第 29 卷第 1 期中国现代医学杂志 Vol. 29 No 年 1 月 China Journal of Modern Medicine Jan DOI: /j.issn 文章编号 : (2019

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1 第 29 卷第期中国现代医学杂志 Vol. 29 No. 209 年月 China Journal of Modern Medicine Jan. 209 DOI: /j.issn 文章编号 : (209) 子宫内膜癌组织 microrna-944 的表达及临床意义章丽 2, 张志秀, 于爱军, 李明 ( 山东省德州市人民医院. 妇产科,2. 病理科, 山东德州 25304) 摘要 : 目的探讨子宫内膜癌组织 microrna-944(mir-944) 的表达及其与子宫内膜癌 (EC) 患者临床病理特征及预后的关系, 并分析 mir-944 对患者的早期诊断价值方法采用实时荧光定量聚合酶链反应 (qrt-pcr) 检测 EC 癌组织 (80 例 ) 和正常子宫内膜组织 (30 例 ) 中 mir-944 的表达情况, 分析 mir-944 表达与 EC 患者临床病理特征之间的关系采用 Kaplan-Meier 生存曲线法分析 mir-944 表达与 EC 患者预后的关系, 并采用受试者操作特征曲线 (ROC) 分析 mir-944 对 EC 的早期诊断价值结果 qrt-pcr 结果显示, mir-944 在 EC 癌组织中的表达水平高于正常子宫内膜组织 (P <0.05) 在 EC 癌组织中,miR-944 表达水平与肿瘤肌层浸润深度有无淋巴转移有无远处转移及国际妇产联盟 (FIGO) 分期相关 (P <0.05), 而与患者年龄绝经状态病理分型和组织分级无关 (P >0.05) Log-rank 检验结果显示,miR-944 高表达组患者的生存时间较 mir-944 低表达组降低 (P <0.05) ROC 分析结果显示,miR-944 的曲线下面积 (AUC) 为结论 EC 癌组织中 mir-944 呈高表达, 且其高表达与 EC 患者不良预后密切相关,miR-944 可作为 EC 早期诊断和预后预测的潜在靶点关键词 : 子宫内膜肿瘤 ; 微 RNAs ; 病理学, 临床 ; 预后中图分类号 : R737.3 文献标识码 : A Role of microrna-944 in patients with endometrial carcinoma Li Zhang, Zhi-xiu Zhang, Ai-jun Yu, Ming Li 2 (. Department of Gynaecology and Obstetrics, 2. Department of Pathology, Dezhou People s Hospital, Dezhou, Shandong 25304, China) Abstract: Objective To investigate expression of microrna-944 (mir-944) in patients with endometrial carcinoma (EC), and to determine its clinical significance. Methods The expression level of mir-944 in 80 cases of EC cancer tissues and 30 cases of normal endometrial tissues were measured by real-time quantitative fluorescence PCR (real-time PCR) test. Relationship between the expression of mir-944 and the clinical characteristics of patients with EC was analyzed. Results RT-PCR showed that the expression level of mir-944 in EC cancer tissue was significantly higher than that in normal endometrium (P < 0.05). Expression of mir-944 was correlated to the depth of tumor myometrium infiltration, lymph node metastasis, distant metastasis and FIGO stage (P < 0.05). Log-rank test showed that the survival time of the patients with high expression of mir-944 was decreased obviously compared with that in patients with low expression group of mir-944 (P < 0.05). ROC analysis showed that the area under the curve of mir-944 (AUC) was No obvious correlation was identified between mir-944 and age, menopausal status, pathological classification, or histological grade (P > 0.05). Conclusions High expression of mir-944 in EC cancer tissue relates to the poor prognosis, which may be used as a potential diagnostic and prognostic biomarker. 收稿日期 : [ 通信作者 ] 于爱军, yuaijun968@26.com ;Tel :

2 第期章丽, 等 : 子宫内膜癌组织 microrna-944 的表达及临床意义 Keywords: endometrial neoplasms; micrornas; pathology, clinical; prognosis 子宫内膜癌 (endometrial carcinoma, EC) 是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率呈逐年升高的趋势, 且患者的预后较差 [] EC 早期患者, 在接受根治手术治疗后, 其 5 年总存活率可高达 96% [2] 然而,EC 在发生远处转移或者复发后, 采用内分泌放化疗的治疗效果并不理想, 患者的存活率较低因此, 临床上迫切需要寻找与 EC 肿瘤形成相关且有助于 EC 早期诊断预后预测的分子靶标微 RNAs [3] (micrornas) 为长度约 22 个核苷酸的非编码小 RNA, 在转录后水平通过降解 mrna 和 / 或抑制翻译, 负性调控靶基因的表达 MicroRNAs 在很多重要的生物学进程中发挥重要作用, 如细胞增殖凋亡病毒感染及肿瘤发生等 [4] 研究证实, 在宫颈癌的肿瘤形成和恶性进展过程中, 存在多种 micrornas 异常表达然而仅少数 micrornas 在宫颈癌中的功能被深入研究本研究以 EC 患者的癌组织样本为研究对象, 采用实时荧光定量聚合酶链反应 (quantitative real-time polymerase chain reaction, qrt-pcr) 检测 EC 癌组织 [5], 和正常子宫内膜组织中 microrna-944(mir-944) 的表达情况, 并分析 mir-944 表达与 EC 患者临床病理特征和预后的关系, 现报道如下资料与方法. 临床资料选取 203 年 6 月 205 年 6 月山东省德州市人民医院 80 例 EC 患者的癌组织手术标本纳入标准 : 具有完整的病历资料 ;2 术后病理诊断为 EC ;3 术前均未接受放化疗 ;4 无内分泌免疫和代谢性疾病 ;5 术前 6 个月内未服用激素类药物排除标准 : 合并其他恶性肿瘤 ;2 全身感染性疾病 ;3 肝肾疾病本研究中,<55 岁患者 43 例, 55 岁患者 37 例 ; 绝经前患者 47 例, 绝经后患者 33 例 ; 子宫内膜样腺癌患者 5 例, 非子宫内膜样腺癌患者 29 例 ; 组织分级 :G 患者 6 例,G 2 患者 26 例,G 3 患者 38 例 ; 肌层浸润深度 /2 患者 39 例, 肌层浸润深度 >/2 患者 4 例 ; 有淋巴结转移患者 54 例, 无淋巴结转移患者 26 例 ; 有远处转移患者 49 例, 无远处转移患者 3 例 ; 国际妇产联盟 (FIGO) 分期 :Ⅰ Ⅱ 期患者 43 例, Ⅲ Ⅳ 期患者 37 例另收集同期 30 例子宫肌瘤等良性病变行子宫切除术患者的正常子宫内膜组织作为对照组所有子宫内膜组织样本离体后, 立即保存于液氮中本研究获该院医学伦理委员会批准, 所有患者知情并签署知情同意书.2 试剂与方法.2. 试剂与仪器 Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司,RNA 提取试剂盒购自美国 Axygen 公司, MicroRNAs 逆转录试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司,cDNA 逆转录试剂盒购自美国 Thermo Scientific 公司,SYBR Green 购自德国 Roche 公司,real-time PCR 引物购自上海生工生物工程股份有限公司 Nanodrop 分光光度计购自美国 Thermo 公司,qRT-PCR 扩增仪购自德国 Roche 公司.2.2 qrt-pcr 检测 mir-944 表达从液氮中取出组织样本, 迅速置于 0 ml 离心管中, 加入 Trizol 试剂, 以匀浆器高速间断匀浆, 匀浆过程中, 离心管置于冰上 Trizol 法提取 EC 癌组织及正常子宫内膜组织中总 RNA, 操作步骤参照 RNA 提取试剂盒的说明书 Nanodrop 分光光度计检测总 RNA 浓度及纯度 (OD 260 /OD 280 比值在.8 ~ 2.0),cDNA 逆转录试剂盒进行逆转录,cDNA 产物置于 -20 冷冻保存备用引物序列如下 :mir-944 正向 5'-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3',miR-944 反向 5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3' ; 内参 U6 正向 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',U6 反向 5'-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3' 定量 PCR 扩增仪检测 mir- 944 相对表达水平 qrt-pcr 扩增体系为 0 μl, 反应条件 :95 o C 预变性 0 s,95 o C 变性 5 s,60 o C 退火 20 s,70 o C 延伸 20 s, 共 35 个循环采用 2 - Ct 法表示 mir-944 相对表达量每个组织样品进行 3 次重复试验后, 进行统计分析.3 随访随访方式为电话或者门诊随访时间为患者术后 ~ 48 个月, 随访终点事件为患者死亡或者到达随访截止时间 (207 年 6 月 ).4 统计学方法数据分析采用 SPSS 3.0 统计软件, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组的比较采用方差分析, 两组的比较采用成组 t 检验计数资料以率 (%) 表示, 比较采用 χ 2 检验, 建立 Kaplan-Meier 生存模型, 组间比较采用 Log-rank 检验, 采用受试者操作特征 5

3 中国现代医学杂志第 29 卷 (receiver operation characteristic, ROC) 曲线 P <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. 不同子宫内膜组织中 mir-944 表达情况 EC 癌组织中 mir-944 相对表达量与正常子宫内膜组织比较, 差异有统计学意义 (t =5.405,P =0.000), EC 癌组织 (3.29±.2) 高于正常子宫内膜组织 (.02±0.32) 2.2 EC 癌组织中临床病理特征与 mir-944 表达的关系 EC 癌组织中,miR-944 表达与患者的年龄绝经状态病理分型及组织分级无关 (P >0.05); 而与肿瘤肌层浸润深度有无淋巴结转移有无远处转移及 FIGO 分期相关 (P <0.05) 在肌层浸润深度 >/2 组的癌组织中,miR-944 表达水平高于肌层浸润深度 /2 组 (P <0.05); 有淋巴结转移组的癌组织中,miR-944 表达水平高于无淋巴结转移组 (P <0.05); 有远处转移的癌组织中,miR-944 表达水平高于无远处转移组 (P <0.05); 在 Ⅰ Ⅱ 期组的癌组织中,miR-944 表达水平低于 Ⅲ Ⅳ 期组 (P <0.05) 见附表 2.3 EC 癌组织中 mir-944 表达与患者生存率之间的关系以平均值为界限, 将 EC 患者分为 mir-944 低表达组 (34 例 ) 与 mir-944 高表达组 (46 例 ), 绘制 Kaplan-Meier 生存曲线结果显示,miR-944 高表达组患者的 5 年总生存率与低表达组患者比较, 差异有统计学意义 (χ 2 =8.534,P =0.003), 高表达组为 54.35%(25/46), 低于 mir-944 低表达组患者的 85.29% (29/34) mir-944 高表达组的患者平均生存时间为 (50.09±2.03) 个月, 而 mir-944 低表达组患者的平均生存时间为 (56.03±.83) 个月,Log-rank 检验结果显示,miR-944 高表达组患者的生存时间较 mir-944 低表达患者降低 (χ 2 =7.784,P =0.006) 见图 2.4 mir-944 表达对患者预测 / 诊断价值分析以正常对照组和子宫内膜癌组为样本, 进行 mir-944 表达水平的 ROC 分析, 分析 mir-944 表达水平对患者是否具有一定的辅助诊断 / 判断价值约登指数 =( 敏感性 + 特异性 -), 约登指数最大时对应的 mir-944 相对表达量, 即为鉴别诊断阈值, 本研究中的鉴别诊断阈值为.8, 在此阈值点, 敏感性为 74.3%, 特异性为 70.8%,ROC 曲线的曲线下面积 (AUC) 为 0.784,- 特异性为 29.2%, 约登指数为 0.45 ROC 曲线见图 2 附表 EC 癌组织中临床病理特征与 mir-944 表达的关系 (x±s) 临床病理特征 n mir-944 t/f 值 P 值年龄 <55 岁 ± 岁 ±.7 绝经状态绝经前 ±.24 绝经后 ±.36 病理分型子宫内膜样腺癌 ±.45 非子宫内膜样腺癌 ±.3 组织分级 G ±.7 G ±.34 G ±.24 肌层浸润深度 / ±.37 >/ ±.6 淋巴结转移有 ±.24 无 ±.4 远处转移有 ±.46 无 ±.33 FIGO 分期 Ⅰ Ⅱ 期 ±.35 图 Ⅲ Ⅳ 期 ±.49 总生存率 /% mir-944 高表达组 mir-944 低表达组时间 / 月 EC 癌组织中 mir-944 表达与患者生存率之间的关系 52

4 第期章丽, 等 : 子宫内膜癌组织 microrna-944 的表达及临床意义敏感性讨论图 2 ROC 曲线数据折线平滑模拟理论阈值特异性 EC 发病率位居女性恶性肿瘤的第 6 位, 据统计, 202 年全球 EC 新发病例数约 32 万 [6] EC 是一种高度异质性的恶性肿瘤, 且多种危险因素可诱发 EC, 如高血压绝经状态不孕症及家族史等 [7] 近年来, 对 EC 诊断和治疗方面取得了巨大进展, 然而 EC 晚期患者的预后并不乐观, 其 5 年总生存率仅 0% ~ 29% [8] 在人类肿瘤发生和恶性进展中, 存在多种 micrornas 的功能异常和表达异常 MicroRNAs 可同时具有促癌基因和抑癌基因功能 [9], 取决于其下游靶基因的功能, 如 mir-340 在骨肉瘤癌细胞通过靶向沉默 ROCK 基因表达, 抑制肿瘤细胞增殖和侵袭, 具有 [0] 抑癌基因功能, 而在胃癌细胞中,miR-340 则能够促进肿瘤细胞生长抑制细胞凋亡, 发挥促癌基因的功 [] 能多种 micrornas 在 EC 细胞增殖和凋亡过程中发挥促癌基因或者抑癌基因的功能, 如 mir-99a-3p [2] mir-0 [3] 等越来越多的证据表明,miR-944 参与多种恶性肿瘤的发生和恶性进展过程, 本研究关注 mir-944 在 EC 癌组织中表达情况及其临床意义首先,qRT-PCR 结果显示, 与正常子宫内膜组织相比,miR-944 在 EC 癌组织中表达水平上调, 提示在 EC 肿瘤形成过程中,miR-944 可能发挥促癌基因的功能, 同时也有研究证实,miR-944 在非小细胞肺癌 (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC) 中靶向下调抑癌基因 SOCS4 表达, 进而促进肿瘤形成, 发挥促癌基因功 [4] [5] [6] [7] 能, 然而,miR-944 在胃癌食道癌及结肠癌等肿瘤细胞中发挥抑癌基因功能, 可能与肿瘤所属组织器官差异或者 mir-944 下游靶基因不同有关分析 EC 癌组织中 mir-944 表达与 EC 患者临床病理特征之间的关系, 结果显示,miR-944 在肌层浸润深度 >/2 存在淋巴转移远处转移和 Ⅲ Ⅳ 期的癌组织中的表达水平较高, 提示在 mir-944 可能促进了 EC 癌细胞对周围组织浸润淋巴转移和远处转移, 且 mir-944 具有作为 EC 早期诊断 (Ⅰ Ⅱ 期 ) 指标的潜能 mir-944 可能是通过靶向调节与肿瘤浸润侵袭及转移相关的基因表达, 进而发挥作用, 如 XIE [8] 等研究证实,miR-944 靶向下调抑癌基因 S00PBP 表达, 进而促进宫颈癌细胞侵袭迁移, 本研究并未对 mir-944 促进肿瘤转移的内在机制进行探究, 将在以后的研究中进行探索此外, 本研究对 mir-944 表达与 EC 患者预后的关系进行分析, 结果显示,miR-944 高表达的 EC 患者, 其术后 5 年总生存率和平均生存时间均低于 mir-944 低表达患者, 提示 mir-944 高表达可能预示着较低的生存率和较短的生存时间, 与 EC 患者不良预后密切相关,miR-944 具有作为 EC 患者不良预后预测的生物靶分子的潜能 HE 等 [9] 在乳腺癌中的研究结果也得到类似的结论,miR-944 通过靶向调节 BNIP3 基因表达, 产生获得性耐药,miR-944 可作为乳腺癌患者不良预后的预测靶标最后,miR-944 表达水平的 ROC 分析, 结果提示 : 当 mir-944 表达水平在.8(ROC 分析所得阈值 ) 以上时, 患者 EC 的阳性率提高提示其可作为判断 EC 的辅助证据,ROC 曲线下面积 AUC 值较高 (0.784), [20] 敏感性和特异性也较好董动丽等的研究结果表明, 血清 HE4 和 CA25 诊断 EC 的敏感性分别为 54.67% 和 28.00%, 特异性分别为 98.57% 和 9.43%, 与之相比, 本研究中 mir-944 诊断 EC 的敏感性较高, 而特异性偏低当然, 由于本研究的实验样本量较少, 可能会导致结果出现一定的偏倚, 在后续的研究中应扩大样本量, 以得到更加可靠准确的结论综上所述, 本研究结果证实,miR-944 在 EC 癌组织中呈高表达状态, 且 mir-944 高表达预示着患者可能发生肌层浸润淋巴结转移及远处转移, 并且与患者较低的术后 5 年总生存率和较短平均生存时间相关, 提示 mir-944 参与并促进了 EC 肿瘤形成和恶性进展,miR-944 可作为 EC 早期诊断和预后预测的潜在靶点参考文献 : [] MATSUO K, MOEINI A, CAHOON S S, et al. Weight change pattern and survival outcome of women with endometrial 53

5 中国现代医学杂志第 29 卷 cancer[j]. Ann Surg Oncol, 206, 23(9): [2] 罗茜, 尹国武, 朱晓明, 等. 子宫内膜癌手术治疗的研究进展 [J]. 现代生物医学进展, 207, 7(): [3] BOGANI G, DOWDY S C, CLIBY W A, et al. Management of endometrial cancer: issues and controversies[j]. Eur J Gynaecol Oncol, 206, 37(): 6-2. [4] 田晓琳, 杨臻, 王建英, 等. 微小 RNA 与肿瘤的关系 [J]. 癌症进展, 206, 4(): [5] MEI J, LI M Q, LI D J, et al. MicroRNA expression profiles and networks in CXCL2 stimulated human endometrial stromal cells[j]. Mol Med Rep, 207, 5(): [6] CHISHTI U, AZIZ A B, AKHTAR M, et al. Selective lymphadenectomy in endometrial cancer: retrospective analysis of morbidity andsurvival data at a tertiary care centre[j]. Pak J Med Sci, 205, 3(4): [7] 石娅娅, 犹忆, 吴艳乔. 关于子宫内膜癌危险因素的 Meta 分析 [J]. 预防医学情报杂志, 205, 3(4): [8] 赵祎琪, 邓泽文, 郄明蓉, 等. 226 例晚期子宫内膜癌的临床病理特征及治疗与其预后的相关因素分析 [J]. 实用妇产科杂志, 207, 33(7): [9] 田晓琳, 杨臻, 王建英, 等. 微小 RNA 与肿瘤的关系 [J]. 癌症进展, 206, 4(): [0] ZHOU X, WEI M, WANG W. MicroRNA-340 suppresses osteosarcoma tumor growth and metastasis by directly targeting ROCK[J]. Biochem Biophys Res Commun, 203, 437(4): [] HOU X, QIAO H. Effect of mir-340 on gastric cancer cell proliferation and apoptosis[j]. Int J Clin Exp Pathol, 205, 8(0): [2] WU D, HUANG H J, HE C N, et al. MicroRNA-99a-3p regulates endometrial cancer cell proliferation by targeting mammalian target of rapamycin (mtor)[j]. Int J Gynecol Cancer, 203, 23(7): [3] KONNO Y, DONG P, XIONG Y, et al. MicroRNA-0 targets EZH2, MCL- and FOS to suppress proliferation, invasion and stem cell-like phenotype of aggressive endometrial cancer cells[j]. Oncotarget, 204, 5(5): [4] MA J, MANNOOR K, GAO L, et al. Characterization of microrna transcriptome in lung cancer by next-generation deep sequencing[j]. Mol Oncol, 204, 8(7): [5] PAN T, CHEN W, YUAN X, et al. mir-944 inhibits metastasis of gastric cancer by preventing the epithelial-mesenchymal transition via MACC/Met/AKT signaling[j]. FEBS Open Bio, 207, 7(7): [6] WARNECKE-EBERZ U, CHON S H, HÖLSCHER A H, et al. Exosomal onco-mirs from serum of patients with adenocarcinoma of the esophagus: comparison of mirna profiles of exosomes and matching tumor[j]. Tumour Biol, 205, 36(6): [7] WEN L, LI Y, JIANG Z, et al. MiR-944 inhibits cell migration and invasion by targeting MACC in colorectal cancer[j]. Oncol Rep, 207, 37(6): [8] XIE H, LEE L, SCICLUNA P, et al. Novel functions and targets of mir-944 in human cervical cancer cells[j]. Int J Cancer, 205, 36(5): E [9] HE H, TIAN W, CHEN H, et al. MiR-944 functions as a novel oncogene and regulates the chemoresistance in breast cancer[j]. Tumour Biol, 206, 37(2): [20] 董动丽, 顾劲松, 赵绍杰. 子宫内膜癌患者血清 HE4 CA25 水平变化及其意义 [J]. 山东医药, 207, 57(3): ( 张西倩编辑 ) 54

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联