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淞朋支
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1 丹参酚酸 B 盐对肝硬化大鼠门静脉高压及肝组织中内皮素 -1 的影响 1 周扬, 顾杰, 徐列明 ( 上海中医药大学肝病研究所, 上海中医药大学附属曙光医院, 上海 ) 摘要 : 目的 : 研究丹参酚酸 B(SA-B) 盐对肝硬化门静脉高压的疗效方法 : 以 0.5% 的二甲基亚硝胺 (DMN) 腹腔注射建立大鼠肝硬化的动物模型, 模型成功后开始给予 SA-B 治疗, 测定各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶 (ALT), 天门冬氨酸氨基转移酶 (AST), 白蛋白 (Alb), 总胆红素 (TBiL) 以及肝组织中羟脯氨酸 (Hyp) 和内皮素 -1(ET-1) 的含量, 肠系膜上静脉插管测定门静脉压力, 观察肝组织病理形态的变化, 并与模型组比较结果 : 治疗组门静脉压力明显降低, 血清 ALT,AST,TBiL 水平及肝组织 Hyp 和 ET-1 含量与模型组比较也都显著下降, 病理学显示治疗组基本恢复正常结论 : 肝硬化时肝组织中 ET-1 含量显著升高 ;SA-B 能显著降低肝硬化时升高的门静脉压力和肝组织中 ET-1 的含量关键词 : 肝硬化 ; 门静脉高压 ; 内皮素 ; 中药 Effects of Salvianolic-acid B on Elevated Portal Pressure and Hepatic Endothelin-1 Level in a Rat Model of Hepatocirrhosis ZHOU Yang,GU Jie,XU Lie-ming. (Institute of Liver Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai , China) ABSTRACT Objective: To investigate the effects of Salvianolic-acid B on portal hypertension due to liver cirrhosis. Methods: After establishing a rat model of hepatocirrhosis successfully via intraperitoneal injection of 0.5% DMN, Chinese herb extraction Salvianolic-B was administrated intragastrically. Three weeks later, serum levels of alanine aminotransferase(alt), aspartate aminotransferase(ast),alb and total bilirubin(tbil),as well as hepatic levels of Hyp and endothelin-1(et-1) were measured. For portal pressure measurement, a catheter was inserted into the superior mesenteric vein and gentlely advanced up to the portal vein. The pathological alterations of liver tissue were observed and compared between control group and treated group. Results: Portal pressure of treated group declined remarkably, and there was also a significant difference between treated group and model group as to the serum levels of ALT, AST, TBiL and hepatic levels of Hyp and ET-1. Conclusion: Hepatic level of ET-1 increases considerably during the process of liver cirrhosis and is highly related to the elevation of portal pressure; Salvianolic-acid B has a significant portal-hypotensive effect against ET-1. KEY WORDS : liver cirrhosis; Portal Hypertension; Endothelin; Chinese Herbs. 1 [ 作者简介 ] 周扬 (1978-), 男, 硕士 Correspondence to: XU Lie-ming,MD,Professor. xulieming@163.com 转载

2 肝硬化门静脉高压是临床上常见的综合病症, 过高的门静脉压力常常会导致腹水脾肿大侧枝循环形成开放等症状的发生, 更甚者出现骤然食道胃底静脉破裂出血而危及病人的生命, 因此, 防治肝硬化门静脉高压, 预防食道胃底静脉破裂出血的研究具有重要的现实意义我们前期的研究显示, 活血中药丹参中的重要水溶性成分丹参酚酸 B 盐 (Salvianolic-acid B,SA-B) 具有抑制肝星状细胞收缩的作用 [1], 在体内能够对抗内皮素 -1(endothelin-1,ET-1) 引起的门静脉压力升高 ( 文章另发 ), 本研究拟在此基础上进一步探讨 SA-B 对肝硬化大鼠门静脉高压的作用 1 材料与方法 1.1 动物健康雄性 SD 大鼠 45 只, 清洁级, 体重 (150±10)g, 上海中医药大学实验动物中心提供, 分笼饲养, 普通饲料自由进食和饮水 1.2 药物 SA-B 由本研究所和中科院上海药物研究所朱大元教授共同研制, 纯度 80%, 制成浓度为 1.25mg/ml 的灌胃液 1.3 主要试剂和仪器二甲基亚硝胺 (dimethylnitrosamine,dmn), 东京化成工业株式会社产品 ; 丙氨酸氨基转氨酶 (alanine aminotransferase,alt), 天门冬氨酸氨基转氨酶 (aspartate aminotransferase,ast), 总胆红素 (Total bilirubin, TBiL), 白蛋白 (albumin,alb) 试剂盒购自南京建成生物公司 ;ET-1 放免试剂盒, 中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所 ;PowerLab 生理数据处理和分析系统, 澳大利亚 ADI 公司产品 ; 膜状内翳剪, 苏州医疗器械总厂 1.4 大鼠 DMN 肝硬化模型的建立及给药方法大鼠随机分为造模组 (31 只 ) 和正常组 (14 只 ), 造模组按 2ml/kg 的剂量腹腔注射 0.5% 的 DMN, 首次注射剂量为全剂量的 2/3, 连续注射 3d 后停药 4d, 共 4w, 第 4w 最后两次分别按全量的 2/3, 1/2 注射 ; 正常组腹腔注射等量的生理盐水造模结束后, 随机取 2 只大鼠处死观察肝脏的病变情况, 经病理学检查证实肝脏有硬化改变后, 造模组随机分为治疗组和模型组治疗组每天按 0.1ml/kg 的剂量给予 SA-B 溶液灌胃, 共 3w; 正常组和模型组每天按 0.1ml/kg 的量灌胃饮用水 1.5 大鼠门静脉压力的测定及标本留取以 2% 戊巴比妥钠按 2ml/kg 剂量麻醉大鼠将麻醉好的大鼠置于保温玻璃板上, 玻璃板温度维持在 37 左右, 固定好四肢, 沿大鼠腹壁正中线剪开长约 2cm 的一字形小口, 打开腹腔, 暴露门静脉主干, 分离出肠系膜上静脉, 结扎远离门静脉的一端, 然后用膜状内翳剪于静脉血管上剪开一 V 形小缺口, 插入 PE-10 管至门静脉正中, 固定后接通压力换能器测定门静脉压力并记录之门静脉压力测定完之后, 腹腔静脉取血, 3000rpm/min,15min 离心取上清作生化测定, 留取肝组织做病理检测和肝组织 ET-1 羟脯氨酸 (Hydroxyproline,Hyp) 测定 1.6 肝功能的检测取适量血清按试剂盒说明书提供的步骤分别测定 ALT AST TBiL Alb 1.7 肝组织 Hyp 含量测定采用 Jamall 氏法测定 [2] 1.8 肝组织 ET-1 含量测定采用放免法测定, 取肝组织, 吸去血迹, 称重 400mg, 放入生理盐水 1ml 研磨制成匀浆,4 3000rpm 离心 15min, 取上清液按照试剂盒说明书严格操作 1.9 病理学检测肝组织经 4% 甲醛液固定之后, 石蜡包埋切片, 作常规 HE 染色和天狼星红染色, 观察肝组织炎症和纤维化程度

3 1.10 统计学处理数据采用均数 ± 标准差 X±S 表示, 用 SPSS11.0 统计学软件中的 ANOVA 程序进行单因素方差分析, 并用 LSD 程序进行两两比较 2 结果 2.1 造模情况介绍至第 7w 末, 正常组大鼠无死亡, 亦无腹水等情况发生 ; 模型组大鼠死亡 4 只, 有 6 只出现腹水 ; 治疗组死亡 2 只, 无腹水发生 2.2 血清中 ALT,AST,TBiL Alb 含量的变化与正常组比较, 模型组大鼠血清中 ALT,AST,TBiL 水平显著升高,Alb 含量下降 ; 治疗组与模型组比较, 血清中 ALT,AST,TBiL 水平明显降低,Alb 含量升高, 见表 1 表 1. 三组大鼠血清 ALT,AST,TBiL Alb 含量的变化组别 n ALT 活性 (u/ml) AST 活性 (u/ml) TBiL 活性 (mg/dl) Alb 含量 (g/l) 正常组 ± ± ± ±2.41 模型组 ±25.94## ±24.97## 0.75±0.13## 28.74±2.91# 治疗组 ±9.35 ** 75.19±14.40 ** 0.45±0.08** 31.94±1.87** 与正常组比较,#P<0.05, ##P<0.01; 与模型组比较,**P< 肝组织 Hyp 含量的变化与正常组比较, 模型组大鼠肝组织中 Hyp 含量显著升高, 而同期的治疗组与模型组比较,Hyp 含量明显降低, 见表 2 表 2. 三组大鼠肝组织 Hyp 含量的变化组别 n Hyp(ug/g 湿肝重 ) 正常组 ±58.51 模型组 ±115.65## 治疗组 ±115.89** 与正常组比较,##P<0. 01; 与模型组比较,**P< 肝组织病理学变化光镜下 HE 染色显示正常组肝小叶结构清晰, 肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列, 可见少许窦旁细胞, 汇管区可见极少量纤维结缔组织造模结束 3w 时模型组大鼠肝脏可见有大量淋巴细胞单核细胞等炎性细胞浸润, 肝窦狭窄 ; 汇管区明显增宽, 广泛增生的纤维组织将肝小叶分割包绕成大小不等的假小叶治疗组肝细胞变性坏死出血纤维增生都有不同程度的改善天狼星红染色显示胶原纤维在正常组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维模型组大鼠肝脏胶原增生明显, 大量较厚的纤维间隔, 向肝小叶内伸展, 分割包绕肝组织, 形成假小叶 ; 治疗组大鼠纤维组织增生程度减轻, 纤维间隔变窄, 着色浅, 假小叶较少 2.5 各组大鼠门静脉压力及肝组织 ET-1 含量的变化情况造模结束后第 3w, 模型组和治疗组大鼠门静脉压力明显高于正常组, 肝组织中 ET-1 含量也较正常组显著升高而治疗组在给予 SA-B 治疗之后, 与同期模型组相比门静脉压力和肝组织中 ET-1 含量均显著下降, 见表 3 表 3. 三组大鼠门静脉压力和肝组织 ET-1 含量的变化组别 n 门静脉压力 (mmhg) ET-1(pg/ml)

4 正常组 ± ±49.51 模型组 ±2.3## ±53.14## 治疗组 ±1.0 ** ±43.60** 与正常组比较,##P<0.001; 与模型组比较,**P< 肝组织 ET-1 含量和门静脉压力之间的相关性肝硬化前后大鼠肝组织中 ET-1 含量和门静脉压力之间呈显著正相关,r=0.66,P<0.01 在运用 SA-B 治疗后, 模型组和治疗组大鼠肝组织 ET-1 和门静脉压力之间仍然呈显著正相关, r=0.43,p< 讨论本研究采用 DMN 腹腔注射的方法制作大鼠肝硬化模型, 此前一项肝硬化大鼠门静脉高压的动态研究显示 [3], 运用 DMN 等肝损伤物质造模之后, 大鼠的门静脉压力会出现明显的升高, 但在去掉这些化学损伤因素之后, 不管是病变的肝组织, 还是升高的门静脉压力, 都有一个自然的恢复过程, 到造模结束后第 4w 时, 模型组大鼠的门静脉压力虽然仍高于正常组, 但是已无显著性差异本研究的重点在于探讨 SA-B 降低门静脉高压的作用, 考虑到模型本身的特点和药物发挥作用需要一定的时间这两个方面, 我们最终将治疗时间设定为 3w 结果显示, 在 DMN 造模结束后 3w, 与正常组相比, 模型组大鼠体重仍明显减轻, 因肝脏缩小因而肝体比下降 ; 而由于脾脏肿大因此脾体比增加 ;ALT AST 和 TBiL 升高反映了肝脏炎症较重 ;Alb 下降表明肝功能障碍 ; 光镜下肝脏炎症程度和纤维化程度都很重 ;Hyp 含量明显增加 ; 门静脉压力明显升高, 同时腹水形成率高, 已经形成典型的伴门静脉高压的肝硬化大鼠 DMN 模型常规需要 4w 的抗肝纤维化治疗才能达到理想的疗效本文实验在治疗 3w 之后, 观察到 SA-B 已显示出比较好的疗效 : 该组大鼠血清 ALT AST 的活性和 TBiL 的含量均较模型组降低, 尤其以 AST 最为明显 ;Alb 含量上升, 说明肝脏的炎症减轻, 合成代谢功能有所恢复肝组织胶原纤维染色和 Hyp 含量测定的结果提示 SA-B 抗肝纤维化作用显著 ; 门静脉压力的测定结果也显示, SA-B 组大鼠的门静脉压力显著下降, 比模型组的门静脉压力下降 1/4 左右该组大鼠肝体比恢复正常脾体比与对照组相比下降, 且无 1 例出现腹水, 说明 SA-B 在抗肝纤维化的同时也具有很好的降低门静脉压力的作用 DMN 肝硬化模型大鼠肝组织中 ET-1 的含量与正常组比较明显升高, 同时门静脉压力也有显著的上升, 而给予 SA-B 治疗之后, 大鼠门静脉压力降低, 肝组织中 ET-1 的含量也相应下降, 门静脉压力变化和肝组织 ET-1 含量的变化的一致性, 提示两者关系密切已知 ET-1 可由活化的 HSC 合成和分泌 [4], 我们已证实 SA-B 能抑制 HSC 的活化 [5], 抑制其合成 ECM 的功能和细胞收缩的功能, 因此 SA-B 组的 ET-1 含量较低, 推测与 SA-B 抑制 HSC 的功能有关, 而该组门静脉压力较低, 可能与 SA-B 抑制 ET-1 的合成与抑制 HSC 的收缩均有关迄今为止, 有关活血化瘀中药抗肝纤维化, 降低门静脉高压的研究很多, 众多观点中比较一致的看法是这些活血化瘀中药能抗氧化防止过氧化脂质的形成, 保护肝细胞, 加速肝细胞的修复与再生, 促使毛细血管网开放增加, 血流增快, 组织灌注增加, 促进胶原降解, 减少肝内胶原含量等, 通过疏的方法改善肝脏微循环, 增加肝脏的血流量从而降低门静脉压力, 它有别于现代医学通过减慢心率, 降低心输出量从而减少门静脉血流量, 降低门静脉压力这样一种堵的办法

5 总而言之,SA-B 作为一种新型的抗肝纤维化的药物, 在改善肝脏纤维化程度的同时, 也能够很好地降低升高的门静脉压力, 预防出血事件的发生, 是一种富有前景的防治肝硬化门静脉高压的药物本研究在技术上得到了上海中医药大学中药研究所吴大正研究员和科技实验中心陆雄副研究员的悉心指导, 在此表示诚挚的谢意! 参考文献 1. 张杰. 丹参酚酸 B 盐对内皮素诱导的肝星状细胞收缩的抑制作用及机制研究. 上海中医药大学博士学位论文,2004,5. 2. Jam all IS.Asimple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues.analytical biochemistry,1981; 王宪波, 刘平, 陆雄, 等. 二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成中门脉压力的动态变化. 世界华人消化杂志,2002,10(4): Shao R,Shi Z,Gotwals PJ,et al.cell and molecular regulation of endothelin-1 Production during hepatic wound healing.mol Biol Cell,2003(6): 刘成海, 刘平, 胡义扬, 等. 丹酚酸 B 盐对转化生长因子 -β1 刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用. 中华医学杂志,2002,82(18):

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中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (