周佳等 :GC-MS/MS 同位素内标法测定肉制品中 N- 二甲基亚硝胺 47 引言 N- 二甲基亚硝胺是一种很强的化学致癌物质袁有 4 多种动物包括灵长类易于感染 N 原亚硝胺引起癌变 [ 原 ] 袁肉制品中大多会添加护色剂亚硝酸钠袁现未找到合适的替代物袁而亚硝酸盐在制作肉过程中很容易和

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1 6 年 9 月中国测试 CHINA MEASUREMENT & TEST Vol.4 No.9 September,6 doi 院.857/j.issn GC-MS/MS 同位素内标法测定肉制品中 N- 二甲基亚硝胺周佳袁袁孙嘉茵袁李宇茜袁唐维英袁徐小平渊. 四川大学华西药学院袁四川成都 64 曰. 四川省药品食品检验检测院袁四川成都 673 冤摘要院采用同位素内标定量袁建立一种快速尧准确测定各种肉制品 N- 二甲基亚硝胺的 GC-MS/MS 法遥样品中加入 D 6 -N- 二甲基亚硝胺内标袁经水蒸气蒸馏尧二氯甲烷提取尧分离尧浓缩袁用多反应监测模式渊 MRM 冤进样分析遥色谱柱为 HP-Innowax 毛细管柱渊 3 m 伊.3 mm 袁.5 滋 m 冤袁氦气为载气袁氮气为碰撞气袁流量为.4 ml/min 遥结果表明院该方法检测范围在耀 3 ng/ml 内袁线性关系良好 y=77.6x-5.6 渊 r = 冤袁精密度 RSD 为.36% 曰回收率为 8.9% 耀 99.5% 袁检出限. 滋 g/kg 遥对 4 种不同来源的肉制品共 4 批次进行检测袁检出 3 批次袁但均未超过限量渊 3 滋 g/kg 冤遥该方法灵敏尧简便尧准确尧重复性好袁可作为肉制品中 N- 二甲基亚硝胺检测的好方法遥关键词院 N- 二甲基亚硝胺曰同位素内标曰 GC 原 MS/MS 曰多反应监测模式曰优化文献标志码院 A 文章编号院渊 6 冤 Isotope internal standard method analysis of N-nitrosodimethylamine in meat products by GC-MS/MS ZHOU Jia 袁袁 SUN Jiayin 袁 LI Yuqian 袁 TANG Weiying 袁 XU Xiaoping 渊. West China School of Pharmacy 袁 Sichuan University 袁 Chengdu 64 袁 China 曰. The Food and Drug Testing Institute of Sichuan Province 袁 Chengdu 673 袁 China 冤 Abstract: A rapid and accurate method to determinate N -nitrosodimethylamine with Isotope internal standard in meat products by GC -MS/MS was established in this paper. Meat and its products 袁 were assayed by used in the mode of multiple reaction monitoring 渊 MRM 冤 after water add Isotope internal standard D 6 -NDMA 袁 vapor distillation 袁 dichloromethane extraction 袁 separation and concentration. The method was used HP capillary column 渊 3 m 伊.3 mm 袁.5 滋 m 冤 as the analytical column 袁 helium as the carrier gas 袁 nitrogen as the collision gas 袁 and.4 ml/min as the flow rate. Results showed that the method had wide linear range 渊 up to to 3 ng/ml 冤 high line correlation 渊 y=77.6x-5.6 袁 r = 冤冤袁 high RSD 渊 less than.36% 冤. The recovery of the method was 8.9% -99.5% 袁 and the detection limit was. 滋 g/kg. 4 batches of 4 kinds of different sources of meat products for inspection and 3 batches of positive 袁 but all does not exceed limited 渊 3 滋 g/kg 冤. The results were accurate 袁 reliable 袁 good repeatability and high sensitivity. This method can meet the requirement for the determination of N-nitrosodimethylamine residues in meat and meat product. Keywords: N-nitrosodimethylamine 曰 isotope internal standard 曰 GC-MS/MS 曰 MRM 曰 optimization 收稿日期院 6--3 曰收到修改稿日期院作者简介 : 周佳渊 983- 冤袁女袁重庆市人袁主管药师袁硕士研究生袁专业方向为药物质量控制遥通信作者院徐小平渊 96- 冤袁男袁四川成都市人袁副教授袁硕士袁主要从事药物质量控制研究遥

2 周佳等 :GC-MS/MS 同位素内标法测定肉制品中 N- 二甲基亚硝胺 47 引言 N- 二甲基亚硝胺是一种很强的化学致癌物质袁有 4 多种动物包括灵长类易于感染 N 原亚硝胺引起癌变 [ 原 ] 袁肉制品中大多会添加护色剂亚硝酸钠袁现未找到合适的替代物袁而亚硝酸盐在制作肉过程中很容易和次级胺类物质反应产生致癌物质 N 原亚硝胺类物质袁一次摄入过多会损伤肝脏和破坏血小板袁出现严重的急性中毒症状袁长期食用会导致肝硬化袁新鲜的肉一般不含 N 原亚硝胺袁而腌制尧卤制的肉常常含有 N 原亚硝胺 [3-5] 袁又以 N- 二甲基亚硝胺检出率最高 [6] 袁一般会对肝尧肾尧肺产生致癌性作用袁在培根尧腌肉尧香肠等肉制品中经常被检出袁国家对肉制品中 N- 二甲基亚硝胺的限量是 3. 滋 g/kg [7] 袁所以建立高灵敏度袁高准确性袁低检出限的方法很有必要遥前处理方面袁笔者发现由于 N- 二甲基亚硝胺具有半挥发性袁浓缩时很容易损失袁尝试加入同位素内标 D 6 -N- 二甲基亚硝胺袁使定量更加准确曰检测方式方面袁目前有关 N 原亚硝胺的检测方法主要有 GC-MS 选择离子扫描模式渊 SIM 冤测定 [8-] 袁现在国标方法 [] 第一法所提及的气相 - 热能分析仪不普及袁很多实验室不适用袁笔者曾用 SIM 进行检测袁发现基质干扰太大袁常出现样品中加入标液却无法定性的情况袁准确度极差袁本实验在这个基础上进行改进袁采用 GC-MS/ MS 同位素内标法多反应监测模式渊 MRM 冤检测肉制品中 N- 二甲基亚硝胺袁基质干扰小袁能有效地对目标物定性定量袁灵敏度高遥材料和方法. 主要仪器 Aglilent 789A 原 7B 气相色谱原质谱质谱联用仪渊美国安捷伦仪器公司冤曰色谱柱院 HP-Innowax 毛细管柱 3 m 伊.3 mm 袁.5 滋 m [] 渊美国安捷伦仪器公司冤曰电子天平渊 Sartorius 袁 CPA 5D 冤袁旋转蒸发仪渊 Buchi 袁 R-5 冤曰漩涡振荡器渊 IKA 袁 MS3digi 鄄 tal 冤曰超声清洗机渊 Auto science 袁 AS55B 冤曰高速离心机渊 Eppendorf 袁 Centrifuge 58R 冤遥. 试剂二氯甲烷渊色谱级冤尧氯化钠尧硫酸尧超纯水曰 N- 二甲基亚硝胺标液渊 Accustandard 院 Lot 院 47 曰浓度院.8 滋 g/ml 冤曰 D 6 -N - 二甲基亚硝胺渊 CDN ISOTOPE Lot 院 X33P9 袁纯度院 99.5% 冤袁硫酸溶液院 9mL 超纯水袁缓慢加入 3 ml 浓硫酸袁混匀袁放至室温袁即得遥.3 标准溶液及内标溶液的配制 N- 二甲基亚硝胺标准工作液院精密量取 N- 二甲基亚硝胺标液. ml 袁置于 ml 棕色量瓶中袁用二氯甲烷定容至刻度袁摇匀袁即得渊质量浓度为.8 滋 g/ml 冤遥 D 6 -N- 二甲基亚硝胺标准工作液院精密称取 D 6 -N- 二甲基亚硝胺标准品.4 mg 袁置于 5 ml 棕色量瓶中袁用甲醇定容至刻度袁得 D 6 -N- 二甲基亚硝胺储备液渊质量浓度约为. mg/ml 袁 4 益以下保存袁 3 个月内使用冤曰精密量取上述储备液滋 L 袁置 ml 量瓶中袁二氯甲烷稀释并定容至刻度袁摇匀袁得内标使用液渊滋 g/ml 袁 4 益以下保存袁周内使用冤遥.4 色谱条件.4. GC 条件进样口温度院 5 益曰进样量院滋 L 袁进样方式院不分流曰载气院高纯氦气袁流量院.4 ml 辕 min 曰升温程序院 5 益保持 4 min 袁以益 /min 升至 6 益袁 7 益后运行 3 min 遥.4. MS/MS 条件电离方式为电子轰击电离渊 EI 冤袁电离能量为 7eV 曰离子源温度院 3 益曰接口温度院 8 益曰四级杆温度院 5 益曰碰撞气院氮气曰溶剂延迟时间院 5 min 曰扫描模式院 MRM 渊多反应监测冤袁定量离子渊质荷比冤 74 跃 44 袁定性离子 74 跃 4 曰内标定量离子 8 跃 5 曰碰撞能量院 74 跃 44 为 5 V 袁 74 跃 4 为 V 曰 8 跃 5 为 V 遥冤用 Scan 模式确认 N- 二甲基亚硝胺的保留时间及质谱图相关信息渊见图尧图冤袁图中可以确认 N- 二甲基亚硝胺的保留时间为 8 min 遥图 4 3 图 N- 二甲基亚硝胺在 scan 模式下的 TIC 图 N- 二甲基亚硝胺在 scan 模式下的质谱图冤离子筛选及 MRM 模式电压的选择在 Product ion 模式下固定 74 的母离子袁分别用 5 袁袁袁 3 V 电压进行碰撞袁由于 N- 二甲基

3 48 中国测试 6 年 9 月亚硝胺的分子量较小 74 袁可以选择的碎片离子不多袁有 44 尧 43 尧 4 尧 3 袁考虑到 3 分子量太小袁容易受干扰袁没有再优化袁如图 3 所示遥在 MRM 模式下分别选用电压 5 袁袁袁 3 V 对 74 跃 44 尧 74 跃 4 尧 74 跃 43 进行筛选袁发现 74 跃 43 响应比较低袁并且旁边易出现干扰峰渊如图 4 所示冤袁最终选定 74 跃 44 和 74 跃 4 袁同时也选择了 74 跃 44 为 5 V 袁 74 跃 4 为 V 袁 74 跃 44 响应较 74 跃 4 高袁 74 跃 44 为定量离子袁响应好尧干扰小遥图 3 Product ion 模式选择子离子全部溶解袁转移至分液漏斗中袁振摇提取袁静置分层袁分取二氯甲烷层袁 4 益以下旋转至近干袁用二氯甲烷转移并定容至 ml 遥.6 方法评价.6. 标准曲线的绘制分别量取浓度约为滋 g/ml 的 N- 二甲基亚硝胺标准工作液渊袁 3 袁 5 袁袁 5 袁袁 3 滋 L 冤及内标使用液各滋 L 袁加二氯甲烷配制成浓度分别为.8 袁 3.4 袁 5.4 袁.8 袁 5. 袁.6 袁 3.4 ng/ml 的标准工作液遥将制备好的 N- 二甲基亚硝胺标准测定液分别注入 GC-MS 辕 MS 袁记录色谱图袁以峰面积为纵坐标袁以 N- 二甲基亚硝胺得浓度渊 ng/ml 冤为横坐标绘制标准曲线为 y 越 77.6x-5.6 渊 r = 冤袁结果表明 N- 二甲基亚硝胺浓度在耀 3 ng/ml 范围内线性良好袁如图 5 所示遥 5 y=77.63x-5.6 r = 浓度 / 渊 ng 窑 ml - 冤图 5 N- 二甲基亚硝胺标准曲线图谱方法精密度试验用该方法对同一样品进行反复测定渊 n 越 6 冤袁考察含量的精密度袁 RSD 为.36% 袁结果符合精密度要求袁如表所示遥表 N- 二甲基亚硝胺精密度测试结果图 4 MRM 模式下 74 跃 43 干扰峰图.5 样品的预处理取样品约 5 g 袁精密称定袁加入内标使用液滋 L 袁使与样品混匀袁置于水蒸气蒸馏装置中袁加入 5 ml 水袁摇匀袁在蒸馏瓶中加入 6 g 氯化钠袁充分摇动使氯化钠溶解袁将蒸馏瓶与水蒸气发生器及冷凝管连接好袁在锥形瓶中加入 3 ml 二氯甲烷及少量冰块袁收集约 ml 的馏出液袁在锥形接收瓶中加入 4 g 氯化钠和 3 ml 硫酸溶液袁搅拌袁使氯化钠测定值 / 渊滋 g 窑 kg - 冤平均 RSD/% 渊滋 g 窑 kg - 冤准确度考察称取空白样品 6 份袁进行 3 个浓度的加标回收试验袁分别加入 N- 二甲基亚硝胺标准工作液渊.8 滋 g/ml 冤 3 袁袁 5 滋 L 袁形成低中高单个浓度袁测定计算回收率袁结果如表所示遥.6.4 检出限称取空白样品 5 g 袁置于水蒸气蒸馏装置的蒸馏

4 周佳等 :GC-MS/MS 同位素内标法测定肉制品中 N- 二甲基亚硝胺 49 表 N- 二甲基亚硝胺回收率试验结果样品 C 加入量 /ng C 测得量 /ng R 回收率 / 豫平均 R 回收率 / 豫样样样样样样瓶中袁加入 N- 二甲基亚硝胺标准使用液渊.8 滋 g/ml 冤滋 L 及内标使用液滋 L 袁使与样品混匀袁加入水 5 ml 袁混合均匀袁加入氯化钠 6 g 袁照.4 样品处理操作袁制备检出限工作液袁注入 GC-MS/MS 袁测得信噪比袁按 S/N=3 颐计算袁折算 N- 二甲基亚硝胺检出限为. 滋 g/kg 遥渊检出限渊滋 g/kg 冤 = 检出限工作液浓度渊 ng/ml 冤伊稀释体积渊 ml 冤 / 取样量渊 g 冤伊 3/ 测得信噪比伊 / 冤遥.7 专属性分别注射空白基质溶液和对照品溶液袁 N- 二甲基亚硝胺保留均较好袁空白基质未见干扰袁对照品与溶剂空白反复进样也未见交叉污染袁专属性较好袁如图 6 所示遥测定图 6 空白样品图谱将样品测定液注入 GC 原 MS/MS 得到峰面积袁从表 3 肉制品中 N 原二甲基亚硝胺检出情况样品是否检出渊滋 g 窑 kg - 冤渊滋 g 窑 kg - 冤渊滋 g 窑 kg - 冤渊滋 g 窑 kg - 冤猪肉垣.57 猪肉垣. 牛肉垣.47 鸡肉原原猪肉垣.78 猪肉原原牛肉垣.4 鸡肉垣.6 猪肉 3 原原猪肉 3 原原牛肉 3 垣.4 鸡肉 3 原原猪肉 4 原原猪肉 4 原原牛肉 4 原原鸡肉 4 原原猪肉 5 垣.47 猪肉 5 原原牛肉 5 原原鸡肉 5 原原猪肉 6 垣.9 鸭肉原原牛肉 6 原原鸡肉 6 原原猪肉 7 原原鸭肉原原牛肉 7 原原鸡肉 7 原原猪肉 8 原原鸭肉 3 原原牛肉 8 原原鸡肉 8 原原猪肉 9 垣.8 鸭肉 4 垣.8 牛肉 9 原原鸡肉 9 垣.54 猪肉原原鸭肉 5 原原牛肉 +.3 鸡肉原原标准曲线中查出相应得浓度渊 ng/ml 冤袁根据稀释倍数和称样量可与算出样品得含量渊滋 g/kg 冤袁结果如表 3 所示遥结果与讨论. 样品前处理的选择考虑到食品基质复杂袁为得到准确的结果袁选取 4 种不同来源肉制品渊包括猪肉尧牛肉尧鸡肉尧鸭肉冤袁采取不同的提取方式袁考察溶剂提取和蒸馏提取袁用二氯甲烷溶剂超声提取时发现袁由于肉制品渊如猪肉冤脂肪含量可以达到 9% 以上袁在浓缩时袁提取液会出现一块块固状的油脂袁实验无法继续袁本实验采用水蒸汽蒸馏方式袁油脂尧蛋白质无法随目标物蒸馏出来袁能够获得理想的提取效果遥. 肉制品中 N- 二甲基亚硝胺的检测常见问题与采用 GC-MS/MS 检测的优势曾用单气质 SIM 模式进行测定袁由于 N- 二甲基亚硝胺的分子量渊 74 冤太小袁容易受多种分子离子干扰袁食品基质复杂袁基质效应特别明显袁常常出现加入标准液却定性不了袁造成定性上的误差袁用 GC 原 MS/MS 的 MRM 模式袁排除了基质带来的干扰袁灵敏度更高遥.3 采用内标法的优势在进行前处理时袁发现样品浓缩及液液萃取过程很容易使目标物流失袁采用 D 6 -NDMA 标准品为内标袁选取内标定量离子 8 跃 5 袁可减少外标法对回收率的影响袁使目标物定量更加准确遥.4 样品测定应用本方法对 4 中不同来源基质样品渊包括猪肉制品批次尧牛肉制品批次尧鸡肉制品 5 批次尧鸭肉制品 5 批次冤共 4 批进行分析袁检测含有 NDMA 3 批次袁含量在耀滋 g/kg 之间袁均未超过国家规定的限量 3. 滋 g/kg 遥渊下转第 87 页冤

5 王毅等 : 二维弹道修正引信制导控制系统半实物仿真 87 冤该半实物仿真系统可有效模拟二维弹道修正引信的实时工作状态袁可有效检验引信制导控制系统功能和准确度遥冤通过仿真试验可对引信制导控制系统进行有效验证袁满足了某型弹箭的战术技术指标要求遥本文设计的半实物仿真系统可通用于包括火箭弹在内的尾翼稳定弹箭袁对其他双旋结构弹箭的制导控制系统半实物仿真具有借鉴意义遥参考文献 [] GRIDER K C 袁 DONALD H. Simulation in missile devel_ opment-yesterday today and tomottow[c] 椅 AIAA 4th annual meeting and technical display Washington D.C. 院 American Institute of Aeronautics and Astronautics 袁 978 院 -5. [] 贡学平袁费海伦. 红外成像制导半实物仿真现状与发展 [J]. 红外与激光工程袁袁 9 渊冤院 [3] NULL R A 袁 PASTRICK H L 袁 MORRISON P A. Copper 鄄 head semi -active laser guidance system develop_ ment [C] 椅 AIAA 4th annual meeting and technical disp_ lay. Washington D.C.: American Institute of Aeronautics and Astronautics 袁 978 院 [4] RAY J A 袁 LARSON G A 袁 TERRY J E. Hardware_ -inthe-loop support of the Longbow/ HELLFIRE mod_ ular missile systems pre -planned product improvement pro 鄄 gram[c] 椅 Proceeding of SPIE, Technologies for Synthetic Environments: Hardware -in -the -loop Testing VI 袁渊 4366 冤院 [5] 苏建刚袁付梦印. 激光末制导炮弹半实物仿真系统 [J]. 系统仿真学报袁 6 袁 8 渊 9 冤院 [6] 许金钢. 毫米波半实物仿真系统实现方法技术研究 [D]. 西安院西北工业大学袁 6. [7] 刘汉忠. 灵巧弹药半实物仿真转台控制系统研究 [D]. 南京院南京理工大学袁 4. [8] 王学刚. 末制导炮弹的目标模拟器半实物仿真 [D]. 南京院南京理工大学袁 6. [9] 吕俊袁李鑫袁凡永华. 基于 RT-LAB 的高空飞艇半实物仿真系统设计 [J]. 电子测量技术袁 5 袁 38 渊 3 冤院 3-6. 渊编辑院刘杨冤渊上接第 49 页冤 3 结束语 NDMA 食品安全限度值比较低袁为了达到检测目的袁样品取样量大袁本方法保留国标中水蒸汽蒸馏法进行前处理袁表面上效率比较低袁但是由于样品取样量大袁肉制品基质复杂袁简单的有机溶剂提取不太现实袁后期净化压力极大袁而采用水蒸汽蒸馏能有效除去大部分的杂质袁并且对环境影响较小袁对操作人员友好遥本法采用水蒸汽蒸馏袁同位素标记袁建立 GC-MS/MS 检测 N- 二甲基亚硝胺的新方法袁结果表明袁 N- 二甲基亚硝胺可通过 GC-MS/MS 的 MRM 模式袁以同位素内标法被快速尧灵敏的良好分离检测袁是肉制品中 N- 二甲基亚硝胺高效检测的较好方法袁可适用于日常食用肉制品的质量监控袁提高人们的食肉安全性遥参考文献 [] 金征宇袁彭驰芳. 食品安全 [M]. 杭州院浙江大学出版社袁 8 院 [] 周光宏袁赵改名袁彭增起. 我国传统腌腊肉制品存在的问题及对策 [J]. 肉类研究袁 3 渊冤院 3-7. [3] 樊丽琴. 咸鱼腌制过程中 N 原亚硝胺及其前提物质的变化规律研究 [D]. 湛江院广东海洋大学袁 9 院 6-7. [4] 刘法佳袁吴燕燕袁李来好袁等. 降低腌制食品中亚硝酸盐含量的研究进展 [J]. 广东农业科学袁袁 38 渊冤院 [5] 杨华袁马俪珍袁王瑞袁等. 肉制品中 N- 亚硝胺及亚硝酸盐测定及其相关性分析 [J]. 保鲜与加工袁 6 袁 6 渊 4 冤院 -3. [6] YURCHENKO S 袁 MOLDER U. The occurrence of volatile N-nitrosamines in Estonian meat pruducts [J]. Food Chemistry 袁 7 袁渊冤院 [7] 食品中污染物限量院 GB 76 要 [S]. 北京院中国质检出版社袁. [8] DRABIK-MARKIEWICZ G 袁 DEJAEGHER B. Influence of putrescine,cadaverine in heated cured pork meat [J]. Food Chemistry 袁渊 4 冤院 [9] 刘印平袁刘玉欣袁云鹏袁等. 啤酒和腊肠中 N,N- 二甲基亚硝胺的测定 [J]. 食品安全质量检测学报袁 5 渊冤院 [] 翁其香. 气质联用法测定食品中 N- 二甲基亚硝胺含量 [J]. 福建分析测试袁 6 袁 5 渊 4 冤院 8-9. [] 赵华袁王秀元袁王萍亚袁等. 气相色谱原质谱联用法测定腌制水产品中的挥发性 N- 亚硝胺类化合物 [J]. 色谱袁 3 袁 3 渊 3 冤院 3-7. [] 食品中 N- 亚硝胺类的测定院 GB/T 59.6 要 3[S]. 北京院中国标准出版社袁 3. 渊编辑院徐柳冤

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.