013,33(6) 王永等 : 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 13 型 MALDI TOF MS(ABI 公司 ) 1. 方法 1..1 菌种培养及诱导表达从划线平板上挑取含 pet b lysostaphin 表达质粒的重组 E.coliBL 1 (DE3) 单菌落, 接种于 LB 培养基

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媚坍锺
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,013,33(6):1 17 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究王 1 永刘沐荣 1 万海同刘翔张加慧封小燕张 1 钒 (1 浙江中医药大学生物工程学院杭州杭州北斗生物技术有限公司杭州 ) 摘要目的 : 探讨聚乙二醇 (PEG) 修饰重组溶葡球菌酶 (lysostaphin) 的反应条件以及修饰后产物的纯化方法方法 : 采用超声波细胞粉碎机进行菌体破碎, 阳离子交换层析疏水层析进行蛋白纯化 ; 在不同条件下, 将活化的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯 (mpeg SPA) 与纯化后的 lysostaphin 反应, 以单个 PEG Lysostaphin 的比例为指标, 用 SDS PAGE MALDI TOF MS 方法确定其在修饰产物中的所占比例 ; 采用 SephacrylS 00 分子筛凝胶层析法对修饰产物进行分离纯化结果 :mpeg SPA 修饰 lysostaphin 的反应条件为 ph8.0, 温度 4,lysostaphin 与 mpeg SPA 的质量比为 1 5, 反应时间.0h; 反应产物经一步 SephacrylS 00 分子筛凝胶层析纯化后, 初步实现分离结论 : 初步确定了聚乙二醇修饰 lysostaphin 的反应条件及修饰产物的纯化方法关键词聚乙二醇重组溶葡球菌酶纯化单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯中图分类号 Q819 [1] 溶葡球菌酶 (lysostaphin) 由 Schindler 等于 1964 年首次从一株编号为 NRRLB 68 的模仿葡萄球菌 (Staphylococussimulans) 培养物中发现并分离此酶为 46 个氨基酸组成的单链分子, 分子量 7kDa, 等电点 PI 介于 10.4~11.4 之间, 其中锌为必须的辅助因子 [ 4] 它能特异性水解细菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五肽桥联中第位和第 3 位甘氨酸形成的肽键 [5], 因此具有破壁溶菌的作用由于甘氨酸五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁中, 其中又以金葡菌细胞壁分布最广, 因此 lysostaphin 主要对葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌具有杀菌溶菌作用 [6] 然而 lysostaphin 作为一种体外抗菌药物, 固体状态保存时往往不利于应用, 液体状态存储时稳定性则比较差为了提高溶葡球菌酶的热稳定性, 我们拟通过 PEG 修饰技术对溶葡球菌酶进行多点修饰为此, 本文进行了溶葡球菌酶的制备纯化, 修饰条件筛选, 修饰产物的分离纯化以及热稳定性考察等研究收稿日期 : 修回日期 : 电子信箱 :wangyong @16.com 1 材料与方法 1.1 材料试剂 M SPA (M.W.5000)(Jekem Technology); 胰蛋白胨和酵母粉 (OXOID 公司 );Amp ( 氨苄青霉素 )( 华北制药股份有限公司 );IPTG( 异丙基硫代 β D 半乳糖苷 ) SDS( 北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司 ); 牛血清白蛋白 (BSA,Sigma 公司 ); 其余试剂均为分析纯或生化纯试剂 1.1. 菌株含有 pet b lysostaphin 表达质粒的 BL 1(DE3) 菌株金黄色葡萄球菌大肠杆菌 BL 1 ( 均为本实验室保存 ) 仪器立式自动电热压力蒸汽灭菌器 ( 上海申安医疗器械厂 ); 超声波细胞粉碎机 ( 宁波荣顺科技仪器厂 );BECKMAN 高速冷冻离心机 ( 德国 BECKMAN); AKTA prime (Amersham Biocsciences 公司 );SP SepharoseFastFlow 色谱柱 SephacrylS 00 High Resolution 色谱柱 (GE Healthcare 公司 );Butyl Sepharose4FastFlow 色谱柱 SephadexG 5 色谱柱 (Amersham Biosciences 公司 );PowerPAC300/Mini Proteam 电泳仪 (Bio Rad 公司 );TU1810DPC 紫外可见分光光度计 ( 上海泸粤明科学仪器有限公司 );BiflexⅢ

2 013,33(6) 王永等 : 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 13 型 MALDI TOF MS(ABI 公司 ) 1. 方法 1..1 菌种培养及诱导表达从划线平板上挑取含 pet b lysostaphin 表达质粒的重组 E.coliBL 1 (DE3) 单菌落, 接种于 LB 培养基 (ph7.0, 含氨苄青霉素 100μg/ml) 中,37 振荡 (0r/min) 培养过夜, 以 1% 接种量转接于 5LLB 培养基 (ph7.0, 含氨苄青霉素 100μg/ml) 中, 继续振荡培养约 3h, 待生长至 OD 600 为 0.6~0.8 时, 加入异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG, 终浓度为 1.0mmol/ml),30 振荡 (0r/min) 培养诱导 3h, 将菌液于 4 条件下,7000r/min 离心 15min 收集菌体 1.. 重组溶葡球菌酶的制备及纯化按 1 克菌体加 0ml 破菌缓冲液的比例, 在菌体中加入预冷的破菌缓冲液 (40mmol/LTris Cl,0.mol/LNaCl,0.5mmol/L EDTA,pH7.5), 用磁力搅拌器将菌体混匀, 混匀后的菌体在冰浴下用超声波细胞粉碎机破碎, 破菌液经 10000r/min 离心 40min 收集上清 ; 上清经 0mmol/L Tris Cl 适当稀释后上样于 SP Sepharose 层析柱, 用 0.1 ~0.5mol/LNaCl,pH7.5 0mmol/LTris Cl 缓冲液进行洗脱, 分布收集洗脱液 ;SP 阳离子交换层析所得组分经 0mmol/LTris Cl 缓冲液适当稀释后 [ 含终浓度为 1.0mol/L(NH 4 ) SO 4 ] 继续上样于 ButylSepharose 疏水层析柱, 用 ph7.5 0mmol/LTris Cl 缓冲液进行洗脱, 收集洗脱液 ;ButylSepharose 疏水层析所得组分继续上样于 SephadexG 5 脱盐柱进行脱盐,50mmol/LNaCl ph7.5 40mmol/LPB 缓冲液进行洗脱, 收集洗脱液以上各组分经超滤膜堆适当浓缩后用 SDS PAGE 电泳检测纯度 1..3 聚乙二醇化溶葡球菌酶结合物的合成及纯化 (1)pH 值的筛选取纯化后的 lysostaphin 液体 3 份, 把 ph 值分别调节为 7.5,8.0,8.5, 按照溶葡球菌酶 SPA=1 5(mg mg) 加入 SPA,4 条件下, 磁力搅拌反应 h, 加入 Gly 终止反应 () 投料比的筛选取纯化后的 lysostaphin 液体 4 份, 把 ph 值调节为 8.0, 分别按照质量比溶葡球菌酶 SPA=1 0.5,1 1,1 3,1 5 加入 SPA,4 条件下, 磁力搅拌反应 h, 加入 Gly 终止反应 (3) 修饰产物的纯化将修饰后产物上样于 SephacrylS 00 分子筛凝胶层析柱, 以 40mmol/LPB 进行洗脱, 分别收集洗脱峰 [7] 1..4 酶活性及蛋白含量测定采用比浊法进行酶活性测定, 规定 :ph7.5 条件下 37 孵育 10min 将金葡菌悬液 6ml 从比浊度 (A 60 )0.50 降至 0.15 所需的 [8] 酶量定义为 1U 溶葡球菌酶蛋白含量按照 Lowry 法进行测定,BSA 为标准蛋白 1..5 溶葡球菌酶及 PEG 修饰酶的热稳定性考察在 45 条件下, 分 3 组对溶葡球菌酶修饰前后的热稳定性进行考察具体操作方法如下 : 第一组用 ph7.5 的 40mmol/LPB 将 lysostaphin 稀释成 0.5mg/ml; 第二组用辅料 ( 终浓度为 40mmol/LPB 0mg/ml 甘露醇 0mg/ml 丙氨酸 15% 甘油 ph7.5) 将 lysostaphin 稀释成 0.5mg/ml; 第三组用辅料将 PEG lysostaphin 稀释成 0.5mg/ml 将其放入 45 的恒温箱中, 每隔一定时间取出酶液,37 下测定其酶活力, 最后将测得的各个时段的酶活与各初始酶活相比较, 计算出经过不同时间后的残余酶活, 从而可以比较热稳定性的变化结果.1 重组 lysostaphin 的制备及纯化菌体经超声破碎后,lysostaphin 主要以可溶性蛋白形式存在于破菌上清中, 破菌沉淀中仅含有少许蛋白, 经过一步 SP 阳离子交换层析纯化后,SDS PAGE 电泳显示纯化后蛋白纯度达到 80% ~85% 左右 ( 图 1),SP 纯化后蛋白进一步进行 Butyl HIC 纯化,SDS PAGE 电泳显示,HIC 纯化后蛋白为一单一条带, 纯度可以达到 95% 以上 ( 图 ), 可以用于 PEG 修饰图 1 SP 纯化图像 Fig.1 SPpurification M:Standard marker; 1:BL 1; :Lysostaphin bacteria; 3: Sediment;4:Supernatant;5:SPpurifiedlysostaphin. 聚乙二醇化溶葡球菌酶结合物的合成及纯化 Lysostaphin 与 SPA 按照质量比 1 5 进行反应后,SDS PAGE 电泳图谱分析可知 98% 的

14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6013 图 HIC 纯化图像 Fig. HICpurification M:Standardmarker;1:HICpurifiedlysostaphin lysostaphin 被 SPA 修饰上, 其中 ph8.0 时修饰率较高 ( 图 3) 在 ph8.

3 14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6013 图 HIC 纯化图像 Fig. HICpurification M:Standardmarker;1:HICpurifiedlysostaphin lysostaphin 被 SPA 修饰上, 其中 ph8.0 时修饰率较高 ( 图 3) 在 ph8.0 时, 当 Lysostaphin 与 SPA 按照质量比为 1 1 反应时,Lysostaphin 过量, 仅有一个 Lys 位点偶联上 PEG 分子 ( 图 4 图 5); 随着 SPA 投料比的增加, 修饰率相应增加 ( 图 5), 当 Lysostaphin 与 SPA 按照质量比为 1 3 反应时, 有 3~6 个 Lys 位点偶联上 PEG 分子, 其中以偶联上 4~5 个 PEG 产物居多 ( 图 6); 当 Lysostaphin 与 SPA 按照质量比为 1 5 反应时, 修饰率最高, 有 5~8 个 Lys 位点偶联上 PEG 分子 ( 图 7); SPA 修饰后混合物经 SephacrylS 00 分子筛凝胶层析纯化后, 先后出现个洗脱峰, 峰 1 为 PEG lysostaphin, 峰为 SPA( 图 8), 在图谱上未出现 lysostaphin 洗脱峰, 这说明当 Lysostaphin 与 SPA 按照质量比为 1 5 反应时,lysostaphin 大部分参与了反应,SephacrylS 00 分子筛凝胶层析基本上实现了反应后产物的分离, 分离效果较好.3 酶活性及蛋白含量测定修饰前 lysostaphin 的浓度为 1.4mg/ml, 修饰后蛋白经超滤膜堆适当浓缩后浓度为 0.58mg/ml 修饰前 lysostaphin 的比活力为 457U/mg, 经 SPA 修饰后, 随着修饰率的增加,PEG lysostaphin 的体外活性相应减少, 其中 lysostaphin 与 SPA 按照质量比 1 5 修饰时修饰度最高但活性只保持了 5% 左右.4 热稳定性考察从实验数据可以看出 :lysostaphin 的热稳定性相对较差, 在 45 条件下放置 10h, 活性几乎降低了一半 ; 加过辅料的 lysostaphin 热稳定性有所提高, 这可能与甘图 3 不同 ph 值对 PEG 修饰 lysostaphin 的影响 Fig.3 Non reducedsds PAGEprofilesfor lysostaphinmodifiedbypeg atdiferentph M:Standardmarker;1:Lysostaphin; :ph7.5;3:ph8.0;4:ph8.5 图 4 不同投料比对 PEG 修饰 lysostaphin 的影响 Fig.4 Non reducedsds PAGEprofilesfor lysostaphinmodifiedbypeg atdiferentmasratios M:Standardmarker;1:Lysostaphin;:1 0.5;3:1 1; 4:1 3;5:1 5 油甘露醇等保护剂的使用有关 ; 而 PEG lysostaphin 的热稳定性最好,45 条件下放置 60h 多, 仍保持了 0% 多的活性由此可以得出 lysostaphin 经 PEG 修饰后可以显著提高热稳定性 ( 图 9) 3 讨论目前随着耐甲氧西林金葡菌 (MRSA) 等耐药葡萄球菌在医院和社区的流行,lysostaphin 作为一种专一抑杀金葡菌药物而日益受到人们的青睐然而由于 lysostaphin 在液体状态下稳定性较差, 极不易于 lysostaphin 的长期使用 PEG 修饰技术是目前延长蛋白质药物半衰期提高稳定性的方法之一, 而它的利用恰恰能解决这一难题目前关于 lysostaphin 聚乙二醇 [9] 修饰的研究较少, 仅有 Walsh 等采用分枝状 PEG 对

013,33(6) 王永等 : 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 15 图 5 PEG Lysostaphin(1 1) 的 MALDI TOF MS 图谱 Fig.5 PEG Lysostaphin smaldi TOF MSdiagram 图 7 PEG Lysostaphin(1 5) 的 MALDI TOF MS 图谱 Fig.

4 013,33(6) 王永等 : 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 15 图 5 PEG Lysostaphin(1 1) 的 MALDI TOF MS 图谱 Fig.5 PEG Lysostaphin smaldi TOF MSdiagram 图 7 PEG Lysostaphin(1 5) 的 MALDI TOF MS 图谱 Fig.7 PEG Lysostaphin smaldi TOF MSdiagram 图 6 PEG Lysostaphin(1 3) 的 MALDI TOF MS 图谱 Fig.6 PEG Lysostaphin smaldi TOF MSdiagram 图 8PEG Lysostaphin 的分离纯化 Fig.8PurificationofPEG Lysostaphin 1:PEG Lysostaphin;:PEG lysostaphin 进行多点修饰, 修饰后产物半衰期可以达到 4h, 但是酶活降低为原来的 1%, 此外分枝状 PEG 价 [10] 格昂贵, 不适合产业化生产 ; 吴宏等对 lysostaphin 进行突变加上巯基后利用 mpeg MAL 对巯基进行定点修饰, 但是经 mpeg MAL 修饰后蛋白, 酶活均有很大降低, 其中酶活最高的 PEG LysT146C 仅为原酶活的 0% 针对前人在 lysostaphin 聚乙二醇化中存在的问题, 有必要继续通过其它的 PEG 修饰方法对 lysostaphin 进行修饰本研究成功构建了 pet b lysostaphin 表达质粒载体, 并实现了蛋白的可溶性表达经多次重复实验发现在 SP 阳离子交换层析以及疏水层析纯化中,Tris 图 9 45 条件下溶葡球菌酶及其修饰酶的活性 Fig.9 TheenzymeactivityoflysostaphinandPEG lysostaphinundertheconditionof45 缓冲体系较 PB 缓冲体系在活性保持率纯化效率方面都有所提高, 因此我们选择 Tris 缓冲体系作为 lysostaphin 的纯化体系, 但是由于 Tris 中的氨基能够与 PEG 发生反应, 为了排除这一干扰, 在重组 lysostaphin

5 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.6013 脱盐一步, 我们将 Tris 缓冲体系更换为 40mmol/LPB 缓冲体系, 从而确立了高效简单的 PEG 修饰 lysostaphin 的方法以及纯化工艺实验中发现经过 PEG 修饰后的 lysostaphin 稳定性显著高于未修饰的 lysostaphin, 但是随着修饰率的增加,lysostaphin 的酶活逐渐降低, 当有 5~8 个 Lys 位点偶联上 PEG 分子时, 活性保持 5% 的水平, 国内目前未见相关报道而导致活性降低的原因可能为大分子物质的化学结合影响了 lysostaphin 的空间结构, 并且与 lysostaphin 化学结合的 PEG 的线性长链在 lysostaphin 分子周围包裹缠绕, 形成了一道分子屏障, 阻碍其活性部位与受体的结合, 从而影响了抗菌活性的发挥 PEG lysostaphin 药物的开发旨在提高 lysostaphin 的稳定性, 降低免疫原性, 从而为此酶的全身用药奠定了物质基础然而, 当前的一个重要限制因素可能是溶葡球菌酶的空间结构尚不明确, 虽然与溶葡球菌酶类似的 LytM 蛋白晶体结构和三级结构域已较为清楚 [11], 可为溶葡球菌酶的改造提供一定参考, 但只有进一步明确溶葡球菌酶自身的活性部位底物结合域以及相互间的关系, 才能更好地进行重组 lysostaphin 的 PEG 修饰为了提高 PEG lysostaphin 的活性, 在后期的实验中我们将利用计算机模拟技术进行 lysostaphin 活性位点 PEG lysostaphin 修饰位点的结构确认以及 PEG 单点修饰 lysostaphin 的研究参考文献 [1]SchindlerCA,SchuhardtVT.Lysostaphin:Anewbacteriolytic agentforthestaphylococcus.procnatlacadsciusa,1964,51 (3): []BrowderH P,ZygmuntW A,YoungJR,etal.Lysostaphin: enzymaticmodeofaction.biochembiophysrescommun,1965, 19: [3] Hrlary R Trayer, Buckley C E. Molecularproperties of lysostaphin, a bacteriolytic agentspecific forstaphylococus aureus.thejournalofbiologicalchemistry.1970,45(18), [4]MariadoCarmodeFreireBastos,BrunaGoncalvesCoutinho, MarcusLívio Varela Coelho. Lysostaphin: A Staphylococal bacteriolysinwithpotentialclinicalapplications.pharmaceuticals, 010,3: [5]MichaelW Climo,KerstinEhlert,GordonLArcher.Mechanism andsuppresion oflysostaphin resistancein oxacilin resistant Staphylococusaureus.AntimicrobAgentsChemother,001,45 (5): [6]PaulaRecsei,AlexandradGrus,RichardPNovick.Cloning, sequence, and expresion of the lysostaphin gene from Staphylococussimulans.ProcNatlAcadSciUSA,Biochemistry, 1987,84(5): [7] 杨信怡, 游雪甫, 蒋建东. 溶葡球菌酶的研究进展. 中国生化药物杂志,005,6(6): YangXY,YouXF,JiangJD.Advancesinlysostaphinresearch. ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics,005,6(6): [8] Richard R Burges, MurayP Deutscher. GuidetoProtein Purification. nd ed.beijing:sciencepres,011,5: [9]Walsh Scot, Anjali Shah, James Mond. Improved pharmacokineticsandreducedantibodyreactivityoflysostaphin conjugated to polyethylene glycol. AntimicrobialAgentsand Chemotherapy,003,: [10] 吴宏, 房伟, 袁瞡等. 溶葡球菌酶的定点突变与 PEG 巯基定点修饰. 生物工程学报,011,7(11): WuH,FangW,YuanJ,etal.Site directedmutagenesisand sulfhydrylpegylationoflysostaphin.chinjbiotech,011,7 (11): [11]OdintsovSG,SabalaI,MarcyJaniakM,etal.LatentLytM at 1.3Aresolution.JMolBiol,004,16,335(3):

6 013,33(6) 王永等 : 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 17 ChemicalModificationofLysostaphinwithActivatedPolyethleneGlycol WANGYong 1 LIUMu rong WANHai tong 1 LIUXiang ZHANGJia hui FENGXiao yan ZHANGFan 1 (1BiologicalEngineeringInstituteofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou ,China) (BIODOORBiotechnologyCo.,LtdofHangzhouCityinZhejiangProvince,Hangzhou ,China) Abstract Objective:Tostudythereactionconditionsforthechemicalmodificationofrecombinant lysostaphin(lysostaphin)withactivatedpolyethleneglycol(peg)andthemethodsforthepurificationofpeg Lysostaphin.Methods:Disruptthecelwalofbacteriabyultrasonicceldisruptorandpurifythelysostaphinby Cationexchangechromatography(SP) andhydrophobicchromatography(hic);lysostaphinwaschemical modifiedwithactivatedmono methoxypolyethleneglycolsuccinimidepropionate(mpeg SPA)undervarious conditions,therationofmono mpeg LysostaphinwasdeterminedbySDS PAGEandEMALDI TOF MS;The reactionmixturewaspurifiedbysephacryls 00molecularsizeexclusionchromatography.Results:Theoptimal reactionwasph8.0,temperature4,1 5forthemasratiooflysostaphinandmPEG,twohoursforreaction timewasselected.thereactionmixturewaspreliminarilyseparatedbyonestepsephacryls 00molecularsize exclusionchromatography.conclusion:it spreliminarilydeterminedthattheoptimalreactionconditionsforthe chemicalmodificationoflysostaphinwithactivatedpolyethleneglycolandthemethodsforthepurificationofpeg Lysostaphin. Keywords Polyethleneglycol(PEG) Recombinantlysostaphin Purification mpeg SPA

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌