2270 第三军医大学学报,2016,38(20) htp://aammt.tmmu.edu.cn controlgroup(p<005).westernblotanalysisshowedthattheexpresionoftotalpkd1wasnotobviously changedbybmp

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七丁
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1 2269 DOI: /j 骨形态发生蛋白 7 改善糖代谢的作用及其机制姜友昭, 练渝, 曾俊, 陈文, 陈兵 ( 重庆, 第三军医大学西南医院内分泌科 ) [ 摘要 ] 目的探索骨形态发生蛋白 7(bonemorphogeneticprotein7,BMP7) 对 2 型糖尿病小鼠糖代谢的影响及其机制方法将 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠, 采用小剂量链脲佐菌素注射联合高脂喂养建立 2 型糖尿病小鼠模型将建模成功的小鼠分为 4 组 (n=20):2 型糖尿病模型组,PBS 对照组 (PBS 腹腔注射 ),BMP7 低剂量组 (BMP7,100μg/kg, 隔日腹腔注射 ),BMP7 高剂量组 (BMP7,200μg/kg, 隔日腹腔注射 ) 4 周后, 分别检测血糖血总胆固醇甘油三酯血清胰岛素水平体质量的变化, 并计算胰岛素分泌指数 HOMAβ 和胰岛素抵抗指数 HOMAIR 取小鼠胰腺,Westernblot 检测蛋白激酶 D1 (proteinkinased1,pkd1) 及磷酸化 PKD1 的表达变化结果与 2 型糖尿病模型组和 PBS 对照组相比,BMP7 高剂量组和低剂量组的血糖甘油三酯均明显降低 (P<005), 而血清胰岛素水平 HOMAβ 均显著升高 (P<005) BMP7 低剂量组和 BMP7 高剂量组的体质量均低于对照组 (P<005),BMP7 高剂量组的 HOMAIR 低于对照组 (P<005) Westernblot 检测发现 BMP7 处理组的 PKD1 蛋白表达量与对照组相比差异均无统计学意义 (P>005), 但磷酸化 PKD1 水平均明显升高 (P<005) 结论 BMP7 可以促进 2 型糖尿病小鼠的胰岛素分泌和改善其胰岛素敏感性, 从而降低血糖, 其改善胰岛素分泌作用可能与增加 PKD1 磷酸化有关 [ 关键词 ] 骨形态发生蛋白 7; 胰岛素分泌 ; 胰岛素抵抗 ; 蛋白激酶 D1;2 型糖尿病 [ 中图法分类号 ] Q591.4;R587.1;R977.6 [ 文献标志码 ] A Efectandmechanism ofbonemorphogeneticprotein7onglucosemetabolism JiangYouzhao,LianYu,ZengJun,ChenWen,ChenBing(DepartmentofEndocrinology,SouthwestHospital,Third MilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China) [Abstract] Objective Todeterminetheefectandinvestigatethemechanismofbonemorphogenetic protein7(bmp7)onglucosemetabolismintype2diabeticmice.methods C57BL/6mice(male,8weeks old)wereusedfortheestablishmentoftype2diabeticmousemodelbylowdosestreptozocininjection combinedwithhighfatchow.thetype2diabeticmiceweredividedinto4groups(n=20):type2diabetic micemodelgroup,pbscontrolgroup(i.p.,injectedwithphosphatebuferedsolution),lowdosebmp7 group(100μg/kg,i.p.injectioneveryotherday)andhighdosebmp7group(200μg/kg,i.p.injection everyotherday).fourweekslater,bloodglucose,totalbloodcholesterol,triglyceride,serum insulinand bodyweightweremeasured.theinsulinsecretionindexhomeostasismodelasesmentofβcel(homaβ) andinsulinresistanceindexhomairwerecalculated.finaly,themice spancreaswereresected,andthe proteinexpresionandphosphorylationlevelofproteinkinased1(pkd1)weredetectedbywesternbloting. Results ComparedwiththemodelgroupandPBScontrolgroup,thebloodglucoseandtriglyceridewere significantlydecreased,andtheinsulinlevelandhomaβindexweresignificantlyincreasedinbothlowdose andhighdosebmp7groups(p<005).bmp7treatmentresultedinsignificantreductionofbodyweight comparedwiththecontrolgroup(p<005).thehonmairwaslowerinhighdosebmp7groupthaninthe [ 基金项目 ] 重庆市自然科学基金 (CSTC2012jA10073) [ 通信作者 ] 陈兵, chenbing3@medmail.com.cn [ 优先出版 ] htp://

2 2270 第三军医大学学报,2016,38(20) htp://aammt.tmmu.edu.cn controlgroup(p<005).westernblotanalysisshowedthattheexpresionoftotalpkd1wasnotobviously changedbybmp7treatment(p>005),butthephosphorylationofpkd1wasgreatlyincreasedinbothbmp7 groupscomparedwiththecontrol(p<005).conclusion BMP7improvesglucosemetabolism through enhancinginsulinsecretionandatenuatinginsulinresistance.itsefectoninsulinsecretionmaybeasociated withincreasedphosphorylationofpkd1. [Keywords] bonemorphogeneticprotein7;insulinsecretion;insulinresistance;proteinkinased1; type2diabetes 目前认为 2 型糖尿病发病的中心环节是胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足 [1] 因此现有的糖尿病药物大多通过改善这两个因素来发挥降血糖作用, 如二甲双胍罗格列酮等药物主要通过改善胰岛素敏感性发挥作用 [2], 而磺脲类药物二肽基肽酶抑制剂的作用环节主要在促进胰岛素分泌 [3] 但是比较遗憾的是目前尚缺乏具有明确的同时改善以上两个环节的药物骨形态发生蛋白 7(bonemorphogeneticprotein7, BMP7) 是 TGFβ 超家族成员之一, 研究发现 BMP7 除参与肾脏的胚胎发育 [4] [5] 骨骼形成与骨折愈合等病理生理过程外, 还可诱导棕色脂肪的形成 [6] 减少摄食增加能量消耗降低体质量 [7] 鉴于肥胖在胰岛素抵抗发生中的重要作用,BMP7 可能通过降低体质量改善机体的胰岛素抵抗而且我们在前期研究中发现人血清 BMP7 水平与空腹胰岛素和胰岛素分泌指数呈明显正相关 [8] 在进一步的细胞研究中, 我们发现 BMP7 可促进其胰岛素分泌 [9] 以上研究结果提示, BMP7 有潜力成为同时改善胰岛素抵抗和胰岛素分泌的药物治疗靶点本研究以 2 型糖尿病小鼠模型为研究对象, 观察 BMP7 对其血糖血脂胰岛素抵抗和胰岛素分泌相关指标的影响, 并初步探索 BMP7 改善胰岛素分泌的机制, 以期为 2 型糖尿病的临床治疗提供新的线索和靶点 1 材料与方法 1.1 材料动物 8 周龄雄性 C57BL/6 小鼠 24 只, 体质量 18~24g, 购自第三军医大学实验动物中心, 饲养于 22 室温, 相对湿度 60% 的环境中试剂重组人骨形态发生蛋白 7(rhBMP7) (PROSPEC, 以色列 ) 链脲佐菌素 (STZ,Sigma, 美国 ), 临用前溶解在 10mmol/L 的柠檬酸缓冲液, 调节 ph 至 4.5 小鼠胰岛素检测试剂盒 (Mercodia, 瑞典 ) PKD1 抗体购自 Santa Cruz 公司,phosphoPKD1 (Ser916) 抗体购自 CelSignaling 公司,Tubulin 抗体购自 Beyotime 公司 1.2 方法型糖尿病小鼠模型的建立采用小剂量 STZ 腹腔注射联合高脂高糖饮食建立 2 型糖尿病小鼠模型 : 注射 STZ 前后均采用高脂饮食 (10.0% 猪油, 200% 蔗糖,2.5% 胆固醇,1.0% 胆酸盐,66.5% 常规饲料配制 ) [10], 然后一次性给予 STZ40mg/kg 腹腔内注射 STZ 注射 3d 后尾静脉采血测定血糖, 随机血糖大于 16.7mmol/L 证明造模成功动物分组及处理造模过程中 4 只小鼠死亡, 将造模成功的小鼠 20 只, 分为 4 组, 每组 5 只 : 12 型糖尿病模型组 ;2PBS 对照组 ;3BMP7 小剂量组 : 给予 rhbmp7 剂量为 100μg/kg, 隔日腹腔注射 ; 4BMP7 大剂量组 : 给予 rhbmp7 剂量为 200μg/kg, 隔日腹腔注射每周检测血糖 4 周后, 进行相关指标检测和分析血生化指标胰岛素的测定小鼠空腹 12h 后, 收集血标本, 用全自动生化分析仪测定血糖总胆固醇 (TC) 甘油三酯 (TG), 胰岛素含量应用相应的试剂盒, 按照说明书进行检测计算胰岛素分泌指数 HOMAβ 和胰岛素抵抗指数 HOMAIR: HOMAβ(%)=20 空腹胰岛素水平 (miu/l)/[ 空腹血糖水平 (mmol/l)-3.5] HOMAIR= 空腹血糖水平 (mmol/l) 空腹胰岛素水平 (miu/l)/ Westernblot 检测取胰腺组织约 100mg 加入 0.5mL 预冷的蛋白裂解液 ( 含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂 ), 匀浆, 离心并收集上清 BCA 法测定蛋白浓度取 30μg 上样, 以 SDSPAGE 凝胶电泳, 然后 100V 恒压湿转至 PVDF 膜上,5%BSA 溶液室温封闭 2h, 分别用 PKD1 phosphopkd1 和 Tubulin 一抗 4 摇床孵育过夜孵育完后以 TBST 洗膜 3 次, 加入相应二抗于室温孵育 1h TBST 洗膜 3 次, 最后加入化学发光底物于室温反应 2min, 将 PVDF 膜放入凝胶

腹腔注射均可以降低小鼠的甘油三酯水平 (P< 005), 但是 BMP7 对小鼠的胆固醇水平无明显影响 (P>005, 图 2) " " "!

3 2271 成像仪中采集图像结果 1.3 统计学方法计量资料以 x±s 珋表示, 采用 SPSS19.0 统计软件, 不同组别之间的比较采用 t 检验 2 结果在造模过程中, 共有 4 只糖尿病小鼠死亡, 可能与血糖过高导致的糖尿病并发症有关 2.1 BMP7 降低 2 型糖尿病小鼠的血糖血脂与 PBS 对照组相比,1 周后 BMP7 低剂量组和高剂量组的空腹血糖均明显降低 (P<005), 其降血糖效应一直持续至 4 周实验观察结束时并且 BMP7 高剂量组血糖低于低剂量组 (P<005), 提示 BMP7 的降血糖作用呈现出剂量依赖性 ( 图 1) 通过检测各组的甘油三酯和胆固醇后发现, 低剂量和高剂量的 BMP7 腹腔注射均可以降低小鼠的甘油三酯水平 (P< 005), 但是 BMP7 对小鼠的胆固醇水平无明显影响 (P>005, 图 2) " " "! a:p<005, 与 PBS 对照组比较 ;b:p<005, 与 BMP7 低剂量组比较图 1 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠血糖的影响 " 1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 2 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠血脂的影响 2.2 BMP7 促进 2 型糖尿病小鼠的胰岛素分泌如图 3 所示, 与 PBS 对照组相比,BMP7 低剂量组和高剂量组的空腹胰岛素水平明显升高 (P<005) 通过计算胰岛素分泌指数 HOMAβ 后,BMP7 处理组的 HOMAβ 指数显著高于 PBS 对照组 (P<005, 图 4) 1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 3 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠胰岛素浓度的影响 1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 4 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠 HOMAβ 指数的影响 (n=5, x±s) 珋 2.3 BMP7 降低 2 型糖尿病小鼠的体质量和胰岛素抵抗指数 BMP7 处理组小鼠体质量明显低于对照组 (P< 005, 图 5) 体质量的下降可能导致胰岛素敏感性增加我们通过计算 HOMAIR 指数来反映小鼠的胰岛素抵抗情况结果发现,BMP7 高剂量组 HOMAIR 显著低于对照组 (P<005), 但 BMP7 低剂量组的 HOMAIR 与对照组相比差异无统计学意义 (P> 005, 图 6) 2.4 BMP7 增加小鼠胰岛磷酸化 PKD1 的表达前期细胞研究中我们发现 BMP7 的促胰岛素分泌作用不依赖于钙离子内流, 而 PKD1 的表达调控是非钙离子内流的促胰岛素分泌的重要途径我们检测了 BMP7 处理后小鼠胰岛 PKD1 的表达结果发现, 处理前后,PKD1 表达无明显变化, 但 BMP7 处理组磷酸化 PKD1(pPKD1) 的表达明显增加 (P<005) 提示

4 2272 第三军医大学学报,2016,38(20) htp://aammt.tmmu.edu.cn BMP7 的促胰岛素分泌作用可能通过 PKD1 的表达调控实现 ( 图 7) 1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 5 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠体质量的影响 1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 6 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠 HOMAIR 的影响!" # A:Westernblot 检测 ;B: 相对表达量 ;1:T2DM 组 ;2:PBS 对照组 ;3:BMP7 低剂量组 ;4:BMP7 高剂量组 a:p<005, 与 PBS 对照组比较图 7 Westernblot 检测 BMP7 对各组 2 型糖尿病小鼠 PKD1 及 ppkd1 表达的影响 $ 3 讨论胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是导致 2 型糖尿病发病的两大根本因素在前期的细胞实验中, 我们已经发现 BMP7 可以促进 MIN6 胰岛细胞的胰岛素分泌但是在体实验中,BMP7 是否能够发挥相似的作用而达到降糖疗效尚不清楚由于 BMP7 是一种细胞因子, 其在组织中分泌后, 可以直接进入血液中, 发挥生物学效应因此, 我们采用重组人 BMP7 蛋白腹腔注射, 观测其对小鼠血糖的影响结果发现 BMP7 注射 1 周后,2 型糖尿病小鼠的血糖就明显下降, 以后血糖一直维持在比较稳定的水平, 直到 4 周实验观察期结束, 证明 BMP7 有显著的降糖效果进一步检测 2 型糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平后发现,BMP7 注射可以使血浆胰岛素水平显著上升, 并且反映胰岛素分泌能力的 HOMAβ 指数也明显升高证实不管是在体中还是离体中,BMP7 均可以促进胰岛细胞胰岛素分泌胰岛素分泌的调控是一个很复杂的过程, 但总体来讲, 主要分近端步骤和末端步骤, 其中近端步骤主要受 Ca 2+ 内流调节, 而末端步骤除了 Ca 2+ 浓度依赖调节外, 还存在非 Ca 2+ 依赖的调节机制在前期研究中, 我们检测了 BMP7 处理的 MIN6 细胞的 Ca 2+ 内流情况, 结果发现, 重组人 BMP7 处理后,MIN6 细胞内的钙离子浓度并无明显变化 [9], 提示 BMP7 调控胰岛素分泌的机制可能在非 Ca 2+ 浓度依赖的胞吐环节有研究发现,PKD1 是介导反式高尔基体网 (TGN) 胰岛素囊泡分裂, 从而导致非 Ca 2+ 浓度依赖胞吐的关键分子 [11] 因此我们检测了 BMP7 对胰岛细胞 PKD1 表达的影响, 结果发现,BMP7 并未增加 PKD1 蛋白的表达, 但是 BMP7 组 PKD1 的磷酸化水平显著增加, 提示 BMP7 可能通过增加 PKD1 的磷酸化从而达到促进胰岛素分泌的作用有研究发现,BMP7 可以促进小鼠前体细胞向棕色脂肪细胞分化, 从而提高机体中棕色脂肪细胞的含量 [12] 而棕色脂肪细胞中含有大量的线粒体, 线粒体内膜解偶联蛋白 (UCP)1 活性较高, 有利于氧化呼吸链解偶联, 使 ATP 转化为热能, 将储存的能量以热能形式消耗掉 [13-14] 因此增加棕色脂肪的数量或功能被认为是防治肥胖及代谢综合征的有效手段 [15] 鉴于 BMP7 在促棕色脂肪形成中的关键作用,BMP7 水平有可能与代谢综合征及肥胖相关我们前期研究中发现, 血清 BMP7 水平与女性体质量指数呈负相

5 2273 关 [16] 本研究中, 我们观察了重组人 BMP7 对 2 型糖尿病小鼠血脂和体质量指数的影响, 结果发现 BMP7 组小鼠的甘油三酯水平明显下降, 而胆固醇水平与对照组无明显差异提示 BMP7 可能通过增加棕色细胞的脂肪酸氧化能力而发挥降血脂作用进一步实验发现,BMP7 可以降低 2 型糖尿病小鼠的体质量, 这与 [17] Tseng 等报道的一致而体质量的降低可能会导致胰岛素敏感性的改善我们的实验也发现,BMP7 高剂量组的胰岛素抵抗指数 HOMAIR 显著低于 PBS 对照组综上所述,BMP7 可以促进 2 型糖尿病小鼠的胰岛素分泌和改善其胰岛素敏感性, 从而降低血糖由于 BMP7 是一种存在于血液中的细胞因子, 因此其在 2 型糖尿病的治疗中具有广阔的应用前景参考文献 : [1] DimasA S,LagouV,BarkerA,etal.Impactoftype2 diabetessusceptibilityvariantsonquantitativeglycemictraits revealsmechanisticheterogeneity[j].diabetes,2014,63 (6): DOI: /db [2] ZhaoW,LiA,XinF,etal.Metforminandresveratrol ameliorate muscle insulin resistance through preventing lipolysisandinflammationinhypoxicadiposetisue[j].cel Signal,2016,28(9): DOI: /j. celsig [3] 中华医学会糖尿病学分会. 中国 2 型糖尿病防治指南 (2013 年版 )[J]. 中华内分泌代谢杂志,2014,30(10): [4] OxburghL,BrownA C,MuthukrishnanSD,etal.Bone morphogeneticproteinsignalinginnephronprogenitorcels [J].PediatrNephrol,2014,29(4): DOI: /s [5] MorisonZ,VicenteM,SchemitschEH,etal.Thetreatment ofatrophic,recalcitrantlongbonenonunion in theupper extremity with human recombinant bone morphogenetic protein7(rhbmp7) and platefixation: A retrospective review[j].injury,2016,47(2): doi: /j.injury [6] ZhengL, Liu JM, WangJX, etal. Efectofbone morphogeneticprotein7ondiferentiationofadiposederived mesenchymalstem celsintobrownadipocytesinrats[j]. ZhongguoYiXueKeXueYuanXueBao,2014,36(6): DOI: /j.isn X [7] Townsend K L, SuzukiR, Huang T L, etal. Bone morphogenetic protein 7 (BMP7) reverses obesity and regulatesappetitethrough acentralmtor pathway[j]. FASEBJ,2012,26(5): DOI: /fj [8] ZengJ,JiangY,XiangS,etal.Serumbonemorphogenetic protein7,insulinresistance,andinsulinsecretioninnon diabeticindividuals[j].diabetesresclinpract,2011,93 (1):e21-e24.DOI: /j.diabres [9] 姜友昭, 曾俊, 陈兵. 骨形态发生蛋白 7 对胰岛素分泌的影响及机制研究 [J]. 第三军医大学学报,2012,34(9): DOI: /j [10] 戚韵雯, 何选丽, 朱丽娟, 等. 糖尿病小鼠认知功能及不同时相点硫化氢的表达 [J]. 第三军医大学学报, 2013,35(24): DOI: /j [11] GoginashviliA,ZhangZ,ErbsE,etal.Insulingranules. Insulinsecretorygranulescontrolautophagyinpancreatic betacels[j].science,2015,347(6224): DOI: /science.aaa2628 [12] SainiS,DuraisamyAJ,BayenS,etal.RoleofBMP7in appetiteregulation,adipogenesis,andenergyexpenditure [J].Endocrine,2015,48(2): DOI: /s [13] LeeP,BovaR,SchofieldL,etal.BrownAdiposeTisue ExhibitsaGlucoseResponsiveThermogenicBiorhythm in Humans[J].CelMetab,2016,23(4): DOI: /j.cmet [14] ShanT,XiongY,ZhangP,etal.Lkb1controlsbrown adiposetisuegrowthandthermogenesisbyregulatingthe intracelularlocalization ofcrtc3[j]. NatCommun, 2016,7:12205.DOI: /ncomms12205 [15] OliverioM,SchmidtE,MauerJ,etal.Dicer1miR328 Bace1signalingcontrolsbrownadiposetisuediferentiation andfunction[j].natcelbiol,2016,18(3): DOI: /ncb3316 [16] 曾俊, 姜友昭, 陈兵. 血清骨形成蛋白 7 浓度与女性肥胖的相关性研究 [J]. 第三军医大学学报,2011,33(8): DOI: /j [17] TsengY H,KokkotouE,SchulzTJ,etal.Newroleof bonemorphogeneticprotein7 inbrownadipogenesisand energyexpenditure[j]. Nature, 2008, 454(7207): DOI: /nature07221 ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑栾嘉 )

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中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (