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救化渝包
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1 中国组织工程研究第 16 卷第 51 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 16, 2012 Vol.16, No.51 doi: /j.issn [ 陈建洪, 王萍, 彭萌, 唐倩, 文韵笙. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能 [J]. 中国组织工程研究,2012,16(51): 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能 * 陈建洪, 王萍, 彭萌, 唐倩, 文韵笙文章亮点 :1 实验选用牙髓治疗后疾病的主要致病菌粪肠球菌作为感染细菌 2 延续前期实验的设计使用 2.5% 次氯酸钠作为对照, 研究含醋酸氯已定或三氯生纳米银冲洗剂的抗菌性能 3 实验采用通过液相化学还原法获得的纳米银制剂, 其形状为球形, 直径为 5-20 nm 关键词 : 纳米银 ; 根管冲洗 ; 醋酸氯已定 ; 三氯生 ; 饥饿期粪肠球菌 ; 次氯酸钠 ; 平板计数法 ; 生物材料摘要背景 : 牙髓根管治疗中有效的根管冲洗可明显减少根管系统内细菌及其产物, 改善治疗效果及预后目的 : 分析含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂对饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型的抗菌效果方法 : 将 45 颗牙体完整发育正常的人单根管前磨牙随机分为 3 组, 建立饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型, 对感染模型使用 Protaper 手动器械进行根管预备至 F3, 同时分别使用含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂含三氯生纳米银根管冲洗剂及次氯酸钠进行根管冲洗, 采用菌落计数法计算根管预备冲洗前后感染根管内的菌落数结果与结论 : 含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂及次氯酸钠冲洗后根管内细菌数量均明显低于冲洗前 (P < 0.01) 含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂组与次氯酸钠冲洗组冲洗后的细菌数量低于含三氯生纳米银根管冲洗剂组 (P < 0.05), 前两组间差异无显著性意义表明含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂较含三氯生纳米银根管冲洗剂具有更强的抗菌效果中山大学附属第三医院口腔科, 广东省广州市陈建洪, 男,1959 年生, 广东省梅州市人, 汉族,1983 年中山医科大学毕业, 副主任医师, 主要从事牙髓病学研究 wangpww@ 126.com 中图分类号 :R318 文献标识码 :A 文章编号 : (2012) 收稿日期 : 修回日期 : ( /GW W) Antimicrobial efficacy of nano-silver endodontic irrigations for an in vitro model infected by Enterococcus faecalis in starvation Chen Jian-hong, Wang Ping, Peng Meng, Tang Qian, Wen Yun-sheng Abstract BACKGROUND: Effective root canal irrigation in root canal treatment can significantly reduce bacteria and their products within the root canal system, improving the treatment effectiveness and prognosis. OBJECTIVE: To evaluate the antimicrobial effects of two kinds of nano-silver endodontic irrigates containing chlorhexidine acetate or triclosan against Entercoccus faecalis in starvation in root canals. METHODS: Totally 45 infected premolars models used in the experiment were divided into three groups randomly, all of which were prepared with Protaper hand instruments to F3, and were irrigated with irrigations containing chlorhexidine acetate, triclosan and NaClO. Microbial growth was analyzed by turbidity of the culture medium, and then colony-forming units were counted on the plates. RESULTS AND CONCLUSION: There was a statistically significant difference in colony-forming units of Entercoccus faecalis before and after irrigation (P < 0.01). All of the three irrigations were antimicrobial. There was no significant difference in the antimicrobial effect between chlorhexidine acetate nano-silver and NaClO (P > 0.05). Chlorhexidine acetate nano-silver and NaClO showed a better antimicrobial effect than triclosan nano-silver, which was statistically significant (P < 0.05). These findings indicated that chlorhexidine acetate nano-silver, triclosan nano-silver and NaClO were antimicrobial, which could not eradicate Entercoccus faecalis in the root canals. Antimicrobial effects of chlorhexidine acetate nano-silver and NaClO were similar, which were better than triclosan nano-silver. Chen JH, Wang P, Peng M, Tang Q, Wen YS. Antimicrobial efficacy of nano-silver endodontic irrigations for an in vitro model infected by Enterococcus faecalis in starvation.zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(51): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 9533

2 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能 Department of Stomatology, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou , Guangdong Province, China Chen Jian-hong, Associate chief physician, Department of Stomatology, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou , Guangdong Province, China Supported by: the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No * Received: Accepted: 引言牙髓治疗后疾病在临床中较常见, 约 30% 经过根管充填的病例仍然存在牙髓治疗后感染 [1] 因粪肠球菌可进入饥饿及半饥饿的状态抵抗环境压力而成为牙髓治疗后疾病的主要致病菌粪肠球菌具有较强的渗透能力, 能够进入根管峡部不规则区及牙本质小管内, 在根管内多以生物膜的形式存在针对牙髓治疗后疾病, 目前主要采用根管再治疗的方法清除感染并封闭根管, 能否彻底清除根管系统内粪肠球菌成为牙髓再治疗成功与否的关键根管冲洗在机械化学根管预备过程中起到极为关键的作用, 有效的冲洗可明显减少根管系统内细菌及其产物, 从而改善根管再治疗效果纳米银作为抗菌剂已逐渐被广泛应用于 [2] 医疗卫生行业, 邱国英探讨了微波联合纳米银抗菌凝胶治疗宫颈糜烂的效果研究选取作者所在医院妇科门诊 2010 年 1 月至 2011 年 6 月期间收治的 186 例宫颈糜烂的患者, 随机分为对照组和治疗组, 各 93 例对照组采用药物治疗, 治疗组在对照组的基础上再行微波治疗, 比较两组的治疗效果结果显示, 治疗组总有效率治愈率均高于对照组, 差异均有非常显著性意义 (P < 0.01); 治疗组阴道排液在 7 d 内停止率阴道排液量阴道出血量经量率显著高于对照组, 差异均有非常显著性意义 (P < 0.01) 表明微波联合纳米银抗菌凝胶治疗宫颈糜烂安全有效, 值得临床推广 [3] 李明春等探讨了纳米银溶液及纳米银凝胶的体外抗菌作用, 为将纳米银开发成烧烫伤外用抗感染药提供依据研究以磺胺嘧啶银为阳性对照, 采用试管二倍稀释法考察纳米银溶液及纳米银凝胶对铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌变形杆菌沙雷氏菌不动杆菌表皮葡萄球菌肠球菌肺炎克雷伯菌白色念珠菌等 10 种病菌的最低抑菌浓度结果显示, 纳米银凝胶纳米银溶液及磺胺嘧啶银对上述 10 种细菌的最低抑菌浓度分别为 ,4-32,32-64 mg/l, 纳米银溶液及其凝胶的抗菌效果明显优于磺胺嘧啶银表明体外实验中纳米银溶液及其凝胶抗菌谱广抗菌作用强, 为其用于治疗烧伤烫伤等感染提供了一定试验依据 [4] 庄沛林检测了纳米银溶液对粪肠球菌的有效作用浓度, 探讨纳米银溶液干预粪肠球菌对牙本质的黏附从而抑制粪肠球菌生物膜形成的作用, 研究纳米银溶液对牙本质表面粪肠球菌生物膜的杀菌作用并明确其有效作用时间, 为探寻新型有效的根管消毒药物以提高根管治疗成功率提供实验依据结果表明 :1 纳米银溶液对粪肠球菌有较强的抗菌作用,0.006% 的纳米银溶液可抑制粪肠球菌生长,0.1% 纳米银溶液可杀灭生物膜状态粪肠球菌 20.1% 纳米银溶液可有效减少粪肠球菌对牙本质的黏附且对牙本质表面形态无明显破坏, 推测应用纳米银溶液冲洗根管可减少粪肠球菌对根管牙本质的黏附, 抑制根管内粪肠球菌生物膜的形成 30.1% 纳米银溶液可在生物膜未完全解体的情况下杀灭牙本质表面粪肠球菌生物膜深层细菌, 提示纳米银溶液对粪肠球菌生物膜有较强的渗透能力和杀菌作用, 其杀菌作用随处理时间的延长而增强, 至 24 h 可完全杀灭粪肠球菌, 表明应用 0.1% 纳米银溶液作为根管消毒药物有望提高根管消毒效果, 其作用时间以 24 h 以上为佳 [5] 舒东将 96 例外科手术后患者随机分为对照组 48 例 ( 常规切口敷料 ) 和观察组 48 例 ( 纳米银抗菌敷料 ), 观察组以生理盐水清洗切口后使用纳米银抗菌敷料覆盖, 对照组以碘伏消毒切口后使用常规无菌敷料覆盖, 对比两组患者切口甲级愈合时间感染情况切口换药频率切口细菌培养数量 1 年后随访两组患者瘢痕发生率结果表明纳米银抗菌敷料可以明显促进外科手术部位伤口甲级愈合时间, 增加愈合程度, 并减少切口感染及瘢痕化发生, 值得临床广泛应用纳米银作为牙髓治疗冲洗药物具有良好的应用前景, 本实验分析含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂对饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型的抗菌效果 1 材料和方法设计 : 对比观察实验时间及地点 : 于 2010 年 8 月至 2011 年 6 月在中山大学附属第三医院完成 9534 P.O. Box 1200, Shenyang

3 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能材料 : 纳米银根管冲洗剂对饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型作用实验的菌种试剂及仪器 : 菌种试剂及仪器来源标准粪肠球菌菌株 (ATCC29212) 中山大学光华口腔研究所脑心浸液培养基广东环凯微生物科技有限公司试剂 A, 试剂 B 华南理工大学材料科学与工程学院 2.5% 次氯酸钠天津天达净化材料精细化工厂 SG-403 生物安全柜美国 The Baker Company Bactron Ⅰ 厌氧培养箱美国 Shel Lab MiniSpin 微型高速离心机德国 Eppendorf 试剂 A 配方 : 取 1 g 卡波姆 940 溶于 60 ml 去离子水中形成水溶液, 后加入醋酸氯已定 1.5 g, 纳米银 100 μg, 乙醇 35 ml, 在均质化速度 r/min 下搅拌 10 min 形成的无色透明液体试剂 B 配方 : 取 1 g 卡波姆 940 溶于 60 ml 去离子水中形成水溶液, 然后加入三氯生 0.5 g, 纳米银 100 μg, 乙醇 35 ml, 在均质化速度 r/min 下搅拌 10 min 形成的无色透明液体离体牙 : 选取因正畸治疗需要拔除的牙体完整发育正常无变异的单根管前磨牙 45 颗为实验研究样本, 供者知情同意牙根长度标准化 : 截去牙冠, 保留 12 mm 牙根, 摘除牙髓, 疏通根管 ; 工作长度标准化 : 自根尖退行 1 mm, 工作长度 WL= 11 mm,protaper 冠下法根管预备至 F3 号锉即根尖段达到 30 号,5.25%NaClO 和 17%EDTA 交替冲洗后, 超声荡洗去除玷污层 ;121 高温高压灭菌 20 min,4 下生理盐水中保存 ; 随机选择 2 标本检测灭菌效果实验方法 : 培养饥饿期粪肠球菌 : 将粪肠球菌标准菌株 (ATCC29212) 梯度解冻至室温, 复苏 ; 将复苏菌液与新鲜 BHI 液体培养基扩增,37 厌氧 ( 体积分数 80%N 2 10%H 2 10%CO 2 ) 培养 24 h 挑取单个菌落进行生化鉴定, 确定为标准菌株后从培养基刮取菌株置于双蒸中, 紫外分光光度计调整菌落形成单位 CFU 至扩增 [6] ; 自扩增初始计, 分别于 2,4,6,8, 16,24,48,72,96 h 取样 100 μl 菌液按照 10 倍稀释法稀释后涂布于 BHI- 琼脂培养皿, 通过平板菌落计数法计算各个时间点菌落数, 绘制生长曲线确立饥饿期感染模型的建立 : 将冻存于 -20 冰箱中的粪肠球菌标准株 ATCC29212 解冻复苏后, 在 BHI 液体培养基中扩增 ; 厌氧 ( 体积分数 80%N 2 10%H 2 10%CO 2 ) 培养, 37 培养 48 h 后, 挑取单个菌落, 取数个单菌落转至 BHI 液体培养基中,37 厌氧增菌培养至饥饿期 72 h, 调整菌悬液密度为麦氏比浊度 5( CFU/mL); 在 45 个盛有无菌牙根的双蒸水 Ep 管中加入 100 µl 麦氏比浊度为 5 的饥饿期粪肠球菌菌液, 放入孵育箱中培养 24 h [7] ; 随机抽取 3 个样本, 于根管口取 10 µl 菌液接种于 BHI- 琼脂培养皿, 厌氧培养 24 h, 根据菌落形态用 API20strep 试剂盒行生化鉴定 ; 细菌学及生化鉴定样本中细菌为饥饿期的粪肠球菌无污染, 即刻进行下一步实验实验分组及根管冲洗 : 将 45 个成功建模的标本随机分为 3 组, 每组 15 个标本根管预备时每更换一次器械分别采用 3 种冲洗剂进行根管冲洗使用 5 ml 注射器针管和 1 ml 侧向开口的注射器针头, 冲洗时将注射器针头沿根管侧壁滑入根管深部, 达工作长度后后退 2 mm, 以无阻力不嵌塞回流通畅为准, 并不时上下左右移动针头, 各组 4 ml 冲洗液匀速缓慢冲洗, 速度为 4 ml/min 根管预备中各组使用的根管冲洗剂 : 组别样本量方法 A 15 样品 A #, 即醋酸氯已定纳米银乙醇溶液 B 15 样品 B *, 即三氯生纳米银乙醇溶液 C % 次氯酸钠感染模型的取样及细菌培养计数 : 第 1 次取样 (N1): 根管冲洗前用 30# 无菌纸尖按照工作长度插入根管中停留 1 min, 吸取根管内液, 立即放入装有 1 ml 生理盐水的 Eppendorf 管中混匀, 分别接种于 BHI 血琼脂平皿上,37 下 CO 2 孵育箱中培养,48 h 后计数菌落数记为 N1 第 2 次取样 (N2):Protaper 手动锉逐步后退法按照工作长度 WL 预备根管至 F3 号锉即根尖段达到 30 号, 每更换一次器械时分别以各组液进行根管冲洗 2 ml 无菌生理盐水冲洗根管后立即用 30 # 无菌纸尖按照根管长度插入根管中停留 1 min, 吸取根管内液培养计数记为 N2 细菌菌落计数 : 取 Eppendorf 管中液体 0.5 ml, 于无菌 BHI 液体培养基中 10 倍系列稀释, 接种于盛有 BHI 固体培养基的平皿,37 厌氧培养 48 h 之后计数菌落形成单位 CFU [8] 细菌复苏实验 : 第 2 次取样后, 在根管内分别插入 4 根饱含 BHI 液体培养基的纸尖,37 下 CO 2 孵育箱中培养 72 h 后, 夹出纸尖放入 BHI 液体培养基中, 继续培养 48 h, 肉眼见培养基变浑浊并根据菌落形态革兰染色实验确定是否有其他微生物感染主要观察指标 : 含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂对饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型的抗菌效果 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 9535

www.crter.org 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能统计学分析 : 细菌计数结果 (CFU/mL) 加 1 后做对数转换, 即 Ⅰg(CFU /ml+1) 比较各组根管内粪肠球菌在根管预备冲洗前后菌落形成单位 CFU 下降情况利用 SPSS 18.0 软件对数据采用 t 检验进行统计学分析, 检验水准取 α = 0.05 2 结果 2.

4 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能统计学分析 : 细菌计数结果 (CFU/mL) 加 1 后做对数转换, 即 Ⅰg(CFU /ml+1) 比较各组根管内粪肠球菌在根管预备冲洗前后菌落形成单位 CFU 下降情况利用 SPSS 18.0 软件对数据采用 t 检验进行统计学分析, 检验水准取 α = 结果 2.1 绘制粪肠球菌生长曲线, 确立饥饿期见图 1, 表 1 Colony-forming units Time (h) Figure 1 Growth curve of Entercoccus faecalis 图 1 粪肠球菌的生长曲线表 1 粪肠球菌的生长曲线分期 Table 1 Growth curve staging of Entercoccus faecalis Staging Time (h) Identification Lag phase 0-2 No changes Log phase 2-6 Increasedgsigni ficeantly Stationary phase 6-36 Maintaining a artain level Death phase Decreasing Starvation phase 72- Dereasing to a stable level 表 2 感染根管经含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂及次氯酸钠冲洗前后根管内粪肠球菌数量变化 Table 2 Colony-forming units (CFU) of Entercoccus faecalis in the root canals before and after irrigation [x _ ±s, Ig(CFU/mL+1)] Group A B C n CFU1 5.31± ± ±0.27 Colony counting CFU2 1.65±0.25 ab 3.12±0.35 a 1.45±0.17 ab ΔCFU(CFU1- CFU2) 3.66± ± ±0.15 注 :A: 含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂组 ;B: 含三氯生纳米银根管冲洗剂组 ;C: 次氯酸钠冲洗组 ;CFU1: 根管冲洗前的菌落形成单位 ;CFU2: Protaper 手动锉逐步后退法按照工作长度 WL 预备根管至 F3 号锉即根尖段达到 30 号, 第 1 次更换器械进行根管冲洗后的菌落形成单位 ; 与 CFU1 比较, a P < 0.01; 与 B 组比较, b P < 0.05; 表明含有醋酸氯已定的纳米银冲洗剂具有和次氯酸钠相近的抗菌性能, 较三氯生纳米银冲洗剂抗菌性能更加优越 3 组冲洗前菌落形成单位 CFU 相近, 均为 5.30 左右, 无明显差异 ;3 组冲洗后菌落形成单位 CFU 均明显低于冲洗前 (P < 0.01); 含三氯生纳米银根管冲洗剂组冲洗后菌落形成单位 CFU 为 3.12 左右, 明显高于含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂组及次氯酸钠组菌落形成单位 CFU 2.3 粪肠球菌复苏实验及菌种鉴定所取样本经过厌氧培养在 BHI- 琼脂培养基平皿上形成乳白色菌落, 边缘整齐, 表面湿润光滑, 低倍镜下呈圆形或椭圆形, 直径 µm, 呈成对或短链状排列, 见图菌落培养计数结果见图 2, 表 CFU A B C Group CFU1 CFU2 注 :A: 含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂组 ;B: 含三氯生纳米银根管冲洗剂组 ;C: 次氯酸钠冲洗组 ;CFU1: 根管冲洗前的菌落形成单位 ;CFU2: Protaper 手动锉逐步后退法按照工作长度 WL 预备根管至 F3 号锉即根尖段达到 30 号, 第一次更换器械进行根管冲洗后的菌落形成单位 ; 图中可见含有醋酸氯已定的纳米银冲洗剂具有和次氯酸钠相近的抗菌性能, 较三氯生纳米银冲洗剂抗菌性能更加优越 Figure 2 Colony-forming units (CFU) of Entercoccus faecalis in the root canals before and after irrigation 图 2 感染根管经含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂及次氯酸钠冲洗前后根管内粪肠球菌的菌落形成单位注 : 粪肠球菌经过厌氧培养在 BHI- 琼脂培养基平皿上形成乳白色菌落, 边缘整齐, 表面湿润光滑, 低倍镜下呈圆形或椭圆形, 直径 µm, 呈成对或短链状排列 Figure 3 Entercoccus faecalis resuscitation and strain identification 图 3 粪肠球菌复苏实验及菌种鉴定 3 讨论由于根管系统的不规则复杂性及现有治疗方法的 9536 P.O. Box 1200, Shenyang

5 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能局限性, 牙髓治疗后根管系统内残存的细菌是造成治疗失败的主要原因, 再治疗根管内粪肠球菌的存在与临床症状及体征密切相关 [9] 粪肠球菌作为牙髓治疗后疾病的根管系统内优势菌种, 其检出率高达 22%-77% 粪肠球菌在极度缺乏营养的环境中可进入饥饿期单独形成生物膜渗透侵入牙本质小管深层, 其对常用根管消毒药物具有一定的耐受能力 [10] [7] 郭惠杰等通过建立体外粪肠球菌感染根管模型, 观察根管内粪肠球菌的感染状态及其分布特征研究选择因正畸减数拔除的健康前磨牙 10 例, 随机分为两组, 将其中 5 例高压灭菌后分别浸泡于含有 1.5 ml 无菌脑心浸液培养基和 0.1 ml 麦氏比浊度为 5 的粪肠球菌菌液的 Eppendorf 管中, 于 CO 2 孵育箱中培养 21 d 建成体外粪肠球菌根管感染模型, 其余 5 例则作为对照组 ; 将所有样本沿牙长轴近远中向劈为两半, 一半作组织学 Brown&Brenn 染色观察, 另一半置扫描电镜下观察粪肠球菌在根管内的感染状态组织学结果显示, 在所有研究组样本中, 粪肠球菌均不同程度地侵入牙本质小管中, 测微尺测量深度可达 μm 所有对照组样本的根管壁表面干净, 牙本质小管排列有序, 无细菌染色颗粒扫描电镜结果显示, 在所有研究组样本的根尖 1/3 段, 粪肠球菌与无定形基质形成典型的生物膜结构, 而在根管的冠 1/3 和中 1/3 段, 粪肠球菌则成对或短链状排列在根管壁表面, 呈现浮游状态 ; 对照组的根管壁表面洁净, 牙本质小管和管间牙本质结构清晰可见, 未见细菌侵入表明粪肠球菌可单独定植于根管内, 形成生物膜并侵入牙本质小管深部此模型可用于体外评价各种机械预备和化学消毒药物对根管内感染的清除效果, 从而为临床选择治疗操作提供参考 [11] Distel 等通过扫描电镜发现体外置有氢氧化钙制剂的根管,160 d 后仍可发现粪肠球菌生物膜牙髓治疗后, 根管系统内粪肠球菌因缺乏营养物质大量死亡, 部分残余进入饥饿期, 细胞壁糖蛋白和 DNA 合成基本停滞特定情况下根尖周组织液自根尖区通道渗入根管为粪肠球菌提供了营养, 细菌恢复活性增殖进而导致病变研究表明粪肠球菌在根管内多以稳定的生物膜形式存在, 其产生多聚糖覆盖于菌体表面, 形成一个微生态系统生物膜为细菌提供了一个安全稳定的生存环境, 有助于抵抗外界环境压力, 从而增强了其对抗菌剂的抵抗力, 因此现有抗菌措施难以取得理想根管消毒效果 [10] 在缺乏营养的环境中, 饥饿状态下的粪肠球菌可生存 4 个月, 甚至更长若饥饿初始时细菌的量较大, 细菌生存的时间将会更长由此可见, 临床中虽然难以彻底灭菌, 在牙髓治疗过程中尽可能的清除细菌对预后有着非常重要的意义 [6,10] 本实验选用粪肠球菌作为感染细菌, 是由于粪肠球菌被认为是牙髓治疗后疾病的主要致病菌, 因此建立饥饿期粪肠球菌根管感染模型旨在模拟牙髓治疗后疾病的机制, 实验结果具有一定的可参考性次氯酸钠因其具有较强的抗菌能力组织溶解能力良好的生物相容性等优势而成为目前临床上使用最广泛的冲洗剂长达 70 余年 [12] [13] 程凡研究不同浓度次氯酸钠溶液在根管治疗中作用实验选入 80 个研究对象, 随机分为 4 组 :A B C 和 D 组, 对每组行根管预处理后, 依次按 1.0%,1.5%,2.0% 和 2.5% 的次氯酸钠浓度冲洗, 冲洗时间为 1 min 以疼痛作为安全性判断标准, 而以复诊率作为疗效的判断标准, 相对应的时间点依次是 24 h 和 1 年, 然后行统计学分析结果显示在以疼痛分级为标准的基础上,4 个浓度组之间差异无显著性意义 (P=0.651); 而以复诊作为疗效观察时,2.0% 和 2.5% 浓度的次氯酸钠疗效优于 1.0% 和 1.5% 浓度的次氯酸钠疗效, 且差异有显著性意义 (P=0.003), 而且 2.0% 和 2.5% 浓度的次氯酸钠两组之间在治疗效果上差异无显著性意义 (P=0.063) 表明 2.0% 浓度的次氯酸钠溶液在根管 [14] 治疗中具有很好的安全性和较好的疗效杨秋菊等探讨了次氯酸钠作为根管冲洗剂的临床效果分析实验选择 100 颗单根管慢性根尖周炎患牙, 随机分为药物治疗组 50 颗, 以 NACLO 和生理盐水做根管冲洗 ; 对照组 50 颗, 以 H 2 O 2 和生理盐水做根管冲洗, 术后 0.5,1,2 年复查结果显示, 药物治疗组效果明显优于对照组 (P < 0.05), 表明次氯酸钠是根管冲洗的理想药物 0.5%-6.0% 次氯酸钠与 17%EDTA 的配合是最为经典的配伍研究显示次氯酸钠对粪肠球菌生物膜具有极强的杀灭作用 [8] [15] 李新军等检测中药茶多酚 MTAD 52.5 g/l 次氯酸钠抑制根管壁粪肠球菌生物膜的能力, 并分析中药茶多酚作为根管冲洗液的可行性实验采用微孔板滴定法检测茶多酚,MTAD 和 52.5 g/l 次氯酸钠液对粪肠球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度, 采用琼脂扩散实验检测 3 种抗菌剂对粪肠球菌的抑菌圈通过建立粪肠球菌感染根管 3 周和 6 周的模型, 分别用茶多酚 MTAD 和 52.5 g/l 次氯酸钠液对粪肠球菌感染后的根管进行处理, 然后对根管壁生物膜中的细菌生存情况进行定性定量分析, 比较这 3 种根管冲洗液抗粪肠球菌生物膜的能力最小抑菌浓度最小杀菌浓度和琼脂扩散实验结果显示 :3 组冲洗剂对粪肠球菌均有抑制作用 ; 在粪肠球菌感染根管 3 周的生物膜中,MTAD 和次氯酸钠液可以完全抑制粪肠球菌生物膜, 茶多酚处理后虽仍有粪 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 9537

6 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能肠球菌生长, 但明显低于生理盐水处理组的细菌生存数, 差异有显著性意义 (P < 0.05) 在粪肠球菌感染根管 6 周的生物膜中, 次氯酸钠液可以完全抑制细菌生长, 茶多酚和 MTAD 作用后仍有活菌生长, 但与生理盐水对照组相比, 细菌生存数均显示了 8 个 log 值的下降, 差异有显著性意义 (P < 0.05) 研究表明 52.5 g/l 次氯酸钠液具有很强的抑制根管内粪肠球菌生物膜作用, 而茶多酚和 MTAD 也具有一定的抑制粪肠球菌生物膜的能力林 [16] 南雁等观察了 0.5% 次氯酸钠根管冲洗剂用于慢性根尖周炎患牙根管治疗的临床疗效研究选择 100 例单根管慢性根尖周病变患牙, 随机分为两组 : 实验组 50 例, 用 0.5% 次氯酸钠做根管冲洗消毒 ; 对照组 50 例, 用 3% 过氧化氢做根管冲洗消毒 ; 观察术后 6 个月的临床及 X 射线片表现, 并分析对比两者的临床疗效结果显示, 0.5% 次氯酸钠根管冲洗组治疗有效率为 56.5% 明显高于 3% 过氧化氢根管冲洗组的 44.4%(P < 0.05), 表明 0.5% 次氯酸钠根管冲洗剂是较为有效的根管冲洗剂此外, 次氯酸钠对病原体有直接的杀灭作用, 并且能降低内毒素活性有实验研究复方次氯酸钠消毒剂对医院口腔器械消毒的效果, 实验采用口腔器械模拟现场消毒试验方法对污染乙型肝炎表面抗原的灭活效果进行观察, 结果显示, 用含有效氯 500 mg/l 以上复方次氯酸钠消毒液浸泡作用 10 min, 对污染到口腔器械表面的乙型肝炎表面抗原灭活率达到 100%; 含有效氯 mg/l 的复方次氯酸钠消毒液连续浸泡常用口腔器械 10 d 未见明显腐蚀结果表明复方次氯酸钠消毒剂对污染到口腔器械上的乙型肝炎表面抗原具有快速的灭活效果, 并且对器械基本无腐蚀由于本实验旨在研究两种纳米银冲洗剂的抗菌性能, 因此延续前期实验的设计使用 2.5% 次氯酸钠作为对照, 并未研究其对玷污层的作用, 所以未加入 EDTA, 后续研究可以探索两种纳米银冲洗剂对玷污层的作用纳米银原子排列为介于固体和分子之间的介态, 其尺寸介于原子簇和宏观微粒之间, 微粒比表面积非常大, 显示出明显的表面效应小尺寸效应和宏观隧道效应根据 Yong-Laplace 方程, 随着表面积的增加, 银的离解程度增加, 溶液中的银离子浓度递增, 从而提高其生物化学活性, 这种活性极强的纳米银微粒具备超强的抗菌能力 [9,17] 纳米银微小的体积使其具有极大的比表面积, 从而存在更多的活性银原子, 其抗菌基质与银离子相似, 但有效杀菌浓度却明显低于金属银或者其他形态的银制剂 [18] 纳米银的杀菌机制主要有损伤细菌 DNA 中断细胞信号转导活性氧自由基的氧化损伤菌体内容物泄漏脱氢酶失活 [19] [20] 代小英等采用悬液定量杀灭实验证明纳米银水溶液可有效杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌噬菌体 MS2,T4 由于合成方法不同, 纳米银具有多种微观形态, 如球形棒形立方体三角形五角形等, 微粒直径均 [21] 小于 100 nm Pal 等研究了不同形状纳米银对大肠杆菌的抗菌性能结果显示, 三角形纳米银在银含量为 0.01 mg/l 时表现出了明显的细菌抑制作用, 而圆形纳米银的细菌抑制最小浓度为 mg/l, 杆状纳米银最小抑菌浓度介于 mg/l 之间该研究结果表明, 纳米银的抗菌性能具有形状依赖性应用原子分辨率的高角环形暗场显像技术对不同尺寸纳米银的抗菌性进行分析, 结果显示微粒直径小于 5 nm 的纳米银表现出了更好的抗菌性能, 表明纳米银的抗菌性能具有尺寸依赖性 [22] 本实验所用的纳米银制剂是通过液相化学还原法, 利用在分散剂聚乙烯醇 400 和聚乙烯醇 2000 水溶液的保护下, 硝酸银在葡萄糖溶液中还原得到的, 其形状为球形, 直径为 5-20 nm, 前期研究中已表明其具有一定的抗菌性能 [15] 作者前期研究比较两种药物对饥饿期粪肠球菌 24 h 生物膜的作用效果 [23] 方法为: 培养饥饿期粪肠球菌 24 h 生物膜, 试液 A 试液 B 以及对照组 2.5% 次氯酸钠分别作用生物膜 3,9,30 min, 活菌菌落计数法计算药物作用前后生物膜中活菌菌落数, 观察药物作用效果结果显示, 试液 A 组在各作用时间点活菌菌落数差异均有显著性意义 (P < 0.05), 试液 B 组除了在 3 min 与 30 min 间活菌菌落数差异有显著性意义 (P < 0.05) 外, 其余时间点差异无显著性意义 (P > 0.05),2.5% 次氯酸钠组在 3 min 与 9 min 间活菌菌落数差异有显著性意义 (P < 0.05),9 min 与 30 min 间活菌菌落数差异无显著性意义 (P > 0.05); 在同一时间点, 试液 A 组与 2.5% 次氯酸钠组活菌菌落数差异无显著性意义 (P > 0.05), 而与试液 B 组差异有显著性意义 (P < 0.05) 表明实验组及对照组药物都有一定的杀菌作用, 杀菌效果 : 试液 A 与 2.5% 次氯酸钠效果相当, 均明显优于试液 B, 但在作用时间内均不能完全杀灭生物膜中的粪肠球菌纳米银颗粒自身的粒径形状浓度和表面修饰物等均能影响纳米银和菌体的接触及侵入, 造成不同的杀伤作用革兰阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖构成, 线性的肽聚糖由小肽连接成相互交联的网状立体结构, 比阴性菌的厚 (20-80 nm) 且更致密, 纳米银不但难以锚定在 [24] 其上面, 而且难以穿过细胞壁庄沛林等利用 MBECTMP&G Assay 建立粪肠球菌感染模型, 以连续稀释法检测纳米银载银纳米二氧化钛掺氮纳米二氧 9538 P.O. Box 1200, Shenyang

7 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能化钛的最小抑菌浓度 MIC 和最小生物膜清除浓度 MBEC 纳米银对粪肠球菌的 MIC 和 MBEC 分别为 62.5 mg/l 和 g/l 表明纳米银对粪肠球菌有较强抗菌作用, 能清除粪肠球菌生物膜本实验中纳米银冲洗剂表现出一定的抗菌性能, 但未能彻底清除粪肠球菌, 仍有残余, 可能主要由于粪肠球菌为革兰阳性菌, 表面携带正电荷的纳米银微粒对其表面黏附结合能力不足, 所以难以得到彻底的杀菌效果如果可以改善纳米银的表面结合黏附能力或者配伍使用强效抗革兰阳性菌的杀菌剂, 理论上可以得到更好的杀菌效果醋酸氯已定由于其具有较强的抗菌性能及较低的毒性, 近年来被发展成为新的根管冲洗材料国内有研究比较不同冲洗液联合应用去除根管玷污层的效果, 实验将 40 颗离体单根管牙截冠后随机分为 5 组, 采用冠向下法进行根管预备, 预备中分别以不同根管冲洗液进行根管冲洗 A 组 :20 g/l 醋酸氯已定 (CHX) 溶液 ;B 组 : 25 g/l 次氯酸钠 (NaOCl) 溶液 ;C 组 :20 g/lchx 溶液 + 乙二胺四乙酸 (EDTA) 凝胶 ;D 组 :25 g/lnaocl 溶液 +EDTA 凝胶 ;E 组 ( 对照组 ): 蒸馏水然后将牙体沿颊舌向纵劈, 扫描电镜观察各组样本在根中 1/3 玷污层和牙本质碎屑的去除情况, 统计学分析比较各组根管清洁的差异结果显示,A B C 和 D 组与 E 组比较差别有显著性意义 (P < 0.05),B D 组对玷污层的去除和牙本质小管开放程度与 A C 组比较差别有显著性意义 (P < 0.05); 两两比较得出 C 组优于 A 组 (P < 0.05),B D 两组差别无显著性意义 (P > 0.05) 结果表明 CHX NaOCl 单独或联合 EDTA 凝胶均可去除玷污层, NaOCl+EDTA 凝胶组的冲洗效果最好, 单独使用 CHX 清洁效果不佳, 与 EDTA 凝胶配合使用去除玷污层的能 [25] 力有提高 Schäfer 等建立粪肠球菌体外根管感染模型, 将醋酸氯已定氢氧化钙凝胶分别导入根管内, 根管顶备后检测根管壁牙本质, 醋酸氯已定组较氢氧化钙组具有更加优越的抗菌性能醋酸氯已定是本实验样本 A 主要成分之一, 结果显示含有醋酸氯已定的纳米银根管冲洗剂具有和 2.5% 次氯酸钠类似的抗菌能力 [26] Fine 等通过临床试验证明三氯生可明显减少口腔中的微生物细菌学检测证实口腔内厌氧菌群在刷牙后 6h 降低 88%,12 h 后降低 96% 本实验中, 含有三氯生的样本 B 与含有醋酸氯已定的样本 A 均具有一定的抗菌能力, 但样本 A 明显优于样本 B 在其他材料与方法完全相同的前提下, 样本 A B 之间的主要差异由其中的抗菌成分醋酸氯已定和三氯生导致的, 由此可见本实验中醋酸氯已定较三氯生具有更加优越的抗菌性能三氯生的理化特性决定其较难溶于水而易于溶解于碱性及有机溶剂, 实验中样本 B 接触水溶液后见到少量白色絮状沉淀, 所以冲洗时针对粪肠球菌的有效抗菌成分较理论值低, 并且沉淀物进一步形成屏障阻止了活性结构域纳米银与粪肠球菌细胞接触, 因此本实验 B 组抗菌效果不理想后续研究中如有方法解决三氯生在水溶液中溶解性问题可能得到更加理想的抗菌效果实验证实含有醋酸氯已定的纳米银冲洗剂具有和次氯酸钠相近的抗菌性能, 较三氯生纳米银冲洗剂抗菌性能更加优越, 结果与前期研究两种纳米银冲洗剂对 24 h 饥饿期粪肠球菌生物膜作用的结果相符致谢 : 感谢中山大学附属第三医院口腔牙体牙髓科在实验中给予的支持感谢中山大学光华口腔研究所对实验的支持 4 参考文献 [1] Friedman S. Management of post-treatment endodontic disease: a current concept of case selection.aust Endod J.2000;26(3): [2] Qiu GY.Zhongguo Yiyao Zhinan. 2012;10(12): 邱国英. 微波联合纳米银抗菌凝胶治疗宫颈糜烂的效果评价 [J]. 中国医药指南,2012,10(12): [3] Li MC,Ma SD,Cao EH,et al.zhongguo Yaofang. 2012;23(21): 李明春, 马守栋, 曹恩惠, 等. 纳米银溶液及其凝胶的体外抗菌作用研究 [J]. 中国药房,2012,23(21): [4] Zhuang PL.Zhongshan Daxue 庄沛林. 纳米银对粪肠球菌抗菌作用的实验研究 [D]. 中山大学, [5] Shu D.Yiyao Luntan Zazhi. 2012;33(1): 舒东. 手术切口应用纳米银抗菌敷料的意义及机理探讨 [J]. 医药论坛杂志,2012,33(1): [6] Figdor D,Davies JK,Sundqvist G.Starvation survival,growth and recovery of Enterococcus faecalis in human serum.oral Microbiol Immunol.2003;18(4): [7] Guo HJ,Yue L.Beijing Daxue Xuebao. 2009;41(6): 郭惠杰, 岳林. 粪肠球菌在根管内定植模式的体外研究 [J]. 北京大学学报,2009,41(6): [8] Delgado RJ,Gasparoto TH,Sipert CR,et al. Antimicrobial effects of calcium hydroxide and chlorhexidine on Enterococcus Faecalis.J Endod.2010;36(8): [9] Richards RM.Antibacterial action of silver nitrate.microbios. 1981;31(124): [10] Estrela C,Sydney GB,Figueiredo JA,et al.a model system to study antimicrobial strategies in endodontic biofilms.j Appl Oral Sci.2009;17(2): [11] Distel JW,Hatton JF,Gillespie MJ.Biofilm formation in medicated root canals.j Endod.2002;28(10): [12] Dunavant TR,Regan JD,Glickman GN,et al.comparative eavluation of endodontic irrigations against Enterococcus faecalis biofilms.j Endod.2006;32(6): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 9539

8 陈建洪, 等. 不同成分纳米银冲洗粪肠球菌离体根管感染的抗菌性能 [13] Cheng F.Zhongguo Shiyong Yiyao. 2012;7(18): 程凡. 不同浓度的次氯酸钠冲洗液在根管治疗中疗效的观察 [J]. 中国实用医药,2012,7 (18): [14] Yang QJ,Xie M.Zhongguo Yiyao Kexue. 2011;1(16): 187. 杨秋菊, 解鸣. 次氯酸钠根管冲洗临床效果分析 [J]. 中国医药科学,2011,1(16): 187. [15] Li XJ,Guo XL,Sun YM,et al.yati Yasui Yazhoubingxue Zazhi. 2011;21(11): 李新军, 郭晓丽, 孙应明, 等. 茶多酚.MTAD 和次氯酸钠液抑制粪肠球菌及其生物膜的作用比较 [J]. 牙体牙髓牙周病学杂志,2011, 21(11): [16] Lin NY,Jin JQ.Zhongguo Linchuang Baojian Zazhi. 2011; 14(3): 林南雁, 金建秋. 次氯酸钠根管冲洗的临床疗效观察 [J]. 中国临床保健杂志,2011,14(3): [17] Kaur P,Vadehra DV.Effect of certain chelating agents on the antibacterial action of silver nitrate.j Hyg Epidemiol Microbiol Immunol.1988;32(3): [18] Kong H,Jangq J.Antibacterial properties of novel poly(methyl methacrylate) nanofiber containing silver nanoparticles.lanqmuir.2008;24(5): [19] Wei H,Qu F,Xu HY,et al.shipin Kexue. 2010;31(17): 魏华, 曲锋, 许恒毅, 等. 纳米银杀菌机理的研究进展 [J]. 食品科学, 2010,31(17): [20] Dai XY,Xu X,Chen ZB,et al.zhongguo Xiaoduxue Zazhi. 2008; 25(3): 代小英, 许欣, 陈昭斌, 等. 纳米银水溶液对噬菌体和细菌杀灭效果的观察 [J]. 中国消毒学杂志,2008,25(3): [21] Pal S,Tak YK,Song JM.Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli.appl Environ Microbiol.2007;73(6): [22] Lok CN,Ho CM,Chen R,et al.proteomic analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles.j Proteome Res. 2006;5(4): [23] Chen JH,Li L,Wang P,et al.linchuang Yixue Gongcheng.2011; 18(11): 陈建洪, 李玲, 王萍, 等. 两种药物对饥饿期粪肠球菌生物膜药敏作用的实验性研究 [J]. 临床医学工程,2011,18(11): [24] Zhuang PL,Gao Y,Ling JQ,et al.yati Yasui Yazhoubingxue Zazhi. 2011;21(12): 庄沛林, 高燕, 凌均棨, 等. 三种无机纳米抗菌剂对粪肠球菌的抗菌作用 [J]. 牙体牙髓牙周病学杂志,2011,21(12): [25] Schäfer E,Bössmann K.Antimicrobial Efficacy of Chlorhexidine and Two Calcium Hydroxide Formulations Against Enterococcus faecalis. 2005;31(1): [26] Fine DH,Furgang D,Markowitz K,et al.the antimicrobial effect of a triclosan/copolymer dentifrice on oral microorganisms in vivo.j Am Dent Assoc.2006;137(10): 来自本文课题的更多信息 -- 基金资助 : 广东省自然基金委员会项目 ( ) 作者贡献 : 陈建洪进行实验设计, 实验实施为彭萌文韵笙, 实验评估为唐倩, 资料收集为王萍, 彭萌成文, 王萍审校, 陈建洪对文章负责利益冲突 : 课题未涉及任何厂家及相关雇主活其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助伦理要求 : 实验涉及采集正畸减数离体牙, 供者对实验的工作知情理解文章概要 : 文章要点 : 含醋酸氯已定或三氯生纳米银根管冲洗剂及次氯酸钠均具有一定的抗菌性能含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂与次氯酸钠抗菌性能相近含醋酸氯已定纳米银根管冲洗剂较含三氯生纳米银根管冲洗剂具有更强的抗菌效果关键信息 : 实验建立了饥饿期粪肠球菌离体根管感染模型, 并对两种新型的纳米根管冲洗剂的抗菌性能进行了检测研究的创新之处与不足 : 将饥饿期的粪肠球菌导入离体牙根管, 建立了感染模型, 模拟了牙髓治疗后疾病的致病机制, 对临床具有一定的指导意义纳米银根管冲洗剂作为新型的牙髓治疗药物具有良好的抗菌性, 可能成为未来牙髓治疗的重要材料两种纳米银根管冲洗剂的生物相容性尚不明确, 仍需进一步的深入研究三氯生的溶解度限制了其抗菌性, 后续将研究其溶解性作者声明 : 文章为原创作品, 数据准确, 内容不涉及泄密, 无一稿两投, 无抄袭, 无内容剽窃, 无作者署名争议, 无与他人课题以及专利技术的争执, 内容真实, 文责自负 9540 P.O. Box 1200, Shenyang

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖