王金凤 等 成纤维生长因子 基因沉默对甲状旁腺激素 3, 促成骨细胞分化作用的影响! # 27 7 " ' 12$#$(13 ## # ' ' 2 "$# # "# $"2$#$ '.( ( "$# 7 7 ' 1$ # #' #$ 0! 2!& " ## # # ' 1#!# 2$ $

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1 复旦学报 医学版 成纤维生长因子,:,. 基因沉默对甲状旁腺激素 - 促成骨细胞分化作用的影响 王金凤 徐小雅 丁巧灵 周 轶 金慰芳 王洪复 高建军 复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室 上海 摘要 目的 研究内源性成纤维生长因子 #"2#$# 对甲状旁腺激素!#$ $' 3, 促成骨细胞分化作用的影响 方法 采用酶消化法分离培养新生 大鼠头盖骨成骨细胞 应用小发夹.($#$!.($.( 干扰技术.( 沉默成骨细胞 表达 应用 法和 3.33 法检测细胞增殖和碱性磷酸酶 4!$!$# (13 活性 应用 &#' &3 法检测其 (13 和骨钙素 #-. 等基因 '.( 水平 研究 3, 对培养成骨细胞和 5 基因沉默细胞的作用 结果 $3, 对培养成骨细胞增殖促进作用明显 分化促进作用弱 ' 1$3, 作用 天 细胞增殖率增加 7 7 而细胞比活性未见明显改变 同时其 (13 和 -. 转录水平轻度上调 分别较对照组增加 7 和 7$3, 上调成骨细胞 '.( 水平 倍 该作用可被针对 特异的 $.( 转染所抑制 基因沉默后 3, 促分化作用明显增强 其 (13 和 -. '.( 水平分别较对照组增加 倍 和 倍 显示内源性 对 3, 促分化的干扰作用 结论 内源性 可能参与 3, 促分化作用的调节 上调可干扰 3, 的促成骨细胞分化作用 关键词 甲状旁腺激素 3, 成纤维细胞生长因子.( 干扰.( 成骨细胞 大鼠 中图分类号 文献标志码 ( ) & #!,:,. # ## ## " 6(. &"/ /&5. & "+,- *5. 6 & " 6(.,"&(-&) '" )"!# 1"#%"!% "%" "# "( " %& ' #"# #$ #"2#$# # #.(#.(# ##!#$ $' 3, "$!' # # # 2# % ' ' #" 7 $#!! # '# # 2#$ $$"! # 4!$!$# (13 ## 2' 3.33 ' #$!# #$ (13 -. '.( 2 # ' &#' &3 #$ 2 # # $.( ' #$# # #$0! ( # ' #!# # # #' #!#!'!# # #! # 2$ # # ##$!"#$%&' )" $'

2 王金凤 等 成纤维生长因子 基因沉默对甲状旁腺激素 3, 促成骨细胞分化作用的影响! # 27 7 " ' 12$#$(13 ## # ' ' 2 "$# # "# $"2$#$ '.( ( "$# 7 7 ' 1$ # #' #$ 0! 2!& " ## # # ' 1#!# 2$ $ 2 # 2#$ # # $.( #$ #$ '4 #' #"# (13-. 0! #!# 2 $2 #$ # # # # $#! $ 0! '"$# # " " #3,$!& " # 0! 3,!! # #' #" ## # ###$"'$' '#!#$ $' 3,#"2#$#.(#.(# # # 甲状旁腺激素!#$ $' 3, 的促成骨作用是其治疗骨质疏松症的重要基础 然而对其促进成骨细胞增殖和分化的细胞基础和影响因 素等尚存争议 作用机制也未完全阐明 成纤维生长因子 #"2#$# 是钙磷调节的核心激素之一 主要由骨组织分泌产生 通过抑制肾 羟化酶和尿磷重吸收等发挥生理 作用 近年研究发现 过表达 可抑制体外培养成骨细胞分化和基质矿化 反映出其对成骨细 胞的直接效应 3, 有调节 表达的作 用 3, 的促成骨细胞分化作用是否与 表达状态有关等尚不明确 为此 本文利用体外培养大鼠成骨细胞 在观察 3, 促成骨细胞增殖和分化的基础上 采用.( 干扰技术.( #.( 沉默其 的表达 研究内源性 对 3, 促分化作用的影响 材料和方法 成骨细胞分离培养 参考文献 取 只新生 大鼠 处死后经 7 乙醇消毒 取颅盖骨于 7 胰蛋白酶 美国 (' 公司 中 预消化 ' 后 将骨片剪成约 '' 的小块 于 7 型胶原酶 美国 "' 公司 中 消化 ' 收集消化液 用新鲜胶原酶重复消化残留骨碎片一次 将两次收集的消化液离心 弃上清液 沉淀用 % 培养液 含 7 胎牛血清 美国 公司 青霉素 华北制药有限公司 5 '1 链霉素 上海新先锋药业有限公司 " '1 重悬接种 于 7 - 饱和湿度条件下培养 每 天换液 次 倒置相差显微镜 日本.4 公司 下观察细胞生长情况 碱性磷酸酶染色 培养皿细胞用 3 洗两次 7 戊二醛固定 ' 蒸馏水漂洗 次 根据碱性磷酸酶 4!$!$# (13 染色试剂盒 华美生物工程公司 说明 按.53(3 底物液为 的比例配制孵育液 作用 ' 蒸馏水清洗 晾干后甘油明胶封片 显微镜下观察 - 作用 取第 继代细胞分别以 孔 万 孔和 万 孔接种于 孔培养板 美国 # 公司 '' 培养皿和 '' 培养皿 丹麦. 公司 培养 $ 后更换为含 7 去激素胎牛血清 澳大利亚 公司 的 % 培养液 用 % 稀释重组人甲状旁腺激素 & 美国 "' 公司 后间隙循环 $ 为一循环 作用 $ 加入 孔培养板细胞 共 次 作细胞增殖和 (13 活性观察 一次性加入 '' 培养皿细胞 终浓度为 ' 1 作用 和 $ 分别收获细胞作 (13 和 -. 等 '.( 水平检测 加入 '' 培养皿细胞 每次终浓度为 ' 1 次 天 相隔 $ 作用 天 于最后加药 $ 后收获细胞作 蛋白水平检测 以等量 % 培养液加入为空白对照 细胞增殖和 % - 活性 参考文献 取 孔培养板细胞 经 ' 1 作用 天 分别采用 3.33 美国 (' 公司 和

3 复旦学报 医学版 年 月 美国 "' 公司 法检测其总 (13 活性和细胞增殖率 分别以 ' ' 孔和 ' ' 孔表示 并以 ' ' ' ' 计算细胞 (13 比活性,:,. 干扰 为研究 表达状态对 3, 促分化作用的影响 以慢病毒质粒!1 - 复旦大学医学分子遗传实验室于敏教授馈赠 为骨架 参考 文献构建 合成特异针对大鼠 '.(. 位点的小发夹.( 干扰 $#$!.($.( 质粒 取第二继代细胞以 万 孔接种于 '' 培养皿 隔日更换为无抗生素 % 培养液 含 7 继续培养 $ 每培养皿换液 '1 采用脂质体! #' 美国 5#" 公司 法分别转染干扰质粒.( &$.( 和!1 - 空质粒.( %'!# &$.( &$.( 序列 & & ((( (( (( & (((( && 和 &(( ((((( ((( (& ( (( ( & (((& & 干扰 $ 更换无抗生素 % 培养液 含 7 恢复培养 $ 收获细胞作 '.( 分析 &$.( 转染细胞经恢复培养 $ 后以 & ' 1$3, & 作用 $ 取细胞作 '.( 分析 以等量 % 培养液加入为空白对照 # " -$ 分析细胞 " 2% 水平 参考文 献 以 北京天根生化科技有限公司 一步法抽提成骨细胞总.( 采用 # #!# # 试剂盒 德国 " 公司 逆转录合成.( 采用 # # * 3 # 德国 " 公司 试剂盒于 03 实时定量 3 系统 美国 ##" 公司 进行目的基因 &#' &3 定量分析 引物序列 正义链 反义链 &(((& (&&&( ( ( &!. &(13 &(((& &&&( ( (& ( &!. & -. & ( ( (((&&( ( & ( ( &!. & (3, &((( (&(( & (& & ( &( (&( (&(&! & 实验操作按试剂盒说明 产物经融解 曲线单峰验证 获得 # 值 计算各测试基因与内参基因 (3, 比值作相对量分析 # 分析蛋白水平 参考文献 以 3 洗细胞 次 用 53( 裂解液 上海碧云天生物技术研究所 裂解细胞 ' 后 于 离心 ' 取上清用 ( 蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术研究所 进行蛋白浓度测定 调整浓度一致后 加上样缓冲液 上海碧云天生物技术研究所 沸水中煮 ' 保存备用 取蛋白样品 1 约 " 经 7 & 3( % 凝胶以 恒压电泳 $ 经 '( 恒流转膜 $ 转移蛋白至 3 膜 美国! 公司 用含 7 牛奶的 7 2 ' 1. ' 1 &,!, 室温封闭 $ 用封闭液分别稀释羊抗 英国 (' 公司 和鼠抗 # 上海碧云天生物技术研究所 孵育过夜 用 洗膜 次后 用辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育 $ ' 1. ' 1 &,!, 洗膜 次 应用化学发光试剂 上海碧云天生物技术研究所 于 $ ' / 图像处理系统 美国 & 公司 发光摄像 用 ## - 软件进行灰度分析 以 与内参 # 比值作相对量分析 统计学分析 数据以, # 表示 增殖和 (13 活性的均数比较采用 3 软件进行单因素方差分析 组间比较采用 1& 检验 差异显著性检验水平设为双尾 基因表达的均数比较采用 # #& 检验 差异显著性检验水平设为单尾 结 果 - 对培养成骨细胞的促分化作用 体外培养的大鼠成骨细胞生长良好 图 ( 细胞胞质呈 (13 染色阳性 图 间隙循环加入含 培养液作用 天 法测定结果显示 对培养细胞具有增殖刺激作用 ' 1 浓度组 值与对照组比较提高 7 7 差异有统计学意义 以 ' 1 浓度作用最明显 图 采用 3.33 法检测的 (13 活性结果显示 总 (13 活性随药物剂量增高而增加 图 但细胞 (13 比活性未见明显增加 图 %

4 王金凤 等 成纤维生长因子 基因沉默对甲状旁腺激素 3, 促成骨细胞分化作用的影响 (13 和 -. 是成骨细胞分化成熟标志分子 为进一步了解 3, 的促分化的作用 以 ' 1 一次性给予后 分别于 和 $ 连续取样 分析细胞 (13 和 -. 转录水平变化 结果显示 有一定促细胞分化作用 作用 $ 时细胞 (13'.( 水平增加 7 $ 和 $ 时逐渐恢复 图 -. 在 $ 时有增加趋势 7$ 时增加幅度加大 7 图 图 0-0< / 对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响,0-0< / # ### (3$ & ##' "!$ ( 4!$!$# (13 #"! # # ' ' #$"# (13 ### ' 3.33 ' #$"% (13 ## # ''' ' %0!!# (13-. # # $ # ' 1$3, # #' #2 # ' &#' 3#!# # ##$## '## (3, 0! ' # # " # #$# -0/ 对培养成骨细胞,:,. 表达的作用 为进一步明确 3, 对成骨细胞 表达的作用 我们一次性给予 ' 1 后 采用多点取样连续观察其 转录水平变化 结果显示 对成骨细胞 转录有上调作用 作用 $ 时其 '.( 水平较对照组增加 倍 $ 时增加 7$ 时恢复 甚至低于对照组水平 图 ( 为观察其蛋白水平变化 我们以 ' 1 作用 天 加药 次 天 结果显示 对成骨细胞 蛋白有上调趋势 增加 7 但与对照组比较差异无统计学意义 图,:,. 基因沉默对 - 作用的影响 成骨细胞 表达 其过表达可影响细胞功能 为进一步研究内源性 对 3, 促分化作用的影响 我们采用.( 干扰技术.( 以大鼠 '.( 序列 为靶序列筛选构建慢病毒转染质粒 &$.( 转染体外培养成骨细胞造成 表达沉默 其与空质粒转染细胞比较 '.( 水平减低约 7 图 ( 在此基础上给

5 复旦学报 医学版 年 月 予 ' 1 作用 $ 结果显示 表达未见升高 图 其 (13 和 -. 转录 水平明显升高 较对照组分别增加 倍 和 倍 图 图. -0< / 对成骨细胞,:,. 表达水平的影响,.# #,:,. -0< / " ( $ '.( # # # $ # ' 1$3, # #' # # ' &#' &3'' % ' ' #$# # ' # (3," ( "!"## # # # # #$ # # # # #' # 2#$ ' 1$3, # ' 6 # #" #0! ' # # # #$# 图 -0< / 对,:,. 沉默的成骨细胞 % - 和 &$2 表达的影响, )-0< / % - &$2,:,.## ( $ 0! # # # #$ $.( ' #$ $0! (13 -.# # $ # # #' #2#$ ' 1$3, # ' &#' 3' ' % #$## #!# # ##$# " 0! # '## (3, 0! ' # # " # #$# 讨 论 3, 的促成骨作用是其治疗骨质疏松症的重 要基础 然而其细胞学机制仍未清楚阐明 研究表明 3, 可显著增强在体成骨细胞数量和活性 但对其促增殖或促分化的作用基础以及影响因 素等仍存争议 是钙磷调节的核心激素之一 主要由骨组织分泌产生 通过抑制肾 羟化酶和尿磷重吸收 等发挥生理作用 近年研究发现 过表达 可抑制体外培养成骨细胞分化和基质矿化 反映出其对成骨细胞功能的直接效应 3, 有调节成骨细胞 表达的作用 其促成骨细胞分化作用是否与 表达状态有关尚不明确 为此 我们首先观察 对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响 结果表明 促进体外培养成骨细胞增殖作用强 而促进分化作用弱 ' 1 浓度组 值提高 7 7 而其细胞 (13 比活性未见明显 增加 与文献报道相似 ' 1 作用下细胞 (13 和 -. 转录水平仅表

6 王金凤 等 成纤维生长因子 基因沉默对甲状旁腺激素 3, 促成骨细胞分化作用的影响 现为轻度短暂升高 3, 是影响 水平的重要因素 甲 状旁腺切除可使血循环中的 含量下降 但 3, 对成骨细胞 表达的直接作用仍有 不同报道 在前期研究中 我们观察了 作用 天后细胞 的转录水平变 化 结果未发现 3, 的上调作用 为进一步明确 3, 对成骨细胞 表达的作用 我们以 ' 1 一次性给予后多点取样 观察其 '.( 水平变化 结果表明 3, 对体外培养成骨细胞 的转录有上调作用 并可持续 $ 在此基础上进一步以 ' 1 每天 次 天后观察其细胞内蛋白水平变化 结果显示 3, 作用下 蛋白增加 7 鉴于 为分泌型蛋白 培养液中该分子的可能增量也值得考虑 因此 该研究表明 3, 可上调成骨细胞 转录水平 其蛋白水平变化尚待进一步确定 成骨细胞 过表达可抑制其体外分化和 基质矿化 为进一步研究内源性 在 3, 促分化中的作用 我们采用小发夹.($.( 转染干扰培养的成骨细胞 表达 与空质粒对照比较 干扰细胞 '.( 水平减低 7 在此基础上给予 ' 1 作用 表达未见升高 而其 (13 和 -. 转录水平明显升高 分别增加 倍和 倍 表明内源性 对 3, 促分化的干扰作用 综上所述 该研究表明 3, 对体外培养成骨细胞促增殖作用强 促分化作用弱 其弱的促分化作用可能与其上调细胞 有关 致谢 复旦大学医学分子遗传实验室于敏教授 谭理老师对基因沉默实验进行技术指导 复旦大学放射医学研究所邵春林教授在基因分析中提供了帮助 参 考 文 献 #. ( & '(3,3,3 " " # # ( " 6$#%% # "2#$ #& 3' #$ ' # ' ' #' #$ 6$"#( 6",*$4 **''# -0! # "2#$ #!! # # ## '#0 ' # " )"! " # " 1 ' # " #!$!$# $' # 1)! )"$ 唐雯菁 周轶 徐小雅 等 体外培养成骨细胞 表达及其对激素的反应 复旦学报 医学版 金慰芳 顾淑珠 高建军 等 重组人 3,& 对体外培养成骨细胞骨形成的作用 复旦学报 医学版 # " (*"/(#.( $'' "!!# $"$& # # ( " 66" 1/ /*(#3 # #' 0! # # # # (# 1" 2#$# ( '". 3#$ $' &!# " "!#$2 " #"" 5" 4 1 '$' #$ # # '# #3, )" 4 1- (( ((5# '# #3, #' #! # '# #!#& '##! # # )" #.# # ( # # '#"##!# 4!$!$# & 3& %& (3 3, " ""# #! # ## ( " $,3$!$# #!# " #!#$!$" % )! ) *$4*6", ' 4 #!! )" $*.2 %3#$ $'!# " "# # #$0! #"2#$#& " ")" ) $ 4 $' " # #"2#$#! # ' # " # 4'#!$!$# ' #' 1)! )"$ 收稿日期 编辑 王蔚

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复旦学报 医学版 年 月 # ##!## & 8%!# ##! %%#  ## % # # %# % %# %# %! % %!### %# # # #!# %# # #! ## ! # &  %#### ##   #*! #& #* 6  !#* 复旦学报 医学版 雌激素水平对大豆苷原 促大鼠成骨细胞分化作用的影响 丁巧灵 王金凤 徐小雅 周 轶 金慰芳 王洪复 高建军 复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室 上海 摘要 目的 观察基础雌激素 "# & 水平对大豆苷原 - 促成骨细胞分化作用的影响 方法采用酶消化法分离培养新生 大鼠头盖骨成骨细胞 通过培养液中添加 雌二醇改变培养微环境 包括空白对照 雌激素水平 应用 法和对硝基苯磷酸盐 %# %

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