保健产品资源的开发提供参考 1 仪器与试剂 1.1 材料与试剂芦笋于 2016 年 4 月采自湖南省沅江市, 经湖南中医药大学中药教研室肖锦仁副教授鉴定为禾本科芦苇属植物芦苇 [Phragmites communis (Cav.) Trin.] 的嫩芽, 标本现保存于湖南中医药大学中药化学教研室,

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翁理称
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1 HPLC 测定沅江产芦笋中 3 种酚酸和 6 种黄酮类成分含量张雨林, 詹济华, 谭洋, 李玲 *, 裴刚 * ( 湖南中医药大学药学院, 长沙 ) 摘要 : 目的建立同时测定沅江产芦笋中原儿茶酸绿原酸香草酸柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素含量的 HPLC 方法采用 Diamonsil C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm), 以甲醇 -0.1 % 甲酸水溶液为流动相, 梯度洗脱, 双波长检测 ( 酚酸 :283,327 nm; 黄酮 :283,335 nm), 流速 1 ml min, 柱温 35, 进样量为 10 μl 结果 3 种酚酸及 6 种黄酮分别在 25 min 和 50 min 内分离, 线性范围为 14.8~500 ml 1 (r= ~ ), 检测限 ~ ml 1, 定量限 ~ ml 1, 加样回收率为 98.73%~102.44%,RSD 为 1.27%~2.20%(n=6) 结论该方法准确灵敏重复性好, 可用于检测芦笋中 9 种成分含量关键词 : 芦笋 ; 酚酸 ; 黄酮 ; 高效液相色谱法中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2018) DOI: /j.cnki.issn 引用本文 : 张雨林, 詹济华, 谭洋, 等. HPLC 测定沅江产芦笋中 3 种酚酸和 6 种黄酮类成分含量 [J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(9): Quantitative Determination of Three Phenolic Acids and Six Flavonoids of Phragmites Communis (Cav.) Trin. ex Steud from Yuanjiang by HPLC ZHANG Yulin, ZHAN Jihua, TAN Yang, LI Ling *, PEI Gang * (School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish quantitative determination method of the protocatechuic acid, chlorogenic acid, vanillic acid, naringin, rutin, quercetin, luteolin, kaempferol and apigenin in Phragmites communis (Cav.) Trin. ex Steud from Yuanjiang by HPLC. METHODS The chromatographic separation was performed on a Diamonsil C 18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm) kept at 35, using methanol-0.1% formic acid aqueous as the mobile phase at a flow rate of 1 ml min through gradient elution, and the detection wavelength was set at dual wavelength(phenolic acids: 283, 327 nm; flavonoids: 283, 335 nm), the injection volume was 10 L. RESULTS The three phenolic acids and six flavonoids were isolated at 25 min and 50 min, the method exhibited linear range of g ml 1 (r= ), the limits of detection(lod) was ml 1, the limits of quantification(loq) was ml 1 and the recovery rate was 98.73% %, RSD was 1.27% 2.20%(n=6). CONCLUSION The method is accurate, sensitive, reproducible, and can be used to detect and quantitative the nine components in Phragmites communis(cav.) Trin. ex Steud. KEY WORDS: Phragmites communis(cav.) Trin. ex Steud; phenolic acids; flavonoids; HPLC 芦笋 [Phragmites communis (Cav.) Trin. ex Steud] 是禾本科芦苇属植物芦苇 [Phragmites communis (Cav.) Trin.] 的幼芽, 又名南荻荻笋, 在洞庭腹地的沅江地区坐拥 45 万亩的生长区域其中含有丰富的黄酮 [1] 氨基酸 [2] 矿质元素 [3] 膳食纤维等活性成分 [4], 具有抗菌抗氧化提高免疫力保肝降血脂抗肿瘤等药理作用 [5-6] 芦笋资源丰富, 天然野生, 且独具风味功效繁多, 被誉为洞庭虫草 [7] 目前对于该植物的应用多限于其成熟植株芦苇, 用于造纸防汛固堤编席作药材等领域 [3], 其可食用嫩芽芦笋仅作为民间菜肴食用, 而其化学成分的研究大部分是基于对成熟芦苇根茎以及叶的成分研究 [5-6], 对于芦苇可食用幼芽芦笋的有效成分研究还极少涉及现已有部分研究表明芦笋中含有黄酮酚酸类成分 [8-9], 而黄酮和酚酸均具有一定的药理活性 [10-11], 黄酮更是如今活性成分研究的热门之一因此本研究对沅江产芦笋中黄酮酚酸类活性成分进行含量测定, 从而分析洞庭湖区河滩野生芦苇嫩茎的营养价值和开发前景, 为芦笋作为药用基金项目 : 湖南省芦笋研究开发中心芦笋产业联合研究开发基金作者简介 : 张雨林, 女, 硕士生 Tel: zhangyulinymm@foxmail.com * 通信作者 : 李玲, 女, 博士, 副教授 @qq.com 裴刚, 男, 博士, 教授 Tel: (0731) peigang@hotmail.com Tel: 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No

2 保健产品资源的开发提供参考 1 仪器与试剂 1.1 材料与试剂芦笋于 2016 年 4 月采自湖南省沅江市, 经湖南中医药大学中药教研室肖锦仁副教授鉴定为禾本科芦苇属植物芦苇 [Phragmites communis (Cav.) Trin.] 的嫩芽, 标本现保存于湖南中医药大学中药化学教研室, 编号 : 甲醇为色谱纯 (TEDIA 公司, 批号 : ); 双蒸水为自制 ; 其余试剂均为分析纯对照品柚皮苷 ( 批号 : ) 芦丁( 批号 : ) 木犀草素 ( 批号 : ) 山奈酚( 批号 : ) 原儿茶酸( 批号 : ) 购自中国药品生物制品检定所, 纯度均 >95%; 芹菜素 ( 上海金穗生物科技有限公, 批号 : ; 纯度 >98%); 槲皮素香草酸绿原酸为自制对照品, 纯度 >95% 1.2 仪器 AL-204 型电子分析天平 ( 梅特勒托利多仪器公司 ); 超声波清洗机 ( 宁波新芝生物科技股份有限公司 );LH-20 岛津高效液相色谱仪 ( 包括二元泵系列溶剂传输单元,Chromatopac 色谱工作站 ) 2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱 :Diamonsil 钻石 C 18 (250 mm 4.6 mm, 5 μm); 流动相 : 甲醇 (A)-0.1% 甲酸水溶液 (B), 梯度洗脱 (1 酚酸 :0~10 min,84% B;10~25 min, 66% B ;2 黄酮 :0~15 min, 72% 57% B, 15~25 min,57% B,25~45 min,50% 35% B, 45~50 min,35% 72% B); 流速 :1 ml min; 柱温 :35 ; 进样体积 :10 μl; 检测波长 :1 酚酸为 283,327 nm;2 黄酮为 283,335 nm HPLC 色谱图见图 1~2 在上述色谱条件下, 各成分可分别在 25 min 和 50 min 内得到分离, 且目标峰形尖锐, 对称性好, 理塔板数图 1 3 种酚酸对照品 (A,B) 和样品 (C,D)HPLC 色谱图 1 原儿茶酸 ;2 绿原酸 ;3 香草酸 Fig.1 HPLC chromatogram of 3 phenolic acid references substance(a, B) and sample(c, D) 1 protocatechuic acid; 2 chlorogenic acid; 3 vanillic acid. 图 2 6 种黄酮对照品 (A,B) 和样品 (C,D)HPLC 色谱图 1 柚皮苷 ;2 芦丁 ;3 槲皮素 ;4 木犀草素 ;5 山奈酚 ;6 芹菜素 Fig. 2 HPLC chromatogram of 6 flavonoids reference substance(a, B) and sample(c, D) naringin; 2 rutin; 3 quercetin; 4 luteolin; 5 kaempferol; 6 apigenin Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No.9 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期

3 2.2 溶液的制备供试品溶液的制备芦笋供试品的制备 : 芦笋 60 干燥, 打粉, 过四号筛供试品一 : 取 10 g 芦笋粉末使用 60% 乙醇 ml 超声提取 1 h, 提取液 60 减压回流浓缩至 50 ml; 供试品二 : 取 20 g 芦笋粉末使用 70% 乙醇 400 ml 水浴加热回流提取 1 h, 重复 3 次, 浓缩成浸膏共 4.5 g, 精密称取 500 mg 浸膏溶解于 25 ml 甲醇中溶液均过 0.45 μm 微孔滤膜,4 保存备用对照品溶液的制备精密称取适量原儿茶酸绿原酸香草酸对照品置于容量瓶中, 加入色谱甲醇定容至刻度, 得到浓度分别为 0.475, 0.500,0.500 mg ml 1 的混合对照品 1; 精密称取适量柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素对照品置于量瓶中, 加入色谱甲醇定容至刻度, 得到各样品浓度为 mg ml 1 的混合对照品 2 溶液均过 0.45 μm 微孔滤膜, 于 4 保存备用 2.3 方法学考察线性关系考察及检测限定量限测定使用二倍稀释法将对照品溶液稀释至初始浓度的 1, 0.5,0.25,0.125, , 倍, 取各浓度对照品溶液分别进样 10 L, 以峰面积为纵坐标 (Y), 质量浓度 (X) 为横坐标, 绘制标准曲线, 计算标准曲线的回归方程及相关系数, 结果见表 1 将配制的混合对照品储备液逐步稀释, 在信噪比为 3/1 时所对应的化合物浓度即检测限 (LOD), 信噪比为 10/1 时所对应的化合物浓度即定量限 (LOQ), 结果见表 1 由表 1 可知, 所测 9 种成分对照品浓度和相应峰面积呈良好线性关系 ; 各个成分的检测限为 ~ g ml 1, 定量限为 ~ g ml 1, 表明此方法灵敏度较高仪器精密度试验取项下对照品溶液, 按项下色谱条件重复进样 6 次, 每次 10 μl, 测得原儿茶酸绿原酸香草酸柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素的峰面积 RSD 分别为 1.38%,1.44%,2.39%, 2.32%,1.89%,2.45%,2.32%,1.77%,2.78%, 表明仪器精密度良好重复性试验取 6 份芦笋浸膏, 每份 2.0 g, 精密称定, 按项下方法制备供试品溶液, 按项下色谱条件重复进样 6 次, 每次 10 μl, 测得 9 种成分的峰面积 RSD 分别为 1.78%,2.11%, 1.77%,0.63%,1.69%,2.21%,1.44%,0.98%, 2.45%, 表明该测定方法的重复性良好稳定性试验取项下的供试品溶液, 按项下的色谱条件, 分别于 0,2,4, 8,12,24 h 进样分析, 测得 9 种成分的峰面积 RSD 分别为 0.78%,0.78%,1.98%,0.58%,0.96%, 1.48%,1.59%,0.78%,1.25%, 证明该供试品在 24 h 内稳定性良好回收率试验吸取中供试品一溶液 1 ml, 平行 6 份 ; 称取中供试品二浸膏 20 mg,5 ml 甲醇溶解, 平行 6 份, 按照药材样品量的 50%,100%,150% 加入相应标准品溶液, 分别进样测定分析, 计算回收率, 得到各成分的加标回收率为 98.73%~102.44%, 且 RSD 值均 <3%, 说明本法具有良好的回收率, 结果见表供试品的含量测定使用已制备供试品一供试品二按项下色谱条件进行检测, 每份样品重复进样 3 次测定分析, 根据表 1 中的线性方程得出样品中各个成分的含量, 见表 3 表 1 9 种成分的线性关系检测限和定量限 Tab. 1 Linear regression data, LOD, and LOQ of nine components 化合物回归方程相关系数 R 2 线性范围 / ml 1 检测限 LOD/ ml 1 定量限 LOQ/ ml 1 原儿茶酸 y= x ~ 绿原酸 y= x ~ 香草酸 y= x ~ 柚皮苷 y= x ~ 芦丁 y= x ~ 槲皮素 y= x ~ 木犀草素 y= x ~ 山奈酚 y= x ~ 芹菜素 y= x ~ 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No

4 表 2 芦笋中 9 种成分加样回收率试验 (n=6) Tab. 2 The recovery test of nine components in Phragmites communis(n=6) 化合物原儿茶酸绿原酸香草酸柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素样品量 / 加标量 / 检测量 / 回收率 / % 平均回收率 /% RSD/ % 讨论 3.1 条件优化提取条件的选择酚酸与黄酮在甲醇中溶解度不一样, 且酚酸存在热不稳定性, 因此采用不同方法提取, 参考文献研究 [12], 供试品一采用 60% 乙醇作为提取溶剂, 料液比为 1 100, 使用超声提取法提取 1 h, 且使用减压回流法在 60 中浓缩, 以供原儿茶酸绿原酸香草酸 3 种酚酸检测 ; 供试品二采用 70% 乙醇作为提取溶剂, 料液比为 1 20, 通过水浴回流加热法反复提取 3 次, 每次 1 h, 以供柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素 6 种黄酮检测 [13] 检测波长的选择查阅药典及结合检测情况得到不同成分的最大吸收波长, 其中香草酸原儿茶酸柚皮苷在 283 nm 处有最大吸收峰, 绿原酸在 327 nm 处有最大吸收峰, 芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素 335 nm 处有最大吸收峰综合考虑可分为 3 个波长进行检测, 即 283, 327 和 335 nm 流动相的选择本试验分别使用甲醇 - 水甲醇 - 甲酸水溶液乙腈 - 甲酸水溶液等不同体系检测供试品, 发现纯水无法实现酚类成分无拖尾现象的完全分离, 乙腈也无法满足供试品的良好分离, 因此选择 0.1% 甲酸溶液为水相, 甲醇为有机相通过尝试不同的梯度洗脱条件, 最后确定本试验中的梯度洗脱程序 3.2 结论本实验使用 HPLC 建立了同时检测包括 3 种酚酸 6 种黄酮类成分在内的 9 种成分的方法, 检测结果中芦笋中 9 种成分的含量为在 87.29~ g 1, 其中香草酸的含量最高, 达到了 0.134% 该方法中, 各成分均有较宽的线性范围和良好的线性关系, 且精密度重复性稳定性表 3 芦笋中 9 种成分含量测定结果 (n=3) Tab. 3 The contents of nine components in Phragmites communis (n=3) 样品批次含量 / g 1 ( 采集时间 ) 原儿茶酸香草酸绿原酸柚皮苷芦丁槲皮素木犀草素山奈酚芹菜素供试品一供试品二供试品一供试品二供试品一供试品二 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No.9 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期

5 及加标回收率 RSD 值均 <3%, 说明该方法具有稳定准确, 定量限检测限低, 灵敏快捷等优点各项研究发现, 原儿茶酸绿原酸香草酸均有抗菌 [14] [15] 抗炎抗氧化的作用, 其中原儿茶酸绿原酸具有保护肝脏抗肥胖 [16] [17-18] 抗肿瘤等药理作用 [19-21] 黄酮类化合物更是近年来国内外研究热点, 研究发现其具有抗氧化抗菌抗炎抗病毒保护肝脏抗糖尿病抗心血管疾病等诸多功效 [22] 例如槲皮素芦丁等在胰岛素抵抗心脏保护和预防血脂升高方面就有良好的疗效 [23-24] 而且黄酮类化合物以其高效低毒的特性在肿瘤治疗上得到广泛的关注和研究, 其中就包括柚皮苷 [25] 芦丁 [26] 槲皮素木犀草素芹菜素山奈酚等 [27] 综合说明本方法测定的芦笋中的数种成分有一定药理活性, 初步确定了芦笋药效作用的物质基础, 在芦笋的质量控制和药用保健等功能性产品的研究开发中具有一定的参考价值 REFERENCES [1] SHAO R, GUO H B, XU W, et al. Progress in the study of active substances from reed [J]. Chin J Biochem Pharm( 中国生化药物杂志 ), 2011, 32(2): [2] YANG H L, CHEN G C. Analysis of nutrient compositions of Paragmites Comunis in different habitast [J]. Acta Prataculturae Sinica ( 草业学报 ), 1994, 3(1): 1-6. [3] XIAO J J, ZHAO L Y, SHI X B, et al. Analysis of nutrients and heavy metals in tender stem of Triarrhena lutarioriparia from the Dongting lake area [J]. Food Sci( 食品科学 ), 2015, 36(12): [4] YU X H, ZHU X M, LI F W, et al. Antioxidant properties of flavonoids extracted from leaves of Phragmites communis Trin. in vivo and in vitro [J]. Food Sci( 食品科学 ), 2015, 36(1): [5] GAN Q, LU F, HOU E T, et al. Research situation of Phragmites communis Trin [J]. Pharm J Anhui Agr Sci( 安徽农业科学 ), 2010, 38(15): [6] ZHAO X X, TAN C Y, MENG F T, et al. The research progress on chemical constituent and biological activity of phragmites australis [J]. Fine Spcl Chem( 精细与专用化学品 ), 2013, 21(1): [7] 喻亚飞. 荻香润肤霜的药学研究 [D]. 湖南中医药大学, [8] WU L, GONG S. Purification of total flavonoids from Lysimachia fortunei Maxim by macroporous absorption resins and ultrasonic wave [J]. Pharm Today( 今日药学 ), 2016, 26(3): , 178. [9] SUN L F, LIU L W, LV J L, et al. HPLC analysis of flavonoids from Reed leaves [J]. Food Sci( 食品科学 ), 2011, 32(10): [10] VAN D W B, KOEK G H, BAST A, et al. The potential of flavonoids in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease [J]. Crit Rev Food Sci, 2017, 57(4): 834. [11] MCKAY D L, CHEN C Y O, ZAMPARIELLO C A, et al. Flavonoids and phenolic acids from cranberry juice are bioavailable and bioactive in healthy older adults [J]. Food Chem, 2015, 168(12): [12] LIAO A H, ZHOU G M, CHEN J H, et al. Simultaneous determination of 6 active compounds in Rosa laevigata Michx by HPLC combined with ultrasonic-assisted extractiongradient wavelength [J]. Food Sci( 食品科学 ), 2017, 38(4): [13] 中国药典. 一部 [S]. 2015: 附录 [14] SHI C, GUO D, ZHANG W T, et al. Antimicrobial activity of protocatechuic acid against Cronobacter sakazakii [J]. Mod Food Sci Tech( 现代食品科技 ), 2017(7): [15] ZHANG X L, LI Y C, NIU X H, et al. Effects of protocatechuic acid on antioxidative abilities in the brains of rotenone-induced Parkinson's disease mice [J]. Pro Mod Biomed( 现代生物医学进展 ), 2011, 11(17): [16] CHO A S, JEON S M, KIM M J, et al. Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fat diet-induced-obese mice [J]. Food Chem Toxicol Int J Pub Brit Ind Biol Res Ass, 2010, 48(3): 937. [17] WANG Y H, GAO Y, LI Z, et al. Anti-proliferative and anti-metastatic effects of protocatechuic acid on mouse breast cancer cell line 4t1 [J]. Acta Nutr Sin( 营养学报 ), 2014, 36(1): [18] THUROW T, LEE S O. Effect of chlorogenic acid and neochlorogenic acid on human colon cancer cells [D]. UA: University of Arkansas, [19] ZHANG H N, AN C N, XU M, et al. Protocatechuic acid inhibits oxidative damage in PC12 cells [J]. Chin J New Drugs( 中国新药杂志 ), 2014, 23(3): [20] ZHAO J J, DAI X M, QU Y S, et al. Progress in the pharmacodynamics of chlorogenic acid [J]. Chin Wild Plant Resources( 中国野生植物资源 ), 2013, 32(4): 1-5. [21] YAO Y L, WANG C M. Research progress of improving effect of chlorogenic acid on alzheimer's [J]. Herald Med( 医药导报 ), 2017, 36(11): [22] TANWAR B. Flavonoids: Dietary occurrence and health benefits [J]. Spatula Dd, 2012, 2(1): [23] DOWER J I, GELEIJNSE J M, GIJSBERS L, et al. Effects of the pure flavonoids epicatechin and quercetin on vascular function and cardiometabolic health: a randomized, double-blind, placebo-controlled, crossover trial [J]. Am J Clin Nut, 2015, 101(5): 914. [24] BOK S H, JEONG T S, BAE K H, et al. Method for preventing or treating elevated blood lipid level-related diseases by administering rutin and quercetin [M]. US [25] LI H, YANG B, HUANG J, et al. Naringin inhibits growth potential of human triple-negative breast cancer cells by targeting β-catenin signaling pathway [J]. Toxicol Lett, 2013, 220(3): [26] PERK A A, SHATYNSKAMYTSYK I, GER EK Y C, et al. Rutin mediated targeting of signaling machinery in cancer cells [J]. Cancer Cell Int, 2014, 14(1): 124. [27] YANG N, JIA X B, ZHANG Z H, et al. Advance in studies on anti-cancer activity and mechanism of flavonoids [J]. Chin J Chin Mater Med( 中国中药杂志 ), 2015, 40(3): 收稿日期 : ( 本文责编 : 曹粤锋 ) 中国现代应用药学 2018 年 9 月第 35 卷第 9 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 September, Vol.35 No

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.