效心搏出膜期时, 分别取适量受精卵置于装有 Trizol 的 2mL 离心管中, 每个时期取 5 管平行样, 置于 -20 冰箱保存 RNA'( ) cdna*+,'-. 保存于 Trizol 中的受精卵用破口枪头吸打数次, 直至胚胎全部破碎, 然后置于装有 1mLTrizol 的离心管中. 总 RNA 提取流程参照 TrizolReagent(Invitrogen) 说明书操作. 所有总 RNA 样品分别取 1μL 作为模板, 按照 OneStepPrimeScriptmiRNAcDNAsynthesisKit 试剂盒 ( 宝生物公司, 大连 ) 的说明进行逆转录, 合成的 cdna 第一链, 于 4 冰箱保存待用.

3 第 5 期朱鑫等 : 翘嘴鳜 mir 146a 在胚胎发育过程中的表达及温度对其表达的影响 23 [15] /01 mir 146a' 2 根据 Chu 等建立的鳜鱼 mirna 文库, 设计 mir 146a 特异性的上游引物, 以管家基因 β actin 作为胚胎发育阶段样品的内参基因 [16]. 用 Primer5.0 软件设计荧光定量 PCR 的引物, 引物由上海铂尚生物公司合成 ( 见表 1). 取 2μL 逆转录好的 cdna 为模板, 加入 12.5μL SYBRPremixExTaqⅡ ( 宝生物公司, 大连 ),1μL 特异性的上游引物和 1μL 通用下游引物 (Uni mirqpcr Primer,10μmol/L, 宝生物公司 ),8.5μL 的无菌水, 总体积 25μL, 扩增反应在 Bio RadCFX96system (USA) 上进行. 扩增条件为 :(1)95 预变性 60s;(2) 扩增和定量,95 变性 5s,60 退火和延伸 25s, 重复 40 个循环.(3) 绘制融解曲线 (65~95, 每 0.1 检测一次荧光值 ) Tab.1 PrimersusedformiRNAdetection 名称 mir 146a F β actin F β actin R Name 引物序列 (5 3 ) CGTGAGACTGATTCCATAGATGG GCCGTGACCTGACTGACTACCT CGCAAGACTCCATACCCAAGAAG 注 :mir 146a 定量所使用的下游引物为通用引物, 序列未公布, 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ( 浓度 :10μmol/L) 相对表达结果计算公式为 R=2 -ΔΔCt, 其中 Ct 值为 PCR 反应循环阈值,ΔΔCt 的计算公式为 :ΔΔCt=(Ct 目的基因 -Ct 内参基因 ) 实验组 -(Ct 目的基因 -Ct 内参基因 ) 对照组. 采用 SPSS12.0 软件对所得相对表达丰度数据进行单因素方差分析 (One wayanova), 并采用最小显著差数法 (LSD) 进行多重比较 (P<0.05 表示显著性差异,P<0.01 表示差异极显著 ), 结果以平均值 ± 标准误差 (Mean±SE,n=5) 表示 mir 146a 有文献报道 mirna 在不同的细胞和不同的发育阶段有差异性的表达, 并且它们参与细胞的生长分化以及凋亡等过程 [17 18]. 目前 mirna 在鱼类胚胎发育阶段的表达研究还较少, 且暂未有文献报道 mir 146a 在鱼类胚胎的发育性表达. 图 1 结果显示, 胚胎在 22 水温孵化下,miR 146a 的表达在发育早期处于较高水平, 其中原肠期前的各时期表达没有显著性差异, 进入尾芽期后显著性地降低, 并持续降低, 在出膜期时达到最低水平. 而在 25 孵化时,miR 146a 的表达在神经期前处于较高水平且各时期都没有显著性差异, 在尾芽期显著性地降低, 在肌效期达到最低值, 心搏期和出膜期处于较低水平并且之间没有显著性差异 ( 图 1). 1 mir 146a:;! <0='>? 2@A.A BBCD mir 146a: E" $!0 =' < 2.>? 2 D ± FG(n=5).!'HIJ K:LM GN(P<0.05) Fig.1 DetectionofmiR 146aexpresionatdiferentembryonicdevelopmentalstages.A,BrepresentmiR 146aexpresedatdiferentembryonicdevel opmentalstageswhenincubationunder22 and25 watertemperature,respectively.valuesarethemean±se,n=5.thediferentleters indicatesignificantdiferencesbetweencolumns(p<0.05)

24 湖南师范大学自然科学学报第 38 卷 2.2 mir 146a <=>?@ 图 1 的结果显示温度影响了 mirna 在胚胎发育中的表达. 当比较胚胎发育同一时期在 22 和 25 水温孵化下 mir 146a 的表达时发现,miR 146a 在 25 水温孵化时的表达较 22 孵化下同时期的表达都出现显著性地降低, 其中除出膜期外, 其他时期的表达差异极显著 (P<0.01)( 图 2).

4 24 湖南师范大学自然科学学报第 38 卷 2.2 mir 146a 图 1 的结果显示温度影响了 mirna 在胚胎发育中的表达. 当比较胚胎发育同一时期在 22 和 25 水温孵化下 mir 146a 的表达时发现,miR 146a 在 25 水温孵化时的表达较 22 孵化下同时期的表达都出现显著性地降低, 其中除出膜期外, 其他时期的表达差异极显著 (P<0.01)( 图 2). 2 mir 146a:;!E" $,!+0='GN 2.O 0= 22 $' 2 D?, J LM GN(P<0.05), J GN LM(P<0.01) Fig.2 ThecontrastiveexpresionofmiR 146aincubatedunderdiferentwatertemperature.Thedatawasexpresedastherelativechangecomparedwith theexpresionlevelofeachstageincubatedunder22,asterisk( )indicatessignificantdiference(p<0.05),doubleasterisk( )indi catessignificanceatp< AB mir 146a 最初被发现在 mirna 中参与天然免疫应答, 当单核细胞受到细菌内毒素侵袭时,miR 146a 的表达显著上调 [19]. 近年来许多文献报道,miR 146a 调节的许多靶基因参与了细胞分化的作用, 但这些研究主要集中在分析 mir 146a 对造血细胞的分化作用, 而 mir 146a 对胚胎发育的作用暂未见到相关报道.Kuang [10] 等的研究验证了 mir 146a 能够抑制 Numb 的表达.Numb 是一种进化保守蛋白, 其作为内源性细胞命运决定因子, 对细胞分裂的命运起决定作用.Numb 对胚胎早期神经和肌肉的发育作用也已经被证明 [20 21]. Numb 作为一个重要的细胞命运决定蛋白, 参与 Notch 的负性调控, 两者的平衡决定了细胞分化的方向 [22]. Notch 信号转导通路作为生物发育分化中高度保守的通路, 通过与配体的相互作用产生级联瀑布效应, 参与细胞发育过程中分化方向的选择, 并对细胞的增殖及凋亡也起着重要的作用 [23 24].Notch 信号通路在胚胎发育中起到调节细胞增殖和决定细胞命运的作用 [25]. 激活 Notch 信号能够促进肌原细胞的增殖, 并降低 MyoD 和 myogenin 的表达来延迟成肌细胞的分化 [26].miR 146a 及其靶基因的研究为进一步了解 mir 146a 在胚胎发育中潜在的作用提供了一些重要的理论依据. 翘嘴鳜 mir 146a 胚胎发育性表达结果显示, 在 22 和 25 水温孵化下,miR 146a 表达规律趋势总体相似, 但在不同温度下,miR 146a 的表达在几个时期经历了微调, 说明温度确实影响了 mir 146a 的表达. 本文结果显示在胚胎发育早期 ( 二细胞到神经胚期 )mir 146a 的表达趋于稳定且处于较高水平 ( 除 22 神经 [27] 胚期有显著性上升 ), 在进入尾芽期后表达都显著性地降低.Giraldez 等的研究表明 mirna 的作用并不是在发育早期决定细胞的命运而是影响发育后期组织的发育和形成, 而在神经胚期前胚胎的大部分组织器官还未开始分化, 本文结果与 Giraldez 等的结论相符. 胚胎发育经过神经胚期后, 是器官形成的主要阶段, 而本文结果显示 mir 146a 的表达在尾芽期显著降低, 表明 mir 146a 的靶基因在这个阶段后受到其抑制作用将 [10] 明显降低, 并推测 mir 146a 的靶基因的作用可能是促进胚胎发育的.Kuang 等的研究发现 Numb 是 mir 146a 的靶基因,Numb 能够促进胚胎早期神经和肌肉的发育 [20 21],Numb 参与调节的 Notch 信号通路也对胚

5 第 5 期朱鑫等 : 翘嘴鳜 mir 146a 在胚胎发育过程中的表达及温度对其表达的影响 25 胎的发育起到重要的作用. 温度是影响鱼类胚胎发育的一个主要的外在因子. 大量研究表明, 在适宜温度下, 随着水温的升高, 胚胎的发育进程加快, 孵化所需时间缩短 [28 29], 但是 mirna 的表达是否受到温度的影响还未见相关报道. 从图 2 可以看出, 在 25 孵化时,miR 146a 在不同阶段的表达都比 22 时出现显著性降低. 这一结果表明温度升高能降低 mir 146a 的表达, 从而调节胚胎的发育. 有研究表明肌纤维增生和增粗的速率在较高的水温孵化时都会升高, 但是温度对肌纤维的增粗效果强于增生 [5]. 在 25 孵化时,miR 146a 的表达显著性降低能增强 Numb 对 Notch 信号通路的抑制作用, 促进成肌细胞的分化, 从而有利于胚胎中肌肉组织形成. 这一结果表明了 mir 146a 在参与水温调节胚胎发育的过程中是通过下调来促进发育的. 4 B 研究表明,miR 146a 在胚胎发育早期 ( 神经期前 ) 的作用不明显. 在胚胎发育后期 ( 尾芽期至出膜 ),mir 146a 通过下调其表达来促进胚胎的发育. 而水温升高能显著降低 mir 146a 在胚胎发育每个时期的表达, 减少其对靶基因 Numb 的抑制, 发挥促进细胞分化的作用, 从而有利于胚胎发育的进程. CD (: [1] 李玉珑, 农小献, 李虹辉, 等. 鳜鱼生肌调节因子 MyoD 的克隆及其发育表达分析 [J]. 湖南师范大学自然科学学报, 2013,36(4): [2] LIUJ.ControlofproteinsynthesisandmRNAdegradationbymicroRNAs[J].CurOpinCelBiol,2008,20(2): [3] XIEX,LUJ,KULBOKASEJ,etal.Systematicdiscoveryofregulatorymotifsinhumanpromotersand3 UTRsbycomparison ofseveralmammals[j].nature,2005,434(7031): [4] FUY,SHIZ,WUM,etal.IdentificationanddiferentialexpresionofmicroRNAsduringmetamorphosisoftheJapanese flounder(paralichthysolivaceus)[j].plosone,2011,6(7):e [5] SONGL,TUANRS.MicroRNAsandceldiferentiationinmammaliandevelopment[J].BirthDefectsResCEmbryoToday, 2006,78(2): [6] HOUBAVIYHB,MURRAYM F,SHARPPA.Embryonicstemcel specificmicrornas[j].devcel,2003,5(2): [7] SUHM R,LEEY,KIMJY,etal.HumanembryonicstemcelsexpresauniquesetofmicroRNAs[J].DevBiol,2004,270 (2): [8] BERNSTEINE,KIM SY,CARMELLM A,etal.Dicerisesentialformousedevelopment[J].NatGenet,2003,35(3): [9] GIRALDEZAJ,CINALLIRM,GLASNERM E,etal.MicroRNAsregulatebrainmorphogenesisinzebrafish[J].Science, 2005,308(5723): [10] KUANGW,TANJ,DUANY,etal.CyclicstretchinducedmiR 146aupregulationdelaysC2C12myogenicdiferentiation throughinhibitionofnumb[j].biochembiophysrescommun,2009,378(2): [11] CONBOYIM,RANDOTA.TheregulationofNotchsignalingcontrolssatelitecelactivationandcelfatedeterminationin postnatalmyogenesis[j].devcel,2002,3(3): [12] KINNEO,KINNEEM.Ratesofdevelopmentinembryosofacyprinodontfishexposedtodiferenttemperature salinity oxygen combinations[j].canjzool,1962,40(2): [13] 何利君. 温度对鳜鱼胚胎发育的影响 [J]. 四川畜牧兽医学院学报,1999,13(4): [14] 刘希良, 宾石玉, 王开卓, 等. 翘嘴鳜的人工繁殖与胚胎发育观察 [J]. 广西师范大学学报 : 自然科学版,2013,31(2): [15] CHUW Y,LIULS,LIYL,etal.SystematicidentificationanddiferentialexpresionprofilingofmicroRNAsfromwhiteand redmusclesofsinipercachuatsi[j].curmolmed,2013,13(8): [16] ZHOURX,MENGT,MENGHB,etal.SelectionofreferencegenesintranscriptionanalysisofgeneexpresionoftheMan darinfish,sinipercachuasti[j].zoolres,2010,31(2): [17] NEILSONJR,ZHENGGX,BURGECB,etal.DynamicregulationofmiRNAexpresioninorderedstagesofcelulardevel

6 26 湖南师范大学自然科学学报第 38 卷 opment[j].genesdev,2007,21(5): [18] MCCARTHYJJ,ESSERKA.MicroRNA 1andmicroRNA 133aexpresionaredecreasedduringskeletalmusclehypertrophy [J].JApplPhysiol,2007,102(1): [19] TAGANOVKD,BOLDINMP,CHANGKJ,etal.NF kappab dependentinductionofmicrornamir 146,aninhibitortar getedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses[j].procnatlacadsciusa,2006,103(33): [20] PETERSENPH,ZOUK,HWANGJK,etal.Progenitorcelmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneuro genesis[j].nature,2002,419(6910): [21] CONBOYIM,RANDOTA.TheregulationofNotchsignalingcontrolssatelitecelactivationandcelfatedeterminationin postnatalmyogenesis[j].devcel,2002,3(3): [22] LIUXH,YAOS,QIAORF,etal.NandrolonereducesactivationofNotchsignalingindenervatedmuscleasociatedwithin creasednumbcx presion[j].biochembiophysrescommun,2011,414(1): [23] LEONGKG,KARSANA.RecentinsishtsintotheroleofNotchsignalingintumorigenesis[J].Blood,2006,107(6): [24] NICOLASM,WOLFERA,RAJK,etal.Notchlfunctionsasatumorsuppresorinmouseskin[J].Natgenet,2003,33(3): [25] ARTAVANIS TSAKONASS,RANDMD,LAKERJ.Notchsignaling:celfatecontrolandsignalintegrationindevelopment [J].Science,1999,284(5415): [26] NOFZIGER D,MIYAMOTO A,LYONSK M,etal.Notchsignalingimposestwodistinctblocksinthediferentiationof C2C12myoblasts[J].Development,1999,126(8): [27] GIRALDEZAJ,CINALLIRM,GLASNERM E,etal.MicroRNAsregulatebrainmorphogenesisinzebrafish[J].Science, 2005,308(5723): [28] 胡振禧, 黄洪贵, 吴妹英, 等. 温度对斑鳜胚胎发育的影响 [J]. 淡水渔业,2014,44(3): [29] 陈昆慈, 朱新平, 杜合军, 等. 温度和盐度对宝石鲈胚胎发育的影响 [J]. 中国水产科学,2007,14(6): ( P Q R) 櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂 (E 20 ) CD (: [1] 代合治, 刘兆德. 复合指标法及其在测试中国省域城市化水平中的应用 [J]. 城市问题,1998,16(4): [2] 都沁军, 武强. 基于指标体系的区域城市化水平综合测度研究 [J]. 地域研究与开发,2006,13(3): [3] 袁晓玲, 王霄, 何维炜, 等. 对城市化发展质量的综合评价分析以陕西省为例 [J]. 城市发展研究,2008,15(2): [4] 韩增林, 刘天宝. 中国地级以上城市化质量特征及空间差异 [J]. 地理研究,2009,31(4): [5] 梁振民, 陈才, 刘继生, 等. 东北地区城市化质量的综合测度与层级特征研究 [J]. 地理科学,2013,33(8): [6] 王家庭, 唐袁. 我国城市化质量测度的实证研究 [J]. 财经问题研究,2009,31(12): [7] 郝华勇. 城镇化质量的差异评价与提升对策以东部 10 省为例 [J]. 经济探讨,2012,31(6): [8] 陈明, 张云峰. 城镇化发展质量的评价指标体系研究 [J]. 中国名城,2013,8(2):1 19. [9] 王富喜, 毛爱华, 赫龙, 等. 基于熵值法的山东省城镇化质量测试及空间差异分析 [J]. 地理科学,2013,33(11): [10] 刘林, 龚表蜀. 基于主成分分析的新疆城镇化动力机制研究 [J]. 经济管理,2009,31(2): [11] 陈明星, 陆大道, 张华. 中国城市化水平的综合测度及其动力因子分析 [J]. 地理学,2009,64(4): [12] 欧向军, 甄峰, 秦永东. 区域城市化水平综合测度及其理想动力分析 : 以江苏省为例 [J]. 地理研究,2008,27(5): [13] 郑文升, 王晓芳, 李诚固.1997 年以来中国副省级城市区域城市化综合发展水平空间差异 [J]. 经济地理,2007,27(2): ( P ST)

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察

人工催产干法授精孵化胚胎发育观察金万昆俞丽杨建新张慈军高永平赵宜双王春英人工催产干法授精孵化胚胎发育观察胚盘隆起细胞期细胞期细胞期细胞期细胞期多细胞期囊胚早期囊胚中期囊胚晚期原肠早期原肠中期原肠晚期神经胚期胚孔封闭期眼泡出现期尾芽期晶体出现期肌肉效应期心脏搏动期孵出期日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼日龄仔鱼感谢中国水产科学院黑龙江水产研究所沈俊宝研究员的悉心指导

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