畜牧兽医学报卷! 是体内必需的矿物元素也是体内含量最多的矿物元素摄入充足的! 对保持动物骨骼完好至关重要摄入不足是导致骨质疏松症最重要的因素有研究表明细胞外高浓度能直接诱导凋亡! 摄入量不足也会导致家畜骨骼的骨化过程受阻此外饲料中! 比例对其吸收有很大影响因为磷酸钙

Size: px

Start display at page:

Download "畜牧兽医学报卷! 是体内必需的矿物元素也是体内含量最多的矿物元素摄入充足的! 对保持动物骨骼完好至关重要摄入不足是导致骨质疏松症最重要的因素有研究表明细胞外高浓度能直接诱导凋亡! 摄入量不足也会导致家畜骨骼的骨化过程受阻此外饲料中! 比例对其吸收有很大影响因为磷酸钙"

受乘
5 years ago
Views:

1 畜牧兽医学报不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响顾建红刘俊栋赵瑞英王富民李慧敏刘宗平扬州大学兽医学院扬州江苏畜牧兽医职业技术学院泰州摘要从日龄番鸭长骨骨髓分离破骨细胞进行培养培养过程中添加不同摩尔浓度比例的钙磷双因子! 为倒置显微镜观察细胞形态于培养第天进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色 "#$! 培养 % 后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝研究不同钙磷比例对番鸭生成及骨吸收功能的影响结果显示培养第天时试验组 "#$! 阳性细胞多于对照组差异极显著 & 试验组中除!' 组与!' 组之间无显著差异外 & 其余各组间差异均极显著 & 扫描电镜观察象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小! 为成反比证实合适比例的钙磷! ' 通过抑制生成和活化抑制的骨吸收活性关键词破骨细胞磷钙抗酒石酸酸性磷酸酶骨吸收陷窝中图分类号 & 文献标识码 $ 文章编号!"#$#%&'&!'#!#! (#!&)*%#$&%& *0,0-.0%0-23$ #.**0-4$56.)*0 3.*)*0 20-1*0-!" #$% &'"% &' ''($" ) "*&' +#78*%98)0-:09%%%.;0,..8 18%*980008*08*9*.) 1,1,8.!!' 78%%%,..8)",98)*00%**09,78%% : 1,08 )*81,*,)**0* *0 *% 1,1, "#$!*0*0-, 0%, 8% %0%%* *0,8.-,00*0-80)*81,, %68,8%..8,0.):89*018*)0-8.17)8, *-0*9*0",870%*980:70!' -8.10%!' -8.1",%*980)0-, *-0*9*0, 8% %",8.%)08%,!' *0,*:*:0:8:*0-**:*0,*:*0-,98)*00%**09,-.1,1,8.*.)888*0*%1,1, *0 收稿日期基金项目国家自然科学基金资助项目江苏省高校青蓝工程优秀青年骨干教师资助项目江苏畜牧兽医职业技术学院院内课题作者简介顾建红女江苏如东人博士生主要从事动物营养代谢病的研究 ()*+,-.&) 通讯作者刘宗平 ()**./0-1*0-/.&%.&0

2 畜牧兽医学报卷! 是体内必需的矿物元素也是体内含量最多的矿物元素摄入充足的! 对保持动物骨骼完好至关重要摄入不足是导致骨质疏松症最重要的因素有研究表明细胞外高浓度能直接诱导凋亡! 摄入量不足也会导致家畜骨骼的骨化过程受阻此外饲料中! 比例对其吸收有很大影响因为磷酸钙的溶解度积为常数! 任一种过多都会影响另一种的吸收动物体内的骨重建 0 8)%*0- 过程有赖于成骨细胞 : 和的活性是目前发现体内唯一专职骨吸收的细胞但钙磷因子对的影响国内外相关报道较少且未见不同钙磷比例对体外形成和活化影响的报道鉴于家禽骨骼系统及产蛋时体内钙磷调节与其他动物存在差异故本试验选择番鸭作为研究对象在对进行体外培养的基础上观察了不同钙磷比例对形成和活化的影响以期为钙磷对禽类骨骼的保护作用提供理论依据材料和方法 / 试验动物日龄番鸭由江苏省水禽种质资源基因库提供 / 主要试剂 (*: 3 分析纯上海生工 53! 3 分析纯中国医药集团上海化学试剂公司胎牛血清杭州四季青公司抗酒石酸酸性磷酸酶 "#$! 染色试剂盒 *-) 象牙片直径 )) 3 *-) / 主要仪器型医用净化工作台苏州金燕净化设备厂! 超纯水装置美国 $5 公司孔培养板 8 二氧化碳培养箱美国 68) 公司 "( 倒置显微镜日本尼康公司 <(( 环境扫描电子显微镜荷兰!,**1 /0 破骨细胞分离及培养取日龄番鸭放血处死用肥皂水清洗遍分离两肢长骨将表面软组织去除干净在 ( 不含胎牛血清中清洗次置于培养皿中纵行剖开用解剖刀轻刮骨髓腔内表面滴管吸取 ( 培养液不含胎牛血清冲洗骨髓腔 8)*0 离心 )*0 弃上清用含不同钙磷比例! 为的培养基 ) 胎牛血清 )3 )- 硫酸庆大重悬后加入孔培养板每孔 ) 培养液中钙磷终浓度见表 =) 饱和湿度下培养于培养第天换液以后每 % 换液次相差倒置显微镜观察细胞贴壁运动情况表培养液中钙磷比例及浓度 1#+%$!!#!#! ##%&'&!&%&'&' 钙磷比例组数钙浓度 )) 磷浓度 )) 对照组试验组 (18*)0-8.1 #*9*.) 1,1,8. 5.): *0 9*.) 008*09 1,1,8.!'!'!'!' / 培养破骨细胞的特性分析于培养第天进行 "#$! 染色用柠檬酸丙酮溶液固定细胞按试剂盒操作步骤进行 "#$! 染色未用 3( 复染倒置显微镜观察酶活性部位呈红橙色分布于胞质内细胞核阴性 > 下随机选取个视野计数个核以上 "#$! 阳性 / 象牙片吸收陷窝的检测象牙片加入孔培养板试验组接种上述含不同钙磷比例培养基重悬的细胞同时设对照象牙

期顾建红等不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响片与不含细胞的完全培养基共培养和对照象牙片与含细胞而不额外添加钙磷的培养基共培养 =) 饱和湿度下培养于培养第天换液以后每 % 换液次 % 后取出象牙片在 & ) 氢氧化铵中超声清洗 )*0 去除象牙片上的细胞用系列乙醇体积分数分别为???? 及?

阳性细胞计数见图结果表明培养第天时试验组与对照组以及各试验组之间 "#$! 阳性数无显著差异 & 培养第天时随钙磷比值降低 "#$! 阳性数增多试验组与对照组之间差异极显著 & 试验组中除!' 组与!' 组无显著差异外 & 其余各组间差异均极显著 & 而形态及染色阳性程度肉眼未见明显差异图培养第天 1" 阳性 *$ 试验组 /*$#!+-1"!'!#%& & 对照组!

3 期顾建红等不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响片与不含细胞的完全培养基共培养和对照象牙片与含细胞而不额外添加钙磷的培养基共培养 =) 饱和湿度下培养于培养第天换液以后每 % 换液次 % 后取出象牙片在 & ) 氢氧化铵中超声清洗 )*0 去除象牙片上的细胞用系列乙醇体积分数分别为???? 及? 脱水自然晾干放置一段时间充分干燥镀金 <(( 环境扫描电子显微镜观察象牙片上吸收陷窝摄片 / 统计分析试验数据采用 ( 中检验进行差异显著性分析结果 /1" 染色及阳性细胞计数培养第及第天各组均可见典型的 "#$! 阳性细胞胞体大胞质内有红色颗粒多核细胞形态多样临近间有突触相连图图 "#$! 阳性细胞计数见图结果表明培养第天时试验组与对照组以及各试验组之间 "#$! 阳性数无显著差异 & 培养第天时随钙磷比值降低 "#$! 阳性数增多试验组与对照组之间差异极显著 & 试验组中除!' 组与!' 组无显著差异外 & 其余各组间差异均极显著 & 而形态及染色阳性程度肉眼未见明显差异图培养第天 1" 阳性 *$ 试验组 /*$#!+-1"!'!#%& & 对照组! '& &! ' &!' &!' 图培养第及第天不同浓度钙磷因子下 1" 阳性 *$ /1!&'+ 1"(*$! #- #! #- 对照与共培养培养液中不额外添加钙磷象牙片表面可见少而浅的吸收陷窝图试验组随! 比值的降低! 为象牙片表面吸收陷窝增多吸收程度增强图图培养第天 1" 阳性 *$ 对照组 0 /*$#!+-1"!!%&0 / 象牙片吸收陷窝观测结果扫描电镜观察骨组织被侵蚀溶解形成陷窝对照不加细胞象牙片表面光滑无吸收陷窝图讨论钙磷与骨骼的关系非常密切而骨骼的不断重建过程涉及和两大类细胞到目前为止尚缺乏具有成熟特征的细胞株因此直接从骨组织中分离培养仍是获得成熟的主要途径随着对分化发育的认识由造血前体细胞

畜牧兽医学报卷诱导培养也可获得样细胞在培养液中加入一定浓度的促生成因子 3!"3!

!%.&% 等的报道一致 8- 等认为 * 达 )) 时刺激凋亡 )) 时抑制骨吸收 ";)* 等则认为细胞外高浓度钙离子能促进小鼠骨细胞培养中样细胞生成据报道磷对的生成和骨吸收具有抑制作用尽管如此国内外就钙磷因子对影响的相关报道较少且未见不同钙磷比例对体外形成和活化的影响本研究在 3

4 畜牧兽医学报卷诱导培养也可获得样细胞在培养液中加入一定浓度的促生成因子 3!"3!( 6 等可诱导生成目前该技术是体外研究分化发育的重要手段之一钙对 0* 等认为细胞外液中高浓度钙 & )) 为对照能直接作用于前体细胞上的钙敏感受体抑制样细胞的生成与,*8* 图 0 对照未与细胞共培养扫描电镜观察象牙片 /0!!.&%+(+-#!!! '-!!%.&% 等的报道一致 8- 等认为 * 达 )) 时刺激凋亡 )) 时抑制骨吸收 ";)* 等则认为细胞外高浓度钙离子能促进小鼠骨细胞培养中样细胞生成据报道磷对的生成和骨吸收具有抑制作用尽管如此国内外就钙磷因子对影响的相关报道较少且未见不同钙磷比例对体外形成和活化的影响本研究在 3 A ) 存在时培养 % 添加钙磷组与对照组相比个核以上 "#$! 阳性数明显增多 & 其中个核以上 "#$! 阳性数随钙磷比下降而增加扫描电镜观察试验组骨吸收陷窝程度大于对照组试验组中图对照与破骨细胞共培养扫描电镜观察象牙片吸收陷窝 /"!%#&!#!!!!! % &%&.%#! 为时的吸收程度小于! 为以及组与动物饲料中的最佳钙磷比例相一致据报道钙敏感受体 *.)0* 同时存在于和表面而且中高浓度钙对活化具有一定的刺激作用因此添加一定浓度钙能改进生长状态且许多研究报道能分泌生成和活化所需的巨噬细胞集落刺激因子 6 以及 56 活化子配体 #$5@ 等所以添加适量钙有利于生成以及发挥骨吸收作用与体内骨重建过程使骨吸收与骨形成之间平衡一致参考文献 *-(70* *.)0%1,1,8.0-87,0%;%1 )09-87*0-7*00%*0.809$0* 图试验组 ''% 钙 ''% 磷扫描电镜观察象牙片吸收陷窝 /"!%#&!#!!!! ''%$# ''%& )*0 ;*B*.) ):*) 0% *.) 8 C.*8)0%.8*0-;)%*0-0%0*%*0 9:0)$)8*0.809*0*5.8* *0.11!80 $(.8$(8%)048$8

5 期顾建红等不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响 *0*0*.)*0;01;:0)*0,9 ) % *08#8, *0-,8)0:0 )*0800:8;*0-% 0%8:.88)%*0-88%*0-87*0-1*- 9%*.)%9**0%*", * *0 8.8*.) 008*0 %*8 *). 11**,)*0%*1,* #8,)).0**0 王兴强杨富生不同诱导因子对大鼠破骨细胞样细胞体外形成的影响临床口腔医学杂志王兴强杨富生葛前进双因子对体外培养大鼠破骨细胞的诱导作用牙体牙髓牙周病学杂志.0- "#%0 $#-.*09 68)*00%6.0*0 #*7*0 (0%8*0 D :**8% )*00%881*0 8**- 于世凤破骨细胞及其骨吸收研究进展 3*-, 8.8*.) *0,*:**;98 )*0:%*8*0-0,*.)0*0-8 18**0-*018.88*,)*0%*1,*#8, )).0**0,*8*,*).87;(99 8.8*.)008*00%*9 980**0*,)*0%*1,* #8, )).0**0 ";)*4"";,,*5 E $"!*0,*:*80% E *01,8*0%. *;98)*0*0,..89 ).:0 )8870%8**,)*0% *1,* #8, )).0**0 ";),*).8)!,1, %8-0**0..89: 0%:0)887 *,)*0%*1,* #8,)).0**0 王晓敏于世凤庞淑珍阿仑磷酸盐促进体外培养鼠破骨细胞凋亡北京医科大学学报 ",84*80"@",).88*%!#$5@#$5@*0)0*0, 8,8*091,1,*-*:08)%*0- ;*0D 87,68#*7 *!*0-.8%*!#$5@*0%. 98)*09*098) )81,-:. 098) )81,-1;80 *,)* 0% *1,* #8, )).0**0

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! # $ #% %&!%'!! $ ( )& * $ +,-.)/ ) 01 * ). 2)3 )01 ( / 433% /1 0 51 -.)/$ 6',)) 4.))%) 0 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0 ".. " - 23 )"." ( ).)") 4. " ' $ 7 " #$%"$8 &' + +." 0"3 / 3 3( 0 ) %.% "(% 2). +.) ")( ) (