免疫化学技术

Size: px

Start display at page:

Download "免疫化学技术"

玲雍
5 years ago
Views:

1 免疫化学技术 1 免疫化学技术简介现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成结构以及抗原和抗体反应的机制此外, 还研究体内其他免疫活性物质, 如补体分子的组成结构及其功能目前, 免疫化学已应用于免疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等随着免疫化学细胞生物学及分子生物学的进展, 免疫学实验技术也迅猛发展, 并已成为当今生命科学研究的重要手段, 尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定前者主要是根据抗原与相应抗体能在体外发生特异性结合, 并在一些辅助因子的参与下出现沉淀凝集及溶解等反应, 从而采用已知抗原检测未知抗体, 或用已知抗体检测未知抗原此外, 尚包括检测体液中各种可溶性免疫分子, 诸如补体各类免疫球蛋白循环免疫复合物溶菌酶各种细胞因子等细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞 (T 细胞 B 细胞 K 细胞 NK 细胞及巨噬细胞等 ) 表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能, 在体外 ( 有时亦可在体内 ) 测定上述各种细胞及其亚群的数量和功能, 以帮助了解机体的细胞免疫水平本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的基本原理及实验操作方法 2 抗原的免疫原性和专一性抗原与免疫原 : 抗原 (antigen,ag) 是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答, 并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质, 也称为免疫原 (immunogen) 前一种性能称为免疫原性 (immunogenicity) 或抗原性 (antigenicity), 后一种性能称为反应原性 (reactogenicity) 或免疫反应性 (immunoreactivity) 抗原的分类 : 根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原 (complete antigen) 和半抗原 (hapten) 两类同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原, 如细菌病毒异种动物血清等仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性, 而无免疫原性的物质称为半抗原, 如大多数的多糖类脂及一些简单的化学物质, 它们本身不具免疫原性, 但当与蛋白质大分子结合后形成复合物, 便获得了免疫原性, 这种与半抗原结合并赋予它免疫原性的蛋白质大分子称为载体 (carrier) 根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗原外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的内源性抗原是指体内的自身成分, 如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰, 成为一种自身抗原或称新生抗原, 使机体发生免疫反应而根据抗原的化学组成可分成蛋白质糖类脂类与核酸等抗原构成免疫原的条件 : 异物性是抗原物质的首要性质免疫活性细胞在正常情况下具有高度精确的识别能力, 能识别 " 自己 " 和 " 非己 ", 将非己物质加以排斥免疫应答就其本质来说, 就是识别异物和排斥异物

2 的应答, 故激发免疫应答的抗原一般需要是异物, 具有异物性的物质可分为以下几种 :1) 异种物质 : 马血清异种蛋白质各种微生物及其代谢产物, 对人来说是异种物质, 均为良好抗原 2) 同种异体物质 : 高等动物同种不同个体之间, 由于遗传基因不同, 其组织成分的化学结构也有差异因此, 同种异体物质也可以是抗原物质例如人类红细胞 A B O 血型物质和人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen, HLA) 即属此类 3) 自身抗原 : 自身组织成分通常无抗原性, 但在某些异常情况下, 自身成分也可成为抗原物质抗原一般为大分子物质, 其分子量在 10kD 以上在一定范围内, 分子量越大, 其抗原性越强分子量在 5kD 以下的肽类, 一般无抗原性, 分子量为 5-10kD 的肽类为弱抗原抗原须是大分子物质的原因为 :1) 分子量越大, 表面的抗原决定簇越多, 而淋巴细胞要求有一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化 2) 大分子胶体物质的化学结构稳定, 不易被破坏和清除, 在体内停留时间较长, 能持续刺激淋巴细胞大分子物质并不一定都有抗原性例如明胶是蛋白质, 分子量达 100kD 以上, 但其免疫原性很弱因明胶所含成分为直链氨基酸, 不稳定, 易在体内水解成低分子化合物如在明胶分子中加入少量酪氨酸则能增强其抗原性因此, 抗原物质除应为大分子外, 其表面必须有一定的化学组成和结构此外, 抗原分子的构象 (conformation) 即抗原分子中一些特殊化学基因的三维结构, 它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞表面的抗原受体互相吻合, 从而启动免疫应答抗原分子的构象变化, 可导致其抗原性的改变抗原的物理性状与免疫原性的强弱有关一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强 ; 聚合状态的蛋白质较其单体抗原性为强 ; 颗粒性抗原较可溶性抗原为强具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体 ( 包括注射吸入混入伤口等 ), 并接触免疫活性细胞, 才能成为良好抗原抗原特异性的物质基础 : 抗原决定簇 (antigenic determinant, AD) 是存在于抗原表面的特殊基团, 又称表位 (epitope) 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合, 从而激活淋巴细胞, 引起免疫应答, 抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合因此, 抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构, 也是免疫反应具有特异性的物质基础一个抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇, 每种决定簇只有一种抗原特异性抗原决定簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位一般蛋白质的决定簇由 5-6 个氨基酸残基组成, 一个多糖决定簇由 5-7 个葡萄糖残基组成, 一个核酸半抗原的决定簇包含 6-8 个核苷酸抗原结合价 (antigenic valence) 指能与抗体分子结合的决定簇的总数, 包括抗原表面功能价及其内部非功能价 3 抗体的结构和功能抗体是机体受抗原刺激后, 由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白, 因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白 (Immunoglobulin) 在免疫应答过程中, 抗体主要由分化的 B

3 淋巴细胞产生, 但有时也需要其他类型的细胞, 如 T 淋巴细胞和巨噬细胞的协同作用抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中, 对体液免疫应答起主要作用目前已发现的人免疫球蛋白有五类, 分别为 IgG IgA IgM IgD 和 IgE 免疫球蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的基本结构单位, 即由两条重链 (heavy chain, H 链 ) 和两条轻链 (light chain, L 链 ) 通过不同数目的二硫键结成 Y 形 ( 见图 8-1) 在抗体分子的 N 端, 不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的, 此区为 " 多变区 "(variable region, V 区 ), 它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位由于抗体多变区这一结构特点, 决定了它对抗原分子 " 识别功能 " 的多样性 ; 不同抗体分子的 C 端结构基本恒定, 称为 " 稳定区 "(constant region, C 区 ) 当抗原与抗体结合时, 抗体分子发生变构效应和集聚作用, 使稳定区的某些部位暴露出来, 并立即发生一系列免疫生理效应, 如固定补体, 促进对抗原分子的吞噬溶解和清除作用图 8-1 IgG1 的基本结构 Fig 8-1. The N-terminal end of IgG1 is characterized by sequence variability(v) in both the heavy and light chains, referred to as the VH and VL regions respectively. The rest of the molecule has a relatively constant(c) structure. The constant portion of the light chain is termed the

4 CL region. The constant portion of the heavy chain is further divided into three structurally discrete regions: CH1, CH2 and CH3. These globular regions, which are stabilized by intrachain disulphide bonds, are referred to as 'domains'. The sites at which the antibody binds antigen are located in the variable domains. The hinge region is a segment of heavy chain between the CH1 and CH2 domains. Flexibility in this area permits the two antigen-binding sites to operate independently. There is close pairing of the domains except in the CH2 region. Carbohydrate moieties are attached to the CH2 domains. 免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在 г- 球蛋白区域, 因此以前有人把 г- 球蛋白误认为就是抗体其实 г- 球蛋白不全是抗体, 而抗体也不全在 г- 球蛋白区域内 ( 见图 8-2) 图 8-2 人血清免疫球蛋白的分布 Fig8-2 Electrophoresis of human serum showing the distribution of the four major immunoglobulin classes. Serum proteins are separated according to their charges in an electric field, and classified as a1, a2, b and g, depending on their mobility. (IgE class has a similar mobility to IgD but cannot be represented quantitatively because of its low level in serum). IgG

5 exhibits most charge heterogeneity, the other classes having a more restricted mobility in the b and fa8 4 抗原抗体的结合体外抗原抗体反应又称血清学反应 (serologic reaction), 因抗体主要存在于血清中, 试验时一般都采用血清标本, 故名但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定, 如对淋巴细胞表面分化抗原的鉴定因此, 血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代抗原与抗体在体外结合时, 可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种反应, 例如凝集沉淀补体结合及中和反应等在此基础上进行改进, 又衍生出许多快速而灵敏的抗原抗体反应, 例如从凝集反应衍生出间接凝集反向间接凝集凝集抑制试验协同凝集试验等 ; 从沉淀反应结合电泳, 衍生出免疫电泳对流免疫电泳火箭电泳等此外, 还有各种免疫标记技术, 如免疫荧光酶免疫测定放射免疫免疫电镜及发光免疫测定等抗原抗体结合具有高度特异性, 即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反应抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目性质和空间构型, 而抗体的特异性则取决于抗体 Ig Fab 段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力抗原与抗体不是通过共价键, 而是通过很弱的短矩引力而结合, 如范德华引力 (Van der waal's attraction force) 静电引力(electrostatic force) 氢键(hydrogen bond) 及疏水性作用 (hydrophobic effect) 等范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比 (F2=1 / d 7 ), 即两者越靠近, 此引力越大这种引力能否最大限度地发挥作用, 关键在于分子的空间构型抗原与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用, 它可增加两种分子结合在一起的倾向, 形成特异性抗原抗体复合物若一个分子在形态上有一个凹陷, 它能准确地与另一分子突出的基因互补, 如同抗原抗体酶底物系统的活性部位的相互作用, 这种相互作用可产生最强的 Van der Waal 接触静电引力又称库仑引力 (Coulumbic attraction force) 发生在带有相反电荷的基团之间, 例如 NH3 + 与 COO- 之间这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比 (F2=1 / d 2 ) 若两个分子间有可能发生电荷转移的部位, 该部位也可能产生静电引力氢键可在共价键结合的氢原子间产生氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合, 再与另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用, 就形成了氢键例如 : -O H-O- -O H-N- -N H-N-

氢键较弱, 键能的大小取决于方向, 即氢键具有方向性在抗原抗体反应中氨基或羧基是主要的供氢体,H+ 必须直接对着或靠近带负电荷的受体原子, 才能产生强的氢键能, 若间接对着, 键能则非常小氢键比 Van der Waal 引力更特异, 因为它需要分子上存在互补的供氢体和受体基团疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反应中十分重要抗原和抗体分子上的疏水决定簇在水中不形成氢键,

6 氢键较弱, 键能的大小取决于方向, 即氢键具有方向性在抗原抗体反应中氨基或羧基是主要的供氢体,H+ 必须直接对着或靠近带负电荷的受体原子, 才能产生强的氢键能, 若间接对着, 键能则非常小氢键比 Van der Waal 引力更特异, 因为它需要分子上存在互补的供氢体和受体基团疏水性结合或疏水作用在各种抗原抗体相互反应中十分重要抗原和抗体分子上的疏水决定簇在水中不形成氢键, 因此倾向于彼此间相互吸引, 而不与水发生作用, 故称之为疏水性作用疏水性作用虽不是引力, 但它有助于抗原与抗体结合例如含有苯基的抗原决定簇倾向于被其他非极性基团围绕, 因此该抗原决定簇从水环境中移动进入抗体分子的 Fab 段的裂缝中, 与抗体结合这说明结合的高能量归因于苯基的疏水性作用上述这些引力当 ph 和离子强度在生理条件下, 通常是最大的 ph 值低于 3~4 或高于 10.5, 这些引力非常弱, 以致抗原抗体复合物易解离抗原与抗体结合有高度特异性, 这种结合虽具有相当稳定性, 但为可逆反应因抗原与抗体两者为非共价键结合, 犹如酶和底物的结合一样, 两种分子间不形成稳定的共价键, 因此在一定条件下可以解离图 8-3 沉淀反应 Fig8-3 The classical illustration of the antigen-antibody reaction in vitro is the precipitin reaction. As increasing concentrations of antigen are added to a constant amount of antibody, the amount of immune complex precipitated rises and then falls. The precipitin curve

7 generated in this way has three zones: Antibody excess zone: the amount of antigen is insufficient to react with and precipitate all the antibody present; thus free antibody can be detected in the supernatant. Equivalence zone: the added antigen is sufficient to combine with and precipitate all the antibody present and neither free antigen nor antibody can be detected in the supernatant. Antigen excess zone: the amount of antigen exceeds that required to bind all the antibody, and this leads to a reduction in the amount of antibody precipitated. This fall is due to the solubilization of the antigen-antibody complexes by the excess antigen. The extent to which this phenomenon occurs varies with different antibodies and with the species from which the antibody is derived. 抗原与抗体的结合, 在一定浓度范围内, 只有当两者分子比例合适时, 才出现可见反应以沉淀反应为例, 分子比例合适, 沉淀物产生既快又多, 体积大分子比例不合适时, 沉淀物产生少, 体积小, 或不产生沉淀物对参与沉淀反应的抗原抗体系统可进行定量测定, 即将抗体置于一系列的试管中, 加入不同量的相应纯抗原, 混合后, 观察所发生的反应, 对沉淀物可作精确定量若抗体量固定不变, 抗原量逐渐增加, 可观察沉淀反应中抗原抗体分子的比例关系由图 8-3 可见有三个抗原抗体相互作用的区带,1) 抗体过剩区 (antibody excess zone): 加入抗原量少, 则沉淀物少, 上清液中有游离的抗体 (free antibody) 2) 平衡区 (equivalence zone): 抗原量逐渐增加, 沉淀物也逐渐增多, 直到抗原抗体比例最佳时, 则出现连续而稳定的抗原抗体晶格 (lattice) 沉淀, 此时沉淀物中抗原抗体复合物量最多, 上清中测不到游离的抗原 (free antigen) 或抗体, 此为平衡区或等价带 3) 抗原过剩区 (antigen excess zone): 抗原量继续增加, 所有抗体均与抗原结合, 此时上清液中可测出游离的抗原, 在此区带中, 由于抗原过剩, 则形成可溶性抗原抗体复合物, 因而沉淀反应部分或完全被抑制抗体与抗原的结合是否出现可见反应, 则与抗原抗体的胶体特性及极性基吸附作用有关抗体球蛋白和抗原 ( 大多为蛋白质也有为多糖类脂或其它化合物 ) 在溶液中均属于胶体物质, 带有电荷胶体粒子又有许多强极性基 ( 如蛋白质的羧基氨基及肽链等 ), 它们与水有很强的亲和力, 以致在粒子外周构成水层, 称为亲水胶体胶体粒子不带水层者, 称为疏水胶体胶体粒子的稳定性即依赖于所带的水层及电荷, 其中亲水胶体的稳定性较高抗体和大多数抗原均属于亲水胶体抗体球蛋白中的氨基酸在水溶液中发生电离, 放出负电荷和正电荷在一定的 ph 中, 胶体粒子所带的负电荷与正电荷相等, 此称为等电点 (isoelectric point, pi) 当溶液的 ph 大于其等电点, 则羧基电离, 胶体粒子带负电荷反之, 当溶液 ph 小于其等电点时, 则氨基电离, 胶体粒子带正电荷特异性抗体

8 与相应抗原间有相应的极性基, 它们互相吸引而结合抗原抗体反应一般分为两个阶段, 第一阶段为抗原和抗体的特异性结合, 此阶段需时很短, 仅几秒到几分钟, 但无可见现象出现接着为第二阶段, 即可见反应阶段, 表现为凝集沉淀细胞溶解等此阶段较长, 历时数分钟数小时以致数天此阶段反应现象的出现可受多种因素的影响抗原与抗体一般为蛋白质, 它们在溶液中都具有胶体性质, 当溶液的 ph 大于它们的等电点时, 例如, 在中性和弱碱性的水溶液中, 它们大多表现为亲水性, 且带有一定量的负电荷特异性抗原和抗体有相对应的极性基, 抗原和抗体的特异性结合, 也就是这些极性基的相互吸附抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性, 此时易受电解质影响如有适当浓度的电解质存在, 就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚, 于是出现明显的凝聚或沉淀现象若无电解质存在, 则不发生可见反应抗原抗体反应, 特别是第二阶段受温度的影响很大在较高的温度中, 由于抗原抗体复合物碰撞机会增多, 复合物体积继续增大的机会也多, 故反应现象加速出现但温度过高 (56 以上 ), 则抗原或抗体将变性或破坏一般常置于 37 的恒温水浴中, 使反应讯速出现合适的 ph 是抗原抗体反应必要的条件之一 ph 过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质 5 动物的常规免疫由于动物的遗传性不同, 同一抗原对不同的动物或同种不同品系动物, 甚至不同个体, 产生特异免疫应答的强弱是不同的因此进行动物免疫时, 必须选择对该抗原敏感的年轻的健康动物常用的实验动物有 : 马羊兔豚鼠和鼠等当抗原初次进入具有免疫应答能力的动物体内后, 经过一段较长的潜伏期才出现抗体, 又经过一段高峰期后, 抗体量逐渐下降至消失这段时期总的抗体量是较低的, 主要的抗体成分是 IgM, 此为抗体对抗原的 " 初次应答 " 当抗原再次进入该机体时, 血清中抗体很快出现, 含量和亲和力也高于初次应答, 其抗体的主要成分是 IgG, 此为 " 再次应答 " 某些物质若先于抗原或与抗原一起注入人体, 可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型, 此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant), 简称 (adjuvant) 佐剂一般分为 :1) 无机佐剂, 如氢氧化铝, 明矾等 ;2) 有机佐剂, 包括微生物及其代谢产物, 如分枝杆菌 ( 结核杆菌卡介苗 ) 短小棒状杆菌百日咳杆菌革兰氏阴性杆菌的内毒素等;3) 合成佐剂, 包括人工合成的双链多聚核苷酸, 如双链多聚肌苷酸胞苷酸 (poly I:C) 双链多聚腺苷酸尿苷酸(poly A:U) 等 ;4) 油剂, 如弗氏佐剂花生油乳化佐剂矿物油植物油等弗氏佐剂是目前在动物实验中最常用的佐剂, 可分为弗氏不完全佐剂 (incomplete Freund's adjuvant, IFA) 和弗氏完全佐剂 (complete Freund's adjuvant, CFA) 两种前者是将抗原和油剂 ( 石蜡油或花生油 ) 混合, 再加入乳化剂 ( 羊毛脂或吐温 -80), 使成为油包水乳剂, 即为 IFA 在 IFA 中加入死的分枝

9 杆菌 ( 如灭活结核杆菌 ) 就成为 CFA CFA 作用较弱, 但易在注射部位形成肉芽肿和持久性溃疡, 因而不适于人体使用佐剂的生物学作用为 :1) 增强免疫原性, 使无或微弱免疫原性的物质变成有效的免疫原 ;2) 可提高初次应答和再次应答的抗体滴度 ;3) 改变抗体类型, 使由产生 IgM 转变为产生 IgG;4) 引起或增强迟发型超敏反应动物个体的不同组织部位对抗原刺激的敏感性也是不同的淋巴结脾脏足掌眼睫膜等是反应的敏感部位, 也是免疫动物的常用部位异体蛋白在佐剂参与下, 可诱发机体产生免疫应答, 获得相应的抗体如果抗原的免疫原性很强, 在基础免疫 ( 第一次免疫 ) 之后, 加强免疫 3~4 次, 便可获得较高效价的抗血清 (antiserum) 6 双向免疫扩散及免疫电泳将可溶性抗原 ( 如小牛血清 ) 与相应抗体 ( 如兔抗小牛血清的抗体 ) 混合, 当两者比例合适并有电解质 ( 如氯化钠磷酸盐等 ) 存在时, 即有抗原抗体复合物的沉淀出现, 此为沉淀反应 (precipitin reaction) 如以琼脂凝胶为支持介质, 则在凝胶中出现可见的沉淀线沉淀弧或沉淀峰根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡, 可定性定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量免疫学的一些测定方法即基于此特性双向扩散法 (double diffusion), 最早由 Ouchterlony 创立, 故又称 Ouchterlony 法此法是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应琼脂凝胶是多孔的网状结构, 大分子物质可以自由通过, 这种分子的扩散作用使分别两处的抗原和相应抗体相遇, 形成抗原抗体复合物, 比例合适时出现沉淀由于凝胶透明度高, 可直接观察到复合物的沉淀线 ( 弧 ) 沉淀线( 弧 ) 的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小分子结构扩散系数和浓度等因素当抗原抗体存在多种系统时, 会出现多条沉淀线 ( 弧 ) 依据沉淀线 ( 弧 ) 可以定性抗原此法操作简便灵敏度高, 是最为常用的免疫学测定抗原和测定抗血清效价的方法 ( 见图 8-4) 图 8-4 免疫双向扩散法

Fig8-4 In immuno-double-diffusion, agar gels are poured onto slides and allowed to set, wells are then punched in the gel and the test solutions of antigen(ag) and antibody(ab) are added.

10 Fig8-4 In immuno-double-diffusion, agar gels are poured onto slides and allowed to set, wells are then punched in the gel and the test solutions of antigen(ag) and antibody(ab) are added. The solutions diffuse out and where Ag and Ab meet they bind to each other, cross-link and precipitate leaving a line of precipitation. This technique may be used to determine the relationship between antigens and a particular test antibody. Three basic patterns appear. In

reaction(a) the precipitin arcs formed between the antibody and the two test antigen fuse, indicating that the antibody is precipitating identical epitopes in each preparation(epitope 1).

11 reaction(a) the precipitin arcs formed between the antibody and the two test antigen fuse, indicating that the antibody is precipitating identical epitopes in each preparation(epitope 1). This does not mean that the antigens are necessarily identical, they are only identical in as far as the antibody cannot distinguish a difference. In reaction(b) the antibody preparation distinguishes the three different antigens, which form independent precipitin arcs. In reaction(c) the antigens share epitope 1 but one antigen also has epitope 2. This is the same situation as in (a), but in this case the antibody can distinguish them, by virtue of being able to react against both epitopes. A line of identity forms with anti-epitope 1, with the addition of a 'spur' where the anti-epitope 2 has reacted with the second epitope, thus indicating partial rather than total identity between the antigen preparations. 图 8-5 免疫电泳法 Fig 8-5 Immunoelectrophoresis allows the comparison of complicated mixtures of antigen such as are found in serum. 1. Antigens are separated in an agar gel by placing an electric charge across it. The gel's ph is chosen so that positively charged proteins move to the negative electrode and negatively charged proteins to the positive. 2. A trough is then cut between the wells and filed with the antibody, which is left to diffuse. 3. The antigens and antibody form precipitin arcs.

12 免疫电泳法 (immunoelectrophoresis)( 见图 8-5) 是在凝胶介质中将电泳法与扩散法相结合的一种免疫化学方法, 用以研究抗原和抗体免疫电泳是使血清在琼脂或琼脂糖中进行的电泳在一定电场强度下, 由于血清中各种免疫球蛋白的分子大小以及荷电状态和荷电量均有差异, 因而它们的泳动速率也各不相同, 加上电泳过程中电渗作用的影响, 使各自组分得到分离在一定电场强度下, 抗原与相应抗体在琼脂介质中加速扩散相遇而形成复合物沉淀, 这种检测方法称作电免疫扩散法 (electroimmunodiffusion) 由于操作方法不同, 电免疫扩散法可分为对流免疫电泳 (countercurrent immunoelectrophoresis)( 见图 8-6), 交叉免疫电泳 (crossed immunoelectrophoresis) 和火箭免疫电泳 (rocket immunoelectrophoresis)( 见图 8-7) 图 8-6( 上图 ) 对流免疫扩散法图 8-7( 下图 ) 火箭免疫电泳法

Fig 8-6, 8-7 Countercurrent electrophoresis is performed in agar gels where the ph is chosen so that the antibody is positively charged and the antigen being tested is negatively charged.

13 Fig 8-6, 8-7 Countercurrent electrophoresis is performed in agar gels where the ph is chosen so that the antibody is positively charged and the antigen being tested is negatively charged. By applying a voltage across the gel the antigen and antibody move towards each other and precipitate. The principle is the same as for immuno-double-diffusion but the sensitivity is increased fold. Antigens may be quantitated by electrophoresing them into an antibody-containing gel in the technique termed rocket electrophoresis. The ph of the gel is chosen so that the antibodies are immobile and the antigen is negatively charged. Precipitin rockets form; the height of the rocket is proportional to antigen concentration, and unknowns are

14 determined by interpolation from standards. The appearance of stained rockets is shown an the right. Both techniques rely on the antigen and antibody having different charges at the selected ph; this is true for most antigens since antibodies have a relatively high isoelectric point (i.e. they are neutrally charged at a more alkaline ph than most antigens). If the charges on the antigen and antibody do not differ sufficiently, the antibody or antigen can be chemically modified to alter its isoelectric point. Rocket electrophoresis can be reversed to estimate antibody concentration if a suitable ph gel can be found to immobilize the antigen, without damaging it or preventing the antigen-antibody reaction. 7 酶联免疫吸附法酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA) 或免疫酶技术 (immunoenzymatic technique) 是指用酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应它采用抗原与抗体的特异反应与酶连接, 然后通过酶与底物产生颜色反应, 用于定量测定目前常用的方法称为酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 其方法简单, 方便讯速, 特异性强 ELISA 是由抗原 ( 抗体 ) 先结合在固相载体上, 但仍保留其免疫活性, 然后加一种抗体 ( 抗原 ) 与酶结合成的偶联物 ( 标记物 ), 此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性, 当偶联物与固相载体上的抗原 ( 抗体 ) 反应后, 再加上酶的相应底物, 即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色其所生成的颜色深浅与欲测的抗原 ( 抗体 ) 含量成正比 ( 见图 8-8) 图 8-8 酶联免疫吸附法

Fig 8-8 ELISA. 1. Antigen in saline is incubated on a plastic plate or tube, and small quantities become absorbed onto the plastic surface. 2. Free antigen is washed away.

15 Fig 8-8 ELISA. 1. Antigen in saline is incubated on a plastic plate or tube, and small quantities become absorbed onto the plastic surface. 2. Free antigen is washed away. (The plate may then be blocked with excess of an irrelevant protein to prevent any subsequent non-specific binding of proteins). 3. Test antibody is added, which binds to the antigen. 4. Unbound proteins

16 are washed away. 5. The antibody is detected by a ligand. The ligand is a molecule which can detect the antibody and is covalently coupled to an enzyme such as peroxidase. 6. This binds the test antibody and after free ligand is washed away. 7. The bound ligand is visualized by the addition of chromogen-a colourless substrate which is acted on by the enzyme portion of the ligand to produce a coloured end-product. 8. A developed plate is shown in the lower panel. The amount of test antibody is measured by assessing the amount of coloured end-product by optical density scanning of the plate. 酶免疫测定技术还包括生物素亲和素系统 (biotin-avidin system, BAS), 均相酶免疫测定法 (homogeneous enzyme immunoassay, HEI) 等免疫标记技术中还有免疫荧光技术 (immunofluorescence technique), 放射免疫测定 (radioimmunoassay, RIA) 和发光免疫测定 (luminescent immunoassay, LIA) 等此外, 免疫印迹或免疫转印技术 (immunoblotting 或 Western blot) 已广泛应用于分子生物学和医学领域, 成为免疫学微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法实际上它是由十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE), 蛋白质转印和固相免疫测定三项技术结合而成其基本原理是蛋白质样品经过 SDS-PAGE 分离后, 通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上, 并保持其原有的物质类型和生物学活性不变, 然后应用抗原抗体反应进行特异性检测由于此技术具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性, 方法简便, 标本可长期保存, 便于比较 ( 见图 8-9) 图 8-9 免疫印迹

17 Fig 8-9 In immunoblotting, antigen samples are first separated in an analytical gel, for example an SDS-PAGE. The resolved molecules are transferred electrophoretically to a nitrocellulose membrane in a blotting tank. The blot is then treated with antibody to the specific antigen, washed, and a radiolabelled conjugate to detect antibodies is bound to the blot. The principle is similar to that of a RIA or ELISA. After washing again, the blot is placed in contact with X-ray film in a cassette; the autoradiograph is developed and the antigen bands which have bound the antibody are visible. The technique can be modified for use with a chemiluminescent label or an enzyme-coupled conjugate (as in ELISA), where the bound material can be detected by treatment with a chromogen which deposits an insoluble reagent directly onto the blot. Glossary of immunochemical terms Antigen A substance which is recognized and bound by an antibody. Antiserum Serum from an animal containing antibodies reacting with particular antigens. Sometimes known as an immune serum.

18 Autoantibodies Antibodies that react with self antigen(s). These are not normally present in blood or body fluids, but, if present, are often associated with pathological conditions known as autoimmune diseases, e.g. rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus(sle), primary biliary cirrhosis. Clone A growing population of cells, derived from a single progenitor cell. The clone is derived asexually by continued division and all cells are genetically identical unless mutation occurs during growth.. Epitope A site on the antigen that is recognized and bound by an antibody. It is normally about six amino acids or carbohydrate residues in size. Epitopes on protein antigens may not be continuous in structure. Sometimes also called an antigenic determinant. Microtitre plate Plastic plate containing many(usually 96) wells in which many types of immunoassay may be carried out more conveniently than in individual tubes. The wells may be flat-bottomed for use in ELISA, U-shaped for use in RIA or V-shaped for haemagglutination tests. They may be flexible or rigid. Peptide A molecule consisting of a number of amino acid residues linked by peptide bonds. Large peptides are sometimes called polypeptides and/or proteins. Plasma Fluid obtained from uncoagulated blood after removal of cellular components. Differs from serum(see below) in containing all components of the coagulation system. Its preparation necessitates the use of an anticoagulant, e.g. heparin, citrate. Serum Fluid derived from coagulated blood after removal of the clot and cell components.

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation 抗原 (antigen,ag) 第一节抗原的概念和特点一抗原的性质 ( 一 ) 概念抗原 (antigen, Ag) 指所有能启动激发和诱导免疫应答的物质, 其可被 T B 淋巴细胞表面的特异性受体 (TCR 或 BCR) 识别及结合, 激活 T/B 细胞产生应答产物 ( 特异性抗体或效应淋巴细胞 ), 并与之发生特异性反应 ( 二 ) 特性 1. 免疫原性 (immunogenicity