复旦学报 医学版 年 月 糖皮质激素长期大量使用常导致骨质疏松 甚 至股骨头坏死 这可能是由于大剂量糖皮质激素直接作用于成骨细胞 骨细胞和骨髓基质干细胞 / ' #' 抑制骨形成 诱发骨细胞凋亡和骨髓脂肪化 近年来 研究发现 ( 糖蛋白 (&"!# (& "! 活性下降时激素性股骨头坏死发生率升高

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1 复旦学报 医学版 利福平改善糖皮质激素诱导的大鼠股骨头退变的组织学研究 韩 宁 阎作勤 同济大学附属东方医院急诊创伤外科 上海 复旦大学附属中山医院骨科 上海 摘要 目的 本研究探讨利福平 -'! 对糖皮质激素诱导的股骨头退变的作用 方法 只 大鼠随机等分为 组 组以利福平每日 '" " 灌胃 周 组以生理盐水每日 '1 灌胃 周 后 周两组均联用甲基强的松龙 ' #$!( 1 每日 '" " 第 周检测血清骨钙素含量 骨髓间充质干细胞 / ' #' 的 ( 糖蛋白 (&"!# (&"! 活性 股骨头内 (&"! 表达 并进行股骨头骨计量学和凋亡染色分析 结果 组 (&"! 活性和表达量均高于 组 与 组相比 组骨化中心面积 骨小梁厚度及数量 破骨细胞和成骨细胞数量均有所增加 骨小梁分离度 脂肪细胞数量和周长 凋亡细胞数量减少 结论 利福平可减轻糖皮质激素诱导的大鼠股骨头退化样改变 该作用可能与其增强骨组织的 (&"! 活性和表达有关 关键词 ( 糖蛋白 利福平 糖皮质激素 股骨头 大鼠 中图分类号 ) 文献标志码 * & ' "" % " " 2 2", 2:&."' *#!#. 5 % &# ' 6# #!#$"" &# ' #!! #"# #$-#--'! # & "#- - ' $ # /# # ## "! -'! "! ' "!'## - ' #$!( 1 & '## / ##$ # -#$# ##$-#$ #$ ' #(&"!# (&"! ## -/ ' #' (&"!.! #$ - ' $ #+ ; / $#'!$' #!# /! #!# '/! ' #!!##$ - ' $ 1 "'!#$"! (&"! ##.! "- # "! $ '##/ #$ '/ # ## / # '/ '! #" -!!$ - ## "- # "! ##!# / #/!#!!## "- # "! ")-'! $/# #$ " # &#! # $ $' / ##$ $ "(&"! ##.! - ' $ $%&(&"!# -'! " # - ' $ # '& &!%. 2.5 (3- 上海市浦东新区青年基金 (+ &!"#$%&' ';#'!$#' '

2 复旦学报 医学版 年 月 糖皮质激素长期大量使用常导致骨质疏松 甚 至股骨头坏死 这可能是由于大剂量糖皮质激素直接作用于成骨细胞 骨细胞和骨髓基质干细胞 / ' #' 抑制骨形成 诱发骨细胞凋亡和骨髓脂肪化 近年来 研究发现 ( 糖蛋白 (&"!# (& "! 活性下降时激素性股骨头坏死发生率升高 (&"! 是一种跨膜糖蛋白 可将糖皮质激素由细胞内 泵至细胞外 削弱激素药理作用 而激素浓度对成骨细胞凋亡和 分化成关键调控作 用 $ 等发现 在糖皮质激素剂量相同的情况下 联用 (&"! 抑制剂 环孢素 和 能显著增加股骨头坏死的发生率 利福平 -'! 是一种公认的 (&"! 表达和 活性增强剂 但其对激素性骨质疏松或股骨头坏死的作用尚不明确 本试验旨在利用利福平增强 (&"! 活性观察其对大剂量糖皮质激素诱导的股骨头退变的影响 材料和方法 主要材料 健康雄性 大鼠 体重 " 由复旦大学附属公共卫生临床中心动物中心提供 流式细胞仪 美国 # 公司 硝酸纤维素膜 德国 $ $ A $ 公司 ## 软件 美国 &) 公司 '"!&! 软件 美国 /# 公司 主要试剂 利福平 ( 分离液 " '1 罗丹明 美国 "' 公司 甲基强的松龙琥珀酸钠注射液 比利时辉瑞制药公司 药品批号 高糖 % 培养基 美国 0/ 公司 胎牛血清 以色列 #' 公司 小鼠单克隆抗体 英国 / ' 公司 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体 美国 # ; 公司 % 1 发光液 美国 ' $' 公司 兔抗鼠多克隆抗体 '& /& 美国 " 公司 正常马血清 卵白素生物素过氧化物酶复合物 美国 # 公司 大鼠骨钙素 %1 试剂盒 美国 ' 公司 2%1 染色试剂盒 德国 ) $ 应用科学部 动物分组和取材 只 大鼠随机等分为 组 组 利福平干预组 用利福平每日 '" " 灌胃 周 组 对照组 用生理盐水每日 '1 灌胃 周 后 周两组均皮下注射甲基强的松龙 ' #$&!( 1 每日 '" " 第 周末处死动物 经心脏取血后解剖分离双侧股骨 冲洗股骨髓腔提取 左侧股骨头用于 + # / # 分析 右侧股骨头经甲醛固定后 % 于 < 脱钙 右侧股骨头经圆韧带沿股骨干纵轴剖开 行大体病理观察后 以低熔点石蜡包埋 制备 ' 切片用于免疫组化和组织学分析 血清骨钙素定量检测 取外周血 分离血清 依据骨钙素 %1 试剂盒说明书检测血清骨钙素含量 通过 个标准品 稀释至终浓度为 "'1 建立标准曲线 以标准品的吸光度 值为纵坐标 相应的标准品浓度为横坐标 待测样品经酶联仪于 ' 波长处测得 值 依据标准曲线计算相应的骨钙素浓度 骨髓间充质干细胞的. 活性检测 高糖 % 含 胎牛血清 完全培养液冲洗股骨髓腔 离心 ' 制成单细胞悬液 倾注于 ( 分离液 "'1 表面 离心 ' 中间细胞层以 ( 洗涤 遍 得到富含 的细胞群 1 单细胞悬液加入 '1 含 胎牛血清和终浓度为 "'1 罗丹明 的高糖 % 完全培养液 < 饱和湿度的孵箱中培养 '( 洗涤细胞 遍 重悬于高糖 % 完全培养液 < 饱和湿度的孵箱中培养 ' 离心 ' 重悬于 '1( 中 立即以流式细胞仪测定荧光强度 以不含罗丹明 的 1 悬液经流式细胞仪检测作为对照组 5!" 检测 应用 ) ( 裂解液于 < 提取股骨头内蛋白 定量后取 " 蛋白质 & 聚丙烯酰胺凝胶电泳并转至硝酸纤维素膜 采用化学发光法免疫检测 一抗小鼠单克隆抗体 工作浓度为 < 孵育过夜 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 "0 室温孵育 $ 加入 液 % 1 系统 后化学发光 应用 ## 软件分析结果 以目的条带与 & # 条带的灰度比值量化目的蛋白表达 股骨头免疫组化 ' 石蜡切片常规脱蜡水化 用 消除内源性过氧化物酶活性 常规猪血清 < 孵育 ' 蒸馏水洗 ( 冲洗 ' 滴加一抗 小鼠单克隆抗体 工作浓度 < 保湿箱内过夜 第 天 ( 冲洗 ' 滴加生物素化的猪抗兔抗体和卵白素生物素过氧化物酶复合物 < 孵育 '( 冲洗 '

3 韩 宁 等 利福平改善糖皮质激素诱导的大鼠股骨头退变的组织学研究 显色 苏木精轻度复染 二甲苯透明中性树脂封片 阴性对照组仅使用二抗 组织学检测 应用 '"!&! 软件测量大体病理照片中股骨头骨化中心面积 骨骺面积 #$! #" -!!$ - ## %' 切片行 % 染色 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶 ### & ##!$!$# )( 染色和原位未端标记 # '.. & ##-&' # ( /" 2%1 凋亡染色 骨计量学分析 每张切片的每个指标测量 个视野 应用 '"!&! 软件进行测量分析 倍视野下检测骨小梁厚度 /$ 骨小梁数量 / 2 骨小梁分离度 /! 股骨头髓腔中的脂肪细胞面积 脂肪细胞数量 单位骨髓面积中的脂肪细胞数量 和脂肪细胞周长 倍视野下检测凋亡细胞数量 单位骨小梁周径 (' 上贴附的成骨细胞数量 2/(' 和破骨细胞数量 2 (' 统计学处理 所有实验数据均以 + # 表示 采用 ## 软件进行统计分析 的 (&"! 活性 2/(' 和 2 (' 采用 & +$# 检验 其余均采用两两比较 检验 为差异有统计学意义 结 果 血清骨钙素定量检测结果 第 周末 两组各获 个 大鼠血清样品 组骨钙素含量为 "'1 显著高于 组的 "'1 3/ 的. 活性 组的 平均荧光值低于 组 图 荧光染料罗丹明 是特异性的 (&"! 底物 可被 (&"! 逆浓度梯度泵至细胞外 利用流式细胞仪检测胞内荧光残留量能够准确反映 (&"! 活性 胞内罗丹明 蓄积越少 则 (&"! 活性越强 组 的 (&"! 活性均显著强于 组 图 3/ 的. 活性. %3/ $## -#-#!# (&"! ## #!!# # (&"! ## #- # $ (&"! ##(&"! ## $/ -'! "!'! #$"!)#.! + # 0! &#3"! &+$## # 免疫组化检测结果 (&"! 分别表达于成骨细胞 图 中黑色三角 骨细胞 图 中白色三角 破骨细胞 图 中黑色箭头 和骨髓细胞 图 中白色箭头 与 组相比 利福平显著增强了 组的 (&"! 表达 图 免疫组化检测股骨头内. 表达的结果."!% % (# #"'!!/ ' $# #"# # $##! # / #" # # /(&"!.! $/ -'! "!'!#$"!

4 复旦学报 医学版 年 月 5!" 检测结果 经过 + # / # 检测 两组均出现 (&"! 条带 图 (&"! 表达 少骨量丢失 量以 (&"! 条带 值与 & # 条带 值的比值来表示 图 与 组相比 组的 (&"! 表达水平显著升高 图 : 股骨头的组织学分析 : " " 图 5!" 检测股骨头内. 表达的结果. "!%5!" #"/ (&!".! $ / #$ #- -(&"!$#& #/ 0! &#3"! # # 组织学分析结果 与 组相比 组股骨头次级骨化中心面积增大 骨小梁增多 增厚 髓腔内脂肪细胞减少 脂肪组织面积降低 凋亡细胞数量显著降低 图 骨计量学分析结果 表 与 组相比 组的 %/$ / 22/(' 和 2 (' 均显著升高 /! 及髓腔中脂肪细胞数量 脂肪组织面积和脂肪细胞周长均显著降低 讨 论 长期使用糖皮质激素会导致骨量丢失 造成局 部骨组织强度下降 甚至股骨头坏死 研究认为 这与大剂量糖皮质激素诱导 成脂分化增强 成骨分化减弱 骨细胞凋亡 成骨细胞凋亡 抑制新骨形成等因素密切相关 本研究发现 利福平能够抑制骨髓脂肪化 减少骨细胞和成骨细胞凋亡 减 "!#$ "+#$#$ '- ( 1#$ ; -#$ % $# #"! #-'! "!'!#$"!&% #" +#$#$ '- ( 1 /$ / 2! # -'! "!'!#$"! /! #$ ; '/ -!# $#! #-'! "! '!#$"! 2%1 #" +#$#$ '- ( 1#$ '/ -!!## "-! # -'! "!'!#$"! 表 骨计量学分析 '! 3%" + # $#'!$' #!' # 0! 0! % /$ ' / 2 '' /! ' 2 -!!## 2/(' '' 2 (' '' 2 -!# '' -! # ('-!# '!' # "! &#3"!2/(' 2 (' '! " &+$# # ##$ #$ '! "# # %%!!$ - ##

5 韩 宁 等 利福平改善糖皮质激素诱导的大鼠股骨头退变的组织学研究 是成骨细胞和脂肪细胞的共同前体 大剂量糖皮质激素促进 成脂分化 导致股骨头内脂肪细胞增多 同时成骨细胞前体减少 成骨细 胞生成受抑制 新骨形成减少 本研究发现 应用利福平后 相同剂量 ( 1 作用下 股骨头内脂肪细胞减少 股骨头内成骨细胞增多 而在相同剂量糖皮质激素作用下 成脂分化与 (&"! 活性密切相关 (&"! 活性越弱 成脂分化越显著 这可能是因为 (&"! 活性减弱导致作为其底物的 ( 1 在胞内蓄积增加 胞内 ( 1 浓度升 高 而糖皮质激素浓度越高 成脂分化越 显著 利福平是一种公认的 (&"! 表达和活性的 增强剂 本研究中其也表现出显著增强 大鼠 的 (&"! 活性的作用 同时股骨头内 (&"! 表达显著增加 因此 我们推测利福平通过增强 的 (&"! 活性 减弱 ( 1 诱导作用 抑制了 的成脂分化 从而保证了成骨细胞前体数量 改善了糖皮质激素诱导的股骨头骨质疏松样改变 在本研究中 相同剂量 ( 1 作用下 利福平增加了破骨细胞数量 这可能是由于利福平应用后 成骨细胞数量增加 成脂分化受抑 成骨细胞前体增多 成骨细胞分化成熟过程中 大量表达 ) 2 1 却只分泌少量 (0) 2 1 (0 比 值增高 促进破骨细胞增生 活化 同时 近年来发现糖皮质激素浓度升高 破骨细胞数量减 少 由于 (&"! 是糖皮质激素浓度的关键调控因素 我们推测 利福平还有可能通过增强股骨头内 (&"! 表达 减弱 ( 1 胞内蓄积 引起破骨细胞数量增加 糖皮质激素诱导成骨细胞 骨细胞凋亡是 0( 股骨头坏死的另一重要机制 本研究中 利福平抑制了相同剂量 ( 1 诱导的股骨头内细胞凋亡 目前发现 糖皮质激素浓度下降 诱导细 胞凋亡作用减弱 本研究中 股骨头内成骨细胞 骨细胞 (&"! 均呈阳性表达 股骨头 (&"! 表达量增加 而 (&"! 表达增加 活性增强 减少糖皮质激 素胞内蓄积 药理作用减弱 这进一步支持了我们的推断 即利福平通过增强 (&"! 表达和活性 削弱糖皮质激素对股骨头的作用 利福平能有效改善糖皮质激素诱导的 大鼠股骨头的退行性改变 这可能与利福平增强了 的 (&"! 活性和股骨头 (&"! 表达密切相关 临床上对于激素性骨质疏松尚无有效的早期治疗手 段 随着病情进展可能导致股骨头坏死 最终往往需要进行关节置换 本研究的结果有望为治疗激素性骨质疏松和股骨头坏死提供新的思路 参 考 文 献 李洪涛 于雪峰 李登宇 等 糖皮质激素性骨质疏松症发病机理研究进展 中国骨质疏松杂志 $,''# ' -# " ' # #! # &# # //# #$# ( # 1 0 # # # # / # # # # #$!!# / -'# # "#$ * ' $$ * 3 0!'!$'#$ - # # -#$ - ' $ -##! ## #,"=,= ) "!'!$' # #$ # & # -- ' $ # '! #$ '# $, $ 2 0 # & # &!/#$ & & & ## - " # $"$ #$!$" # # # / #-##, # - #$'! %%-# -!# ##.' #$ #!# ' #" ## ) " # "#$ - -" # $' # # "# ##, # $,''# %-# -! #$!' # - # //# )6 $,''# %-# - #' #$!' #-# //#' /"/"+ :"( 0 # - (&"!# #!# ## #$ ' / &/ / / -'!, *+. 2! 1 ' # ## - )( )((&' # ' #" ##' / -#' #, 张华峰 马信龙 激素性股骨头坏死的骨质疏松学说

6 复旦学报 医学版 年 月 中国骨质疏松杂志 +" 0 0 (!# # '!!# $ #! # # # &# # '. #" # "(* 1'/# #$ ' $ ' # '&! #$!.' - ' # # & #,, " 潘志宏 韩宁 ( 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 复旦学报 医学版,1 1, +",.' #$ &!"!' ' #'# '$'- # &#, * " %1 +)#;)%$ '!' # # "&# (&"!#.! " ' #&"& ##' *+ /" +", $# & $ (%-# - #,, '!#+ " # 1 0 & # $/# /!# / # # # # / $ "!!#, * ',+.' #$ $/# #$ -'# - ' # # # # & " #-/ ## ".! ) # + # ) )1(-# $/#- # / #"!'# -!!# - # / # # # / " #!# # '$' -#$# -# /, /&# $$ * 0!'!$'#$ - # &# -#$ - ' $ -# #! ## # 收稿日期 编辑 段佳 ' #$! / -'#!# 上接第 : 页 $1( # #/!##-# $!## ## -& -&! )/ 0//# )' 1 ( 1"&# ' ''"# -$!## # $#- # $#$ # ( %1"&# ' ''"# - - $!## $'. '(*, 11) 1 1"&# ' - -! '& $!## &-&! # '" $ $ (, $" # $ '/ 1"&# ' /-#-$!## # '" $ $ #$ # # $!## -# $ /#$!## -#" &!# '#$,/# " +$'# $# ( # -!- #/ -# $!## #,! )(!# % $#" ## ' -$!## -#"),* 1, " 1$" $!## - -'/#$!## / -# -$!## #" &!# &$!## - #" '#$ /#, & )" &)" ;!## '#$ &#& $ # ' *+ & ) /. & "),1!## - #"'#/#$ "&# ' -&! #, #'' ($ 1-"!## "#$!## #$ -''"# '' ' ' 收稿日期 编辑 张秀峰

潘志宏 等 2 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 -, , 随着糖皮质激素在临床的广泛应用 股骨头坏 死患者不断增多 但应用相同剂量激素的患者并非都发生股骨头坏死 据统计 激素性股骨头坏死率约为 近年来 等和 等发现当肾移植或系统性红斑狼疮患者的 2 糖

潘志宏 等 2 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 -, , 随着糖皮质激素在临床的广泛应用 股骨头坏 死患者不断增多 但应用相同剂量激素的患者并非都发生股骨头坏死 据统计 激素性股骨头坏死率约为 近年来 等和 等发现当肾移植或系统性红斑狼疮患者的 2 糖 复旦学报 医学版 糖蛋白抑制对体外培养骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 潘志宏 韩 宁 复旦大学附属金山医院骨科 上海 同济大学附属东方医院急诊创伤外科 上海 摘要 目的 探讨 2 糖蛋白 2 2 活性抑制对骨髓间充质干细胞 - 在糖皮质激素诱导下成脂分化的影响 方法 体外培养 大鼠 - 分别给予维拉帕米 组 - 组 和 组 加入等量生理盐水作为阴性对照 组 培养至第 天 用罗丹明 荧光染料结合流式细胞仪技术检测

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复旦学报 医学版 年 月 ' '! $! ! !!'!0 #!  )!#  # $ '! $ $ '! '!,  '! 2 '! $ $!#$ !!'!0!' #! #' #. '! &# '! $, $ #! $!&#! $) !& ! '! $$, 复旦学报 医学版 局部植入利福平, 缓释剂对 糖蛋白 $! 活性及激素性股骨头坏死的影响 费 腾 李 朔 潘建峰 刘 嘉 陈 晨 郭常安 邵云潮 阎作勤 复旦大学附属中山医院骨科 上海 摘要 目的 观察局部植入利福平! ' 缓释剂对 糖蛋白 &#! &# 活性及激素性股骨头坏死的影响 方法 建立激素性股骨头坏死的动物模型 取 只成年雌性兔 随机平均分为 组 个对照组 空白 口服给药 肌肉注射 和局部缓释组

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