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绍讪戈
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1 嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告研究題目 : 具功能性乳酸菌飲品之開發計畫編號 : CN10504 執行期限 :105 年 01 月 01 日至 105 年 12 月 31 日主持人 : 食品科技系王淑珍中華民國 105 年 11 月 14 日

2 一摘要乳酸菌因其益生菌 (probiotics) 特性, 且應用廣泛, 早已是食品界的研究主題, 加上保健食品在國內日益受到重視, 因而更加引發大眾對乳酸菌的興趣早期醫學對於感染 H. pylori 的病患大多施以抗生素治療, 雖然治癒率高, 但是長期服用抗生素對於患者還是會造成生理上的副作用, 且近年來發現有部分 H. pylori 菌株具有抗藥性本系微生物團隊多年收集很多乳酸菌種, 同時也從事乳酸菌研究及功能開發, 瞭解乳酸菌對人類健康的功能因此, 擬將一些對人體有益之乳酸菌研究其對造成胃癌之一的幽門桿菌之抑制作用, 並探討培養條件及培養基配方, 製成產品二緒言胃癌是台灣及全世界常見且死亡率高的疾病, 除了飲食因子外, 幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylori) 是已知造成胃癌最重要的危險因子之一透過許多流行病學及組織病理學的研究, 目前發現感染此菌後造成胃炎及後續的萎縮性胃炎 (atrophic gastritis) 胃腸化生 (gastrointestinal metaplasia) 等胃癌前驅病徵 (1) 早期醫學對於感染 H. pylori 的病患大多施以抗生素治療, 雖然治癒率高, 但是長期服用抗生素對於患者還是會造成生理上的副作用, 且近年來

3 發現有部分 H. pylori 菌株具有抗藥性乳酸菌 (LAB) 廣泛存在於大自然中, 在發酵食品中扮演重要的角色, 可做為製程中產酸及風味的來源, 以及防腐與保存食品之用乳酸菌在發酵過程中會分泌乳酸醋酸過氧化氫雙乙醯 (diacetyl) 洛德因 (reuterin) 及細菌素 (bacteriocins) 等產物, 可以抑制一些污染菌或是病原菌的生長 (3,4) 其中又以雙叉桿菌 (Bifidobacterium) 及乳酸桿菌 (Lactobacillus) 等的益生菌最受重視腸道是食物消化最主要的器官, 同時也主宰了營養廢物毒物的吸收分解與排泄, 身體健康的人其腸道功能必然是健全的益生菌在腸道中扮演著重要的角色, 腸道內菌種的種類相當多, 有益生菌有害菌及中間菌, 三者在腸道內互相競爭養分及空間若是腸道內的益生菌數量足夠且菌態活躍, 自然就能抑制腸道內壞菌的數量與繁殖速度隨著年齡的增長, 腸道中的有益菌會減少, 而有害菌則可能會不斷地增加, 隨之而來的就是老化功能不健全的腸道因此, 現代人養生保健之道, 無非是時時保持腸內有益菌的數量, 控制有害菌在體內的活動範疇本系微生物團隊多年收集很多乳酸菌種, 同時也從事乳酸菌研究及功能開發, 瞭解乳酸菌對人類健康的功能因此, 擬將一些對人體有益

4 之乳酸菌經由篩選對幽門桿菌具有良好抑菌效果的菌株, 探討乳酸菌發酵液抑制幽門桿菌及其尿素酶活性, 與其發酵液對幽門桿菌吸附 cell 表面能力的影響, 製成抑制幽門桿菌的保健食品三材料與方法 ( 一 ) 實驗材料 : 1. 試驗菌株 (1) Helicobacter pylori BCRC (2) H. pylori BCRC (3) Lactococcus lactis subsp. lactis BCRC 以上均購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 ( 新竹, 台灣 ) (4) 自行分離之 Lactic acid bacteria 2. 培養基培養基 : MRS broth Tryptic soy broth 含 sheep blood ( 二 ) 實驗方法 1. 乳酸菌之培養本研究所使用乳酸菌為自行分離之植生性乳酸菌株 B0001~B0159

5 從 -20 冰箱中取出菌株 50μl 接種至 10ml MRS 培養液中, 再從培養液取出 100μl 至 10ml MRS 培養液進行二次菌種活化, 以供實驗備用 2. H. pylori 之生長曲線測定從 -20 冷凍櫃中取出 1% 幽門桿菌至 5ml TSB 培養液 ( 含 5% Sheep Blood), 於 37 10%CO2 培養 48 小時, 進行二次活化再取 1% H. pylori 至 10ml TSB ( 含 5% Sheep Blood), 於 37 10% CO2 培養 72 小時, 進行生長曲線測定, 經由一系列稀釋後, 取 0.1ml 塗抹於 TSA ( 含 5% Sheep Blood), 於 37 10% CO2 培養 72 小時, 計算菌落數 3. 乳酸菌發酵液製備將活化後之乳酸菌以 MRS broth 培養於小時, 將培養後的乳酸菌發酵液 ( 菌量 10 7 ~10 8 CFU/ml) 以 10% HCl 調整其 ph 至 2.0, 取發酵液置於離心管中, 以 4 高速離心機 19000rpm 離心 10 分鐘, 取上清液冷藏, 以供實驗備用 4. 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之篩選 - 洋菜擴散法將活化後之幽門桿菌取 200μl 塗抹於 TSB-Agar, 在無菌操作台中風乾 5 分鐘, 以洋菜擴散法 (Agar diffusion method) 篩選對幽門

6 桿菌菌株具有抑制作用之乳酸菌 (12) 5. 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之生長試驗取以 NaOH 調整 ph 至 4.0 的乳酸菌發酵液與以培養 48hr 的 H. pylori 加入 TSB 培養液混合 (1:1:2) 培養於 37, 在培養至 0hr 4hr 與 8hr 時, 分別取出培養液進行菌落數與菌體濃度 (O.D595 nm) 測定, 並推算其抑制率 Inhibition rate(%):(1-lab-scs O.D595/MRS OD595) 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之尿素酶試驗 H. pylori 所產生之尿素酶可代謝尿素產生氨, 並利用氨中和胃酸, 籍以幫助幽門桿菌在酸性環境的胃中仍能形成菌落本試驗參照 (13) Nankamura 等學者的方法, 測定尿素酶利用其代謝尿素產生氨的特性, 偵測所生成氨的含量, 推知尿素酶的活性, 測量之方法是採用 Berthelot method (14) 偵測氨的含量 a. 在 5 ml TSB 培養液 ( 含 10% FBS) 加入 0.05ml 10% 尿素 b. 將乳酸菌發酵液以 NaOH 調整 ph 至 4.0, 取培養 48hr 之 H. pylori ( CFU/mL) 與乳酸菌發酵液 ( 最終濃度達 6% 12.5% 25%) 加入 5ml TSB 培養液 ( 含 10% FBS 0.05ml 10% 尿素 ) 中混均 c. 置於 37 分別培養小時, 離心 (6000 rpm,4,10 分鐘 ), 取上清液, 加入 0.1 ml 0.85% 酚紅指示劑混均勻, 置於 37

7 反應 10 分鐘, 測 O.D 540 nm (15) 7. 乳酸菌酸耐受性試驗取 1ml 二次活化後的乳酸菌液加入 1.5ml 離心小管 11,000 rpm 離心 10 分鐘, 去除上清液後, 加入 1ml ph 7.4 PBS buffer 緩衝溶液清洗, 接著抽取 100μl 到 9ml 之 ph 3.0 或 2.5 的 MRS-HCl 中, 於 37 下進行酸耐受性反應 3 小時反應後取出 1ml 以 11,000 rpm 離心 10 分鐘, 去除上清液後, 加入 1ml ph 7.4 PBS buffer 緩衝溶液清洗, 再以 11,000 rpm 離心 10 分鐘, 去除上清液後, 在以乾淨的 MRS 回溶, 馬上進行平板塗抹, 培養 48 小時計數 8. 乳酸菌菌種鑑定 (1) PCR 增幅反應將所萃取的乳酸菌菌株之 DNA 進行 16S rdna 的增幅反應分別加入 5 μl 的 DNA 2.5 mm dntp 2.5 μl 10 PCR buffer 5 μl primer 1 (27F) primer 2 (1492R)(30 pmole/μl)1.6 μl 及 5 U 的 ExSel high DNA polymerase 0.04 μl, 補充無菌水至總量 50 μl, 進行 PCR 反應 (GeneAmp PCR system 2400) 反應條件開始以分鐘以及 94 1 分鐘 45 1 分鐘 72 7 分鐘進行 35 個循環, 最後以 72 維持 1 分鐘將 PCR 產物以 1.8% agarose gel 於 1 x TBE buffer 中進行電泳分離, 經 ethidium bromide 染色後,

8 置於 UV Box 下觀察四結果與討論 1. H. pylori 之生長曲線結果顯示在 0-24 小時兩菌菌量由 4.0 log CFU/ml 上升至 6.0 log CFU/ml, 至 48 小時菌數則明顯趨緩, 至 72 小時兩菌菌量則達到 8.1 log CFU/ml 以上 ( 圖 1) 2. 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之篩選 - 洋菜擴散法研究結果顯示,B0003 B0055 B0078 B0136 B0155 乳酸菌對 2 株幽門桿菌皆具有良好的抑制活性 ( 表 1) 3. 乳酸菌發酵液對 H. pylori 之生長影響乳酸菌 B0055 對 H. pylori BCRC 及 H. pylori BCRC 抑制效果優 ( 表 2) 4. 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之尿素酶活性之影響由結果顯示, 幽門桿菌之尿素酶活性在樣品的濃度增加下, 抑制的能力會隨著增加, 然且隨著作用的時間增加抑制能力則會隨著降低對 H. pylori 之生長有明顯抑制效果的各別乳酸菌株以 12.5% 的濃度進行試驗結果顯示 B0003 B0055 及 B0155 對 H. pylori BCRC 及 H. pylori BCRC 抑制效果優 ( 表 4)

9 5. 乳酸菌對酸的耐受性試驗將 B003 B0055 及 B0155 菌株進行對酸耐受性試驗 ( 表 5), 結果顯示, 在 ph 2.5 的環境下所有乳酸菌株可達到 10 4 CFU/mL 6. 乳酸菌菌種鑑定將所分析之 16S rdna 序列與 NCBI 資料庫中已發表之核酸序列進行比對,B0003 分離株與 AL L. plantarum 有 99% 的核酸序列相似性 B0055 分離株與 HM L. plantarum 有 100% 的核酸相似性,B0155 分離株與 CP L. plantarum 有 99% 的核酸序列相似性, 是屬於植物性來源的乳酸菌

10 10 9 BCRC17023 BCRC Bacteria counts(log CFU/ml) Time(hr) 圖 1 H. pylori 於 37 微好氧培養 72 小時之生長曲線 Fig 1. The growth curve of H. pylori incubated microaerobically at 37 in Tryptic soy broth containing 5%Sheep Blood for 72 hr 表 1 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 之抑制活性 Table 1. The inhibition activity of the lactic acid bacteria against H. pylori Strains Inhibition zone(cm) BCRC17023 BCRC15415 MRS(pH2.0 ) BCRC BCRC B B B B B

11 Strains 表 2 乳酸菌發酵液對 H. pylori 之生長抑制之結果 Table 2. The inhibition activity of lactic acid bacteria fermented liquor with H. pylori H. pylori BCRC H. pylori BCRC hr 4hr 8hr 0 hr 4 hr 8 hr logcfu/ml logcfu/ml logcfu/ml logcfu/ml logcfu/ml logcfu/ml MRS broth ± ± ± ±0.01 BCRC ±0.01 ** 7.41 ±0.00 * ±0.00 ** 6.71 ±0.01 ** BCRC ±0.00 * 7.53 ±0.00 * ±0.02 * 7.02 ±0.01 B ±0.00 ** 7.35 ±0.00 ** ±0.01 * 6.89 ±0.01 * B ±0.01 ** 7.36 ±0.00 ** ±0.01 ** 6.80 ±0.01 ** B ±0.00 * 7.44 ±0.00 * ± ±0.01 B ±0.01 * 7.38 ±0.00 ** ± ±0.04 B ±0.00 ** 7.30 ±0.00 ** ± ±0.01

表 4 12.5% 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 尿素酶活性之結果 Table 4. The inhibition urease activity of 12.5% lactic acid bacteria fermented liquor with H. pylori H. pylori BCRC17023 H. pylori BCRC15415 O.D 540 O.

12 表 % 乳酸菌發酵液抑制 H. pylori 尿素酶活性之結果 Table 4. The inhibition urease activity of 12.5% lactic acid bacteria fermented liquor with H. pylori H. pylori BCRC17023 H. pylori BCRC15415 O.D 540 O.D 540 Strains 24hr 48hr 72hr 24hr 48hr 72hr Blank BCRC ** ** ** ** ** ** BCRC * * * * * B ** 0.48 ** * N.D B ** ** * * * ** B * ** ** N.D N.D : non detected * 乳酸菌發酵液在對幽門桿菌之尿素酶活性抑制具有顯著差異 (p<0.05) ** 乳酸菌發酵液在對幽門桿菌之尿素酶活性抑制結果高於 BCRC10791 (p<0.05) 表 5 乳酸菌對酸耐受性試驗(pH 2.5 and 3) Table 5. Analysis of acid tolerance (ph 2.5 and 3) for lactic acid bacteria strains ph3,3hr ph2.5,3hr Strain CFU/mL CFU/mL CFU/mL BCRC ± ± ±0.06 BCRC ± ± ±0.03 B ± ± ±0.05 B ± ± ±0.06 B ± ± ±0.14

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untitled 理類 CN9626 行 96 年 1 1 96 年 12 31 參行 97 年 2 28 1 行離 Lactic acid bacteria 金 Staphylococcus aureus 行離 159 API 50 CHL 行離 159 不度了行 H 2 O 2 1 Lactobacillus plantarum 了識益益來不利來益切了流 Joerger 2003