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详谕郭
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2013 年中国科学: 生命科学 SCIENTIA SINICA Vitae 论文第 43 卷 www.scichina.

com 中国科学杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 大发现时代的生命组学专刊磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用余娟平, 马强, 张斌, 马瑞娟, 许细广, 李明松, 徐伟文 *, 李明 * 南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所, 广州 ② 南方医科大学南方医院消化内科, 广州 ② ② 510515; 510515 同等贡献 * 联系人,

com 收稿日期: 2012-11-22; 接受日期: 2012-12-27 国家高技术研究发展计划(批准号: 2012AA020205)和广东省科技厅省部产学研结合项目(批准号: 2011A090200028)资助摘要磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)对肝细胞癌(HCC)的诊断具有很高的敏感性和特异性, 是具有前景的肿瘤标志物.

1 2013 年中国科学: 生命科学 SCIENTIA SINICA Vitae 论文第 43 卷中国科学院学部科学与技术前沿论坛第 1 期: 89 ~ 95 life.scichina.com 中国科学杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 大发现时代的生命组学专刊磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用余娟平, 马强, 张斌, 马瑞娟, 许细广, 李明松, 徐伟文 *, 李明 * 南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所, 广州 ② 南方医科大学南方医院消化内科, 广州 ② ② ; 同等贡献 * 联系人, xu_sandy2006@126.com; mingli2006_2006@126.com 收稿日期: ; 接受日期: 国家高技术研究发展计划(批准号: 2012AA020205)和广东省科技厅省部产学研结合项目(批准号: 2011A )资助摘要磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)对肝细胞癌(HCC)的诊断具有很高的敏感性和特异性, 是具有前景的肿瘤标志物. 本文的目的是应用抗人-GPC3 单克隆抗体 7D11(7D11 McAb), 通过免疫组化(IHC)的方法检测 HCC 组织中的 GPC3 蛋白, 并初步评价其诊断 HCC 的临床应用价值. 通过对 HCC 病理组织正常肝脏组织和胆管细胞癌(ICC)病理组织进行免疫组化染色来评价 7D11McAb 的可应用性. 同时, 应用 7D11McAb 作为检测抗体对 40 例关键词磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 7D11 单克隆抗体肝细胞癌免疫组化 HCC, 7 例 ICC 和 50 例正常人的血清 GPC3 进行检测. 免疫组化结果显示, GPC3 蛋白在 85%(34/40)HCC 组织高表达, 而在正常人和 ICC 病人的组织中阳性率均为 0%(0/50 和 0/7). 血清学检测结果显示, GPC3 在 HCC, 正常人和 ICC 病人的血清中阳性率分别为: 42.5% (17/40), 0%(0/50%)和 0%(0/7). 7D11McAb 的制备为 GPC3 能大规模应用于临床奠定了基础. 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是第 5 大常发恶性肿瘤, 全球癌症病人中肝细胞癌病人约占 6%, 且全球每年约有 50 万新增病例 [1]. 在中国, 肝细胞癌是第二大癌症杀手 [2]. 目前, 影像学技术, 如 CT 扫描超声波检测或磁共振成像等是诊断 HCC 的主要手段, 但是影像学检测对微小病灶良性病变或肝硬化结节等的鉴别准确度不够, 对 HCC 的诊断临床仍缺乏可靠的方法. 肿瘤标志物对肿瘤的诊断具有特异性, 因此临床需要特异的 HCC 标志物来辅助鉴别诊断 HCC 与其他良性肝病. 甲胎蛋白( -fetoprotein, AFP)是目前应用最广泛的 HCC 标志物, 但约有 11%~47%肝硬化病人 15%~ 58%慢性肝病病人或肝脏损伤修复患者的 AFP 值同样有显著升高 [3]. 因此, 临床仍需要特异的肝癌标志物为肝癌的早期发现及预后判断等提供信息. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3, GPC3)是通过糖基化磷脂酰肌醇连接在细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一员[4]. GPC3 在胚胎组织, 如胎肝中有高引用格式: 余娟平, 马强, 张斌, 等. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用. 中国科学: 生命科学, 2013, 43: 89 95, doi: /scls 英文版见: Yu J P, Ma Q, Zhang B, et al. The initial clinical application of specific antibody against Glypican-3 in hepatocellular carcinoma diagnosis. Sci China Life Sci, 2013, 56, in press

余娟平等 : 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用表达, 而在成人正常肝组织中不表达. 目前, 大量研究表明, GPC3 在肝细胞癌患者的癌组织和血液中都高表达, 在正常人和其他良性肝病患者中不表达 [5~10]. 因此, GPC3 被认为是具有潜力的肝癌标志物. 但是, 目前没有太多针对 GPC3 的特异性抗体及检测方法.

2 余娟平等 : 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用表达, 而在成人正常肝组织中不表达. 目前, 大量研究表明, GPC3 在肝细胞癌患者的癌组织和血液中都高表达, 在正常人和其他良性肝病患者中不表达 [5~10]. 因此, GPC3 被认为是具有潜力的肝癌标志物. 但是, 目前没有太多针对 GPC3 的特异性抗体及检测方法. 因此, 研发针对 GPC3 的特异性抗体及检测方法显得尤为重要, 这也是该标志物能服务于临床和病人所必须解决的问题. 通过对组织抗原修复方法和 7D11McAb 使用浓度的摸索, 免疫组化 (immunohistochemical, IHC) 的结果显示, 7D11McAb 对组织 GPC3 蛋白具有高的特异性和敏感性. 而且 7D11McAb 不但可以检测到 HCC 患者组织中 GPC3, 还可以在 HCC 患者血清中检测到 GPC3. 因此, 7D11McAb 是非常具有应用前景的一株抗体, 为 GPC3 能顺利服务于临床及肝癌病人打下了基础. 1 材料与方法 1.1 组织和血液标本 40 例 HCC 组织 21 例癌旁组织和 7 例胆管细胞癌 (intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC) 组织均来自南方医院肝胆外科, 于 2011 年 2 月 ~2011 年 11 月收治的术前未经放化疗患者的手术切除标本. 40 例 HCC 癌组织包括 11 例分化良好 21 例中度分化 5 例低度分化组织 3 例组织无分化信息 ; 患者的年龄性别是否合并肝硬化乙型肝炎病毒感染情况肿瘤大小等信息均有收集. 肿瘤标本均取无坏死癌组织, 癌旁标本均取距癌组织 2 cm 处无癌细胞浸润的组织. 所有组织福尔马林固定, 脱水, 石蜡包埋, 制备 3 m 厚切片. 40 例 HCC 和 7 例 ICC 患者术前血液标本同样收集. 同时收集 50 例健康人的血液标本. 1.2 免疫组化抗体来源 7D11McAb 由南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所制备并提供 ( 图 1); 另一株 Glypican-3 单克隆抗体 1G12(1G12McAb) 购自 Biocare Medical 公司 ( 货号 : PM396AA). 二抗工作液购自 Cell Marque 公司 ( 批号 : R ). 1.3 优化实验条件为了达到最佳的免疫组化实验结果, 本研究组进行了组织抗原修复方法及一抗使用梯度的摸索. 图 1 免疫荧光法鉴定 7D11McAb(200 ) 将 7D11McAb 加入经处理的 GPC3 表达阳性的肝癌细胞 Huh7( 购自中国科学院上海细胞库 ) 进行孵育, 然后进行荧光染色. A: 在荧光显微镜下观察的结果, B: 在普通光镜下观察的结果. 与 7D11McAb 反应的细胞可以在荧光显微镜下看到荧光. 结果表明, 7D11McAb 可特异识别 GPC3 蛋白采用柠檬酸盐 ( 浙江常青化工有限公司, 分析纯 ) 和 EDTA( 生工生物工程股份有限公司, 超级纯, CAS# )2 种溶液进行高温高压抗原修复法对比. 取 HCC 组织标本, 以 3 m 的厚度切 8 张, 编号为 1~8. 切片脱腊水化后, 1~4 张标为 A 组, 5~8 张标为 B 组. A 组的 4 张切片用柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复法进行修复, 取 0.01 mol/l(ph6.0) 柠檬酸盐缓冲液 1000 ml 于压力锅中, 加热至沸腾, 将 A 组 4 张脱腊水化切片置于耐高温塑料切片架上, 放入已沸腾的缓冲液中, 盖上锅盖, 继续加热至喷气后维持 2 min. 移开热源, 用自来水冷却后打开锅盖使其冷却至室温, 取出切片, 用 PBS 冲洗. B 组 4 张切片用 EDTA 高温高压抗原修复法进行修复, 取 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 抗原修复液 1000 ml 于压力锅中, 具体步骤同 A 组. 甩掉切片上液体后滴加事先稀释好的一抗. 一抗浓度分别为 : 1:400, 1:600, 1:800 和 1:1000. 将 4 个浓度的一抗工作液对应 A, B 组的 4 张切片 ( 表 1). 室温温浴 30 min 后用 PBS 清洗. 滴加二抗工作液, 室温温浴 30 min 后用 PBS 清洗. 1.4 免疫组化程序将切片放入 60 恒温箱中烘烤 20 min, 常规脱蜡至水化 ( 二甲苯 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, 95% 乙醇 ). 切片放入已沸腾的 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 抗原修复液中, 继续加热至喷气后维持 2 min. 冷却后取出用蒸馏水冲洗, 再用 PBS 冲洗. 用马血清白蛋白对组织进行封闭以去除非特异性反应. 滴加 1:1000 的一抗工作液 90

3 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期表 1 两种抗原修复法对应的组织切片编号及一抗使用浓度抗原修复方法 0.01 mol/l(ph6.0) 柠檬酸盐 1 mmol/l(ph8.0) EDTA 溶液组织切片编号 D11 McAb 浓度 1:400 1:600 1:800 1:1000 1:400 1:600 1:800 1:1000 (7D11McAb, 1G12McAb), 室温温浴 30 min, 用 PBS 清洗. 同时用 PBS 缓冲液替代一抗对组织进行染色以此作为阴性对照 ( 图 2). 滴加二抗工作液, 室温温浴 30 min 后用 PBS 清洗. 将切片浸入含 10% 过氧化氢的甲醇溶液中 10 min 以阻断内源性过氧化物酶的活性. DAB 显色 3 min, 用蒸馏水冲洗 10 min. 苏木精复染 3 min, 蒸馏水冲洗 10 min. 脱水透明后用中性树脂封片, 镜检. 1.5 免疫组化实验用南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所提供的 7D11McAb 按免疫组化程序对 40 例 HCC 癌组织切片 21 例癌旁组织切片 7 例 ICC 癌组织切片进行免疫组化染色, 镜检. 同样用 1G12McAb 按说明书步骤对这 3 组切片进行免疫组化染色, 镜检. 将 2 株抗体的染色结果进行对比. 1.6 血清 GPC3 和 AFP 水平的比较对 40 例 HCC 患者, 7 例 ICC 患者和 50 例正常人血清 GPC3 和 AFP 值进行检测. 血清 GPC3 检测方法为双抗体夹心化学发光免疫分析法 (chemiluminescence immunoassay, CLIA), 其中检测抗体为 7D11McAb. AFP 检测应用的是购买的时间分辨免疫分析试剂盒 ( 中山大学达安基因股份有限公司 ), 按其提供的说明书进行. 1.7 资料分析应用卡方检验对实验结果进行统计分析, 当 P<0.05 时认为存在显著差异. 1.8 免疫结果的判定阳性范围计分 : 0~5% 为 0 分, 6%~25% 为 1 分, 26%~50% 为 2 分, 51%~75% 为 3 分, >76% 为 4 分 ; 阳性着色计分 : 无着色为 0 分, 淡黄色为 1 分, 棕黄色为 2 分, 棕褐色为 3 分. 2 项结果相加 <2 分为阴性 ( ), 2~3 分为弱阳性 (+), 4~5 分为阳性 (++), 6~7 分为强阳性 (+++). 2 结果 2.1 抗原修复方法的比较采用 0.01 mol/l(ph6.0) 柠檬酸缓冲液高温高压修复组织抗原时, IHC 结果显示, 在癌细胞出现阳性染色的同时, 周围的血管内皮出现非特异性染色, 且随着一抗 (7D11McAb) 浓度的调整非特异染色没有减弱 ( 图 3A~B). 采用 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 高温高压修复组织抗原时, IHC 结果显示, 当一抗 (7D11McAb) 的稀释比为 1:1000 时, 组织出现阳性染色, 其结构清晰, 核浆对比度好, 没有血管内皮等其他非特异性染色 ( 图 3C~E). 1G12McAb 的染色对比结果与 7D11McAb 的染色结果一致 ( 图 3F~G), 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 比 0.01 mol/l (ph6.0) 柠檬酸盐抗原修复效果要好. 因此, 本实验中采用 1 mmol/l EDTA(PH8.0) 高温高压抗原修复法, 一抗 (7D11) 稀释度为 1: 免疫组化结果图 2 免疫组化阴阳性对照 (200 ) A: HCC 组织, 1G12McAb; B: HCC 组织, PBS( 阴性对照 ); C: HCC 组织, 7D11McAb; D: HCC 组织, PBS( 阴性对照 ) 分别用 7D11McAb 和 1G12McAb 对 40 例 HCC 组织标本, 21 例癌旁标本和 7 例 ICC 组织标本进行组化染色. 7D11McAb 的 IHC 结果为 : HCC 组阳性率为 87.5%(35/40), 癌旁和 ICC 组织染色均显示阴性 ; 将弱阳性纳入阳性范围, 则 HCC 癌旁和 ICC 的阳性率分别为 90%(36/40), 14.3%(3/21) 和 0%(0/7). 1G12McAb 的 IHC 结果为 : HCC 癌旁和 ICC 阳性率分别为 82.5%, 0% 和 0%; 弱阳性被纳入阳性范围, 则 91

余娟平等 : 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用 HCC 癌旁和 ICC 的阳性率分别为 92.5%(37/40), 9.5%(2/21) 和 0%(0/7) ( 表 2). 两株抗体的组织染色效果一致 ( 图 4). 2.3 血清 GPC3 和 AFP 水平用 CLIA 法进行血液 GPC3 的检测, 其中检测抗体为 7D11McAb. 标准曲线见图 5.

(80 ); F: 柠檬酸, 1G12 McAb 1:1000 (200 ); G: EDTA, 1G12 McAb 1:1000 (200 ) 表 2 Glypican-3 在 HCC, ICC 和癌旁组织中的表达标本例数 7D11McAb 1G12McAb +++ ++ + +++ ++ + HCC 40 18 17 1 4 17 16 4 3 ICC 7 0 0 0 7 0 0 0 7

4 余娟平等 : 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用 HCC 癌旁和 ICC 的阳性率分别为 92.5%(37/40), 9.5%(2/21) 和 0%(0/7) ( 表 2). 两株抗体的组织染色效果一致 ( 图 4). 2.3 血清 GPC3 和 AFP 水平用 CLIA 法进行血液 GPC3 的检测, 其中检测抗体为 7D11McAb. 标准曲线见图 5. 结果显示, 正常图 3 G 不同组织抗原修复方法与一抗稀释度的 IHC 染色结果比较 A: 柠檬酸, 7D11McAb 1:400 (200 ); B: 柠檬酸, 7D11McAb 1:1000 (200 ); C: EDTA, 7D11McAb 1: 600 (200 ); D:EDTA, 7D11McAb 1:1000 (200 ); E: EDTA, 7D11McAb 1:1000 (80 ); F: 柠檬酸, 1G12 McAb 1:1000 (200 ); G: EDTA, 1G12 McAb 1:1000 (200 ) 表 2 Glypican-3 在 HCC, ICC 和癌旁组织中的表达标本例数 7D11McAb 1G12McAb HCC ICC 癌旁图 4 7D11McAb 与 1G12McAb 的 IHC 结果对比 A: HCC 组织, 7D11McAb (200 ); B: HCC 组织, 1G12McAb (200 ); C: 癌旁组织, 7D11McAb (80 ); D: 癌旁组织, 1G12McAb (80 ); E: ICC 组织, 7D11McAb (80 ); F: ICC 组织, 1G12McAb (80 ) 图 5 GPC3-CLIA 的标准曲线 6 个标准品的浓度分别为 : 0, 10, 50, 100, 500 和 1000 ng/ml. 曲线方程为 : y=928.08x , R 2 =

5 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期参考值为 30 ng/ml 时, 45%(18/40) 的 HCC 病人血液 GPC3 显著升高, 其浓度范围为 32~545 ng/ml; 而在 ICC 和正常人血清中检测值均小于 3 ng/ml. 对同组血清进行 AFP 值检测, 结果显示, 正常参考值为 20 ng/ml 时, 55%(22/40) 的 HCC 病人血清 AFP 显著升高, 28.5%(2/7) 的 ICC 病人血清 AFP>20 ng/ml, 正常人血清 AFP 值正常. 表 3 列出了组织 GPC3 血清 GPC3 和 AFP 的检测结果. 从表 3 可见, 组织 GPC3 的阳性率高于血清 GPC3 阳性率. 40 例 HCC 组织的 GPC3 染色程度与其血清 GPC3 的浓度没有相关性. 血清 GPC3 阳性率分别为 : 正常人 0%(0/50), HCC 45% (18/40), ICC 0%(0/7); AFP 的阳性率分部为 : 正常人 0%(0/50), HCC 55%(22/40), ICC 28.5%(2/7). 联合检测血清 GPC3 和 AFP 时, HCC 的阳性率提高至 72.5% (29/40). 2.4 组织 GPC3 的表达与肿瘤大小, 病理分级, 肝炎和肝硬化的关系应用卡方检验来分析 GPC3 的表达与肿瘤大小, 病理分级, 肝炎和肝硬化的相关性. 详细信息见表 4. 结果显示, GPC3 的表达与这 4 方面的因素没有显著相关 ( 肿瘤大小 0.25>P<0.5, 病理分级 0.975>P<0.99, 肝炎 0.5>P<0.75 和肝硬化 0.1>P<0.25). 3 讨论肿瘤的确诊是治疗前的关键步骤, 早期的小肝癌结节往往由分化良好的肝细胞组成, 缺乏典型的形态特征 [13]. 因此, 单独的形态学标准对鉴别诊断高度不典型增生结节和早期肝癌等依然存在一定的困难 [14]. 特异性肿瘤标志物的发现和应用显得尤为重要, 其相应的检测抗体和检测技术的开发成为必须解决的问题. GPC3 是通过糖基化磷脂酰肌醇连接在细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一员 [4]. 有文献指出, GPC3 在 HCC 患者中有显著升高, 且与 AFP 没有相关性 [15,16]. 因此, GPC3 是一个极具有潜力的肝癌标志物. 但目前缺乏敏感性高, 特异性强且经济的 GPC3 检测方法能应用于临床. 本研究的鉴别结果显示, 7D11McAb 能特异识别 GPC3( 图 1). 在 HCC 组织中对 GPC3 有特异的识别能力 ( 图 2), 其 IHC 结果与目前商业化的 1G12McAb 的染色结果一致. 为了建立可靠的免疫组化检测技术, 对组织抗原修复方法和 7D11McAb 的使用浓度进行了初步摸索. 结果显示, 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 修复液比 0.01 mol/l 柠檬酸盐 (ph6.0) 修复液的修复效果好. 在 1 mmol/l EDTA(pH8.0) 修复液修复和 1:1000 浓度的 7D11McAb 时, IHC 结果显示, 组织结构清晰, 色彩明亮且核浆对比度好, 没有血管内皮等其他非特异性染色. 7D11McAb 免疫组化结果显示, 85% 的 HCC 患者组织 GPC3 表达为阳性, 而在 ICC 和正常人中均为阴性. 虽然卡方检验结果显示 HCC 病人 GPC3 的表达与肿瘤大小是否感染肝炎和肝硬化没有显著相关, 但实验数据显示, 肿瘤 <5 cm, 感染肝炎, 伴有肝硬化的病人组织 GPC3 阳性率分别为 94.4%, 94.1% 和 95%; 而肿瘤 >5 cm, 没有感染肝炎, 不伴有肝硬化的病人组织 GPC3 阳性率分别为 77.3%, 82.6% 和 80%. 表 3 HCC, ICC 和健康正常人的组织 GPC3 血清 GPC3 和血清 AFP 的检测结果标本例数组织 GPC3 血清 GPC3 血清 AFP HCC ICC 健康正常 a) 表 4 GPC3 的表达与肿瘤大小, 病理分级, 肝炎和肝硬化的相关性肿瘤大小 /cm 病理分级是否感染肝炎肝硬化 <5 >5 W M P 是否是否阳性例数阴性例数阳性率 (%) a) W: 分化良好, M: 中等分化, P: 低度分化 93

6 余娟平等 : 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3 特异性抗体对肝细胞癌临床诊断的初步应用可见, GPC3 的表达与这 3 个因素还是有一定的关联. Wang 等人 [17] 2006 年报道, GPC3 在 70%(38/54) 的 HCC 组织中为阳性, 在 48%(14/29) 的高度不典型增生或早期肝癌和 3%(2/65) 的良性肝病中有表达. 此报道与本研究的实验结果一致. 7D11McAb 在 GPC3 的免疫组化检测中具有高的敏感性和特异性. 应用 7D11McAb 作为检测抗体进行血清 GPC3 的检测, 结果显示, 在参考值为 30 ng/ml 时, 45% (18/40)HCC 患者血清中 GPC3 值 >30 ng/ml, 而在 ICC 和正常人血清中 GPC3 均为阴性. 对同组血清进行 AFP 值检测, 结果显示, 在参考值为 20 g/l 时, 55%(22/40) 的 HCC 患者和 28.5%(2/7) 的 ICC 患者血清 AFP 值 >20 g/l, 正常人均为阴性. 在 HCC 病例中, 血清 GPC3 的表达与 AFP 没有相关性. 联合检测 GPC3 和 AFP 其敏感性提高至 72.5%(29/40). Liu 等人报道 [18], 47% 的 HCC [19] 患者血清 GPC3 为阳性. Soha 等人报道, 在 HCC 患者中, AFP 阳性率为 76.5%, GPC3 的阳性率为 63.5%, HCC 患者的 GPC3 水平明显高于正常人和肝硬化患者, 这些报道均与本研究的实验结果相符. 总之, 7D11McAb 可以特异性识别 GPC3, 它不仅能应用于免疫组化检测, 同样可以应用于血清学检测, 为 GPC3 能真正应用于临床打下基础. 任何一种肿瘤标志物不可能在所有的肿瘤患者中都有表达. 因此, 相对于单个的标志物, 联合检测可提高诊断敏感性. GPC3 和 AFP 的联合检测可显著提高 HCC 的诊断敏感性而不影响检测特异性. 参考文献 1 Parkin D M, Bray F, Ferlay J, et al. Estimating the world cancer burden:globocan Int J Cancer, 2001, 94: Zhou L, Liu J, Luo F. Serum tumor markers for detection of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2006, 12: Taketa K. -fetoprotein: revaluation in hepatology. Hepatology, 1990, 12: Filmus J, Selleck SB. Glypicans: proteoglycans with a surprise. J Clin Invest, 2001, 108: Zhu Z W, Friess H, Wang L, et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut, 2001, 48: Zhou X P, Wang H Y, Yang G S,et al. Cloning and expression of MXR7 gene in human HCC tissue. World J Gastroenterol, 2000, 6: Hippo Y, Watanabe K, Watanabe A, et al. Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3 as a serological marker for early-stage hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 2004, 64: Zhang QY, Qin X, Zhen L,et al. Development of a competitive radioimmunoassay for glypican-3 and the clinical application in diagnosis of hepatocellular carcinoma. Clin Biochem, 2010, 43: El-Shenawy S Z, Sabawi M M E1, Sheble N, et al. Diagnostic role of serum glypican-3 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma. Nat Sci, 2012, 10: Wang F H, Yip Y C, Zhang M, et al. Diagnostic utility of glypican-3 for hepatocellular carcinoma on liver needle biopsy. J Clin Pathol, 2010, 63: Mariana C, Ian R W, Morris S, et al. Glypican-3 a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma. Gastroenterology, 2003, 125: Llovet J M, Chen Y, Wurmbach E, et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology, 2006, 131: Roskams T, Kojiro M. Pathology of early hepatocellular carcinoma: conventional and molecular diagnosis. Semin Liver Dis, 2010, 30: Bruix J, Morris S. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology, 2011, 53: Zhu ZW, Friess H, Wang L, et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut, 2001, 48: Yutaka M, Shumpei I, Hiroko I, et al. Glypican-3, overexpressed in hepatocellular carcinoma, modulates FGF2 and BMP-7 signaling. Int J Cancer, 2003, 103: Wang X Y, Degos F, Dubois S, et al. Glypican-3 expression in Hepatocellular tumors:diagnostic value for preneoplastic lesions and Hepatocellular carcinomas. Hum Pathol, 2006, 37: Liu H, Li P, Zhai Y, et al. Diagnostic value of glypican-3 in serum and liver for primary hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 2010, 16: Soha ZE1-S, Maha ME1 S, Nashwa S, et al. Diagnostic role of serum glypican-3 as a tumor marker for hepatocellular carcinoma. Nat Sci, 2012, 10:

中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期余娟平, 2009 年毕业于中山大学医学检验专业, 2011

马强, 博士, 主要研究规模化抗体制备技术, 临床用检测试剂盒的开发, 基因治疗用新型慢病毒载体构建以及应用, 大肠肿瘤

1993 年毕业于上海医科大学, 1999 年取得第一军医大学内科学博士学位, 2002 年从复旦大学遗传所博士后出站.

近 10 年主要从事蛋白质组学抗体库建设疾病标志物研究及体外诊断试剂研发, 具有丰富的产业化转化经验. 李明, 教授, 博士生导师.

7 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期余娟平, 2009 年毕业于中山大学医学检验专业, 2011 年就读于南方医科大学, 免疫学硕士. 主要从事临床用检测试剂盒的开发及规模化抗体制备技术. 马强, 博士, 主要研究规模化抗体制备技术, 临床用检测试剂盒的开发, 基因治疗用新型慢病毒载体构建以及应用, 大肠肿瘤肝脏肿瘤的分子诊断与基因调控及蛋白质组学研究, 侧重于肿瘤特异性标志物的发现以及应用等研究方向. 徐伟文, 研究员, 硕士生导师年毕业于上海医科大学, 1999 年取得第一军医大学内科学博士学位, 2002 年从复旦大学遗传所博士后出站. 主要从事分子免疫疾病相关蛋白功能研究及抗体制备生物诊断试剂研制等方面的研究. 近 10 年主要从事蛋白质组学抗体库建设疾病标志物研究及体外诊断试剂研发, 具有丰富的产业化转化经验. 李明, 教授, 博士生导师年获中山医科大学理学博士学位. 现任南方医科大学生物技术学院院长, 广州市抗体技术研究中心主任, 广东省教育厅抗体工程重点实验室主任. 长期从事抗体工程分子诊断基因工程疫苗和药物的应用基础和产品开发研究. 在标志物应用研究及转化领域取得了一系列重要的医学研究成果. 95

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人