期 郭政宏等 一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 抗生素过量使用会使病原菌出现耐药等问 题 而微生态制剂中的益生菌可以在胃肠道调节动物体微生态平衡 发挥预防疾病 提高动物生产性能的作用 因此使用微生态制剂替代抗生素已成为 0 一种趋势 目前应用较为广泛的微生态制剂主要有芽孢杆菌制剂

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1 中国畜牧兽医! " 一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 郭政宏 周 彪 严亨秀 西南民族大学生命科学与技术学院 成都 摘 要 为获得来源于藏绵羊的益生菌菌株 对健康母藏绵羊新鲜粪便进行 水浴处理 0/ 以筛选具有抗逆性的芽孢杆菌 再综合形态学 生理生化特征及 & 序列分析进行鉴定 通过抑菌试验 耐酸 耐胆盐试验及产水解酶试验等方法对其生物学特性进行研究 结果显示 从新鲜粪便样品中分离到的芽孢杆菌菌株 ; 对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑菌效果 通过分析鉴定其为短小芽孢杆菌 该菌株在! 的环境中存活率为 0 在 胆盐环境中存活率为 0 可产生蛋白酶和纤维素酶 对 种常用的抗生素具有很高的敏感性 从试验结果可分析出该短小芽孢杆菌 ; 有一定的抗逆性和潜在的益生能力 且该菌株不含耐药质粒 不会在动物肠道微生态系统中造成抗生素抗性的水平传递 具有作为微生态添加剂开发的潜力 关键词 藏绵羊 短小芽孢杆菌 分离 鉴定 特性中图分类号 0 文献标识码 文章编号 ".", ()"&("&&!"&&)&!),!"&"&! "&''()"&%", ;'5:757';+3 :7,6 ( & )&!6!+,!!! -%"!"&:&9:-:9!&99&+95!&9!9:9+--+9:&/ (:9+5::! &:5:,&:9+95:5:+-95:/+-:(:9+5::!+!&::95 +9:&6&79&:+9 /:9&0/+-95&:9+::&:&:::(5:/&!5-7+-! :/+-5+&+9:&9+&:6::95:- :&:/!&:5::-++ -:+:9:5:/+-5+&+9:&9:&:96:67+9/&+-9:9+&: 979:9+-:+-9&:979:95&-9:/:9:9+95:&/:95(5:&:6-9 5:95+995:-;-+9:&/&:5:,&:9+(:9+5::! :&+-::9+& (5& :9+995:- ;+-%96&+-&+9:+0 6:&95::&/:9! +0 6:&95::&/:9 -:+-996-!&6:!&9:+:+:-6-+: ++:9:9//-6: :-% ;5++:&9+:7&::&:9+:+!9:9+-!&9+-9::95:9&+ 99+!-+/+6-9+6:5&9+-9&+/+99&:9+: 95:9:9+-/&:9:/ :!9:9+-9:::-!:++/&: : /.0(:9+5::!-%-+9:9+95+&+9:&9 收稿日期 0 基金项目 中央高校专项基金项目 3 四川省应用基础研究项目 3 作者简介 郭政宏 男 重庆垫江人 硕士生 研究方向 动物微生物 /+-/ 通信作者 严亨秀 女 四川南江人 博士 教授 研究方向 病理学 药理学 兽 /+-+5:7,659/+-/

2 期 郭政宏等 一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 抗生素过量使用会使病原菌出现耐药等问 题 而微生态制剂中的益生菌可以在胃肠道调节动物体微生态平衡 发挥预防疾病 提高动物生产性能的作用 因此使用微生态制剂替代抗生素已成为 0 一种趋势 目前应用较为广泛的微生态制剂主要有芽孢杆菌制剂 酵母菌制剂和乳酸菌制剂等 其中 芽孢杆菌制剂因其具有较高的抗逆性而应用广 泛 近几年 各国学者对多种动物源性芽孢杆菌 展开了研究 " 等从干旱地区鸟类的粪便中分离出了具有驱蚊 灭蚊功效的苏云金芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌和球形芽孢杆菌 D0(+&+&: 等从!!! 白蚁肠道中分离出能高产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌 且该菌株所产 木聚糖酶具有较高的稳定性 (: 等利用从健康鸡肠道中分离得到的枯草芽孢杆菌 ) 来抑制产气荚膜梭菌 % 的生长 藏绵羊 ( :9+5::! 作为青藏高原特有的重要畜种之一 其适应能力强 长期生长在青藏高原及其邻近的 / 以上的高寒 低氧的高原地区 是中国三大原始绵羊品种之一 也是当地牧民重要的生产生活 资料之一 因其独特的生长环境及天然放牧的饲养方式而具有重要的研究意义及资源开发价值 目前对藏绵羊资源利用开发集中在产肉性能 产毛性 能及适应遗传性能等方面 但对其肠道益生芽孢杆菌分离研究还未见报道 本试验首次在藏绵羊粪便中分离到一株具有益生潜力的短小芽孢杆菌 -% 并对其形态学 生理生化 抑菌性 耐酸 耐胆盐及产水解酶等特性进行研究 旨在为高原动物来源的益生芽孢杆菌的开发利用提供一定的理论参考 材料与方法 1 样品来源 于阿坝州红原县一牧民家中无菌采集散养母藏绵羊新鲜粪便 ) 坐标 北 I=J 东 I= J 并置于 液氮保存带回实验室 1 主要试剂及仪器 " 固体培养基 " 液体培养基 蛋白酶选择培养基 纤维素酶选择培养基 淀粉酶选择培养基参 0 照文献制得 试验所需主要试剂有磷酸盐缓冲液 革兰氏染色液 盐酸 氢氧化钠 牛胆盐,)&:! 细菌基因组 小量制备试剂盒 细菌 & 通用引物及 )6!:&, 等 恒温水浴锅! 计 超净工作台 光学显微镜 高速冷冻离心机 恒温振荡培养箱 ) 仪 电泳仪 凝胶成像系统等 1 样品预处理称取 冻存的粪便样品 7 于 环境解冻 置于 /"/-" 含有小玻璃珠的磷酸盐缓冲液中 涡旋混匀 纱布过滤后 收集滤液于 水浴 0/ 1 菌株分离及纯化取 /" 热处理后的滤液分别均匀涂布于 个 " 固体琼脂培养基上 待涂布液晾干后 置于 培养箱中倒置培养 5 接种环挑取涂布培养后琼脂培养基上的单菌落 划线接种于 " 固体琼脂培养基上 置于 培养箱中倒置培养 5 重复 次划线接种培养 即可得到纯化的菌株 进行革兰氏染色并镜检 将合适的菌株接种于 " 液体培养基中扩大培养 并于 甘油保种 17 生化特性鉴定将纯化的菌株接种于细菌生化鉴定管中 培养箱中培养 5 观察结果参照伯杰氏细菌鉴定手册! 和常见细菌系统鉴定手册! 进行鉴别 13- 序列分析取 /" 菌液 &/ 离心得到菌体 采用,)&:! 细菌基因组 小量制备试剂盒提取细菌总 并采用 & 基因通用引物.0=((((((= 0=3(((((((= 进行序列扩增 ) 扩增体系 0"@ +)0 )6!:&,0" 上 下游引物各 " 模板 " '0") 扩增条件 预变性 0/ 变性 0 退火 延伸 0/0 个循环 延伸 / 保存 将扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳 / 检验是否有目的条带出现 并把有目的条带的 ) 产物原液送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序 1 同源性及系统发育学分析将测序得到的 & 序列提交到 59!-/57 中进行 "( 比对 并下载同源性较近的序列 用 :7+0 软件采取邻位相连法构建系统进化树 19 体外抑菌试验采用牛津杯法测定菌株对大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌的抑制情况 菌液接种于 /"

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 " 液体培养基中 恒温振荡培养 5 取 /" 菌液 &/ 离心 0 / 取上清并用 / 滤器过滤 收集滤液待用 将灭菌牛津杯放入制备好的 " 固体培养基上 倒入含有指示菌株的 " 固体培养基 约 00 待培养基凝固后小心取掉牛津杯 然后将收集的滤液 " 加入到固体培养基的孔中 放置于 培养箱中培养 5 测量抑菌圈的直径 1 耐酸能力分别取 /" 中扩大培养的菌液 置于 /"! 为 0 的 " 液体培养基中 恒温振荡培养 5 以空白 " 液体培养基调零紫外可见分光光度计 测定菌液在 / 处的 值 每个样做 次重复后取其平均值 计算菌株存活率 存活率 B 经酸处理菌液 / 值 未经酸处理菌液 / 1 耐胆盐能力分别取 /" 中扩大培养的菌液 置于 /" 含有 0 及 牛胆盐的 " 液体培养基中 恒温振荡培养 05 同 处理 计算菌株存活率 1 产酶能力分别在蛋白酶选择培养基 纤维素选择培养基和淀粉酶选择培养基上点种分离的菌株 恒温培养 5 在纤维素选择培养基上先滴加 /7/" 刚果红溶液染色 / 再滴加 /-" +- 溶液 观察菌落周围是否出现水解圈 在淀粉酶选择培养基上滴加碘液 观察菌落周围是否出现水 0 解圈 1 药敏试验 采用纸片扩散法 根据抑菌圈大小判断菌株对常见抗生素药物的敏感程度 结果与分析 试验分离 筛选得到一株各方面性能相对比较好的藏绵羊源芽孢杆菌 将其命名为 ; 1 菌落及菌体形态 划线培养 5 菌株菌落呈圆形 表面光滑乳白色 不透明 边缘整齐 质地中等 图 革兰氏染色镜检 菌体杆状呈紫红色 为革兰氏阳性菌 图 菌落形态 菌体形态 -+-/&!5-7:-+/&!5-7 图 菌株 : 1 生化试验结果菌株 ; 生化反应结果见表 根据结果初步判断菌株 ; 可能为短小芽孢杆菌 -% 13- 分析 ) 扩增产物电泳结果见图 由图 可知 扩增的条带在! 之间 约为 0! 通 过测序测得该片段大小为! 系统进化树构建结果见图 由图 可知 菌株 ; 和短小芽孢杆菌的遗传距离最小 亲缘关系最近 判定该菌株为短小芽孢杆菌 -% 综合分析比较菌株 ; 的生理生化特性及 & 分析结果 可确定菌株 ; 为短小芽孢杆菌

4 !( 期 郭政宏等一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 %(% 表! 菌株 -6)0%& 生化试验结果 K7!J : 5 1-6)0%& ;7 5 3D L 3 项目 结果 项目 结果 L G < T L G < T 硝酸还原试验 5 "T, - 厌氧生长 =- P,U \ S 0 葡萄糖 N T, h! 试验 h! 木糖 7] 明胶试验 N - O, - T 阿拉伯糖 = P - R06 试验 R]" U-T O "3 "T, - 吲哚试验 L -" 0 接触酶试验 : 蔗糖 6T, 棉子糖 < O O - -S]" ] 甘露醇 ;- 0!阳性&0!阴性! Z&0! 5U Z ;! K0&&&K5= ;. & 5!阴性对照& %' 0!菌株 6Y5!N) ;! K0&&&K5= ;. & 5! 5U Z, & %-"0! 6Y5!N) 图!! 菌株 -6)0%&M/J 扩增电泳结果 P!!-6)0%& ; 5 = 3 5,D5 : 1 M/JL, 1 3 5; =I = 图 &! 菌株 -6)0%& 的系统进化分析 P &!MDF 5 ; 3; 5 1-6)0%& ; =I = F!I %! 抑菌试验 菌株 6Y5!N) 对指示 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 无 抑菌圈!对大肠杆菌和沙门氏菌有明显的抑菌效果! 经过试验发现!加入 菌 体 沉 淀 和 空 白 对 照 的 孔 洞 周

5 中 国 畜 牧 兽 医 卷 围没有明显抑菌圈 而加入全菌液和离心上清液的孔洞周围有明显抑菌圈 且离心上清液的抑菌圈较 全菌液的抑菌圈大 图 大肠杆菌 沙门氏菌 + 阴性对照 菌体沉淀 全菌液 上清液 & +-+7&6!:9&67+-!&:!9+97&6!(9+-+9:&+-67&6!" 66!:&+9+97&6! 图 菌株 : 体外抑菌试验结果 &1)":"&"&%!"&) 5& ". 17 耐酸 耐胆盐试验由图 0 可知 菌株 ; 在! 为 及 0 的 " 液体培养基中的存活率分别为 0 及 00 随着培养基! 的降低 菌株 ; 的存活率下降幅度较大 但在! 为 的 " 培养基中存活率仍达到 0 证明该菌株对于强酸环境有较强的耐受性 由图 可知 菌株 ; 在含有 0 及 牛胆盐的 " 液体培养基中的存活率分别为 00 及 0 菌株的存活率随着培养基中牛胆盐含量升高而有较大幅度下降 但在牛胆盐含量为 的 " 液体培养基中的存活率为 0 说明该菌株 能在一定浓度胆盐环境中生存 1 产酶能力在菌株 ; 水解酶的测定中 在蛋白酶选择性培养平板和纤维素酶选择性培养平板上 菌落周围出现明显的水解圈 在淀粉酶选择性培养平板上未出现水解圈 说明菌株 ; 具有较高的产蛋白酶和纤维素酶的能力 没有或产淀粉酶的能力较弱 图 1 药敏试验选取常用抗生素作为试验药物 用纸片扩散法进行药敏试验 结果见表 由表 可知 菌株 ; 对大多数抗生素敏感 对链霉素 林可霉素 呋喃妥因 红霉素呈中度敏感 图 7 菌株 : 在酸存在下的存活率 &17, &)" :"&&",!!&

6 期 郭政宏等 一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 0 图 菌株 : 在胆盐存在下的存活率 &1, &)" :"&&",! %&) )" 蛋白酶选择性培养平板 纤维素酶选择性培养平板 淀粉酶选择性培养平板 )&9:+::-:9:/:6/:-6-+::-:9:/:6//-+::-:9:/:6/ 图 菌株 : 在 种水解酶选择性培养基上的水解特性 &1.)!"&&"&:"&&", &",.) )!"& & 表 菌株 : 药敏试验结果 %), )"&"& "":"& 药物 :: 结果 :6-9 药物 :: 结果 :6-9 泰乐菌素 (- 链霉素 9&:!9/ 呋喃妥因.6&++9 四环素 (:9&+-: 利福平 +/! 氯霉素 5-&+/!5:- 庆大霉素 :9+/ 青霉素 ):- 环丙沙星!&-,+ 万古霉素 D+/ 林可霉素 "/ 红霉素 &95&/ 耐药 中介 敏感 :9+9:&+9:-:9::9: 讨 论目前从动物源分离到的益生芽孢杆菌大多数为枯草芽孢杆菌 -! 少数为地衣芽孢杆菌 - 蜡样芽孢杆菌 - 等 且基本来源于平原动物 本研究首次从高原动物 藏绵羊 分离筛选到一株具有益生 潜力的短小芽孢杆菌 -% 传统的细菌鉴定主要根据菌体形态 革兰氏染色 菌落形态及生化试验进行粗略判定 耗时久 误差大 灵敏度低且干扰因素多 随着分子生物学的快速发展 基于细菌核糖体小亚基 在功能和遗传进化中的高度保守性建立的 & 方法被广泛应用于细菌分类鉴定中 弥补了传统生理生化鉴

7 中 国 畜 牧 兽 医 卷 定方法时间久 误差大等不足 具有方便 快捷 准确等优点 同时可从分子生物学角度来比较不同菌株之间的差异 对确定新的菌株 建立种属间遗传进化 树有着重要的作用 本试验筛选菌株通过菌落菌体形态学 生化试验及 & 序列分析 综合判定菌株 ; 为短小芽孢杆菌 - % 动物体内环境复杂 影响因素较多 如酸性环境 胆盐环境 酶作用等 都能影响益生菌的存活率和定植率 因此菌株在酸 胆盐环境生长状况对于评 价益生菌是否优良有着重要的意义 本试验分离的短小芽孢杆菌 ; 对酸 胆盐环境表现出一定的抗性 说明该菌株有可能具有耐受动物胃肠道不良环境而到达肠道定植的能力 同时该菌株还表现出一定的体外抑制大肠杆菌 沙门氏菌的能力 这可能与芽孢杆菌代谢产生的细菌素等物质可抑制某些病原菌株有关 这也说明 ; 可能具有预防肠道疾病的潜力 有研究证明 芽孢杆菌能分泌促进动物机体对营养物质降解消化的酶类 如蛋白酶 纤维素酶 淀 粉酶等 这些酶类能够在一定程度上帮助动物机体降解消化饲料中的有机物 以促进动物机体对营养物质的吸收 本次试验中分离筛选的菌株在蛋白酶选择培养基和纤维素酶选择培养基上能出现明显的水解圈 表明菌株具有产蛋白酶和纤维素酶的能力 也就意味着其有在动物机体内帮助消化饲料有机物的潜力 在药敏试验中 菌株对大多数抗生素都比较敏感 仅对链霉素 林可霉素 呋喃妥因 红霉素中介 因而在使用益生菌作为添加剂时 不能与该菌株敏感的抗生素一同使用 这也是保证益生菌发挥益生 作用的前提 小 结综合短小芽孢杆菌 ; 抑菌性 耐酸 耐胆盐及产水解酶等特性的研究 认为该菌株可作为制备微生态添加剂的备选菌株 且该菌株不含耐药质粒 不会在动物肠道微生态系统中造成抗生素抗性的水平传递 但该菌株在动物机体内的益生能力及应用动物的种属还有待进一步研究 参考文献 D7 ++7:9):9+-9/ &+- &:9+: + /-:6-+& :!:/-7 &!% %! 9&+ -+9: &/7-+-+/!-:,!" :& &+ -7&:9 +:+/7&+/!9:!+957:1! 00 -+/+ &6 D9:++ :9+-)& 9&-:&&:+&79&+9:7&9::!& 69 /:-,! "0 (5+:&) -9:&+9:9+99+7&95!&/9:&&6::!&69&:: &-!0 0 王亚芳 肖群平 吕慧源 等 猪复合微生态制剂菌株的筛选及对仔猪生产性能的影响 中国畜牧杂志 :9+-'&+-+/9&+9 +:-:9 /,96&:-!&97::&+9: (&:- :+:.++!75+-:7: ( D( ) 9&+! 00 5:." 3+7":9+-)&9!!+-!+/:-&+9: 9:9+-96/&7::/! "0 0 ""+6+: :9+9 /9+9:&+&/95:/695+&: 96/-++!9:9&::5&:6. 70 (+&+&:&7+6, &+:6&: ,-+-9-!:, 9&+9:&/ 95:76995:9:&/9:!!! %% - -! 00 (: 3(+ 59!% +:-9&+-!-+9:&/ 95:7+9&9:9+-9&+95:+-955:%%,"00 5+7%.3+73): :9+-/!+& :&:5&/:-::-:9:: (:9++9:-!: + (:9+ 5::!! & 王振宇 王培培 陈 丽 等 欧拉型藏羊肉理化及近红外光谱特性研究 肉类研究 王欣荣 吴建平 藏羊脑动脉系统结构特征与高原适应性研究 家畜生态学报 石少英 杨树猛 马登录 等 欧拉型藏羊选育效果研究 畜牧兽医杂志

8 期 郭政宏等 一株藏绵羊源短小芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 0 龚 慧 猪源益生芽孢杆菌的筛选及发酵工艺研究 洛阳 河南科技大学 +&&9 :-"-6&( (+,/'69 -:95:)&+&9::&7: +6+-9:/ +9+9:&-7: 9: 3&!&7:& 蔡妙英 东秀珠 常见细菌系统鉴定手册 北京 科学出版社 於 剑 艾必燕 星芳 等 & 的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用 重庆中草药研究 王丽娟 肠杆菌科细菌生化鉴定系统的研制及评价分析 中外医疗 0 /!< "):9:&)&:9. 5+&+9:&+ 9:&(!&/95/+-959-:& :+:&!9(!!! +:!::-+9:&/ /+-95:& /:9+9" 6:- :/ :9:&/+9& :-+&69+::&6&7:& /:9+9 / %! 0 "++!695&+ D5+5 )6&+-(! % + -!!!95:!&:::++-:+-9!!0 7+&& &+-&::: :&+/ 1!! 秦 瑶 王 苇 郭秉娇 等 株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌试验研究 中国畜牧兽医 责任编辑 卢庆萍

臧晓南 张学成 王高歌 刘金姐 张晓辉 刘 滨 对两种丝状蓝藻 钝顶节旋藻和盐泽螺旋藻 在基因工程中常用作选择试剂的 种抗生素 氯霉素 氨苄青霉素 红霉素 链霉素 卡那霉素 庆大霉素和新霉素 的敏感性作比较实验 结果表明 两种蓝藻对抗生素的敏感性既有共同的特点 也有 明显的差异 它们对红霉素 氯霉素和链霉素最敏感 致死浓度分别为 和 两种蓝藻对氨苄青霉素比较敏感 的氨苄青霉素即可抑制 和 的生长 但

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