目录 一 出版书籍 1 出版书籍目录 2 教材封面 3 出版信息页 4 目录 5 精选内容 二 自编实验教材 1 自编实验教材目录 2 自编实验教材内容

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1 典型自编教材

2 目录 一 出版书籍 1 出版书籍目录 2 教材封面 3 出版信息页 4 目录 5 精选内容 二 自编实验教材 1 自编实验教材目录 2 自编实验教材内容

3 出版书籍目录 序号 教材名称编者出版单位出版时间课程名称 1 2 生物化学 ( 全国 十一五 规划教材 ) 生物化学学习指导 ( 全国 十一五 规划教材 ) 邱业先中国农业出版社 邱业先中国农业出版社 生物化学 ( 二 ) 生物化学 ( 一 ) ( 二 )

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80 自编实验教材目录 序号 实验教材 指导书名称编者实验课程名称 1 植物学 ( 形态解剖 ) 实验指导 王金虎钱玮 植物学 ( 一 ) 2 植物学 ( 系统分类 ) 实验指导 王金虎钱玮 植物学 ( 二 ) 3 人体解剖生理实验指导 秦粉菊 人体解剖生理学 4 普通遗传学实验指导 邵爱华叶亚新 遗传学 5 细胞生物学实验指导 姚雪梅 细胞生物学 6 生化技术实验指导 王桃云 生化技术 7 生化工程实验指导 陈佳佳 生化工程 8 微生物学实验指导 汪金莲金萍钱玮 微生物学实验 9 生物技术大实验 扶教龙等 生物技术大实验 生物学野外实习指导 ( 动物分册 ) 生物学野外实习指导 ( 植物分册 ) 12 普通生物学综合实验讲义 袁红霞 王金虎金琎 王金虎袁红霞金琎 生物学野外实习 生物学野外实习 普通生物学综合实验

81 植物学 ( 一 ) 实验指导 钱 玮王金虎 苏州科技学院化生学院

82 前言 植物学实验是学习植物学课程的重要组成部分, 是贯彻理论联系实际的重要手段 它不仅帮助学生加深理解 验证巩固和提高所学的知识, 而且通过实验, 使学生学习掌握实际工作所需要的基本技能, 培养学生独立思考, 分析问题和解决问题的能力 使学生养成严密的科学态度, 实事求是的工作作风和严肃认真的工作习惯 为学习其它课程和将来担任中学植物学教学打下扎实的基础, 为此特提出以下几点要求 : 一 做好实验前的准备工作 : 实验前必须认真阅读实验指导, 明确实验目的 内容和方法, 并准备好实验时所需物品, 如实验指导 植物学教科书 实验报告纸 2H 或 3H 硬铅笔一枝 小刀 橡皮 厘米尺等 二 认真进行实验 : 实验时必须遵照教师的指示切实遵守正确的操作方法, 按照规定的步骤, 踏实, 严肃认真, 一步一步地做 观察记录, 绘图要求实事求是 如遇困准, 可举手问教师 三 当堂完成实验报告 : 每次实验必须按照规定格式写实验报告, 实验报告必须凭自己观察所得, 要求真实正确, 独立完成 四 爱护实验室的一切设备和实验仪器, 切片 标本材料等, 如有损坏应主动向教师说明原因, 并填写报损报废单, 以便酌情处理 五 实验结束, 应清理自己的实验台, 把实验用具洗净擦干, 安放妥当. 方能离去 六 实验室必须保持安静, 不允许高声喧哗和谈笑, 每次实验结束应组织人员打扫, 保持实验室的清洁卫生 2

83 目录 实验一显微镜的使用方法和植物细胞 ( 一 )...1 实验二植物细胞 ( 二 )...8 实验三植物细胞 ( 三 )...10 实验四植物细胞的有丝分裂...12 实验五植物组织 ( 一 )...14 实验六植物组织 ( 二 )...16 实验七植物组织 ( 三 )...18 实验八种子结构和幼苗类型...20 实验九根的结构...22 实验十茎的结构 ( 一 )...25 实验十一茎的结构 ( 二 )...27 实验十二叶的结构...29 实验十三花 ( 一 )...31 实验十四花 ( 二 ) 果实...33 附 绘图的方法与步躁...36 附二徒手切片法...37 附三永久装片和永久切片的制作...38 附四几种主要显微组织化学反应及试剂配制...41 附五常用的固定液和离析液

84 实验一显微镜的使用方法和植物细胞 ( 一 ) 一 目的要求 : 1. 了解显微镜的使用方法和保养 2. 学习临时装片法 : 撕片法 3. 了解植物细胞的主要组成部分 二 仪器 药品 材料 : 仪器 : 显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 解剖针 刀片 吸水纸 培养皿材料 : 洋葱鳞茎 药品 : 碘 碘化钾溶液 8% 食盐溶液 中性红溶液三 实验内容 : ( 一 ) 显微镜的构造和使用方法 : 显微镜是一种精密仪器, 是研究生物科学不可缺少的工具, 对于一个将要从事生物学学习和研究的同志来说, 应该很好地掌握显微镜的结构和使用方法, 当然要熟练地使用它, 必须有一段实践过程, 但是 开始时就注意正确的使用方法, 将会帮助我们迅速地掌握它 显微镜的种类很多, 就大类说 : 有光学显微镜和电子显微镜 我们这里只介绍普通用的光学显微镜 ( 图 1-1) 一般光学显微镜可分为两大部分 : 光学部分和机械部分 光学部分是显微镜所以能放大物体的核心 ; 机械部分是用以装置光学部分, 使其更好地发挥作用 光学部分 : 1 物镜 : 又叫接物镜, 安装在镜筒的下端 利用入射光线造成被检物体的第一次象, 它关系着观察的正确与否, 所以是显微镜的心 脏 新式的物镜结构比较复杂, 它是由一系列复式透镜固定在金属筒内组成的 物镜下端的透镜叫做前透镜, 上端的透镜叫做后透镜, 前透镜越小, 放大率越高 物镜的种类很多, 我们实验用的显微镜装有三个物镜, 上面刻有放大的倍数 例如 :10x 40x 100X 就是放大 10 倍 40 倍 100 倍的意思 10 倍的物镜叫做低倍镜,20 倍的物镜叫中倍镜,40~65 倍的物镜叫高倍镜,90~100 倍的物叫油浸物镜, 简称油镜 有些物镜上标有表示物镜主要性能的参数, 例如在 10 倍物镜上标有 10/0.25 1

85 和 160/0.17, 这里的 10 是放大 10 倍,0.25 是镜口率, 也叫数字孔径,160 是镜筒长度, 单位是毫米,0.17 是所要求的盖玻片厚度, 单 位毫米 物镜放大倍数越高与标本的距离越近 2 目镜 : 又叫接目镜, 安装在镜筒的上端 目镜是一个金属的园筒, 上端装一块较小的透镜, 下端装有 块较大的透镜 它的作用 是把物镜放大了的实象进 步放大, 以便观察 目镜上也刻有放大的倍数, 例如 :5x 10x, 表示放大 5 倍,10 倍 根据需要可以更换使用 放大倍数较大的目镜, 它的镜头较短, 叫做高倍目镜 3 反光镜 : 是 个可以随意转动的镜子, 能把光线反射到聚光器里 反光镜有两面, 一面是平面镜, 一面是凹面镜 平面镜反光较弱, 在光线较强时使用 ; 凹面镜反光较强, 在光线较弱时使用 4 聚光器 : 在载物台下面的聚光器支架上 由聚光镜和虹彩光圈组成 聚光镜由一片到几片透镜组成, 它集中从下面反光镜投射来的光线射入镜筒中, 聚光镜的下方装有虹彩光圈, 可以缩少或放大, 借以调节光线的强弱 虹彩光圈下面有一个金属圈, 可以放置各式滤光片, 可以改变日光或灯光的色调和强弱 2

86 从上所述可知, 显微镜的放大过程基本是 : 光线从反光镜由下向上反射, 经聚光器集中的光线透过实验标本 ( 因此实验标本必须是透 明的 ) 经过物镜产生第一次放大的倒的实像, 再通过目镜中观察, 又经过一次放大, 因此我们眼睛所看到的最后的物像是放大的, 倒的虚像 倒置的虚像常常使初学者发生困难, 但经过一段时间的实践就会 习惯的 物镜和目镜配合所得的放大倍数, 一般是用物镜和目镜原有的放大倍数的乘积表示的, 例如目镜 10x 和物镜 8x 配合, 则放大 80 倍, 若目镜 10x 和物镜 40x 配合, 则放大 400 倍, 依次类推. 机械部分 : 1 镜座 : 显微镜的底部是一个沉重的 马蹄形的金属座, 叫做 镜座 镜座支持整个显微镜, 使其稳固地站立着 2 镜柱 : 从镜座向上直立的短柱叫镜柱 镜柱支持镜臀和载物台 3 倾斜关节 : 镜柱和镜臂交界处的一个活动关节, 它可使显微镜向后倾斜至 90 o 以内的任何角度, 便于观察 但一般不宜超过 40 o, 以免显微镜倾倒 4 镜臂 : 镜柱上端的弯曲部分叫做镜臂, 是用手握镜的地方 5 载物台 : 载物台呈方形或园形, 是放置玻片标本的地方 台的中央有一园孔, 以便光线从下方通过, 叫做通光孔 载物台上常装 有机械移动器或有一双压片夹, 一方面可固定标本, 同时也可利用上面的操纵纽使玻片标本前后左右移动, 便于观察标本的各个不同部位 6 镜筒 : 装在镜臂上端的一个金属园筒叫镜筒, 上端插装目镜, 下端与物镜联结 它的主要作用是用来保护象的光亮度, 并使目镜和物镜配合保持 定的距离 ( 一般是 160 或 170 毫米 ) 7 转换器 : 在镜筒的下端有一个能旋转的园盘叫转换器 转换器上有 2~4 个园孔, 用来安装不同的物镜 依靠转换器可以随意把需要的物镜调换到镜筒下面 8 调节轮 ( 器 ): 镜筒两旁有两对调节轮, 一大一小, 大的是粗调节轮, 小的是细调节轮, 都为调节镜筒的升降之用, 向外旋转时镜筒下降, 向内旋转时镜筒上升 粗调节轮转动一圈, 镜筒移动 10 毫米, 细调节轮转动一圈, 镜筒移动 0.1 毫米 有些显微镜的调节轮装在镜臂的下端, 转动时使载物台作上下移动 3

87 Ⅱ 显微镜的使用方法 1 低倍镜的使用方法 (1) 安放镜座 : 把显微镜放在实验桌上, 靠身体的前方, 略偏左, 镜座应距桌沿 6~7 厘米左右, 镜筒向前, 镜臀向后, 便于用左眼观察, 右眼绘图 (2) 低倍镜定位 : 先用大调节轮作顺时针方向转动, 使载物台稍微下降, 然后转动转换器, 使低倍镜与镜筒成一直线, 正对通光孔 (3) 对光 : 将聚光器转到最高点, 虹彩光圈完全开足, 然后用 左眼向目镜里看 并随手把反光镜转向光源, 使光线反射到镜筒, 这时明亮的圆形视野就出现在我们眼前 光线过强时要缩小光圈或用平面反光镜, 光线过弱时则用凹面反光镜, 如光源系自然光, 决不能用 直射的太阳光, 以免损伤眼晴 玻片标本和显微镜 (4) 放置装片 : 光对好后, 把制成的装片放在载物台上, 用压片压住 装片上的标本必须对准通光孔 (5) 对准焦点 : 逆时针方向转动大调节轮, 使载物台上升到物镜距离盖玻片 2 3 毫米为止, 然后用左眼朝目镜里看 ( 右眼也要睁开, 以便画图 ), 同时顺时针方向转动大调节轮, 让载物台馒慢下降, 直到对准焦点看到物像为止 如不清楚, 可用小调节轮来回转动调节, 使物象清晰 若因大调节轮转动太快, 致使超过焦点, 物象不能出现时, 则本 项目必须重新做起, 千万不要在眼睛注视目镜的同时逆时针旋转大调节轮, 以防物镜与载玻片相碰以致损坏 焦点对好后, 如果物象过偏, 可移动载玻片 镜中所成的象是倒 象, 故玻片移动方向跟物象移动的方向正好相反 2 高倍镜的使用方法 (1) 要使用高倍镜, 必须首先用低倍镜观察清楚, 并选择最适 合的标本移到视野的正中, 然后转动转换器, 让高倍镜正对通光孔 (2) 用左眼朝目镜里看, 观察的物象立即出现, 同时微微转动小调节轮, 直到物象清晰为止 (3) 如果用高倍物镜而光线不能充满整个孔口, 则应转动光圈和聚光器, 调整光量, 以获得最适合的光度 Ⅲ 使用显微镜时应注意的事项 1 取显微镜时, 用右手握镜臂, 左手托镜座, 不可斜提, 以免目镜从镜筒滑出 4

88 2 放显微镜时, 先让镜座前脚着落在桌子上, 然后把整个镜座放下, 动作要轻, 防止镜身受到振动 3 观察时, 显微镜不要随便移动位置, 不要斜放桌面 4 保持整齐清洁, 避免灰尘, 水汽沾污, 也不准用手指摸透镜, 以免汗液沾污, 擦镜头要用擦镜纸 5 观察临时装片时, 不要把显微镜向后倾斜, 避免水从盖玻片下流出, 把实验材料带走和沾污载物台 6 不要随便转动粗 细调节轮, 使用细调节轮时用力要轻, 转 动慢, 如果转不动, 不要强转, 以免磨损齿轮 显微镜上的零件不要拆下来, 以防损坏 7 玻片标本从载物台上取出时, 必须先降低载物台, 免得玻片 撞击物镜 8 升高载物台时, 一定要从旁注视物镜和玻片, 防止它们接触, 压碎盖玻片, 磨损透镜 9 显微镜用过后, 必须取出玻片标本, 用细软抹布把显微镜各部揩拭干净, 如透镜沾污, 就用擦镜纸擦干净, 再转动转换器让两个镜头偏于两旁, 以免物镜碰到聚光器, 最后锁入镜箱里 b 从洋葱上切取一片鳞叶, 在其内表皮 ( 凹面 ) 用刀片划成 5 毫 米大小的正方形刻痕, 再用镊子轻轻撕下这块表皮, 放在载玻片的水滴中, 表皮接触叶肉的一面必须向上, 并展平 c 用镊子夹取干净的盖玻片, 使盖玻片的一边接触水滴的边缘, 再慢慢地放下盖玻片, 避免产生气泡 d 染色为了使细胞的结构在显微镜下观察得更清楚, 可在盖玻片的一边加一滴的碘 碘化钾溶液, 在盖玻片的另一边用吸水纸吸 水, 使染色剂迅速扩散进去 也可在盖盖玻片以前加染色剂 e 盖玻片下的液体过多时, 材料和盖玻片容易浮动, 影响观察, 必须用吸水纸从侧面吸去一部分液体 如果液体不足, 容易产生气泡, 可以用滴管加一滴水在盖玻片的一边, 让水漫漫流入, 压出气泡 临时装片制好后, 便可放在显微镜下观察, 有表皮的地方应对准物镜中 5

89 央 (2) 观察细胞的基本结构 先在低倍镜下观察, 找到最典型的标本, 移至视野中央, 然后转高倍镜仔细观察以下内容 : a 细胞壁 : 每个细胞呈长的多边形, 细胞壁在细胞外侧是无色 透明的薄壁, 两个相邻细胞的侧壁紧密连接, 没有细胞间隙, 由于中胶层不易看到, 因此两个相邻细胞之间只看到一层壁 但应记住, 每个细胞具有自己本身的壁 细胞膜紧贴着细胞壁不易辨认 b 细胞质 : 在细胞壁里, 原为无色透明粘液, 经碘一碘化钾染色后呈淡黄色 在成熟细胞中紧贴细胞壁成一薄层 细胞质中具有许多小颗粒, 即各种细胞器或贮藏物质 c 细胞核 : 为无色透明更加粘稠的物质构成, 折光性强, 近似球形, 染色后呈黄褐色, 在成熟细胞中, 常常被液泡挤在贴壁的细胞质中 核内有 1 2 个核仁, 核与细胞质交界面为核膜, 其它为核质 有时候在细胞中看不到细胞质或细胞核, 这是由于剥取表皮时, 细胞被破坏, 细胞内的生活物质从细胞中流出去了 d 液泡 : 在细胞质里可以看到一个或几个水泡似的结构叫液泡 为了观察清楚可先撕取洋葱鳞叶表皮, 置于载玻片上, 并滴一滴中性红溶液, 静置 20 分针后在显微镜下再观察, 可见到染成红色的液泡分散成几个或联成 个中央大液泡 2 原生质体质壁分离和质膜的现察 : 另制一片洋葱表皮的临时装片, 在盖玻片的一侧加入一滴 8% 的食盐溶液, 在玻片另一侧用吸水纸将食盐溶液引入盖玻片下 当细胞 浸在食盐溶液中时, 因食盐溶液比液泡中的细胞液的浓度大, 因此水从细胞中往外流, 液泡体积缩小, 液泡周围的细胞质跟着收缩, 到一定程度时, 在显微镜下可看到细胞质和细胞壁发生分离称质壁分离 质壁分离是发生在质膜和细胞壁之间, 这时可看到薄而光滑的质膜包裹着细胞 质 在观察质壁分离的过程中, 可看到从壁上分离的细胞质和细胞壁之间先保留 有粘性的原生质丝, 它们先延长, 然后断开, 这就是部分的胞间联丝 它们常通 过纹孔, 牢固的与相邻细胞相连 如果重新用清水取代食盐溶液, 水分重新进入细胞, 液泡扩展, 质壁分离又 可复原 四 实验报告 : 绘几个典型的洋葱鳞叶表皮细胞, 并注明细胞的基本结构名称 6

90 五 思考题 : 1 植物细胞有哪些基本构造? 各有何生理功能? 2 什么叫质壁分离? 质壁分离能否复原? 为什么? 7

91 实验二植物细胞 ( 二 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 识别质体的形态 ( 二 ) 了解细胞间的相互连系 : 胞间连丝 纹孔 ( 三 ) 学习整体装片法 涂片法 二 仪器 材料 : 显微镜 盖玻片 载玻片 刀片 镊子 吸水纸 培养皿 黑藻 红辣椒 柿胚乳横切面永久切片三 实验内容 : ( 一 ) 叶绿体及原生质流动的观察 : 在实验前 分钟, 用镊子从新鲜的黑藻枝条上摘取幼嫩的小叶放到培养皿的水里, 水温最好保持 20 25oC, 然后放在向光的地方 实验时取黑藻的叶做成临时装片, 在显微镜下观察 每个细胞 内含有许多绿色的椭圆球形颗粒, 即叶绿体, 它们是植物进行光合作用的细胞器, 幼嫩的叶片观察叶绿体更有利, 然后在高倍镜下仔细观察, 可以看到含有许多叶绿体及微小颗粒的细胞质, 在细胞内明显地 向着 定的方向作有规则的运转, 这就是原生质流动 它可以促进细胞内的物质运转, 有利于代谢活动的进行 ( 二 ) 有色体和细胞壁上纹孔的观察 : 用刀片在新鲜的红辣椒果实表面切取一条长约 2 厘米, 宽 0.5 厘米的果肉, 平铺在硬质平面上, 用刀片将其果肉刮去, 直至果皮呈透明状的橘黄色 切取一小块做成临时装片在显微镜下观察 能看到一个个 形状不规则的细跑, 细胞中有淡灰色的细胞质和橙黄色的有色体, 细胞壁带黄色很厚, 壁上有小孔叫纹孔, 通过纹孔有许多原生质细丝, 即胞间联丝 它是细胞间物质和信息传递的主要通道 ( 三 ) 胞间连丝的观察 : 胞间连丝普遍存在于生活的植物细胞中, 但由于胞间连丝非常细小 ( 直径 0.02~0.2 微米 ), 在光学显微镜下很难看到, 需要经过特殊 的染色方法, 才能观察 取柿胚乳横切面永久切片在低倍镜下进行观察, 可以看到柿胚乳组织是由许多厚 壁 细胞组成 这些细胞壁非常厚, 约占细胞直径的一 8

92 半 其加厚壁主要由半纤维组成, 是一种贮藏物质 中央是原生质体, 它已被染成蓝黑色 有些细胞的原生质体在制片过程中脱落, 只剩下 细胞壁和中央的空腔 选择细胞切面整齐的部分 ( 有些部分的细胞排列不整齐而被切歪, 这些切面不易看清细胞壁上的胞间连丝 ) 移到视野的中央, 转换高倍镜仔细观察, 在厚厚的细胞壁上的平行细丝即为 胞间连丝 四 实验报告 : 1 绘几个红辣椒表皮细胞, 示有色体和单纹孔 2 绘几个柿胚乳细胞示胞间连丝 五 思考题 : 1 原生质流动对细胞的生命活动有什么作用? 2 有色体在植物体中有何作用? 9

93 实验三植物细胞 ( 三 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 了解细胞内重要的贮藏物质 : 淀粉粒 脂肪 蛋白质 结 晶体的形态及其简单的鉴别方法 ( 二 ) 学习徒手切片法 二 仪器 材料 药品 : 显微镜 盖玻片 载玻片 刀片 镊子 吸水纸 培养皿土豆 蓖麻种子 紫茉莉 碘一碘化钾溶液 苏丹 Ⅲ 溶液 三 实验内容 : ( 一 ) 马铃薯块茎中淀粉粒的观察 : 用解剖针从马铃薯块茎切面的表皮下取 滴混浊的液汁, 放在载 玻片上的水滴中, 盖上盖玻片, 放到显微镜下观察 可见到大小不同的颗粒即淀粉粒, 选择典型的大的淀粉粒在高倍镜下观察 淀粉粒为无色的固体颗粒, 大多数马铃薯淀粉粒具有明暗交替的 轮纹, 这些轮纹在淀粉粒的一边比另一边宽, 形成偏心的结构 马铃薯具有三种类型的淀粉粒 1 单粒淀粉只有一个脐点的淀粉粒, 常较大 2 复粒淀粉每个淀粉粒具有两个以上的脐点围绕每个脐点分别积累淀粉层, 常较小 3 半复粒淀粉有两个以上脐点, 除围绕每个脐点的淀粉层外, 还有包围几个脐点的共同淀粉层积累, 常较小 为了证明颗粒是由淀粉组成, 可进行淀粉和碘的特异反应, 从盖玻片旁引进碘 碘化钾溶液, 可看到淀粉逐渐由无色变成兰色 ( 二 ) 蓖麻胚乳贮藏蛋白质和脂肪的观察 : 把蓖麻种子的胚乳切成薄片, 用碘 碘化钾染色可见细胞中许多染成金黄色的颗粒, 这就是储藏的蛋白质定型结晶称糊粉粒 蛋白质与碘一碘化钾作用成黄色是蛋白质定性的特异反映 蓖麻胚乳的徒手切片, 用苏丹 Ⅲ 染色, 然后轻压盖玻片, 可见染成红色的油滴 苏丹 Ⅲ 与脂肪类物作用成为红色, 是脂肪类物质的一种定性侧定 10

94 ( 三 ) 紫茉莉茎中薄壁细胞内结晶的观察 取紫茉莉茎做成徒手切片 ( 横切 ) 可看到在髓部和皮层薄壁细胞 的某些细胞中有针形的结晶, 这就是针晶四 实验报告 :1 绘出马铃薯的三种不同类型的淀粉粒 2 绘几个紫茉莉茎髓部薄壁细胞, 注明结晶体 五 思考题 : 1 用什么方法鉴别植物体中含有淀粉 脂肪和贮藏蛋白质? 11

95 实验四植物细胞的有丝分裂 一 目的要求 : 了解植物细胞有丝分裂各期特征 二 仪器 药品 材料 : 显微镜 载玻片 盖玻片 刀片 镊子洋葱根尖纵切片 醋酸洋红溶液 盐酸酒精溶液 三 实验内容 : ( 一 ) 洋葱根尖顶端分生组织的有丝分裂 取洋葱根尖纵切片观察有丝分裂各个时期 ( 在根尖分生区部分 ) 的图象 1 分裂间期 : 细胞等径, 细胞核内除核仁外, 核质均 2 前期 : 开始时核质中出现较小的染色质颗粒, 或逐渐增多形成棒状染色体, 最后核膜 核仁消失 3 中期 : 染色体排列在细胞的中部, 常成弯曲的形状, 细胞中 出现明显的纺锤体 4 后期 : 每个染色体纵裂为二, 两组子染色体分别向细胞两极移动 5 末期 : 染色体移向两极后, 重新分散成小的染色体颗粒 子核出现, 在赤道面中央出现成膜体或细胞板, 并向周围扩展, 形成新的细胞壁, 两个子细胞便形成了 ( 二 ) 用新鲜的洋葱根尖制作有丝分裂的压片, 其过程如下 : 1 洋葱鳞茎或大蒜鳞茎一个, 放在盛水的玻璃杯上, 水的高度以接触洋葱底部为宜, 然后放到温暖的地方, 三 四天后便长出白根 2 在上午十时到下午四时前, 剪取长约 3 毫米的根尖, 放在盐酸酒精溶液中 ( 浓盐酸 1 份与 95% 酒精 1 份 ) 解离 使材料软化, 便于压平 气温越高, 解离时间越短 在 25oc 左右时, 解离 3 分钟便可 解离后用清水冲洗 5 分钟 3 染色 : 将解离后的根尖移到干净的载玻片上, 加一滴醋酸洋红 (40% 醋酸 100 毫升煮沸加入 1 克洋红, 搅拌再煮, 冷却后过滤 ), 也可用稀释的紫药水代替, 然后用小刀把根尖压平, 使细胞分散, 盖上盖玻片, 便可在显微镜下观察, 找到正方形的细胞后再调换高倍镜 12

96 详细观察, 找出相当于分裂前期 中期 后期 未期的图象 ( 四 ) 实验报告 : 绘出洋葱根尖细胞有丝分裂各个时期的简图, 并注明各部分名称 ( 五 ) 思考题 : 1 观察细胞的有丝分裂, 应到根的哪一部分去找? 2 如何识别处于静止期和分裂期的细胞? 3 通过观察, 说明植物细胞有丝分裂各时期的特征 13

97 实验五植物组织 ( 一 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 了解薄壁组织 保护组织的形态 结构特征及其与功能的关 系 ( 二 ) 掌握徒手切片法 撕片法 二 仪器 材料 : 片 显微镜 盖玻片 载玻片 刀片 镊子 培养皿大叶黄杨嫩茎 新鲜的蚕豆叶 椴木 2-3 年生枝条横切面永久切 三 实验内容 : ( 一 ) 薄壁组织观察大叶黄杨嫩茎的薄壁组织 : 在大叶黄杨嫩茎的表皮内有多层 薄壁组织细胞, 这些细胞的体积比其它细胞大, 细胞壁薄, 并有发达的细胞间隙 由于新鲜材料中细胞间隙内充满空气, 因此在显微镜下观察时, 常呈黑色 这些细胞一般为等直径多面体 由于徒手切片较 厚, 在切片上可以看到这些细胞的立体形状 在嫩茎髓部的细胞也具有薄壁组织的特征, 属于贮藏薄壁组织 ( 二 ) 保护组织 : 1 观察蚕豆叶表皮的保护组织 : 撕下蚕豆叶的下表皮一小块, 制成临时装片, 在显微镜下观察, 可以看到叶表皮细胞形态不规则, 彼此紧密的嵌合 在表皮细胞间散布着许多气孔, 气孔是植物体与外 界进行气体交换的门户, 也是水分蒸腾的主要通路 气孔由两个肾形的保卫细胞围合而成, 保卫细胞的细胞壁在近气孔的一边较厚, 而相对一边的壁较薄, 当保卫细胞充水膨大时, 向表皮细胞的一方弯曲, 将气孔分离部分的细胞壁拉开, 促使气孔张开 保卫细胞的原生质体与表皮细胞不同, 它们有丰富的细胞质, 明显的核, 并有叶绿体, 在不断变化的外界条件下, 保卫细胞能通过自己的生理活动, 对气孔的 开闭起一定的调节作用, 从而保证了光合作用的进行和防止体内水分的过度散失 2 观察椴木 2-3 年生枝条周皮的保护组织 : 根和茎由于次生生 长的结果使表皮失去作用, 代替表皮作用的是新产生的保护组织 周皮, 它是由次生分生组织 木栓形成层进行平周分裂, 向外分化 14

98 成木栓层, 向内分化成栓内层, 属于次生保护组织 从显微镜下观察椴木茎的永久切片, 可以看到从表皮向内有木栓层 木栓形成层和栓 内层, 这些细胞都是扁平的 木栓层由数层细胞壁栓化的死细胞构成, 在横切面上排列整齐, 细胞壁较厚, 并栓质化, 染色较深, 径向壁被挤得弯曲 栓内层由一层生活的薄壁细胞组成 在周皮上还有皮孔与外界相通, 用肉眼观察枝条时, 皮孔为一个小点 皮孔是周皮的一部分, 这个部位的木栓形成层细胞比它两侧的细胞更为活跃, 细胞分裂快而多 这些木栓细胞呈圆形, 细胞间隙大 最初形成的皮孔出现在气孔的下方, 由于这些木栓细胞形成得多, 向外挤压, 使其外面的木栓层和表皮破裂, 形成皮孔 皮孔为喇叭口状, 这些木栓细胞成为 补充细胞 四 实验报告 : 1 绘图记录薄壁组织的组织特征 2 绘图记录叶表皮保护组织的组织特征 15

99 实验六植物组织 ( 二 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 了解机械组织 分泌结构的形态 结构特征及其与功能的关 系 ( 二 ) 掌握徒手切片法 二 仪器 材料 : 显微镜 盖玻片 载玻片 刀片 镊子 培养皿芹菜叶柄 梨果实 桔皮间苯三酚 三 实验内容 : ( 一 ) 机械组织 : 1 厚角组织 : 细胞具有不均匀增厚的出生壁 切取一段芹菜叶 柄, 做徒手切片, 在显微镜下观察, 在叶柄脊状突起的棱处的表皮下可以看到具有折光很强的 小星体 结构, 这就是厚角组织, 小星体 便是几个相邻细胞角隅处不均匀增厚的部分, 较暗的部分便是细 胞腔, 厚角组织分布不连续 2 厚壁组织 : 细胞具有均匀增厚次生壁 从梨果肉或梨心周围取颗粒状的黄褐色硬粒 石细胞群, 置于载玻片的水滴中, 用镊子 的柄将硬粒压碎, 使分布均匀, 做成临时装片 在显微镜下进行观察 每个石细胞近乎等径, 细胞壁上有圆形的单纹孔, 因细胞壁均匀增厚, 呈现出明晰的放射状纹孔道, 有的纹孔道常汇合成分枝状, 形 成分枝纹孔道 细胞腔小, 没有原生质体 用间苯三酚染色, 石细胞壁染成红色, 说明细胞壁木质化 ( 二 ) 分泌结构 : 观察桔果皮内的分泌腔 : 取用水浸泡过的桔果皮, 可以看到黄色透明小点, 这就是溶生方式形成的分泌腔 作徒手切片, 在显微镜下观察, 可看到在溶生腔中有分泌细胞破裂后释放的分泌物质, 周围有 部分损坏的分泌细胞 四 实验报告 : 1 绘几个芹菜叶柄皮层厚角组织细胞, 并注明名称 3 绘出 1~2 个梨的石细胞图, 注明各部分结构名称 16

100 鉴定? 五 思考题 : 1 厚角组织和厚壁组织在形态上 化学性质上有什么区别? 如何 17

101 实验七植物组织 ( 三 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 了解输导组织结构特征 ( 二 ) 学习木材离析法 二 仪器 材料 药品 : 显微镜 盖玻片 载玻片 镊子 广玉兰 银杏木材离析材料, 南瓜茎纵切 横切永久切片铬酸 硝酸 碘一氯化锌 间苯三酚三 实验内容 : ( 一 ) 观察木质部中输导组织的形态结构研究植物组织形态结构特征, 方面可以将植物体的某一部分做成纵切片 横切片进行观察, 另一方面也可用特殊方法从植物体中分 离出来加以研究 前者对于了解某一组织在植物体中的位置以及它与其它组织的关系是必要的, 而后者, 对组成该组织的细胞特征的研究则较为清楚 下面用组织离析的方法来观察木质部中的输导组织 取广玉兰和银杏枝条切成小段, 分别放入盛有铬酸 硝酸植物组织分离液中 (10% 铬酸 +10% 硝酸, 各一份配成 ) 放入 30~40oC 的温箱内 2~3 天后取出, 用清水冲洗数次, 除去酸液进行镜检 取少许 上述材料分别做成临时装片, 在显微镜下观察, 区别广玉兰和银杏木材, 并仔细研究导管分子 管胞 纤维 木薄壁细胞的结构特征 纤维 : 细胞呈长梭形, 两端尖, 细胞壁厚, 上面有狭小的纹孔, 细胞腔内无内含物 导管分子 : 细胞两端具穿孔, 细胞壁有螺纹 梯纹 网纹或孔纹的增厚, 细胞一般较粗, 细胞腔内无内含物 主要存在于被子植物中 管胞 : 细胞两端不具穿孔, 顶端较窄, 其它特征与导管分子相似 主要存在于裸子植物和蕨类植物中 木薄壁细胞 : 细胞呈长方柱形, 细胞壁较薄, 细胞腔内有内含物 为了鉴别纤维和管胞 导管等细胞壁的化学材料, 可用滤纸在切片一侧吸干水分, 在另 侧滴一 二滴碘一氯化锌溶液, 经短时间后, 纤维的细胞壁会呈现特有的兰紫色反应 ( 二 ) 观察韧皮部中输导组织的形态结构取南瓜茎横切面和纵切面的永久切片, 用肉眼可看到茎的横切面 18

102 呈五边形, 中央有一个五星状的气室, 横切面上有十个维管束, 其中五个较大, 分布在气室旁边 ; 五个较小, 与它们交错排列分布在靠近 茎的表面 南瓜茎中输导组织集合成维管束 观察用间苯三酚染过色的横切面, 可看到维管束中间部分有 4 个大而较宽的红色环, 这便是被横切断的木质化的导管, 在大导管旁靠 近气孔的一侧具有一些直径较小的导管, 导管间分布着一些薄壁组织细胞和厚壁的纤维, 这部分就是木质部 在木质部的分侧和内侧, 有两堆细胞排列紧密, 但不整齐, 细胞 大小也不一致的薄壁细胞成分, 这便是韧皮部 ( 南瓜为双韧维管束 ), 其中口径较大的多角形细胞为筛管, 它的旁边有小的伴胞, 也有其它薄壁细胞, 有些筛管可以看到筛扳 在本质部及外侧的韧皮部之间有几层排列整齐, 而成径向排列的薄壁细胞, 这便是形成层 在用间苯三酚染色的纵切片上, 有染成红色的弹簧状结构, 这便 是螺纹导管, 另外还可见到环纹, 孔纹 网纹导管, 以孔纹导管的口径为最大, 导管无细胞内含物 纵切片在高倍镜下仔细观察, 可找到筛管和伴胞 在韧皮部中筛 管口径较其它细胞为大, 伴管分子呈长管状, 上下分子之间有筛板相隔 间苯三酚染色后的片子中, 筛板呈浅黄色, 上有较大的孔一 筛孔, 在筛管旁有时可看到紧贴着一列较小的伴胞 四 实验报告 : 1 绘图记录导管分子 管胞 纤维的结构图, 并注明名称 2 绘几个南瓜茎横切面韧皮部细胞示筛管 ( 筛板 ) 和伴胞, 注 明各部分名称 五 思考题 : 1 导管和筛管在形态构造上有何区别? 在显微镜下如何区别? 19

103 实验八种子结构和幼苗类型 一 目的要求 : 了解种子的形态, 构造及幼苗的类型 二 仪器 材料 药品 : 显微镜 放大镜 刀片 解剖针 镊子蚕豆 蓖麻 小麦种子 小麦籽粒纵切永久切片 大豆及蚕豆 小麦幼苗碘 碘化钾溶液三 实验内容 : ( 一 ) 种子的类型和构造 : 根据种子内部是否有胚乳, 种子可分成有胚乳种子和无胚乳种子两类 1 有胚乳种子的构造 : (1) 蓖麻种子的构造 : 识别出它的种阜 种脊, 用刀片沿种脊把种子纵切, 可以看到外种皮硬而厚, 外种皮内方有一层白色薄膜即内 种皮, 内种皮以内大部分为乳白色胚乳, 胚乳中间有两条线状物即两片子叶, 子叶基部联合的部分是胚芽 胚轴 胚根 另取一粒蓖麻种子, 剥去外种皮, 用刀片在中央沿与子叶平行的方向, 把两片子叶分 开, 注意子叶的形状及其上面的脉纹形状 (2) 小麦种子的构造 : 1 用刀片将小麦种子沿腹沟纵切, 然后滴一滴碘一 碘化钾溶 液, 可见大部分染成兰色, 这是含淀粉粒的胚乳, 在下端角上不呈兰色的部分是胚 2 取小麦种子纵切永久切片在低倍镜下仔细观察以下各部分 : 果皮和种皮 : 两者结合紧密, 形成籽粒的外皮, 不易区别 胚乳 : 位于种皮之内 在胚乳的上方, 最外一层细胞颇大, 长方形, 含蛋白质 ( 糊粉粒 ) 叫糊粉层, 其内为薄壁细胞, 内储淀粉粒 上皮细胞 : 在胚与胚乳相接处有一层排列整齐的细胞叫上皮细胞 在胚生长过程中, 通过该层细胞吸收胚乳内的养料供胚生长 胚 : 位于胚乳的下面 包括以下几个部分 : 子叶 : 一枚呈盾形, 又叫盾片, 与胚乳贴在一起 胚芽 : 位于胚的上端, 其外有胚芽鞘包围 20

104 胚根 : 位于胚的下端, 外有胚根鞘包围 胚轴 : 位于胚芽与胚根之间的部分 外胚叶 : 位于胚的外侧, 为退化器官, 呈一小突起 2 无胚乳种子取蚕豆种子一粒, 识别出种皮上的种脐 种孔 剥去种皮, 里面两片肥大的部分即子叶 沿 侧将两片子叶分开, 连接两片子叶的地方即胚轴 胚根和胚芽在胚轴的两端, 胚根朝向种孔, 胚芽在另 端 ( 二 ) 幼苗的类型 : 不同种类的植物种子, 萌发形成幼苗时, 由于胚的各部分, 特别是胚轴部分的生长方式和速度不一样, 因此形成的幼苗在形态上也不 样 常见的植物幼苗可分为两种类型, 即子叶出土的幼苗 ( 如黄豆 棉花等 ) 和子叶不出土的幼苗 ( 如蚕豆 玉米 小麦等 ) 将蚕豆 黄豆 玉米 小麦 棉花种子 ( 用水浸泡一天后, 放在 湿润的培养皿内 ), 在适宜的温度下观察其萌发过程, 注意种子每天变化的情况, 哪 部分首先突破种皮? 哪一部分首先伸长? 最先伸出土面的是什么? 四 : 实验报告 : 1 绘出蚕豆 蓖麻种子的外形和解剖结构图, 并注明各部分名称 2 绘出小麦籽粒的解剖结构图, 并注明各部分名称 21

105 实验九根的结构 一 目的要求 : 1 观察了解各类根的初生 次生构造 2 了解根的增粗生长 二 仪器 材料 : 显微镜 小麦根 蚕豆根 刺槐根以及棉花老根的横切片三 实验内容 : ( 一 ) 双子叶植物根的初生结构 : 根的初生结构, 可以在根的成熟区 ( 根毛区 ) 的横切面上看到 取蚕豆根根毛区横切面永久切片, 在显微镜下观察内部结构 1 表皮 : 根的最外层细胞, 由一层排列紧密的薄壁细胞组成, 细胞近似长方柱形, 角质层薄, 不具气孔, 一部分表皮细胞的外壁延伸成根毛, 这些特征和它的保护 吸收 固着等作用有关 2 皮层 : 由表皮以内的多层薄壁细胞组成, 细胞排列疏松 紧贴 表皮的一层细胞排列紧密, 称外皮层 皮层的最内一层细胞排列也很紧密, 称内皮层 内皮层细胞的侧壁和上 下横壁具有木栓化的带状增厚, 称为凯氏带 3 维管柱 : 内皮层以内的部分, 结构比较复杂, 包括以下几部分 : 1 中柱鞘 : 由一层薄壁细胞构成, 向外紧贴内皮层, 向内紧邻于 初生木质部的外方 中柱鞘细胞可以恢复分生能力, 在有些切片中可看到个别细胞已分裂成内外两个, 侧根就从这里产生 2 初生木质部 : 在根的横切面上, 整个初生木质部的轮廓呈幅射 状 蚕豆的幅射状木质部常具有四个或五个棱角, 即木质部脊 观察木质部脊的尖端, 可以看到它们是由最小的导管所组成, 即原生木质部 原生木质部以内有较大的导管分布在近中心的部分称为后生木质 部 3 初生韧皮部 : 位于木质部脊之间, 即与木质部脊相间排列, 由筛管和伴胞等组成 蚕豆根的韧皮部外侧可以看到厚壁纤维, 这是豆 科植物根的特点 4 薄壁组织 : 介于初生木质部和初生韧皮部之间 22

106 ( 二 ) 单子叶植物根的构造 : 单子叶植物的根始终保持初生结钩, 它们的解剖结钩, 同样可分 为表皮 皮层 维管柱三部分, 但各部分构造都有特点, 现以小麦 ( 或水稻 玉米 ) 的根为例, 认识以下各部分 : 1 表皮 : 由 1~2 层薄壁细胞组成, 一般寿命较短, 当根毛枯死 后, 往往解体脱落 2 皮层 : 也可分为三部分, 外皮层由 2~3 层细胞组成 玉米根的外皮层是厚壁组织, 有机械支持作用, 水稻根的外皮层有一层厚壁 细胞, 非常确显 水稻幼根的皮层为多层细胞组成, 而较老根的皮层, 有明显的气腔, 它是由几列皮层簿壁细胞解体而成的腔道 根茎 叶的气腔互相 贯通形成良好的通气系统, 叶片进行光合作用所释放的氧气, 可以通过气腔进入根部, 供根部呼吸所需要, 所以水稻能在水中生活 内皮层细胞五面增厚, 只有外切向壁是薄的, 在横切面上, 增厚 的部分呈马蹄形, 内皮层中也有少数细胞壁不增厚的细胞, 即通道细胞 3 维管柱 : 中柱鞘是一层薄壁细胞, 也是侧根发生之处, 木质 部辐射角, 水稻 6 10 个, 小麦 7 11 个, 玉米 12 个, 韧皮部和木质部相间排列 在小麦的中央为后生木质部所占据 ( 三 ) 侧根形成的观察 : 侧根的发生是中柱鞘一定部位的细胞进行不断地切向和径向分裂形成一团新的细胞, 即侧根原基, 侧根原基逐渐分化为生长点和根冠, 生长点细胞进一步分裂 生长 分化, 于是穿过主根的皮层 表 皮层, 伸入土中 侧根的维管束与母根相连 取刺槐根横切示侧根起源永久切片在显微镜下进行观察 ( 四 ) 根的次生构造 : 取棉花次生根横切面切片, 在显微镜下进行 观察 : 1 周皮 : 在根的最外围, 由几种排列整齐的矩形细胞组成, 它包括木栓层 木栓形成层 栓内层 周皮是次生保护组织 2 韧皮部 : 在周皮以内, 包括初生韧皮部和次生韧皮部, 初生韧皮部常常被内部组织的生长而挤压破坏, 所以主要是次生韧皮部 棉根次生韧皮部中有许多厚壁细胞, 另有筛管和薄壁细胞 3 维管形成层 : 由几层长方形的薄壁细胞组成, 排列较整齐, 呈一园环, 包围在木质部的外面 形成层向内的衍生细胞分化成次生木质部 23

107 向外的衍生细胞分化成次生韧皮部 4 木质部 : 在维管形成层以内, 包括初生本质部和次生木质部 初生木质部范围小, 在近中心部分导管较小 ; 次生木质部有大量大的导管存在, 占木质部的主要部分 5 髓 : 在根的中心, 由薄壁细胞组成 四 实验报告 : 1 绘蚕豆幼根的横切面简图以及一部分详图, 并注明各部分名 称 2 绘出棉花次生根横切面一部分详图, 并注明各部分名称 五 思考题 : 单子叶植物的根与双子叶植物的根在构造上有何不同? 列表进行比较 24

108 实验十茎的结构 ( 一 ) 一 目的要求 : ( 一 ) 了解茎尖的构造和茎伸长的关系 ( 二 ) 了解茎的初生结构 二 仪器 材料 药品 : 显微镜 载玻片 盖玻片 刀片 镊子 培养皿 黄杨叶芽纵切永久切片 向日葵或棉花茎横切面永久切片 大叶黄杨幼茎间苯三酚盐酸溶液 三 实验内容 : ( 一 ) 茎尖的构造 : 取黄杨叶芽的纵切片在显微镜下观察, 可见茎尖和根尖一样可分为分 生区 伸长区 成熟区, 但无类似根冠的结构 分生区位于茎尖顶端, 一般为半球形, 具强烈的分裂能力, 故称生长锥 仔细观察茎尖分生组织的结构位于生长锥最表面的一层或几层细胞, 排列整齐紧密, 称 为原套, 包围原套之内的是一团排列不规则的细胞群, 称为原体, 靠近生长锥下面的一些突起是叶的原始体, 叫叶原基, 愈靠下的叶原基愈长, 逐渐发育成幼叶, 在幼叶腋内的突起称叶芽原基, 它将来发展 成侧枝, 故又称侧枝原基, 从叶芽纵切面上, 可以清楚地看出, 它是枝条的雏形 ( 二 ) 茎的初生结构 : 取大叶黄杨幼茎一段, 做徒手切片, 用间苯三酚染色, 然后在显微镜下从外向内逐次加以观察 1 表皮 : 位于茎的最外层, 是幼茎的保护组织, 常由单层细胞 组成, 细胞长方柱形, 长径与茎的长轴 ( 纵轴 ) 平行, 排列紧密, 外切向壁略有加厚, 并复有角质层, 有助于保护作用 2 皮层 : 茎的皮层一般不及根的皮层发达, 但结构要比根的复 杂, 皮层的外部, 即靠近表皮的部分, 细胞角隅部分特别加厚, 称为厚角组织 它们在皮层的外部连接排成 环或分散成束, 尤其是茎的棱角部分更为发达, 主要功能是支持作用 厚角组织以内为排列疏松 的薄壁细胞, 占皮层的大部分, 厚角组织和靠近外方的薄壁细胞具有叶绿体, 因此幼茎常呈绿色 蚕豆茎中最内一层皮层细胞, 就是一层 25

109 薄壁细胞, 无特殊构造, 但细胞内含有大量的淀粉粒, 易被碘 碘化钾溶液染成兰色, 故称淀粉鞘 3 维管柱 : 是皮层以内的部分, 包括维管束 髓 髓射线等部分 多数的茎与根不同, 无明显的内皮层, 也不存在中柱鞘, 故皮层与维管柱没有明显地分界 初生维管束 : 包括初生木质部和初生韧皮部, 以及在木质部和韧皮部之间的形成层 一部分植物, 初生维管束始终成束状, 各束分立, 排列成轮状, 轮廓非常明显, 例如向日葵 棉花和多数木本植物幼茎 横切面上, 初生维管束在发展过程中连成园筒, 只有在初形成的部分可以看到束的轮廓, 但初生木质部为内始式, 原生本质部在内, 后生木质部在外 ( 比较茎的初生维管束组织与根的初生维管束组织在结构 上有何区别 ) 髓居茎的中心, 一般是薄壁组织, 也常具厚壁细胞 髓射线也叫初生射线, 在维管束之间 内连髓部, 外通皮层 在 维管束成束分立的种类如向日葵等, 髓射线更为明显, 髓射线一方面有横向运输作用, 方面与髓部细胞同为茎的贮藏组织 四 实验报告 : ( 一 ) 绘简图记录茎尖的解剖构造, 注明各部分名称 ( 二 ) 绘双子叶植物幼茎的横切面简图以及部分详图, 并注明各部分名称 五 思考题 : 双子叶植物根和茎的初生构造有何异同? 26

110 实验十一茎的结构 ( 二 ) 一 目的要求 : 1 了解单子叶禾本科植物茎的结构 2 了解茎的次生构造 3 识别木材三切面切片 二 仪器 材料 : 显微镜 载玻片 盖玻片 刀片小麦茎 玉米茎 椴树茎 松木材三切面等切片三 实验内容 : ( 一 ) 单子叶植物茎的构造 : 1 小麦茎的内部构造 : (1) 表皮 : 由一层细胞组成, 具有气孔 (2) 下皮层 : 在表皮内方, 由几层厚壁细胞组成 有的下皮层连成环 ( 如水稻 玉米 ), 但小麦茎的下皮层为绿色薄壁组织所隔开, 下皮层的发育与抗倒伏有关 (3) 基本组织 : 下皮层以内是基本组织, 其细胞内含有叶绿体, 故表面为绿色, 具光合作用能力 (4) 维管束 : 小麦 水稻维管束排列成内, 外两轮, 外轮的维管 束较小, 位于茎的边缘, 大部分埋藏在下皮机械组织中 ; 内轮的维管束较大, 周围为基本组织所包围, 节间中空形成髓腔, 每一个维管束由韧皮部和木质部组成 没有形成层, 这是禾本科植物的茎和双子叶 植物茎的主要不同之处 木质部呈 V 形,V 形尖端为最先成熟的部分, 即原生木质部, 包括几个环纹导管和螺纹导管以及少量薄壁组织, 在成熟过程中, 这些导管大多被破坏, 形成一个比较大的空腔 ;V 字张 开 端为后来成熟的部分, 即后生木质部, 包括两个很大的孔纹导管和少数管胞 本质部的外方为韧皮部, 由若干筛管和伴胞组成, 在木质部和韧皮部的外围有机械组织包围着, 构成维管束鞘 2 玉米茎的构造 : 玉米茎的维管束结构与小麦相似, 区别在于玉米茎的薄壁组织中分散着许多维管束, 排列不规则, 靠近边缘的维管束小而密集, 愈向 中心愈大, 也较稀疏, 茎不中空 ( 二 ) 多年生木本植物茎的次生构造 : 27

111 在显微镜下观察三年生椴树茎的横切面, 可以看到四个基本组成部分 : 1 树皮 : 包括表皮 周皮 ( 周皮由木栓层 木栓形成层 栓内层 ) 皮层厚角组织及薄壁组织 韧皮部的韧皮纤维 韧皮部薄壁组织 筛管及伴胞 韧皮射线等 次生韧皮部中韧皮纤维与其它分子分层交替排列, 有些韧皮射线或髓射线细胞径向分裂和扩展, 使射线呈喇叭形扩展 2 形成层 : 在木质部和韧皮部之间 细胞壁薄, 细胞呈径向压 扁的长矩形 3 木质部 : 其中有导管 管胞 薄壁细胞及木纤维 木射线等 4 髓部 : 大部分为薄壁细胞, 髓的最外层细胞较小称环髓带 5 髓射线 : 是呈径向排列的薄壁细胞, 从髓通向皮层 在三 四年生的枝条上可以清晰地看到木质部呈现同心环带的年轮, 秋天形成的木质部分子, 细胞较小, 壁较厚 ; 春天形成的部分, 细胞较大, 壁较薄 ( 三 ) 观察松木三切面 : 为了充分了解茎的构造, 必须从三种切面作比较观察, 所谓三种 切面即横切面 切向切面和径向切面 ( 参阅教科 P130 P131, 图 3 74) 请认真观察仔细分清楚并进行比较 四 实验报告 : 1 绘玉米横切面简图以及其中一个维管束详图 2 绘椴树茎横切面部分详图 3 如何区别木材三切面切片的三个切面? 五 思考题 : 1 草本双子叶植物茎和单子叶植物茎有何区别? 2 木本植物茎是如何加粗的? 28

112 实验十二叶的结构 一 实验目的 : ( 一 ) 了解双子叶植物叶的构造及其与生理功能的关系 ( 二 ) 了解禾本科叶片和松属针叶的构造特点 二 仪器 材料 : 显微镜 女贞叶 松属针叶 小麦叶横切面永久切片三 实验内容 : ( 一 ) 观察女贞叶横切面和小麦叶横切面 : 在女贞叶横切面中可以看到叶片的主要结构包括表皮 叶肉 叶脉三部分 1 表皮 : 在横切面中, 表皮为一层排列较整齐的矩形细胞, 气 孔分布在下表皮较多, 上表皮较少 上表皮细胞的外面有较明显的角质层, 以减少水分的蒸腾 小麦叶片表皮在两个维管束之间有几个大型薄壁细胞, 称泡状细 胞 在横切片中, 呈扇形排列, 当叶片水分减少时, 泡状细胞便收缩, 使叶片卷曲, 以减少蒸腾面积 2 叶肉 : 叶肉是上 下表皮之间的绿色组织的总称, 是叶进行 光合作用的主要部分 细胞内含有丰富的叶绿体 女贞叶的叶肉细胞有栅栏组织和海绵组织之分, 栅栏组织靠近上表皮, 是长柱形薄壁细胞, 其长轴与上表皮垂直, 在栅栏组织内有溶 生的腺腔, 在栅栏组织细胞内的叶绿体的分布常取决于外界条件, 特别是光照程度 在强光下叶绿体贴近细胞的侧壁, 减少受光面积, 避免过度发热 ; 在弱光下, 叶绿体分散在细胞质内, 充分利用散射的光 能 海绵组织位于栅栏组织与下表皮之间, 细胞形状不规则, 排列较疏松, 细胞间隙大, 在气孔内方形成较大的气室, 保证了叶肉的气体交换 这种叶肉细胞有栅栏组织和海绵组织之分的叶称异面叶 大多数双子叶植物的叶都属异面叶 小麦的叶肉细胞没有栅栏组织与海绵组织之分, 叶肉细胞都为同 形皱褶的薄壁细胞, 含叶绿体很多, 这种叶称为等面叶 3 叶脉 : 叶脉的内部构造随叶脉大小而不同 女贞叶中脉或大 29

113 的侧脉有一个维管束, 其中木质部位于上方, 韧皮部位于下方, 两者之间有微弱的形成层, 维管束周围是薄壁组织 大的叶脉还有厚壁组 织 叶脉越细, 结构越简单, 小的叶脉没有厚壁组织和形成层, 木质部和韧皮部也简单化了, 维管束外有一层薄壁细胞形成的维管束鞘 水稻叶脉以中脉最大, 中脉里有多数维管束排列, 中央有空腔与根 茎的通气组织相通, 光合作用产生的 O2 经通气组织可供根的呼吸 叶片上纵走的维管束大小相间排列, 维管束鞘多数有两层细胞, 少数也有一层, 因品种而不同 每个叶脉上 下方都有成片的厚壁组织把 叶肉隔开, 而与表皮相接 ( 二 ) 针叶的构造 : 许多裸子植物的叶子是针形叶 表皮细胞壁很厚, 外被一层很厚 的角质层, 表皮内为多层厚壁细胞称下皮, 气孔下陷, 叶肉由多含叶绿体的薄壁细胞构成, 细胞壁具有许多向内凹入的褶皱 叶绿体沿皱壁分布 叶肉中具有树脂道, 由许多分泌细胞围绕而成 具有明显的 内皮层, 内皮层细胞呈鼓形, 富含淀粉粒 内皮层里面为薄壁细胞构成的基本组织, 中央有两个或一个维管束 四 实验报告 : 1 绘出女贞叶的横切面图, 注明各部分名称 2 绘出小麦叶的横切面图, 注明各部分名称 3 绘出松属针叶的横切面图, 注明各部分名称 30

114 实验十三花 ( 一 ) 一 目的要求 : 观察花的形态, 花序类型, 了解花药的发育及其构造 二 仪器 材料 药品 : 解剖镜 镊子 解剖针 刀片 载玻片 盖玻片八角金盘花序 百合花花药横切片 三 实验内容 : ( 一 ) 观察八角金盘花序的构造, 八角金盘花序是伞形花序, 其每朵花由花柄 花萼 花冠 雄蕊 雌蕊和蜜腺等部分组成 1 花柄 : 又称花梗, 着生于花枝上, 是支持花的棒状物 2 花托 : 在花柄顶端略膨大部分 为花萼 花冠 雄蕊 雄蕊的着生部位 3 花萼 : 位于花的最外轮, 基部结合成筒状, 边缘有 5-6 齿, 有保护幼花的功能 4 花冠 : 位于花萼的内轮, 由五片花瓣组成, 镊合状排列 ; 离 生 5 雄蕊 : 在花冠内方, 着生于花盘边缘, 雄蕊 5 每个雄蕊由花丝和花药组成, 花丝细长, 花药着生于花丝顶端, 成熟花药呈黄色, 内有许多黄色花粉粒 6 雌蕊 : 雌蕊 5, 位于花的中心部位 子房与花托愈合, 子房下位, 雌蕊由子房 花柱 柱头三部分组成 花柱分离, 柱头上有不 少小突起, 常分泌出粘液 花柱较短, 子房位于花柱的下方, 埋于花托之内, 五心皮五室, 中轴胎座 ( 二 ) 百合花药的发育和解剖构造 : 百合花药有四个花粉囊, 花粉囊在花粉的四个角, 成熟花药的花粉囊充满花粉粒 花药的发育初期结构较简单, 最外层是表皮, 里面仅由一些相似的分生细胞组成 随着花药的发育, 分化成花粉囊和药 隔 花粉囊分为囊壁, 由表皮 纤维层 ( 外 ) 中层 ( 中 ) 绒粘层 ( 内 ) 组成 表皮为一层排列紧密的扁平细胞组成 纤维层在表皮的内侧, 是一层较大的细胞 花粉成熟时, 此层细胞除了和表皮层细胞接触的 一面和径内壁外都发生斜纵向条纹状次生增厚并木质化 纤维层内是中层, 中层由一层或数层细胞组成, 细胞长方形贮有淀粉和营养物质, 31

115 通常在花药成熟过程中解体 中层内是绒粘层, 常常只有一层细胞, 细胞较大, 细胞质浓, 双核或多核, 此层细胞对花粉粒的发育起重要 作用 成熟花药绒粘层往往解体, 药隔中央有花药维管束 四 实验报告 : 1 绘出八角金盘花序简图, 并写出一朵花的花公式 2 绘出百合花成熟花药横切面简图, 注明各部分名称 32

116 实验十四花 ( 二 ) 果实 一 目的要求 : ( 一 ) 了解子房 胚珠 胚囊的构造及胚的形态 ( 二 ) 观察各类果实 二 仪器 材料 : 显微镜 百合子房横切永久切片 荠菜子房纵切永久切片三 实验内容 : ( 一 ) 观察子房 胚珠 胚囊的构造 1 子房的解剖构造 : 取百合子房的横切片在显微镜下观察, 百合子房是由三心皮组成的, 中轴胎座 观察胚珠着生的部位以及每个心皮维管束的部位, 分 出它们的背缝线, 并找出胚珠 珠被 珠孔 合点 珠心和胚囊 (1) 珠被 : 在胚珠外面 分两层, 即外珠被和内珠被, 在珠柄一侧的外株被与珠柄愈合生长, 不能被分开 (2) 珠孔 : 即内外珠被顶端不闭合的孔隙 (3) 合点 : 位于珠孔的相对的一端, 这里珠被与珠心联合 (4) 珠心 : 胚囊与珠被之间的薄壁细胞, 在珠孔端容易区分, 只 有一层 (5) 胚囊 : 在胚珠的中央 成熟胚囊是 个大的胚, 内有 7~8 个细胞, 在靠近珠孔的一端有三个细胞, 位于中间的较大的一个是卵 细胞, 两侧的两个细胞比卵细胞略小, 叫助细胞 ; 靠近合点一端有三个反足细胞 ; 在胚囊中央有两个极核 2 百合胚囊发育的观察 : 胚囊的发育 : 最初珠心是一团相似的薄壁细胞, 以后在靠近珠孔一端的表皮下有一个细胞, 体积较大, 细胞质浓, 核大而显著, 称孢原细胞, 孢原细胞进一步发育成大孢子母细胞 百合胚囊发育为贝母型, 大孢子母细胞经过减数分裂后形成四个单倍的核 ( 大孢子 ),4 个大孢子呈 1+3 排列, 即珠孔端一个, 合点端三个 然后珠孔端的一个核正常分裂, 合点端的三个核分裂时纺锤体融 合成一个共同的纺锤体, 这样分裂结束时, 珠孔端有两个单相核, 核较小, 而合点端有两个三相核, 明显较大, 接着各自再分裂一次, 成 33

117 为八个核 四个合点端的为三相核, 四个珠孔端的为单相核, 然后两端各有一核移向中央 成熟胚囊的结构就是珠孔端一个卵 (n), 两个 助细胞 ( n ), 中央一个次生极核 ( 1n+3n), 合点端是三个反足细胞 ( 3n) 要求观察单核胚囊期, 双核胚囊期, 四核胚囊期和成熟胚囊期 注意胚珠的形态 大小及胚囊内细胞核的数目和位置, 在各个时期的区别 ( 二 ) 观察胚的形态 1 荠菜幼胚的整体观察卵受精后, 分裂成柄细胞和胚细胞 柄细胞位于珠孔的一端, 柄 细胞经过几次分裂, 形成一列由几个细胞组成的胚柄, 胚柄基部有一个大细胞, 称为基细胞 胚细胞经过无数次的分裂, 不但细胞的数目大量增加, 而且细胞 有了初期分化, 形成胚的各部分 胚体初期的分裂和生长方向是一致的, 因此初期胚体呈球形 以后细胞继续分裂, 数目增加, 由于各部分的生长速度有所不同, 胚顶部细胞生长慢, 而胚两边的细胞分裂生 长较快, 逐渐在胚上形成两个突起, 中间显得缢陷 两个突起继续生长形成子叶, 缢陷部位的细胞以后形成胚芽, 胚轴和胚根在胚芽下方形成 极核受精后发育成胚乳 胚乳的形成方式是以细胞自由分裂形成, 先进行多次核分裂, 细胞核从胚囊边缘开始布满胚囊, 然后进行细胞质的分割, 逐渐产生细胞壁, 形成充斥胚囊的胚乳, 供胚发育的 营养 2 观察荠菜子房的纵切片 : 荠菜子房纵切面的轮廓在切片中呈倒三角形, 内有许多胚珠, 中 央有 条假隔膜, 胚珠通过珠柄着生在假隔膜上 由于胚珠着生的方向不同, 因此切片中的胚珠切面呈现出不同的形状 在这些胚珠中寻找出一个胚囊的正中纵切面, 从中可以看到珠 被 珠孔 合点 珠心 胚囊等结构 不同发育时期的胚珠, 其形态结构有所不同, 请仔细观察加以区别 1 幼胚期 : 胚胎通过胚柄着生于胚囊的珠孔端, 胚柄为一列细胞, 最下部固着的基细胞较大, 细胞中有大的液泡, 胚柄顶部是胚体, 这个时期的 胚体是多细胞的球状体, 因此称球形胚 胚乳处于游离核的状态, 许多园球形的核, 分布于胚囊的四周, 34

118 还有一些核分布在胚的周围 2 鱼雷胚时期 : 这个时期的胚体顶端两侧已形成明显的子叶突起, 子叶中央凹陷部分将发育成胚芽生长点, 这时的胚柄仍发达 胚乳游离核已部分地发育出细胞壁 3 成熟胚时期 : 胚体已经很大, 两片子叶同时向 侧发出弯曲, 胚体几乎占满了胚囊的整个空间, 胚柄已退化, 变得很短, 但基细胞仍存在 胚乳已大部分被胚吸收, 有时在胚体基部胚柄周围还有些残存 四 实验报告 : 1 绘百合花子房横切面简图, 其中 个胚珠绘详细图 2 绘荠菜子房纵切面中的一个胚珠, 示发育中的胚 35

119 附 绘图的方法与步躁 实验绘图是学习和研究生物科学的重要手段 在实验中只有对标本进行认真细致的解剖 观察 理解才能产生正确的绘图 反之, 通 过绘图又能帮助我们认真细致的观察 解剖, 并对观察到的现象进 步加深理解和记忆 实验绘图是对实验工作的记录, 不需要美术家那样作图 它的要 求是简单明显, 线条清楚, 亲自看见和标本符合, 而且加注, 绘图 律用铅笔 (2H 或 3H) 绘图的最重要要求是动笔前必须仔细观察, 充分了解自己所观察 到的全部内容, 然后计划图在纸上的大小和位置, 以及选择最好的显示方法, 使所绘的图既符合标本又简单 明了 清楚 初学绘图时, 可按以下步骤进行 : 1 根据实验要求, 仔细观察, 选出要画的部分 在选择时应选取较完整 较典型和较显著的部分, 有时较好的部分并不集中在一处, 可以把分散的凑成一个较完整的画面 2 决定图的大小和位置 一般构造简单的可画得小一些 ( 占纸的 1/4), 构造复杂的可大一些 ( 占纸的 1/2) 要防止画得太小, 使许多部分挤在一起 3 实验号数和标题写在实验纸正中上方, 姓名 日期写在纸的右上角, 每一小图的标题写在图的下方, 图的右方要留出注字的部分 4 绘图时, 在选好的标本部分找一中线或明显的界线, 在纸上 轻轻标记, 作为初步的定界 5 画出标本的大致形状, 包括各部分的联系 6 画出全部构造的轮廓, 并细致的核对标本, 加以修改 仔细 画出各部分, 可用点的密度和粗 细不同以示区别, 并用橡皮擦去不必要的线条 7 用正楷字注明图中各部分名称, 注字划线应相互平行, 字一 般注在图的右面 实验报告在教师审阅后必须妥善保存, 以便复习参考之用 36

120 附二徒手切片法 在研究植物结构时, 需要用刀把器官或组织切成薄而均匀的切 片, 才能确切地看到它们的内部结构, 因此制作切片是很重要的 制作切片时除用各种切片机制作外, 最常用的是徒手切片法 它虽然比不上切片机切出的片子那样薄而均匀, 但设备简单, 制作迅速, 而且技 术熟练后, 也常能制作很好的切片. 徒手切片操作方法 : 1 将植物材料切成半厘米见方,1 2 厘米的长方条 如果是叶 片, 应把叶片切成半厘米宽的窄条, 夹在胡萝卜 ( 萝卜 马铃薯块茎也可 ) 长方条的切口内 2 取上述材料成直立方向, 用左手拇指和食指夹住材料, 使其 固定不动, 然后将材料的上端超出手指约 2 3 毫米 右手用拇指和食指紧握刀片的右下角, 刀片必须锋利, 刀口向内, 刀身内外, 两臂基部紧贴身上, 以免手臂动摇 3 切片时, 先将材料的上部削平, 刀口应从左前方向右后方, 以水平方向对着自己移动 动作要敏捷, 中途不要停顿, 如此可连续切数片薄片 在切片过程中须用清水等湿润材料切面, 以防干燥 4 将切成的薄片轻轻移入盛清水的培养皿中, 如用 70% 酒精固定的则移入 70% 的酒精中, 最后选择薄而均匀的切片, 做成临时装片进行观察 如果认为所作的徒手切片很好, 有价值需要永久保存, 可制成永久装片或永久切片 37

121 附三永久装片和永久切片的制作 制作永久装片或永久切片, 必须经过下列七道工续 : (1) 杀死和固定 : 把准备好并经过处理的材料浸入固定液, 让固定液迅速渗入组织中, 使细胞硬化并保持和生活时相同的状态 固定液的体积一般是材料体积的 50 倍, 并防止材料下沉或上浮, 保证固定液能从各个方面 渗到材料里 固定时间的长短, 随材料的大小和固定液的性质而定 一般植物切片在 95% 的酒精里固定半小时, 洋葱根尖在醋酸酒精溶液里固定 20 分钟 (2) 洗涤 : 经药液固定的材料要用水或酒精洗去渗入组织中的固定液, 以免影响染色 用福尔马林 酒精或物理方法固定的材料不用洗涤 (3) 染色 : 材料洗涤后, 用染色剂染色, 使细胞的结构显示清楚 有的染色剂为水溶液, 而固定液为高度酒精时, 则将固定的切片自酒精下降到 水后, 再行染色 ; 如染色剂为 50% 酒精溶液, 则可自 70% 酒精 ( 或 95% 酒精经 70% 酒精后 ) 移入染色剂, 每度酒精时间为 5 分钟到 10 分钟, 有的染色剂可以染 般细胞, 如洋红溶液 有的染色剂只能染细胞的 一部分, 如甲基蓝溶液是酸性染色剂, 它和碱性细胞质有很大的亲和力, 可用来染细胞质 ; 龙胆紫溶液是碱性染色剂, 它和酸性细胞核有很强的亲和力, 可用来染细胞核 染色时间, 普通切片染 5 分钟左右 为宜 如果染色大浅, 必须重染, 如染色太深, 可用极稀的盐酸 (50 毫升水中加 滴稀盐酸 ) 洗 5 分钟, 进行适当褪色, 然后用水冲洗 20 一 30 分钟, 洗去盐酸 (4) 脱水 : 脱水就是除去材料中的水份, 以便长期保存 脱水时先把材料放入低浓度的酒精里, 再逐渐移到高浓度酒精中 ( 即 30% 100%), 以防 止材料收缩或发生其它变化 脱水的时间, 随材料的种类和大小而定, 一般在 小时以上 (5) 透明 : 透明就是用透明剂使脱水的材料变得透明, 在显微镜下易于观察清楚 材料浸在透明剂里的时间不能太长, 以免变脆断裂, 一般材料 38

122 浸在二甲苯中只要 5 分钟就行了 (6) 封藏 : 透明后的材料放到载玻片中央, 用树脂胶封藏便可永久保存 (7) 标签 : 装片或切片制好后, 在载玻片的右边贴上标签, 标签上用墨水注 明标本名称 几种染色方法 : 1 代氏苏木精作单色染色 : (1) 选取薄而均匀的切片经蒸馏水后, 移入 0.5%~1.0% 的代氏苏木精中染色 3~10 分钟 (2) 用蒸馏水洗去多余的染剂 (3) 用流水冲洗, 使苏木精素变成兰色 ( 如果认为染色太深时, 可在滴数滴盐酸的蒸馏水中进行褪色, 直到染色适当为止, 再用流水冲洗, 使变兰色 ) (4) 经 30% 50% 70% 85% 95% 各级酒精 5~10 分钟脱水 (5) 在 100% 酒精中换液两次, 每次 5~10 分钟 ( 应加盖密闭, 以防空气中的水汽进入 ) (6) 经 1/2 纯酒精 +1/2 二甲苯, 再到纯二甲苯各 5~10 分钟, 起透明作用 (7) 用中性树胶封藏, 盖上盖玻片, 贴上标签即成 2 番红和固绿作二重染色, 适用于一般植物组织, 特别是分生组织, 其结果是染色体或细胞核, 核仁 木质化细胞壁均成鲜红色, 纺锤丝 纤维素细胞壁 细胞质均成绿色 染色程序 : (1) 将切片材料固定于 95% 酒精中 (2) 用 1% 番红的 50% 酒精溶液染色数小时 (3) 用 50% 酒精洗去多余染料 (4) 用 70% 85% 95% 100% 的酒精中脱水各 3~5 分钟 (5)0.1% 固绿 ( 溶于 95% 酒精 ) 染色 10~40 秒钟 (6) 纯酒精 3~5 分钟 (7) 经 1/2 纯酒精 +1/2 二甲苯溶液约 3~5 分钟 (8) 二甲苯透明 5 分钟 (9) 中性树胶封片, 并贴标签 3 番红及代氏苏木精二重染色 : (1) 切片固定于 95% 酒精中半小时至 24 小时 39

123 (2) 经 70% 酒精移入 50% 酒精, 各 5 分钟 (3) 用 1% 番红的 50% 酒精溶液中染色 12~24 小时 (4) 用 50% 酒精洗 10 分钟 (5) 经 30% 酒精到水中各 5 分钟 (6) 在 1% 代氏苏木精水溶液染色 5~10 分钟 (7) 用水洗 5 分钟 (8) 以 1% 的盐酸水褪去过深的染料, 约 3~5 分钟, 视材料是否适度而定 (9) 用清水洗数次, 约 10~15 分钟 (10) 用 30% 50% 70% 85% 95% 各级酒精各 5 分钟 (11) 纯酒精中 5 分钟 (12)1/2 纯酒精十 1/2 二甲苯中 5 分钟 (13) 纯二甲苯 5 分钟 (14) 中性树胶封片 注意 : 如在二甲苯中发现材料有白雾, 说明去水不干净, 特别是在阴雨天气空气湿度大, 水汽容易进入纯酒精中, 应加以注意 40

124 附四几种主要显微组织化学反应及试剂配制 为了鉴别细胞壁和细胞内物质的化学组成, 可以利用一些特殊的显微化学反应, 利用这些反应也可帮助我们了解各种组织的细胞结构 特征 几种重要而常用的显微组织化学反应列表如下 : 鉴定物质试剂反应其它物质反应 1 蛋白质浓硝酸加入氨液时染成鲜黄色, 颜色加深变成橙色并不染色 2 淀粉 (1) 碘的酒精溶液或 (2) 碘化钾溶液染成淡紫或黑紫 色并不染成上述颜色 3 纤维素 ( 在细胞壁上 ) (1) 碘 碘化锌或 (2) 碘化钾硫酸 染成淡紫色并膨胀细胞壁上的其它物质并不染成上述颜色 4 木质 ( 在细胞壁上 ) (1) 硫酸苯胺溶液或 (2) 间苯三酚盐酸溶液染成柠檬黄色或樱桃红色非木质化的细胞壁保持无色 5 木栓质 ( 在栓质化细胞壁上 ) 苏丹 Ⅲ 酒精溶液染成红色除角 质 脂肪 油 挥发油和橡胶外不染色 6 角质 ( 在角质层和角质化的细胞壁上 ) 苏丹 Ⅲ 酒精溶液染成红色除木栓质 脂肪 油 挥发油和橡胶外不染色 7 脂肪 ( 成滴状 ) 苏丹 Ⅲ 酒精溶液染成红色除木栓质 角质 油 挥发油和橡胶外不染色 8 油 挥发油和橡胶 ( 成滴状 ) 苏丹 Ⅲ 酒精溶液染成红色除木 栓质 角质 脂肪外不染色上述几种试剂的配制和使用方法 : 1 浓硝酸 : 蛋白质和硝酸的朊黄反应, 是测定蛋白质的一种可 靠反应 这种反应可在盖玻片下进行, 含有酪胺酸的复合蛋白质, 经浓硝酸作用若干时间后, 就变成了鲜黄色 ( 朊黄酸 ), 吸去一部分硝酸再放入氨液, 则颜色和深度变成橙色甚至棕色 当用 NaoH 作用时, 颜色就变成了棕红色 树脂 生物碱和若干种羟基芳香族化合物, 都能产生这样的反应, 但是用氨液处理后, 只有蛋白质才显出由黄色到棕黄色的急剧转变 2 碘 碘化钾溶液 : 取 2 克碘化钾溶解在 5 毫升蒸馏水中, 再加入 1 克碘, 待溶解后用蒸馏水稀释到 100 毫升, 盛入棕色瓶中, 41

125 保存在暗处 ( 光亮处容易成氢碘酸 ) 本溶液用来测定淀粉和用作标本染色 3 碘 碘化钾 硫酸 : (1) 碘 碘化钾溶液配制方法见 2 (2)65% 硫酸 : 约 7 分重的 95% 硫酸加到 3 分重的蒸馏水中 盖 玻片下的材料先用碘 碘化钾浸透, 再在盖玻片一边加一滴硫酸, 让其扩散, 含纤维素的细胞壁染成深兰色并发生膨胀 4 碘 氯化锌 : (1)50 克氯化锌 (ZhCl2) 和 16 克碘化钾 (KI) 溶于 17 毫升蒸馏水中, 加过量的碘, 静置数天, 将上层溶液倒入棕色滴瓶中备用 (2) 将 20 克氯化锌加热溶于 8.5ml 的水中, 冷却后, 用滴定管 滴入碘一碘化钾溶液 ( 将 3 克碘化钾和 1.5 克碘溶解于 60 毫升水中 ) 不断震荡直至出现碘的沉淀时为止, 通常滴入 1.5ml 碘液已够 此溶液能把纤维素细胞壁染成紫色, 木质化细胞壁染成黄色, 细胞核染成 棕色, 细胞质染成淡黄色 5 间苯三酚盐酸溶液 : 在 20% 的盐酸 (HCl) 中加入间苯三酚达到饱和为止 此溶液是测 定木质素的主要试剂, 使用时将溶液滴在盖玻片一侧, 木质化的细胞经作用后染成樱桃红色 颜色深浅还因木质化程度而不同, 所染颜色不能持久 6 硫酸苯胺 : 将 1 克硫酸苯胺溶解于 100ml 的水中, 再加上五滴硫酸 由硫酸苯胺的水溶液或酒精溶液处理过的木质化细胞壁被染成鲜黄 7 苏丹 Ⅲ 0.01 克苏丹 Ⅲ( 干粉 ) 溶解于 5ml 96% 的酒精中, 全部溶解后加入 5ml 甘油, 配好后的溶液让其澄清, 将澄清液倾出保存备用 苏丹 Ⅲ 是可被脂肪及其类似物质大量吸收的偶氮染料, 故广泛用于测定这些物质 8 醋酸洋红溶液 :100ml 45% 醋酸煮沸加入 1 克洋红, 搅拌再 煮, 冷却后过滤 用来染染色体 9 龙胆紫溶液 : 把龙胆紫溶解在 2% 醋酸液里, 直到溶液不变成深紫色为止 用来染细胞核 42

126 附五常用的固定液和离析液 1 常用的固定液 (1) 标准固定液 ( 即 F A A 固定液或称万能固定液 ) 配方 :50% 或 70% 酒精 50 毫升 冰醋酸 5 毫升 福尔马林 5 毫升 适用范围 : 适用于高等植物的器官, 也常用于低等植物的标本固 定 (2) 醋酸酒精溶液 : 配方 : 纯酒精 3 份, 醋酸 1 份 适用于固定根尖 ( 约 15 分钟 ), 花药 (1 小时 ) 经固定后在浓酒精里浸 15 分钟, 然后保存在 70% 酒精里 (3) 福尔马林 (37% 一 40% 的甲醛 ): 可起到固定和防腐作用 适合固定的浓度 :10% 福尔马林 ( 即 3.7 4% 甲醛 ) 可用于固定植物营养器官的标本, 但固定高等植物的花时, 其花容易萎缩, 观察时不易疏展 (4) 酒精 : 适合固定的浓度为 70% l00% 酒精是重要的组织保存剂 但并不常用, 因在 95% 和 100% 的酒 精中保存, 会使组织收缩变硬, 一般只保存在 70% 酒精中, 如欲永久贮存, 仍须与甘油等量混合后使用 2 常用的离析液 研究组织中的个别细胞, 必须用药液使细胞从组织中分离出来, 分离细胞用的药液叫分离液, 常用的有以下几种 : (1) 氢氧化钠溶液 ( 也可用氢氧化钾溶液代替 ) 用 15% 30% 的氢氧化钠溶液可浸离韧皮纤维 如果将植物的幼根用浓氨水浸泡两天 ( 每天更换一次氨水 ), 然后换等量 10% 氢氧化钠和 50% 酒精混合液, 再浸泡两天 ( 每天更换一次 溶液 ), 最后冲洗 可用于观察离析的立体细胞 (2) 盐酸酒精溶液 : 在 1 份 95% 的酒精里徐徐加入等量的浓盐酸, 可用于植物幼嫩 组织 ( 如根尖分生组织 ) 离析, 它兼有固定和离析两重作用 (3) 硝酸铬酸溶液 : 43

127 取 1 份 10% 硝酸,1 份 10% 铬酸, 配成硝酸铬酸溶液, 可分离木质部细胞 (4) 硝酸氯化钾 : 取硝酸 5 毫升, 加入 1 克氯化钾, 加热 5 分钟 可将木材离析 44

128 植物学 ( 二 ) 实验指导 钱 玮王金虎 苏州科技学院化生学院

129 前言 植物学实验是学习植物学课程的重要组成部分, 是贯彻理论联系实际的重要手段 它不仅帮助学生加深理解 验证巩固和提高所学的知识, 而且通过实验, 使学生学习掌握实际工作所需要的基本技能, 培养学生独立思考, 分析问题和解决问题的能力 使学生养成严密的科学态度, 实事求是的工作作风和严肃认真的工作习惯 为学习其它课程和将来担任中学植物学教学打下扎实的基础, 为此特提出以下几点要求 : 一 做好实验前的准备工作 : 实验前必须认真阅读实验指导, 明确实验目的 内容和方法, 并准备好实验时所需物品, 如实验指导 植物学教科书 实验报告纸 2H 或 3H 硬铅笔一枝 小刀 橡皮 厘米尺等 二 认真进行实验 : 实验时必须遵照教师的指示切实遵守正确的操作方法, 按照规定的步骤, 踏实, 严肃认真, 一步一步地做 观察记录, 绘图要求实事求是 如遇困准, 可举手问教师 三 当堂完成实验报告 : 每次实验必须按照规定格式写实验报告, 实验报告必须凭自己观察所得, 要求真实正确, 独立完成 四 爱护实验室的一切设备和实验仪器, 切片 标本材料等, 如有损坏应主动向教师说明原因, 并填写报损报废单, 以便酌情处理 五 实验结束, 应清理自己的实验台, 把实验用具洗净擦干, 安放妥当. 方能离去 六 实验室必须保持安静, 不允许高声喧哗和谈笑, 每次实验结束应组织人员打扫, 保持实验室的清洁卫生 1

130 目 录 实验一藻类植物 (Algae)...3 实验二菌类植物 (Fungi) 地衣植物(Lichens)...5 实验三苔藓植物 (Bryophyta)...6 实验四蕨类植物 (Pteridophyta)...8 实验五裸子植物 (Gymnosperm, 一 )...10 实验六裸子植物 ( 二 )...12 实验七被子植物 (Angiosperm, 一 )...14 实验八被子植物 ( 二 )...16 实验九被子植物 ( 三 )...18 实验十被子植物 ( 四 )...19 附录...21 植物检索表的编制和使用方法

131 实验一藻类植物 (Algae) 一 目的要求 : 了解藻类植物的基本特征 二 仪器和用具 : 显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 解剖针 滴管 刀片 三 内容和方法 : ( 一 ) 蓝藻门 (Cyanophyta) 1. 色球藻属 (Chroococcus) 在阴湿的树干上用刀片刮下蓝绿色 碎屑, 清水装片观察 植物体为单细胞或由胶质鞘包围的群体, 细胞半球形或四分体形, 无核 2. 颤藻属 (Oscillatoria) 在富含氨的浅水沟边土壤上, 生长着 深绿近黑色的粘胶状物, 便是该类 清水装片, 观察不分枝丝状体及其左右摆动 扁平的细胞和藻殖段 3. 念珠藻属 (Nostoc) 取浸泡过的地木耳 (N. commune) 少许, 清水装片观察 植物体为念珠状丝状体, 由胶质包围, 异形胞壁厚 4. 项圈藻属 (Anabaena) 亦称鱼腥藻, 植物体似念珠藻, 但无公共胶质鞘 取红蘋 (Azolla) 叶挤压少许汁水于载玻片上, 装片 ( 二 ) 绿藻门 (Chlorophyta) 1. 衣藻属 (Chlamydomonas) 取新鲜材料装片或永久制片观察 : 二条鞭毛 伸缩泡 一个红色眼点 杯状载色体 蛋白核 细胞核 2. 水绵属 (Spirogyra) 分布于池塘边 水沟 水田中, 漂浮于水面, 摸之有滑腻感, 植物体为不分枝丝状体, 载色体螺旋形, 上有淀粉核, 细胞核位于中央, 具接合生殖 3. 轮藻属 (Chara) 生于富含钙质的水体中 取新鲜或浸泡材料观察 : 植物分 枝 叶 假根及精囊和卵囊 4. 石莼属 (Ulva) 海产, 生于潮间带上部石砾 岩石处 观察 浸泡标本 : 植物体呈片膜状, 由两层细胞组成 ( 三 ) 硅藻门 (Bacillariophyta) 羽纹硅藻属 (Pinnularia) 春 夏 秋生于各种水域, 常附生于 3

132 水中高等植物上 取此标本清水装片, 观察时, 用解剖针轻触盖片, 使其内藻体翻转, 壳面和带面均可见 ( 四 ) 红藻门 (Rhodophyta) 紫菜属 (Porphyra) 海生 植物体片膜状, 紫红色 精子囊 : 取藻体中部边缘处有浅色斑块者, 横切制成水装片, 显微镜观察 藻 体为一或两层细胞构成, 除了普通营养细胞外, 还有精子囊, 内含不动精子 64 个 横切面观察, 每个精子囊可见 4 个不动精子 果孢子囊 : 取具果孢子囊的藻体横切清水装片观察, 可见营养细胞外 还有果孢子囊, 每个果孢子囊具 8 个果孢子, 横切面可见 4 个排成 2 列 ( 五 ) 褐藻门 (Phaeophyta) 海带 (Laminaria japonica) 海产 取腊叶或浸制标本观察海带孢子体由带片 柄和固着器组成 又, 取成熟带片横切切片显微镜下观察 注意 : 带片由 表皮 皮层 和 髓 组成 ; 孢子囊为表皮细 胞发育而成 ; 孢子囊棒状, 丛生, 孢子囊间由侧丝相隔, 侧丝顶端具一胶质冠 再取海带配子体永久制片, 显微镜下观察 : 雌配子体分枝少, 雄配子体多分枝 四, 作业 : 1 绘念珠藻属植物体全形及群体一部分放大图 2 绘衣藻形态结构图, 注明各部名称 3 绘水绵丝状体, 并标名称 4 绘海带孢子体外形, 带片横切面示孢子囊 侧丝 胶质冠, 并表 明名称 4

133 实验二菌类植物 (Fungi) 地衣植物 (Lichens) 一 目的要求 : 了解菌类植物的一般特征 ; 了解地衣的三种类型 二 仪器和用具 : 同前 三 内容和方法 : 1 细菌三型观察细菌三型涂片哟内永久制片, 区别球菌 杆菌和 螺旋菌 2 根霉菌 (Rhizopus) 取面包 馒头上长出的霉装片置显微镜下观察 : 菌丝体管状 无分隔 无分枝, 主枝横生, 称匍匐枝 ; 在匍 匐枝的一些紧贴基质处有假根, 在假根上方生出一至数条直立的孢子囊梗, 顶端膨大为囊轴, 其上形成孢子囊, 囊内具许多黑色孢子 3 酵母菌属 (Saccharomyces) 取酵母装片在显微镜下观察 : 植物 体为单细胞 出芽生殖 4 青霉菌 (Penicillium) 取青霉装片在显微镜下观察, 注意菌丝有无分隔, 从菌丝上生出长而直立的扫帚状的分生孢子梗, 梗端有 一串青绿色的分生孢子 青霉菌可在腐烂的桔皮上取得 5 蘑菇属 (Agaricus) 菌盖, 菌褶, 菌环及菌柄 取菌褶永久切片, 在显微镜下可见, 菌褶中央菌丝交错疏松排列为菌髓 ; 菌髓两侧为 子实层, 由担子和侧丝组成, 有的种类有囊状体, 担子顶有小梗, 小梗上长出担孢子 ; 菌髓与子实层间菌丝排列繁密呈假薄壁细胞状, 为子实层基 6 小麦秆诱病菌 (Puccinia graminis) 孢子壁的厚薄, 有无分隔 取小叶横切片观察, 可见诱孢子器呈杯状, 生于叶背面, 杯底有短而密的菌丝, 由他产生一连串的橘黄色孢子 7 观察几种常见担子菌子实体的外部形态 (1) 灵芝 (Ganoderma lucidum),(2) 木耳 (Auricularia auricula), (3) 银耳 (Tremells fucifomis). 8 地衣根据标本区别 : 壳状地衣, 叶状地衣和枝状地衣 四作业 1. 绘根霉菌, 示匍匐枝, 假根, 孢子囊梗, 轴及孢子囊 2. 绘青霉外形图, 并标明各部分名称 3. 绘伞菌菌盖横切简图, 并放大一部分菌褶, 注明各部分名称 5

134 实验三苔藓植物 (Bryophyta) 一 目的要求 : 掌握苔藓植物的主要特征和生活史, 并识别几种苔 藓植物 二 仪器和用具 : 显微镜 解剖镜 镊子 解剖针 三 内容和方法 : ( 一 ) 苔纲 (Hepaticae) 地钱属 (Marchantia) 春夏季在阴湿的山坡沟边或阴湿的庭院中可采集到这类植物 地钱的营养体 ( 配子体 ) 是背腹两面的叶状体, 二叉分支 ; 背面深绿色, 粗糙 具网纹, 网纹中央有小白点, 为通气 孔, 有时还可看到胞芽杯 ; 腹面淡绿, 具假根及鳞片 春末, 雌雄异株的叶状体背面边缘分叉处分别产生雌雄生殖器, 雌枝产生伞状 边缘深裂为下垂 8-10 条指状芒线的雌托, 伞下两芒线间倒悬着 1 列颈 卵器, 每行颈卵器两侧各有一片薄膜将其遮住, 称蒴苞 ; 颈卵器瓶状, 具颈部 腹部和 1 个短柄 ; 雄株上产生盘状 边缘浅裂的雄托, 盘顶具许多精子器腔, 每腔内有一个卵圆形精子器, 腔有小孔与外界相连 受精后, 颈卵器内发育成孢子体, 寄生于配子体上发育, 孢子体为假蒴苞包围, 孢子体分为基足 蒴柄 孢子囊三部分, 孢子囊内有孢子和弹丝 用解剖镜观察地钱标本 用显微镜观察地钱胞芽装片 雌托切片 雄托切片和孢子体切片 ( 二 ) 藓纲 (Musci) 1. 葫芦藓 (Funaria hygrometrica) 生于阴湿处 配子体的观察 : 具茎 叶 假根, 雌雄同株但异枝 雄枝端的苞叶较大, 而且外张, 形如一朵小花, 为雄器苞 雄器苞中央生有多个 精子器和侧丝, 成熟时淡黄绿色或橘红色 取雄枝置于载玻片上, 在解剖镜下用解剖针剥掉雄苞叶, 观察精子器和侧丝 将剥好的雄枝端清水装片, 置显微镜下观察, 可见精子器棒状, 基部有小柄, 外为一 层细胞组成的精子器壁, 内生有精子 雌枝端的雌苞叶较窄, 且互相紧包如芽状, 其内有数个具柄的颈卵器及其隔丝 同上法制清水装片 6

135 或永久制片置显微镜下观察, 可见颈卵器瓶状, 外有一层细胞的壁, 颈部较长, 内有颈沟细胞 ( 成熟时液化 ), 腹部膨大, 内有一个卵细 胞 孢子体观察 : 由颈卵器内的受精卵发育成胚, 再发育成孢子体, 着生于配子体顶端 孢子体由孢蒴 蒴柄 基足三部分构成 孢蒴梨 状, 顶部有蒴帽 用显微镜观察孢蒴纵切片, 可见由数层细胞构成的蒴壁, 中间为蒴轴, 蒴轴从孢蒴基部直达顶部与蒴盖相连, 蒴盖下蒴口缘处有两层蒴齿, 蒴轴与蒴壁之间有造胞组织和气室 原丝体观察 : 取原丝体装片观察, 原丝体为绿色 有分枝和芽 具假根的丝状体 芽将发育成配子体 2 泥炭藓属 (Sphagnum) 生于水湿或沼泽地 取水浸标本 观察外形, 茎直立具分枝, 侧枝有弱枝和强枝之分 取 1 叶片, 清水装片, 显微镜下观察 : 叶片由一层细胞构成, 无中肋 ; 叶细胞有两种, 一种为含叶绿体的细长小细胞, 连接成网状 ; 另一种在网眼间, 是大 型无色细胞, 胞壁具螺纹加厚和水孔, 为死细胞 ( 选做 ) 四 作业 1 绘地钱的雄器托和雌器托各一部分, 示精子器和颈卵器 2 绘地钱孢子体纵切, 示主要结构 3 绘葫芦藓配子体和孢子体外形图 7

136 实验四 蕨类植物 (Pteridophyta) 一 目的要求 : 掌握石松亚门和楔叶亚门的特征和区别 掌握真蕨植物亚门的特征, 并对蕨类植物基本特征有一个全面的了解 二 仪器和用具 : 同前 三 内容和方法 : ( 一 ) 石松亚门 (Lycophytina) 1 石松属 (Lycopodium) 取石松 (L. clavatum) 腊叶标本, 用解 剖镜 ( 放大镜 ) 观察其外部形态 : 不定根, 叉状分枝的茎, 线状钻形营养叶螺旋排列于茎上 ; 孢子叶集生枝顶为孢子叶穗 观察千层塔 (L. serratum) 腊叶标本 2 卷柏属 (Selaginella) 取卷柏 (S. tamariscina) 腊叶标本, 用解剖镜观察, 可见它主茎短, 直立, 顶端丛生小枝 小枝扇形分叉, 辐射开展, 干旱时内卷如拳 茎上密生鳞叶, 背腹各两列, 交互着生 孢子叶穗生于枝顶, 孢子囊异型, 具大小之分, 生于孢子叶的叶腋处 ( 二 ) 楔叶亚门 (Sphenophytina) 1. 问荆 (Equisetum arvense) 取它的腊叶 ( 浸泡 ) 标本观察 : 孢子体为多年生草本 具根状茎和气生茎, 且具明显的节和节间, 节间有纵肋, 中空, 根状茎上生不定根, 气生茎上轮生磷叶, 基部合生成鞘, 营养枝具分枝, 绿色, 生殖枝不分枝, 棕褐色, 枝顶生孢子叶 球 取永久切片在显微镜下观察, 可见孢子叶盾状, 孢子囊生于孢子叶下面边缘 2. 观察节节草 (Hippochaete ramosissimum) 腊叶标本 ( 三 ) 真蕨亚门 (Filicophytina) 1. 蕨属 (Pteridium)(1) 孢子体 : 观察腊叶标本和显微镜下观察 蕨孢子叶经囊群横切永久制片, 注意下列特征 : 茎根状, 具不定根, 叶大,2~4 回羽状复叶 ; 孢子囊群沿叶缘背面生, 叶缘反卷为假囊群盖 叶片中具维管束 ; 孢子囊群具盖, 其中生数个具柄的孢子囊, 孢 子囊小, 壁单层细胞组成, 具纵行环带, 环带细胞多数内侧壁和两侧壁加厚, 少数壁不加厚的细胞称唇细胞, 孢子同型 8

137 (2) 配子体 : 显微镜下观察蕨原叶体装片 原叶体腹面具假根, 假根附近有球形的精子器, 精子器壁细胞一层, 内具 个螺旋 形的精细胞 原叶体腹面顶端凹处有乳头体突起, 即颈卵器颈部, 其腹部埋在原叶体组织内, 具腹沟细胞和卵各一个 (3) 幼期孢子体 : 用解剖镜或显微镜观察其装片 幼孢子体寄 生于配子体上, 具一片初生叶 ( 第一叶 ), 叶下为一突起, 即茎, 其下生根, 以上结构长成后, 转为独立生活, 配子体枯死 2. 槐叶苹 (Salvinia natans) 取浸泡或新鲜标本观察形态 : 小型 浮水植物, 茎细长横走被褐色毛 ; 叶三片生, 上侧 2 片矩圆形, 表面密布乳头状突起, 浮于水面, 为浮水叶, 下侧一片细裂成须, 悬垂水中, 称沉水叶, 无根孢子果生于沉水叶基部短枝上, 有大小之分 取大 小孢果切片在显微镜下观察, 大孢子果内具少数几个大孢子囊, 每个囊内具 1 个大孢子 ; 小孢子果内具多数小孢子囊, 而每个囊内具 64 枚小孢子 ( 示范 ) 3. 观察下列植物标本, 注意其形态特征 : 海金沙 (Lygodium japonicum) 风尾草 ( 井栏边草,Peris multifida) 贯众 (Cyrtomium fortunei) 狗脊 (Woodwardia japonica) 瓦韦 (Lepisorus thunbergianus) 铁线蕨 (Adiantum capillus-veneris) 满江红 (Azolia imbricata) 等 四 作业 : 1. 绘问荆孢子叶放大图, 标明名称 2. 绘蕨孢子叶经囊群横切面, 示孢子囊结构, 并标明各部分名称 3. 绘蕨原叶体外形图, 示假根 颈卵器和精子器 9

138 实验五裸子植物 (Gymnosperm, 一 ) 一 目的要求 : 了解裸子植物的一般特征 二 仪器和用具 : 同前 三 内容和方法 : 1. 苏铁 (Cycas revoluta) 观察盆栽苏铁或腊叶标本 苏铁为常绿乔木, 茎直立不分枝, 叶集生枝顶, 大型, 一回羽状深裂 大 小孢子叶球观察 雌雄异株, 大孢子叶丛生茎顶, 每片大孢 子叶上密生锈色绒毛, 上部宽, 边缘羽裂, 下部为狭长柄, 柄两侧各生 2-6 枚胚珠, 种子核果状, 成熟时朱红色 ; 小孢子叶螺旋排列于长轴上成棒状小孢叶球生于茎顶, 小孢子叶扁平, 肉质, 鳞片状, 窄楔 形, 下面生有许多由 3-5 枚小孢子囊组成的小孢子囊群 用解剖镜观察小孢子囊壁的结构和开裂方式与蕨类的相似 2. 银杏 (Ginkgo biloba) 观察标本 银杏为落叶乔木 ; 枝分营 养性长枝和生殖性短枝 ; 叶扇形, 具二叉分的平行脉 大 小孢子叶球观察 雌雄异株 小孢子叶球呈柔荑花序状, 每个小孢子叶具 1 短柄, 柄端为为由 2 个小孢子囊组成的悬垂的小孢子 囊群 大孢子叶球有 1 长柄, 柄端具 2 个环行大孢子叶, 即珠领 ( 珠座 ), 其上各生 1 枚胚珠, 通常仅一个成熟 种子纵切观察 种子核果状 ; 种皮 3 层, 外种皮肉质, 中种皮骨 质, 内种皮纸质 ; 胚具 2 片子叶, 胚柄不明显, 胚乳丰富 3. 松属 (Pinus) 取马尾松 (P. massoniana) 或黑松 (P.thunbergii) 带大 小孢子叶球的枝条观察 叶二型, 鳞叶螺旋状着生于长枝, 针 叶成束生于极不发达的短枝上 注意 : 针叶每束数目, 并对它作横切面, 显微镜下观察树脂道分布 数目及维管束数目 小孢子叶球 ( 雄球花 ) 观察 : 小孢子叶球长椭圆形, 生当年生新 枝基部 ; 小孢子叶背生 2 个小孢子囊 用针取小孢子囊中花粉在显微镜下观察, 可见每粒花粉具 2 个气囊 大孢子叶球 ( 雌球花 ) 观察 : 大孢子叶球为球形锥体, 一般生于 当年生新枝顶端 用镊子取大孢子叶置解剖镜下观察 每片大孢子叶由苞鳞 ( 生于珠鳞表面 ) 珠鳞和倒生于珠鳞腹面的 2 枚胚珠组成 10

139 球果观察 : 种鳞 ( 果鳞 ) 由珠鳞发育而来, 顶端肥厚称鳞盾, 微具横脊即鳞脊, 中央 ( 先端 ) 微凹为鳞脐 ( 鳞脐在有些种类为凸起, 有刺或无刺 ), 发育的种鳞具 2 粒种子 ; 种子上部具翅 ( 有些种类无翅 ) 四 作业 : 1 绘苏铁大 小孢子叶外形图, 并标名称 2 绘银杏大 小孢子叶球外形图, 并注明名称 3 绘银杏种子纵切面图, 并标名称 4 绘松大 小孢子叶球纵切面, 并注明各部分名称 5 绘松果球的一枚种鳞, 标出鳞盾 鳞脐和鳞脊 11

140 实验六裸子植物 ( 二 ) 一 目的要求 : 识别常见裸子植物种类 二 仪器和用具 : 放大镜 解剖针 镊子 刀片 三 内容和方法 : 在校园内或附近实地观察识别常见的裸子植物种类 ( 个别重要种类如当地不产, 可观察腊叶标本 ): ( 一 ) 苏铁科 (Cycadaceae) 苏铁 (Cycas revoluta) ( 二 ) 银杏科 (Ginkgoaceae) 银杏 (Ginkgo biloba) ( 三 ) 松科 (Pinaceae) 1. 日本冷杉 (Abies firma);2. 银杉 (Cathaya argyrophylla);3. 雪松 (Cedrus deodara);4. 金钱松 (Pseudolarix kaempferi);5. 白皮松 (Pinus bungeana) 或日本五针松 (P. parvifora);6. 马尾松 (Pinus massoniana); 7. 黑松 (Pinus thunbergii) ( 四 ) 杉科 (Taxodiaceae) 1. 柳杉 (Cryptomeria fortunei);2. 杉木 (Cunninghamia lanceolata); 3. 水杉 (Metasequoia glyptostroboides) 观察要点 : 叶形, 互生或对生 ; 球果苞鳞和种鳞的结合情况 ( 五 ) 柏科 (Cupressacae) 1. 侧柏 (Platycladus orientalis);2. 柏木 (Cupressus funeberis);3. 圆柏 (Sabina chinensis);4. 龙柏 (Sabina chinensis kaizuca );5 刺柏 (Juniperus rormosana) 观察要点 : 叶形, 鳞叶尖或钝, 刺叶是否下延生长 ; 生鳞叶小枝扁平或圆, 下面有否白粉 ; 球果结构 ( 六 ) 罗汉松科 (Podocarpaceae) 1. 罗汉松 (Podocarpus macrophyllus);2. 竹柏 (Nageia nagi) 观察要点 : 叶形 ; 大 小孢子叶求结构 ; 球果形态 ; 核果状种子 : 四 作业 : 12

141 1 列表指出松科 杉科和柏科的异同点 2 通过上述实验, 总结裸子植物的主要特征 13

142 实验七被子植物 (Angiosperm, 一 ) 一 目的要求 : 了解被子植物原始特征 ; 掌握各科主要特征 ; 识别常 见植物 二 仪器和用具 : 同实验六 三 内容和方法 : ( 一 ) 花 果的解剖 1. 木兰科 : (1) 白玉兰 ; (2) 含笑 观察两种植物花的各部分数目 排列方式和果实的类型 2. 蔷薇科 : (1) 麻叶绣绒菊 ;(2) 蛇莓 ;(3) 野蔷薇 ;(4) 垂丝海棠 ;(5) 桃 花 5 出数 ; 雄蕊与花鼓合生成花筒 ; 子房上位或下位, 单雌蕊 复雄蕊, 心皮分离或合生 ; 梨果 核果, 瘦果或蓇葖果 3. 木樨科 : 丁香圆锥花序 ; 花辐射对称, 花冠 萼筒 4 裂, 雄蕊 2, 子房 2 室 ; 蒴果 ( 二 ) 识别下列植物 ( 以室外为主, 少量重要种类当地不产者, 观察腊叶标本等 室外教学的安排可与后面实验的本部分合并, 分若干次 完成, 且前后次序应据季节作调整, 不必拘泥于 指导 中排列的顺序 ): 1. 木兰科 : 木莲 白玉兰 广玉兰 紫玉兰 合笑 鹅掌楸 观光木等 提示 : 枝条具环状托叶痕 ; 叶形 ; 花着生位置 ; 每心皮胚珠 ( 种子 ) 数 2. 蔷薇科 : 蛇莓, 枇杷, 白娟莓, 垂丝海棠, 石楠, 红叶李, 桃, 毛樱花, 绯红重瓣晚樱, 月季, 野蔷薇, 金樱子, 茅莓, 麻叶绣绒菊 提示 : 上述各种各属哪个亚科 ; 单叶或羽状复叶 ; 观察刺 ; 花 果形态 3. 木樨科 : 迎春花, 金钟花, 白蜡树, 女贞, 小蜡, 桂花, 油 14

143 橄榄 4. 杨柳科 : 垂柳 提示 : 花序直立 ; 注意叶形等 四 作业 : 1 绘含笑花纵剖面图 2 绘日本樱花 野蔷薇花展开图 3 绘丁香花展开图 五 思考题 : 1 如何区别木兰属 含笑属 木莲属和鹅掌楸属? 2 比较蔷薇科四亚科主要特征的异同点 3 杨属 柳属的分类依据是什么? 15

144 实验八被子植物 ( 二 ) 一 目的要求 : 掌握各科主要特征, 并识别常见植物 二 用品 : 同实验六 三 内容和方法 : ( 一 ) 解剖下列植物花果 : 1. 桑科 : 构树观察 : 雄 雌花序及花组成, 果实类型 2. 石竹科 : 粘毛卷耳全株密被长柔毛 花瓣 4 或 5; 雄蕊 10; 特立中央胎座 蒴果 10 齿裂 3. 十字花科 : 诸葛菜十字花冠 ; 四强雄蕊 ; 子房假 2 室 长角果, 四棱柱形 4. 含羞草科 : 合欢 5. 苏木科 : 紫荆 6. 蝶形花科 : 紫藤以上 3 科归属豆目 注意观察 : 花冠辐射对称至两侧对称, 假蝶 形还是蝶形 ; 雄蕊多数至定数至 2 体 ; 荚果 ( 二 ) 识别下列植物 : 1. 桑科 : 桑树, 构树, 柘树 提示 : 枝叶具乳汁 ; 柔荑或头状花序 2. 石竹科 : 鹅不食, 粘毛卷耳, 须苞石竹, 繁缕 提示 : 叶对生 ; 节膨大, 节间中空 ; 花瓣数目及分裂 具爪与否 ; 蒴果 3. 十字花科 : 油菜, 荠菜 提示 : 植物体有无辛辣汁液 角果类型 四 作业 : 1 绘粘毛卷耳花株, 示叶序 节的形态 花和果的形态以及子房的纵剖面图 16

145 2 绘诸葛菜花形态图 3 绘紫藤花展开图, 示花萼 旗瓣 龙骨瓣 二体雄蕊 五 思考题 : 试述豆目三科的共同点和分类依据 17

146 实验九被子植物 ( 三 ) 一 目的要求 : 掌握各科主要特征, 并识别常见植物 二 用品 : 同实验六 三 内容和方法 : ( 一 ) 解剖下列植物花果 : 1. 樟科 : 樟重点注意花被数, 雌蕊的排列及花药的开裂方式和方向, 以及发育状况和腺体 2. 大戟科 : 泽漆 取杯状聚伞花序 ( 大戟花序 ) 观察 : 总苞与裂片间有 4 个腺体 ; 雌花 1 朵位于中央, 子房上位,3 心皮 3 室 ; 雄花在雌花周围, 每花 仅 1 枚雄蕊 ; 蒴果 3. 伞形科 : 野胡萝卜 重点 : 复伞形花序, 花 5 出数, 子房下位,2 室 ; 双悬果 ( 二 ) 识别下列植物 : 1. 樟科 : 樟树 山胡椒 狭叶山胡椒 提示 : 叶形 叶脉及香气 ; 花单性还是两性, 花药几室, 花序类型 2. 大戟科 : 重阳木, 泽漆 地锦 乌柏 油桐 提示 : 植物体常具乳汁 ; 叶柄两侧常具腺体 ; 花序及果实形态 3. 伞形科 : 野胡萝卜, 破子草 提示 : 植物体具芳香性气味 ; 叶柄鞘状抱茎 ; 茎中空 ; 复伞形花 序 ; 双悬果 另, 破子草果具倒钩刺 4. 山毛榉科 : 苦槠, 石栎, 白栎 提示 : 常绿或落叶 ; 叶排列为二列或旋转, 叶缘 ; 雄花序直立还 是下垂 ; 每总苞 ( 壳斗 ) 内坚果几枚, 壳斗形态 四 作业 : 1 绘樟树带花的枝条, 示叶形和叶脉 花序 花的组成 2 绘泽漆杯状花序展开图, 并表明各部分 18

147 实验十被子植物 ( 四 ) 一 目的要求 : 掌握各科主要特征, 并识别常见植物 二 用品 : 同实验六 三 内容和方法 : ( 一 ) 解剖下列植物花果 : 1. 夹竹桃科 : 夹竹桃 伞房状聚伞花序 ; 花 5 数, 花萼连合, 呈漏斗状, 喉部有 5 枚撕 裂状副花冠, 雄蕊生于喉部, 花药箭形, 顶端药隔延长成丝状而互相扭曲在一起, 子房 2 室 ; 蓇葖果 ; 种子顶端具黄褐色种毛 2. 菊科 : 一年蓬 ( 蒲公英 ) 观察花序的特点 花冠的形态 聚药雄蕊 下位子房等特征 3. 莎草科 : 香附子 穗状花序指状排列 ; 小穗轴有白色透明的翅, 鳞片紧密,2 列, 膜质, 卵形或矩圆形, 长约 3mm, 中间绿色, 两侧紫红色, 有 5-7 脉 ; 花两性, 雄蕊 3, 雌蕊 1, 柱头 3 裂, 子房上位,1 室,1 胚珠 ; A 坚果, 具 3 棱 4. 禾本科 : 鹅观草观察 : 复穗状花序, 颖片, 稃片, 浆片, 雄蕊, 丁字药, 子房上位, 柱头羽毛状, 颖果 ( 二 ) 识别下列植物 : 1. 夹竹桃科 : 夹竹桃, 络石 提示 : 上述植物体具乳汁 ; 叶轮生 四 作业 : 1 绘夹竹桃花纵剖面图 2 绘一年蓬两种类型花展开图 3 绘鹅观草小穗简图及 1 朵小花形态图 19

148 五 思考题 : 1 菊科两亚科的分类依据是什么? 2 如何区别莎草科和禾本科? 20

149 附录 植物检索表的编制和使用方法 一 目的要求 : 了解植物检索表的编制方法并学会使用它 二 仪器和用具 : 解剖镜 放大镜 解剖镜 镊子 刀片 三 内容和方法 : 1. 植物检索表编制的原理和方法植物检索表 (Key) 是识别 鉴别植物种类的主要工具书, 它根据马克 (Lamark) 提出的二岐分类原则编制而成 首先对一群植物的形态特征进行分析, 找出异同点 ; 接着把这群植物中具有某类相同特征的植物放在一起, 归在一个项目下, 把与之相对的不同特征的植物归在另一个项目下 ; 然后, 在同一项目中又分出对应的两项 ; 如此下去, 最后得出要鉴定的植物所在的分类阶层, 如科 属 种等 2. 植物检索表的类型检索表就其所能鉴定出植物的最终分类阶层又分可检索表 分属检索表 等, 而据检索表文字的排版形式, 通常有定距式和平行式两类 (1) 定距式 校园内裸子植物分科检索表 1. 叶大型, 羽状深裂, 集生树干顶 ; 树干不分枝 苏铁科 Cycadaceae 1. 叶小型, 不为羽状, 生于小枝 ; 树干分枝 2. 叶扇形, 叶脉叉状 银杏科 Ginkgoaceae 2. 叶条形 披针形 针形 钻形 刺形 鳞片状 椭圆形 3. 雌球花珠磷两侧对称, 雌球花发育成球果 4. 球果的种鳞和苞鳞离生 ( 仅基部合生 ) 松科 Pinaceae 4. 球果的种鳞和苞鳞一半或更多合生, 稀种鳞极小, 苞鳞极大或无苞鳞 5. 常绿或落叶性, 叶披针形 条形 钻形或鳞形 ; 种鳞与叶均螺旋排状, 稀对生 杉科 Taxodiaceae 5. 常绿性, 叶鳞形 刺形或披针形 ; 种鳞和叶均交互对生或轮生 柏科 Cupressaceae 3. 雌球果花珠磷 ( 套被 ) 辐射或近辐射对称, 雌球花不发育成球果, 种子核果状或坚果状 罗汉松科 Podocarpaceae (2) 平行式 校园内裸子植物分科检索表 1. 叶大型, 羽状深裂, 集生树干顶 ; 树干不分枝 苏铁科 1. 叶小型, 不为羽状, 生于小枝 ; 树干分枝 2 2. 叶扇形, 叶脉叉状 银杏科 2. 叶非扇形, 其它形状 3 3. 雌球花珠磷两侧对称且发育成球果 4 3. 雌球果花珠磷 ( 套被 ) 辐射或近辐射对称, 雌球花不发育成球果, 种子核果状或坚果状 罗汉松科 21

150 4. 球果的种鳞与苞鳞离生 ( 仅基部合生 ) 松科 4. 球果的种鳞与苞鳞半合生或完全合生 5 5. 常绿或落叶性, 叶披针形 条形 钻形或鳞形; 种鳞与苞鳞均螺旋排列稀交互对生 杉科 5. 常绿性, 叶鳞形 刺形 披针形 ; 种鳞和叶交互对生或轮生 柏科 3. 检索表使用法当我们新采集到一株不认识的植物时, 首先对其形态特征进行观察记录, 然后对检索表条文查对, 若特征与条文相符, 则继续往下查对 ; 若不符, 则对照对应条文 ( 相同编号的另一条 ), 直到找到植物的名称 四 作业 : 1. 用植物分科检索表查出所给植物标本的所属科 2. 编写松科 (10 属 ) 分属检索表 22

151 人体解剖生理学实验指导 ( 应用心理学专业 ) 编者 : 秦粉菊

152 目 录 实验一反射弧的分析 3 实验二神经系统 5 实验三小鼠学习能力的测定分析 9 实验四视野 盲点的测定和声音的传导途径 11 实验五动脉血压的测定及影响因素分析 15 附录一生物机能实验系统介绍 18 附录二实验动物及其主要生理学数据 26 附录三常用生理溶液的配制 32

153 实验一 反射弧的分析 实验目的 : 分析反射弧的组成部分并探讨各部分的作用 实验原理 : 在中枢神经系统的参与下, 机体对体内 外刺激可产生相应的反应过程称为反射 反射活动的结构基础是反射弧 反射弧包括感受器 传入神经 反射中枢 传出神经和效应器五个部分 要引起反射, 首先必须有完整的反射弧 反射弧的任何一部分有缺损, 都会使反射不能实现 实验对象 : 蟾蜍 实验器材和药品 :BL410 生物机能系统, 蛙手术器械, 探针, 铁架台, 骨夹, 刺激电极, 烧杯, 培养皿, 棉花, 纱布, 棉线,1% 硫酸 实验步骤 : 1. 用探针从蟾蜍枕骨大孔刺入颅腔, 捣毁脑组织, 但不能破坏脊髓 2. 用蛙足钉将蟾蜍俯卧位固定在蛙板上, 背侧剪开右大腿皮肤, 在股二头肌和半膜肌间分离坐骨神经, 并穿二根棉线备用 3. 用骨夹夹住蟾蜍的下颌 ( 避免夹到舌根部位 ), 悬挂在铁架台上 4. 启动计算机, 打开 PowerLab 主机电源, 在桌面上单击 Chart4 for windows 图标, 进入 Chart 应用程序窗口 刺激设置方法参见附录 BL410 生物机能系统刺激输出的设置 图 1 脊髓反射实验装置图 观察项目 : 1. 用培养皿盛 1 % 硫酸溶液, 将蟾蜍左后肢的中趾 ( 最长的脚趾 ) 趾端浸于硫酸溶液中, 观察其反应 然后立即用清水洗净脚趾上的残余硫酸, 并用纱布轻轻揩干

154 2. 在左后肢踝关节上方, 将皮肤作一环形切口, 剥去切口以下皮肤 ( 趾尖皮肤应除净 ), 前项实验 3. 用上述方法以硫酸溶液刺激右后肢的中趾趾端, 观察有无反应 4 将该侧坐骨神经作双结扎, 在两结扎线中间将神经剪断 再以硫酸溶液刺激右后肢的中趾趾端, 观察其反应 5. 以连续电刺激 ( 刺激波宽为 0.1 ms, 刺激强度为 1~5 V, 刺激频率为 50 Hz) 对右侧坐骨神经中枢端进行刺激, 观察同侧和对侧后肢的反应 6. 用探针破坏脊髓, 重复项目 5 7. 以上述的电刺激对右侧坐骨神经外周端进行刺激, 观察同侧及对侧后肢的反应 8. 直接刺激右侧腓肠肌, 观察反应 思考题 1. 在右侧坐骨神经剪断后, 动物的反射活动发生了什么变化? 这是损伤了反射弧的哪一部分? 2. 没发生反应的一侧后肢, 是损伤了反射弧的哪些部分? 3. 剥去趾关节以下皮肤, 如不再出现原有反应, 是损伤了反射弧的哪一部分? 注意事项 1. 离断颅脑部位要适当, 太高可能保留部分脑组织而出现自主活动, 太低也会影响反射的引出 2. 夹住蟾蜍下颌时应避免夹在舌根部位, 以免蟾蜍四肢过度挣扎 3. 每次用硫酸溶液或纸片处理后, 应迅速用浴缸中清水洗去皮肤上残存的硫酸, 并用纱布擦干, 以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液 4. 浸入硫酸溶液的部位应限于一个趾尖, 每次浸泡范围也应恒定, 切勿浸入太多 5. 电刺激神经前应先对腿部肌肉进行刺激, 以证明刺激输出有效 创新与探索 1. 每组可自行选择其它方法来证明反射弧的组成 2. 全班对实验结果进行交流

155 实验二 神经系统 实验目的 :1. 观察中枢神经系统的组成及其各自的位置分布 ; 2. 观察周围神经系统 ( 颈丛 臂丛 腰丛和骶丛及各内脏神经丛 ) 的组成, 位置分布 ; 3. 掌握多极神经元及假单极神经元的形态结构特点, 了解神经胶质细胞触觉小体 环层小体 运动终板光镜结构特点 实验材料 : 脊髓横切面模型 脑正中失状切面标本 ( 模型 ) 脑干和间脑标本 ( 模型 ) 脑干神经核模型 整脑标本 ( 模型 ) 全身血管神经标本模型 多极神经元切片 小脑皮质切片 触觉小体 运动终板 假单极神经元 周围神经 ( 横切 ) 切片 周围神经 ( 纵切 ) 切片 实验项目 : 一 中枢神经系统 ( 一 ). 脊髓 (1) 外形观察 : 颈膨大 ; 腰骶膨大 ; 脊髓圆锥 ; 终丝 ; 前正中裂 ; 后正中沟 ; 前 后外侧沟 (2) 内部结构 : 观察 : 灰质 : 前角 后角 白质 : 前索 后索 ( 一 ) 脑 (1) 概况观察 : 分脑干 间脑 小脑和端脑 端脑掩盖间脑 (2) 脑干 : 自下而上分为延髓 脑桥 中脑三部分 脑干观察 : 腹侧面 :ⅰ 延髓 : 前正中裂, 前外侧沟 ; 沟内有舌下神经相连 ; 锥体和锥体 交叉 ⅱⅱ 脑桥 : 基底沟, 桥臂上连三叉神经 ; ⅲ 中脑 : 大脑脚, 脚间窝 ; 窝内有动眼神 经穿出 背侧面 :ⅰ 延髓 : 后正中沟, 后外侧沟 后外侧沟内上 下有舌咽 迷走和副神经 连脑 ; 楔束结节 薄束结节 脑桥, 菱形窝 ⅱ 中脑 : 上 下丘 ; 下丘下方有滑车神经连脑 ⅲ 脑干的内部结构 : 用脑干神经核电动模型显示脑干内神经核团及上 下行纤维束 ( 三 ) 小脑 : 观察小脑外形 (1) 小脑蚓 (2) 小脑半球 ; 小脑扁桃体 ( 四 ) 脑室 : 观察脑室模型, 注意其沟通关系 ( 五 ) 间脑 : 位中脑上方, 主要包括丘脑和下丘脑 观察外形 ( 六 ) 端脑 : 主要包括左 右大脑半球 观察大脑纵裂 ; 胼胝体 ; 大脑横裂 端脑观察 : 1. 大脑半球外形 : 取大脑半球标本, 首先辨认其上外侧面 内侧面和下面 然后依次观察 : (1) 大脑半球的叶间沟和分叶 : 三条叶间沟是 :1 外侧沟 : 是大脑半球上外侧面上的自前下 行向后上的一条深裂, 并延续至大脑半球的下面 2 中央沟 : 在外侧沟的上方, 自半球上缘 中点的稍后方, 斜行前下 几乎到达外侧沟, 沟的上端还延续至半球的内侧面 3 顶枕沟 : 自半球内侧面, 胼胝体后端的稍后方斜向后上方, 略延伸至半球上外侧面 4 分叶 : 额叶位 于中央沟之前, 外侧沟的上方 ; 顶叶在中央沟和顶枕沟之间 ; 枕叶为顶枕沟后方的部份 ; 颞 叶位于枕叶的前方, 外侧沟的下方 ; 岛叶隐于沟的深面, 略呈三角形 (2) 大脑半球各面的主要沟回 1 上外侧面 : 主要观察下述沟 回在中央沟的前方寻认与其平行走向的中央前沟及其位于 两沟之间的中央前回 在中央前沟的前方寻查大致与半球上缘平行走向的额上沟和额下沟,

156 以及额上回 额中回和额下回 在中央沟的后方寻认与其平行走向的中央后及其位于两者之间的中央后回 在颞叶的上部辨认颞上沟 它与外侧沟大致平行走向 外侧沟和颞上沟之间的脑回, 即颞上回 在颞上回的后部, 外侧沟的下壁处可见数条短而斜行的脑回, 即颞横回 在顶叶的下部, 辨认环绕颞上沟末端的角回 2 内侧面 : 主要辨认以下结构 距状沟 : 位于枕叶内, 呈前后弓状走行并与顶枕沟的下端呈 T 字形交叉 扣带回 : 为紧位于胼胝体背侧和头端的脑回 中央旁小叶 : 位于扣带回的背侧, 分前后两部, 分别为中央前 后回在半球内侧面的延续部份 侧副沟 : 在距状沟的下方, 呈前后方向走行, 自枕叶伸向颞叶 海马旁回 : 为侧副沟前部上方的脑回 3 下面 : 主要观察嗅球和嗅束的位置和形态 2. 大脑半球的内部结构 : 在大脑水平切面标本上, 自浅入深观察 : (1) 大脑皮质 : 比较不同部位的厚度差异 (2) 基底核 : 首先在基底核模型观察豆状核 尾状核和杏仁体的形态及其与背侧丘脑的位置关系, 然后观察大脑水平切面标本 :1 豆状核 : 呈三角形, 位于背侧丘脑的外侧, 两者之间隔以白质纤维板 豆状核被穿行其间的两层纤维板, 分隔为内 中 外三部份 外侧份为壳, 其余两部份为苍白球 2 尾状核 : 被切成前 后两部份, 分别位于丘脑的前 后方, 前部较大, 是尾状核的头, 后部较小, 是尾状核的尾 3 杏仁体 : 因其位置较低, 在此种切面上不能看到 (3) 大脑髓质 : 主要观察如下结构 1 胼胝体 : 观察脑的正中矢状切面标本, 可见胼胝体, 略呈钩状, 后部粗厚并弯向后下 在冰冻脑纤维剥制标本上, 可见胼胝体是由联系两侧大脑半球的纤维构成 纤维呈扇形广泛联系两侧大脑半球 2 内囊 : 在冰冻脑纤维剥制标本和脑水平切面标本上, 内囊是位于豆状核 尾状核和丘脑之间的宽厚白质层 白质层的纤维是由上行的感觉纤维束和下行的运动纤维束构成 一侧内囊呈夹角向外的 < 形, 可分为三部 : 前部位于豆状核和尾状核之间, 称内囊前肢 ; 后部位于豆状核和丘脑之间, 称内囊后肢 ; 前 后肢汇合处称内囊膝 3 联络纤维 : 系指联系本侧大脑半球不同部位皮质的纤维, 在冰冻脑纤维剥制标本上容易观察 (4) 侧脑室 : 取脑室标本结合模型观察侧脑室的形态 分部及脉络丛的形态 3. 脑和脊髓的被膜 血管.(1) 脑和脊髓的被膜 : 观察三层被膜由外向内 : 硬膜 蛛网膜 软膜 注意硬脑膜形成的特殊结构 (2) 脑和脊髓的血管 : 主要观察大脑动脉环的构成, 位置 二 周围神经系统 ( 一 ) 脊神经 (1) 颈丛 : 在胸锁乳突肌深面寻认颈神经前支, 可见颈丛由第 1~4 颈神经前支组成 发皮支自胸锁乳突肌后缘中点浅出, 呈放射状分布于枕 耳后 颈侧和颈前部 颈丛最重要分支是膈神经, 观察其走行 (2) 臂丛 : 由第 5~8 颈神经前支和第 1 胸神经前支组成 注意其走行 主要分支 : 尺神经 正中神经 肌皮神经 桡神经 腋神经 注意其起源和特殊的行程加以区分 (3) 胸神经前支除第 1 对胸神经前支的大部和第 12 对胸神经前支的小部分分别加入臂丛和腰丛外, 其余均不形成丛, 第 1~11 对胸神经前支各自位于相应的肋间隙内, 和肋间神经 第 12 对胸神经的前支行于第 12 肋的下方称肋下神经 各神经沿途发肌支, 观察其分布 (4) 腰丛 : 由第 12 胸神经前支小部分, 第 1~3 腰神经前支全部及第 4 腰神经前支一部分组成 主要分支 : 髂腹下神经, 髂腹股沟神经, 闭孔神经, 股神经, 生殖股神经 观察各神经分布

157 (5) 骶丛 : 由第 4 腰神经前支一部分和第 5 腰神经前支组成的腰骶干及所有骶, 尾神经前支组成 其主要分支 : 臀上神经, 臀下神经, 阴部内神经 ; 坐骨神经, 其中坐骨神经又分为 : 胫神经和腓总神经, 观察各神经分布 ( 二 ) 内脏神经丛 : 观察以下神经丛的位置 1. 心丛 2. 肺丛 3. 腹腔丛 4. 腹主动脉丛 5. 腹下丛 三 神经组织切片观察 1. 多极神经元 (5 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 脊髓中央呈蝴蝶形 ( 或 H 形 ) 染色较深的部分为脊髓灰质 ; 周围染色较浅的部分为脊髓白质 灰质内一对较圆钝的膨大突起为前角, 一对细而长的突起为后角, 将前角置低倍镜下观察 低倍 : 白质中多为有髓神经纤维的横断面 灰质中含有神经元的胞体 大量神经胶质细胞和无髓神经纤维等 前角中可见胞体较大的多突起细胞即为多极神经元 ( 前角运动细胞 ) 选择其中结构完整的神经元, 换高倍镜观察 高倍 : 多极神经元胞体大, 呈圆形或多角形, 细胞质着浅红色 ; 细胞核大而圆, 多位于胞体中央, 核内异染色质较少, 故染色浅呈空泡状, 核仁清楚可见 ; 胞质内的紫蓝色小块状或颗粒状结构为尼氏体 胞突多为数个, 长短不一, 胞质内见有颗粒状尼氏体的胞突为树突 ; 起始部呈圆锥形, 内无尼氏体, 染色浅的胞突为轴突 在神经元周围有很多小而圆形的胞核为神经胶质细胞核 2. 假单极神经元 (7 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 切片上呈椭圆形或长椭圆形 低倍 : 神经节外围有致密结缔组织被膜, 实质内神经元被神经纤维束及结缔组织分隔成群, 其胞体大小不等 神经纤维大部分是有髓神经纤维 高倍 : 选择一个较大的神经元进行观察 胞体近圆形, 突起较难见到 ; 胞核大而圆, 染色浅, 有明显的核仁 ; 胞质嗜酸性, 内有细颗粒状染成紫蓝色的尼氏体 每个节细胞的胞体均被一层扁平或立方形的卫星细胞所包裹 3. 周围神经 ( 横切 )(6 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 切片上圆块状为神经横切面, 每一切面内含有很多有髓神经纤维 低倍 : 在整个神经外面包围的结缔组织即为神经外膜 其中含有血管与脂肪细胞等 结缔组织伸入神经内将其分成大小不等的神经纤维束, 包在每个神经纤维束外面的结缔组织为神经束膜 ; 伸入神经纤维束内, 包在每条神经纤维外面的结缔组织为神经内膜 高倍 : 见神经纤维为大小不等的圆形结构 其中央染成紫红色的小点是轴突横切面, 轴突周围浅染区是髓鞘 髓鞘外围染成红色的环状结构为神经膜 ( 施万细胞的外侧胞质 胞膜及施万细胞外的基膜 ) 有些还可见施万细胞的细胞核 4. 周围神经 ( 纵切 )(10 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 切片上长条状为神经纵切面 低倍 : 在整条神经外面有神经外膜, 内有紧密平行排列的神经纤维 高倍 : 神经纤维中央染成紫红色的一线状结构为轴突 ; 轴突两边呈泡状或网格状结构部分为髓鞘 ; 髓鞘外缘染成浅红色的细线状结构为神经膜, 并可见蓝色的椭圆形施万细胞胞核 神

158 经纤维上每隅一段距离, 神经膜向内凹陷, 髓鞘中断形成一个狭窄区即为郎飞结, 两郎飞结之间的一段神经纤维为一个结间体 5. 触觉小体 (46 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 表面染色较深部分为表皮, 下方红色部分为结缔组织真皮, 结缔组织向上皮底部突出的部分为真皮乳头 低倍 : 在真皮乳头内可见椭圆形小体, 即触觉小体 高倍 : 触觉小体呈卵圆形, 外包有结缔组织被囊, 小体内有许多横列的扁平细胞 6. 环层小体 (46 号 H.E 染色 ) 观察内容 : 肉眼 : 紫红色的一侧为表皮 ; 下方红色的为真皮 真皮下粉红色部分为皮下组织 环层小体在真皮深层或皮下组织 低倍 : 在真皮深部或皮下组织的结缔组织内, 可见体积较大的圆形或椭圆形小体, 即环层小体 高倍 : 环层小体一般以横切面为多, 呈圆形, 小体的中央有一染成红色的小点, 为神经纤维末梢的横切面, 周围有很多层由扁平细胞呈同心圆排列的被囊 纵切面则呈椭圆形, 小体的中央有一均质圆柱体 7. 运动终板 (11 号氯化金染色 ) 观察内容 : 低倍 : 可见骨骼肌纤维染成浅紫色, 而神经纤维染成黑色 神经纤维其分支的终末膨大形成爪状末梢附着在骨骼肌纤维上 高倍 : 可见运动终板的爪状末端常呈扣状膨大, 附着在骨骼肌纤维上 复习思考题 ( 一 ) 在 HE 染色组织切片上如何识别神经细胞? ( 二 ) 尼氏体 神经原纤维 突触有何染色特性? 其光镜结构和超微结构如何? ( 三 ) 在 HE 染色组织切片上如何区分有髓和无髓神经纤维? ( 四 ) 如何区别横断面上的平滑肌和神经纤维的形态结构?

159 实验三 小鼠学习能力的测定分析 实验目的 : 学习用 Y 型迷宫测定小鼠学习能力的方法, 并自行设计探讨各种因素 ( 如热应激, 冷应激, 疲劳态, 睡眠剥夺和缺氧等 ) 对小鼠学习记忆能力的影响 实验原理 : Y 型迷宫即为 Ⅲ 三等分辐射式迷宫, 由三个支臂和一个连接区组成, 三臂相互夹角为 120, 每臂底部铺以细铜棒 铜棒可与刺激电源相通 各臂未端装有信号灯, 信号灯开启指示该臂为安全区, 即该臂底部不通电 安全区的方位可随机变换, 当某臂为安全区时, 另两臂和连接区均带电, 可训练动物学会主动逃避反应, 逃向安全区 因此 Y 型迷宫是利用大鼠对电刺激 ( 危险信号 ) 的逃避来使小鼠对信号灯 ( 无关信号 ) 形成条件反射, 通过测其形成反射所需的学习次数 n 来表示其学习能力 n 增加, 表示大鼠的学习能力下降 ;n 降低, 表示大鼠的学习能力升高 实验对象 : 小鼠实验器材和药品 :Y 迷宫, 冰块, 热水 水池 水平台 钠石灰 实验步骤 : 1. Y 型迷宫 :⑴ 接通电源前, 把迷宫与刺激器的连接线插准 迷宫 I 区面板底下面有一个梯形面的 40 插 注意 : 接插时梯形的面要对准! 不然易损坏仪器 ⑵ 开机前, 应把输出强度拧到最小位置 ( 向左 ) ⑶ 开机后, 立即有刺激输出, 面板上八只发光二极管循环闪烁 ⑷ 按实验需要, 可使三个区中任意一区为安全区 如按下 I 键,I 区指示灯亮,I 区为安全区, 其他各区均有刺激 按 + - 键设定时间, 设定后按 复位 键确认, 在设定时间内 I 区没有刺激, 但灯亮 ⑸ 按 0 键时, 三个区均无刺激, 指示灯不亮 ; 但中央隔离区仍有刺激, 以阻止动物从一区进入另一区 图 1 Y 型迷宫实验装置图 2. 学习测试 : 三臂末端小区按 I 一 Ⅱ 一 Ⅲ 一 I 臂轮流作为起步区或安全区 小鼠在信号灯亮后 或遭受到电击后直接逃避至安全区者为正确反应, 反之为错误反应 将小鼠放入迷宫箱某

160 一臂, 适应环境 3~5min 后通电电击, 大鼠性喜暗处, 但进入暗处的小鼠会受到电击, 记为错误 当小鼠进入光亮处才免受电击, 一次性逃避至安全区记为正确 3. 学习能力指标 : 将般将小鼠经训练而达到学会的标准定为连续 10 次测试中有 9 次正确者 记录每一小鼠迷路分辨学习达到学会标准所需的训练数, 以此作为评价小鼠学习能力好坏的客观指标 观察项目 : 1. 记录正常情况下小鼠学习能力指标 2. 热应激等对小鼠学习能力的影响 3. 冷应激对小鼠学习能力的影响 4. 疲劳态对小鼠学习能力的影响 5. 缺氧对小鼠学习能力的影响 6. 实验结束后, 将实验记录填人表中 ( 自行设计表格 ) 注意事项 1. 严把筛选关是保证实验结果可靠性 2. 确保仪器性能稳定 3. 实验环境的要求 : 为了排除噪音 光线 时间等外界因素的干扰 要求实验环境安静 光线较暗 ( 可挂黑色 不透光窗帘 ), 一般在上午或下午的固定时间进行 创新与探索 1. 每组自行选择一种因素, 设计实验, 例如睡眠剥夺可设计不同的睡眠剥夺时间观察睡眠剥夺对小鼠学习能力的影响 2. 最后对实验结果进行全班交流

161 实验四 视野 盲点的测定和声音的传导途径 项目一视野测定 实验目的 : 学会视野的测定方法, 了解测定视野的意义 实验原理 : 视野是单眼固定注视正前方时所能看到的空间范围, 此范围又称为周边视力, 也就是黄斑中央凹以外的视力 借助此种视力检查可以了解整个视网膜的感光功能, 并有助于判断视力传导通路及视觉中枢的机能 正常人的视力范围在鼻侧和额侧的较窄, 在颞侧和下侧的较宽 在相同的亮度下, 白光的亮度最大, 红光次之, 绿光最小 不同颜色视野的大小, 不仅与面部结构有关, 更主要的是取决于不同感光细胞在视网膜上的分布情况 实验对象 : 人 实验器材 : 视野计, 各色 ( 白 红 黄 绿 ) 视标棒, 视野图纸, 铅笔 实验步骤和观察项目 : 1. 观察视野计的结构并学会使用 视野计的样式颇多, 最常用的是弧形视野计 它是一个 安在支架上的半圆弧形金属板, 可围绕水平轴旋转 360 该圆弧上有刻度, 表示由点射向 视网膜周边的光线与视轴之间的夹角 视野界限即以此角度表示 在圆弧内面中央装一 个固定的小圆镜, 其对面的支架上附有可上下移动的托颌架 测定时, 受试者的下颌置 于托颌架上 托颌架上方附有眼眶托, 测定时附着在受试者跟窝下方 此外, 视野计附 有各色视标, 在测定各种颜色的视野时使用 2. 将视野计放在光线充足的桌子上, 让受试者背对光线, 面对视野计坐下, 下颌放在托架上, 眼眶下缘靠在眼眶托上 ( 简易视野计无托颌架, 仅有眼眶托 ), 使眼恰与弧架的中心位于同一水平面上 ( 图 3-27) 3. 先将弧架摆在水平位置, 遮住左眼, 用右眼注视弧架的中心点 实验者从周边向中央慢慢移动贴有白色纸片的视标棒 随时询问受试者是否看见了白色视标 当受试者回答看到时, 就将视标棒移回一些, 然后再向前移, 重复试一次 待得出一致结果后, 就将受试者刚能

162 看到视标时视标所在的点标在视野图纸的相应经纬度上 4. 将弧架转动 45, 重复上述的操作 如此继续下去, 分别测定 的视野范围, 共操作 8 次, 得出 8 个点 将视野图纸上测得的 8 个点依次连成光滑的封闭曲线, 就得出白色视野范围 5. 按相同的操作方法, 分别测定红 黄 绿或其它三种颜色的各色视野 6. 同样方法测出左眼的视野 注意事项 : 1. 测试过程中, 受试者眼应始终凝视弧架的中心点 2. 测试时, 色标移动速度要慢 思考题 : 不同颜色的视野范围有何不同? 创新与探索 1. 每组改变实验环境的光线, 观察光线强弱对视野的影响 2. 设计实验观察情绪对视野的影响 项目二盲点测定 实验目的 : 证明盲点的存在及测定其大小 实验原理 : 视神经自视网膜穿出的部位缺乏感光细胞, 外来的光线成像于此处不能引起视觉 因此, 将视神经穿出视网膜的部位称作盲点 我们可以根据物体成像的规律, 从盲点的投射区域, 推算出盲点所在的位置和范围 实验对象 : 人实验器材和用品 : 白纸, 铅笔, 小黑色目标物, 尺, 遮眼板 实验步骤和观察项目 : 1. 证明盲点的存在 : 在黑板上贴一张 cm 的白纸, 在白纸的左侧面画一个小而显眼的黑色 + 字, 距 + 字右侧 25 cm 处画一个直径 5 cm 的黑色圆形色标 受试者站在距白纸 2m 处, 遮住左眼, 用右眼注视正前方白纸上的 + 字, 此时白纸右侧的圆形色标清楚可见 令受试者向白纸缓慢前行, 在前进中圆形色标突然从受试者视野中消失, 若继续缓慢前行, 圆形色标又会在受试者视野中重新出现 这样, 可证明盲点的存在 2. 在黑板上和眼相平行的地方划一白色 + 字记号, 受试者立于黑板前, 使眼与 + 字的距离为 50 cm 用遮眼板遮住一眼, 让受试者用另一眼目不转睛地注视 + 字 实验者将小白色目标物由 + 字开始慢慢向所测眼的外侧移动, 到受试者刚好看不见目标物时, 就把目标物所在位置记下来 继续再将目标物慢慢向外侧移动, 直到它刚又被看见时, 再记下它的位置 由所记下的两个记号的中点起, 沿着各个方向移动目标物, 找出并记录目标物能被看

163 见和看不见的交界点 将所记下的各点依次连接起来, 就可以形成一个大致呈圆形的圈 此圈所包括的区域叫做盲点投射区域 3. 依据相似三角形各对应边成正比的定理, 计算出盲点与中央凹的距离和盲点的直径 参考图 3-28 及下列公式 : 图 计算盲点与中央凹的距离和盲点的直径 盲点与中央凹的距离 (mm)= 盲点投射区域与十字距离 (15 500) 盲点的直径 (mm)= 盲点投射区域的直径 (15 500) 参考值 1. 生理性盲点呈椭圆形, 垂直径 7.5cm+2cm, 横径 5.5cm~2cm 2. 生理性盲点在注视中心外侧 15.5cm, 在水平线下 1.5cm 思考题 : 为何在正常双眼视觉中不能发现盲点的存在 ( 无视野缺损现象 )? 项目三声音传导的途径 实验目的 : 通过任内氏和魏伯氏试验, 了解气传导和骨传导的两种不同途径, 进而了解临床上鉴别传导性耳聋和感音性耳聋的常用方法 实验原理 : 声波在正常人主要经外耳 鼓膜和听骨链, 再经卵圆窗传入内耳引起听觉, 称为气传导 声波也可直接作用于颅骨, 引起内淋巴振动, 产生听觉, 称为骨传导 骨传导的效果远较气传导为差 当气传导发生障碍时, 气传导的效应减弱或消失, 骨传导效应相应提高 由于鼓膜或中耳病变等气传导障碍引起的听力下降或消失, 称为传音性耳聋 由耳蜗等病变引起的听力下降或消失, 称为感音性耳聋 实验对象 : 人实验器材和用品 : 音叉 ( 频率为 256 次 / 秒或 512 次 / 秒 ), 棉球

164 实验步骤和观察项目 : 1. 比较同侧耳的气传导和骨传导 ( 任内氏试验, 简称 RT): 2. ⑴. 室内保持安静, 受试者取坐位 检查者振动音叉后, 立即将音叉柄置于受试者一侧颞骨乳突部 此时, 受试者可听到音叉响声, 以后随着时间延长, 声音逐渐减弱 当受试者刚刚听不到声音时, 立即将音叉移至其外耳道口, 则受试者又可重新听到响声 反之, 先置音叉于外耳道口处, 当听不到响声时再将音叉移至颞骨乳突部, 受试者仍听不到声音 临床上叫做任内氏试验阳性 (+), 这说明正常人气传导时间长 3. ⑵. 用棉球塞住同侧耳孔, 重复上述试验 若测气传导时, 振动的音叉在外耳道口听不到声音, 则再敲击音叉, 先置于外耳道口, 待听不到响声时, 将音叉置于颞骨的乳突部, 受试者仍听到响声, 说明气传导时间缩短, 等于或小于骨传导时间, 临床上称为任内氏试验阴性 (-) 比较两耳的骨传导 ( 魏伯氏试验, 简称 WT): 5. ⑴. 将振动的音叉柄置于受试者前额正中发际处, 要受试者比较两耳感受的声音强度 正常人两耳声音强度相同 记录时以 表示偏向, = 表示声音在中间 6. ⑵. 棉球塞住受试者一侧耳孔, 重复上述操作, 询问受试者声音偏向哪侧? 7. 下表是用任内氏试验和魏伯氏试验来鉴别正常人 传音性耳聋和感音性耳聋的试验结果 正常人传音性耳聋感音性耳聋 RT WT 注意事项 : 1. 敲响音叉, 用力不要过猛, 切忌在坚硬物体上敲打, 以免损坏音叉 2. 音叉放在外耳道口时, 应使音叉的振动方向正对外耳道口 注意叉枝勿触及耳廓或头发 思考题 : 声波通过哪些途径传入内耳? 为何正常情况下气传导效果远高于骨传导?

165 实验五 动脉血压的测定及影响因素分析 实验目的 : 了解间接测定动脉血压的原理, 学习用间接测压法, 测定肱动脉的收缩压和舒张压并观察某些因素对动脉血压的影响 实验原理 : 人体血压的测定部位常为肱动脉, 一般采用间接测压法 (Korotkoff 听诊法 ), 即使用血压计的袖带在动脉外施加不同压力, 根据血管音的变化来测量血压 刚能听到血管音时的最大外加压力相当于收缩压, 而血管音突变或消失时外加压力即相当于舒张压 实验对象 : 人实验器材 : 血压计, 听诊器 实验步骤 : 1. 准备 : 血压计有两种, 即水银柱式和表式 两种血压计都包括橡皮袖带 橡皮球和检压计三部分 测压前应检查袖带是否漏气 宽度是否合乎标准 ( 世界卫生组织规定 : 成人上臂用袖带宽度为 14 cm, 长度为以能绕上臂一周超过 20%, 儿童用袖带宽度为 7 cm) 检压计是否准确 ( 检查袖带内与大气相通时, 水银柱液面是否在零刻度 ) 2. 测量人体动脉血压的方法 ( 图 3-15): ⑴. 嘱受试者静坐 5~10 分钟 ⑵. 让受试者脱去右臂衣袖 ⑶. 松开血压计橡皮球的螺帽, 驱出袖带内的残留气体, 然后将螺帽旋紧

166 ⑷. 让受试者前臂放于桌上, 手臂向上, 使前臂与心脏等高, 将袖带缠在该上臂, 袖带下缘至少在肘关节上 2 cm, 松紧适宜 ⑸. 在肘窝内侧先用手指触及肱动脉脉搏所在, 将听诊器胸件放在上面 不可用力压迫胸件, 也不能接触过松, 更不能压在袖带底下进行测量 ⑹. 用橡皮球将空气打入袖带内, 使血压计的水银柱逐渐上升到听诊器内听不到血管音为止 继续打气, 使水银柱再上升 3~4 KPa, 随即松开气球螺帽, 徐徐放气, 水银柱缓慢下降, 仔细听诊, 当听到第一声 咚咚 样血管音时, 血压计上所示水银柱刻度即为收缩压 ⑺. 继续缓慢放气, 此时血管音先由低而高, 然后由高突然变低, 最后则完全消失 血压计在听诊音调突然由高变低瞬间所示的水银柱刻度则为舒张压, 血压记录常以 收缩压 / 舒张压 KPa 表示 ⑻. 连测 2~3 次, 取其最低值 发现血压超出正常范围时, 应让受试者休息 10 分钟再复测 在休息期间可解下受试者的袖带 观察项目 : (1) 热应激对受试者对血压的影响记录正常血压后, 令受试者在比室温高 10 处呆 20min 后测压 (2) 情绪对受试者血压的影响待血压恢复正常后, 令受试者回忆其最气愤的往事 1 分钟测压 (3) 强运动对受试者血压的影响让受试者作原地蹲起运动,1 min 内完成 50~60 次, 共做 5min 运动后立即坐下测压, 并将最大的血压数值记录下来 (4) 冰水刺激对血压的影响受试者取坐位, 测量正常血压, 然后让受试者的手浸入冰水中 2 min 测压 注意事项 1. 测压时室内需保持安静, 以利听诊 2. 戴听诊器时, 务使耳具的弯曲方向与外耳道即接耳的弯曲端向前 思考题 : 1. 正常人从卧位转为立位时, 动脉血压有否明显变化, 为什么? 2. 试从间接测压法原理解释为何不能将听诊器的胸件放在袖带下进行测量? 3. 为何肌肉收缩状态的变化会影响到血压的改变? 创新与探索

167 1. 每组选择一种机体状态自行设计实验, 观察人体某种状态对对血压的影响 2. 设计实验观察情绪对血压的影响 [ 附 ] 电子血压计 : 人体动脉血压的测定除常规使用的血压计以外, 尚有多种应用传感器来测定血压的装置 如今最常用的电子血压计测血压完全自动化, 十分方便快捷, 有臂式 腕式和指式 电子血压汁测压的基本方法利原理与一般血压计大体相同, 所不同的是用微音器代替听诊器检拾血管音, 再通过传感, 将血管音转变为闪光 数字 报话等形式显示血压数值 这样, 自己就可测血压 无论血压计如何变化, 都必须用水银检压计校对读数, 换算为动脉的血压数值

168 附录一生物机能实验系统介绍 BL-410 生物机能实验系统是配置在微机上的 4 通道生物信号采集 放大 显示 记录与处理系统 它由以下三个主要部分构成 : (1) PC 机 (2) BL-410 系统硬件 (3) TM_WAVE 生物信号采集与分析软件 BL-410 系统硬件是一台程序可控的, 带 4/8 通道生物信号采集与放大功能, 并集成高精度 高可靠性以及宽适应范围的程控刺激器于一体的设备 TM_WAVE 生物信号采集与分析软件利用微机强大的图形显示与数据处理功能, 可同时显示 4 通道从生物体内或离体器官中探测到的生物电信号或张力 压力等生物非电信号的波形, 并可对实验数据进行存贮 分析及打印 该系统可适用于大 中专医学院校, 科研单位进行生理 药理 毒理和病理等实验, 并可完成实验数据的分析及打印工作, 它完全替代了原有利用分离的放大器 示波器 记录仪 刺激器等仪器所构成的烦琐而性能低下的生物信号观测系统, 功能更加强大与灵活, 必将成为下一代的生物信号显示与处理系统 TM_WAVE 生物信号显示与处理软件中的所有功能及操作方法, 您都能够在以下的叙述中找到 因此, 如果您想更好地使用 BL-410 生物机能实验系统, 完成更多的分析与处理功能, 那么您应该认真阅读下面的内容 TM_WAVE 信号显示与处理软件以图形化的 WinXP 操作系统为基础, 采用图形化的程序设计方法, 在出色完成各项功能的基础上, 以尽量方便用户使用为设计准则, 使用户通过直接点击直观的 有意义的图标为主要操作手段, 来完成大部分的功能 但是, 由于该软件要在有限的屏幕大小上表达众多的意义, 既要完成 4/8 道生物信号波形的显示, 又要将以往分散在几个仪器上的功能操作面板 ( 如放大器调节面板, 刺激器调节面板, 显示控制面板等 ) 以及一些提示信息集中显示在屏幕上, 还要考虑到用户的使用方便, 即尽量直观地进行操作, 而不必键入过多的命令或进入到深层次的菜单中进行操作, 这之间形成了一对矛盾, 显然鱼和熊掌不可兼得, 因而在设计中仍然保留有菜单操作 一 启动软件 1 进入 WinXP 操作系统 ; 2 如果您已经在您的计算机上安装了 TM_WAVE 生物机能实验系统, 那么在 WinXP 操作系统的桌面上将出现启动图标, 参见下图 双击 TM_WAVE 软件的启动图标即可以启动该软件 WinXP 桌面上的 BL-420S 生物机能实验系统 启动图标二 退出软件

169 选择 TM_WAVE 软件 文件 菜单中的 退出 命令即可退出软件 三 主界面主界面从上到下依次主要分为 : 标题条 菜单条 工具条 波形显示窗口 数据滚动条及反演按钮区 状态条等 6 个部分 ; 从左到右主要分为 : 标尺调节区 波形显示窗口和分时复用区三个部分 在标尺调节区的上方是通道选择区, 其下方是 Mark 标记区 分时复用区包括 : 控制参数调节区 显示参数调节区 通用信息显示区 专用信息显示区和刺激参数调节区五个分区, 它们分时占用屏幕右边相同的一块显示区域, 您可以通过分时复用区底部的 5 个切换按钮在它们之间进行切换 对于 TM_WAVE 软件主界面中需要特别说明的是视的概念 视可以看作为一个用于观察生物波形信号的复合显示窗口, 其中包括直接用于观察生物波形的显示窗口和相关的辅助窗口 每一个视均包含有 6 个子窗口, 它们分别是 : 时间显示窗口 ( 用于显示记录数据时间 ) 4 个通道的波形显示窗口 ( 每个通道对应于一个波形显示窗口 ) 数据滚动条及反演按钮区( 用于数据定位和查找 ) 视的重要性就在于它把波形的显示部分组成了一个整体, 即视就是一个完整的波形显示系统, 那么到底左 右视的设计有什么好处呢? 首先, 在 TM_WAVE 软件中的左 右视的大小并不固定, 我们通过左 右视分隔条可以同时改变左 右视的大小, 一个视变大的同时另一个视缩小, 当我们把左 右视分隔条移动到最左边或最右边, 那么其中一个视消失, 另一个视变为最大, 此时, 它具有单视显示系统的全部优点, 比如, 显示区域最大等 ; 其次, 如果左 右视同时出现, 在实时实验过程中, 我们可以使用右视观察即时出现的波形, 同时使用左视观察过去时间记录的波形, 这样, 在不暂停或停止实验的情况下, 我们可以观察本次实验中任何时段的波形 ; 在数据反演时, 可以利用左 右视比较不同时段或不同实验条件下的波形, 这些都是单视系统所无法比拟的 注意 : 当您拖动左 右视分隔条显示左视时, 可能会出现这种情况 : 左视下面的时间显示窗口和滚动条没有出现 如果出现这种情况, 您可以重新再拖动一下左 右视分隔条即可 之所以出现这种情况, 与 Windwos 系统的消息机制有关 TM_WAVE 软件主界面上各部分功能一览表生物信号波形显示窗口是 TM_WAVE 软件主界面中最重要的组成部分, 实验人员观察到的所有生物信号波形及处理后的结果波形均显示在波形显示窗口中 BL-410 生物机能实验系统是 4 通道的生物机能实验系统, 即可以同时观察 4/8 个通道的生物信号波形, 那么对应于每个实验通道必须有一个波形显示通道, 所以在 TM_WAVE 软件处于初始状态时屏幕上共有 4 个波形显示窗口 除了与采样通道对应的显示通道之外, TM_WAVE 软件还可以设置 8~12 个分析通道, 即在屏幕上最多可显示的通道数为 16 实验时用户可以根据自己的需要在屏幕上显示 1 至 16 个波形显示窗口, 也可以通过波形显示窗口之间的分隔条调节各个波形显示窗口的高度, 但由于 4/8 个波形显示通道的面积之和始终相等, 所以当您把其中一个显示窗口的高度调宽时, 必然会导致其它显示窗口的高度变窄

170 如果用户使用通道之间的分隔条将各个通道显示窗口的高度调乱, 这时他可能很难将这些窗口的高度恢复到初始大小 不必担心, 有一个简单的方法帮助您将所有通道的显示窗口恢复到初始的大小, 那就是在任何一个显示窗口上双击鼠标左健 实际上在某个通道显示窗口上双击鼠标左健是一个窗口大小切换命令, 它可以将该窗口变为最大化或者将其恢复到原始大小, 在某一个通道显示窗口上双击鼠标左健, 首先将这个窗口变为最大化 ; 然后, 您再在这个最大化的显示窗口上双击鼠标左健, 将把所有的通道显示窗口恢复到初始大小, 所以, 无论您将各个通道显示窗口的高度调得多乱, 最多在某个显示窗口上双击鼠标左健两次, 就可以将所有的通道显示窗口恢复到初始大小 在通道显示窗口中还有一个快捷功能菜单可供您选择 当您在信号窗口上单击鼠标右键时,TM_WAVE 软件将会完成两项功能 : 一是结束所有正在进行的选择功能和测量功能, 包括两点测量 区间测量 细胞放电数测量以及心肌细胞动作电位测量等 ; 二是将弹出一个快捷功能菜单 在这个快捷功能菜单中包含的命令大部分与通道相关, 所以如果您需要对某个通道进行操作, 就直接在那个通道的显示窗口上单击鼠标右键弹出与那个通道相关的快捷菜单 比如对某个通道的波形进行信号反向或平滑滤波等操作 在理解显示窗口快捷菜单命令之前, 我们还需要解释一个概念即区域选择, 所谓区域选择是指在一个或多个通道显示窗口中选择一块区域, 并且该区域以反色方式显示 区域选择之所以重要, 是因为有很多功能与其相关, 包括显示窗口快捷菜单中的数据导出功能 ; 另外, 在进行区域选择的同时,TM_WAVE 软件内部还完成了选择区域参数测量 ( 与区间测量相似, 但不完全相同 ) 和选择区域图形复制等操作, 所以区域选择是一个基础性的概念 如果我们不能了解这个概念和怎样进行区域选择, 那么对于与其相关的描述将很难阐明 怎么进行区域选择呢? 有两种不同的区域选择方法, 一是只在一个通道显示窗口中进行区域选择, 即只选择一个通道显示窗口中的内容 ; 二是同时选择所有通道显示窗口中相同时间段的一块区域 两种区域选择的操作方法基本相同, 只是完成操作的窗口不同, 前一种操作在通道显示窗口中完成, 后一种操作在时间显示窗口中完成 区域选择的具体操作方法是 : 在将要选择区域的左上角按下鼠标左健以确定选择区域的左上角, 然后在按住鼠标左健不放的情况下向右下方拖动鼠标以选择区域的右下角, 当您选择好区域的右下角后松开鼠标左健即完成区域选择操作 当您进行区域选择后, 系统内部将自动完成选择区域的图形复制功能 所谓图形复制, 就是将您区域选择的一块窗口区域连同从这块区域波形中测出的数据一起以图形的方式发送到 Windows 操作系统的一个公共数据区棗剪辑板内, 以后您可以将选择的这块图形粘贴到任何可以显示图形的 Windows 应用软件, 如 Word Excel 或画图中, 方法是选择这些软件 编辑 菜单中的 粘贴 命令 下面我们将对显示通道快捷菜单中每个命令进行详细介绍 : 1 自动回零

171 自动回零功能可以使由于输入饱和而偏离基线的信号迅速回到基线上 如果您给 BL-420/820 系统的信号输入接口加入一个很大的输入信号, 会引起该通道放大器信号饱和, 执行该命令可以立刻消除放大器的零点飘移 2 原始数据导出原始数据导出是指将您选择的一段反演实验波形的原始采样数据以文本形式提取出来, 并存入到相应的文本文件中 原始数据导出功能只在数据反演阶段起作用, 并且在您对某个通道的实验数据进行了区域选择之后这个命令才有效 数据导出的具体操作步骤如下 : 1) 拖动反演滚动条在整个反演数据中查找您需要导出的实验波形段; 2) 将需要导出的实验波形段进行区域选择; 3) 在选择的区域上单击鼠标右键弹出通道显示窗口快捷菜单, 然后选择数据导出命令, 数据导出菜单中有两个子命令 本通道数据 和 所有通道数据, 选择其中一个完成数据导出 执行数据导出命令后得到选择波形段的原始采样数据以文本形式存入到 \data 子目录下, 并以 datan.txt 命名, 其中 n 代表通道号, 例如, 从 1 通道上选择的数据段导出到 data1.txt 文本文件中, 如果选择导出 所有通道数据, 那么导出数据的文件名为 :data.txt 导出的原始数据采用文本格式的原因之一是为了方便地在 notepad 等文本编辑器中进行查看, 另外文本类型这种中间格式可以被读入到很多其它的数据统计 分析软件, 如 Excel MatLab SAS SPSS 等中进行进一步地统计 分析处理 3 测量点数据导出测量点数据导出功能可以将测量光标位置处的波形点数据直接导出到 Excel 中, 也可以将无创血压测定中得到的收缩压 舒张压 心率等指标直接导出到 Excel 中进行统计分析, 这个功能主要用于无创血压测量, 选择这个命令, 会向右弹出一个子菜单 通过这个功能, 在无创血压测量系统中, 可以将每次测量得到的收缩压和舒张压直接导入到 Excel 中, 方法如下 : 1) 打开要测量的数据文件; 2) 通过单击工具条上的 打开 Excel 命令打开 Excel 电子表格 ; 3) 通过窗口左上角的通道选择列表框选择要测量血压的通道, 一般压力在 1 通道 ; 4) 移动十字光标到要测量数据的点, 比如收缩压点, 5) 单击鼠标右键弹出快捷菜单, 选择 测量点数据导出 命令, 在弹出的子菜单中选择要导出的项, 包括 : 收缩压 舒张压 心率和当前值, 选择完成后, 系统自动导出数据到 Excel 中 ;

172 6) 使用同样的方法也可以将光标当前位置处的测量数值直接导出到 Excel 中 ; 7) 测量心率要测量心率必须配合 Mark 标记, 首先将 Mark 标记从窗口左下角拖到要测量的第 1 个脉搏波的顶点, 释放鼠标左键 ; 然后移动光标到第 4 个脉搏波上, 单击鼠标右键弹出快捷菜单, 选择 测量点数据导出 心率, 完成心率的测量并导出到 Excel 4 基线显示开关该命令用于打开或关闭标尺基线 ( 参考 0 刻度线 ) 显示 5 门限显示开关该命令用于打开或关闭频率直方图或序列密度直方图中用于选择分析数据范围的上 下门限线的显示 6 原始波形开关该命令只在刺激触发方式下有效 它用于打开或关闭原始波形 在刺激触发方式下, 如果我们只想在波形显示通道上显示叠加或叠加平均波形, 那么我们可以通过这个命令关闭原始波形, 是屏幕更加清爽 7 叠加波形该命令在刺激触发方式下有效 它用于打开或关闭叠加波形曲线 刺激触发的叠加波形以金黄色显示 8 叠加平均波形该命令在刺激触发方式下有效 它用于打开或关闭叠加平均波形, 叠加平均波形以深灰色显示 叠加平均波形是叠加波形除以一个整数倍数得到的 当您选择这个命令后, 会弹出一个平均倍数输入对话框, 参见下图 对话框中的有效范围是指从 1 到 2 倍当前刺激次数之间的范围, 默认地, 平均输入倍数为当前刺激次数 9 最近 10 次波形开关该命令在刺激触发方式下有效 使用该命令您可以打开或关闭最近 10 次刺激触发得到的波形 最近 10 次波形的同时显示构成一幅伪三维图形, 参见下图, 它将有助于您对前后波形的比较 在同时显示的 10 次波形中, 最上面的一条波形是时间最近的一条波形曲线, 越下面的波形时间越远, 每两条波形之间相隔在 0-25 个屏幕像素值之间可选 10 比较显示该命令用于打开或关闭比较显示方式

173 比较显示是指将所有通道的波形一起显示在 1 通道的波形显示窗口中进行比较 这个功能在进行神经干动作电位传导速度的测定实验中非常有用 11 信号反向该命令用于将选择通道的波形曲线进行正负反向显示 12 平滑滤波该命令用于对选择通道的显示波形进行平滑滤波 13 添加特殊标记该命令用于在波形的指定位置添加一个特殊实验标记 当您在某一个实验通道的空白处 ( 这里所指的空白处是指与其它特殊实验标记相隔一定距离的地方 ) 单击鼠标右键, 此时弹出的窗口快捷菜单中该命令有效, 选择该命令, 将弹出 特殊标记编辑 对话框 您在这个对话框的编辑框中输入新添加的特殊实验标记内容, 然后按下 确定 按钮, 该特殊实验标记将添加在您单击鼠标右键的地方 需要注意的是添加的特殊实验标记不能超过 30 个汉字 添加的内容将被存盘 14 编辑特殊标记该命令用于编辑记录波形中一个已标记的特殊实验标记 当您在一个实验通道中某一个已标记的特殊实验标记上单击鼠标右键, 此时弹出的窗口快捷菜单中该命令有效, 选择该命令, 将弹出 特殊标记编辑 对话框, 您直接在这个对话框的编辑框中修改原有的特殊实验标记内容 15 删除特殊标记该命令用于删除记录波形中一个已标记的特殊实验标记 当您在一个实验通道中某一个已显示的特殊实验标记上单击鼠标右键, 此时弹出的窗口快捷菜单中该命令有效, 选择该命令, 将弹出删除特殊实验标记确认框, 按下 是 (Y) 按钮, 该特殊标记被删除 ; 如果您按下 否 (N) 按钮, 那么此次删除无效 四 数据处理我们进行生物机能实验的目的是验证或研究生物机体在某种实验条件下的反应状况, 这种反应是以某种形式 ( 如数据的变化 图形的变化 ) 表现出来的, 其中某些数据对我们来讲是有用的, 而另一些数据则可能是无效的 将有用的数据从大量的原始数据中提取出来的方法就是数据提取, 数据提取的作用和目的是为了实现数据的共享以及数据的进一步统计 分析 数据提取是指从记录的原始实验数据中以某种形式 ( 如图形 BL-420/820 格式数据 通用文本格式数据等 ) 提取出有用的或我们感兴趣的某一段或多段数据, 并将其存贮为其它格式文件或插入到其它应用程序, 如 Word Excel 中 在 BL-410 生物机能实验系统中, 数据提

174 取方式包括 4 种, 它们分别是 : 数据导出 数据剪辑 图形剪辑和区间测量数据结果的导出, 下面将对它们作一一介绍 1 数据剪辑数据剪辑是指将选择的一段或多段反演实验波形的原始采样数据按 BL-420 的数据格式提取出来, 并存入到您指定名字的 BL-420 格式文件中 由于数据剪辑提取的数据格式为 BL-420 数据格式, 所以该剪辑数据可以被 BL-420 生物机能实验系统的软件所读取, 并能继续在该数据上进行分析以及数据提取等操作 这个命令只有在您对某个通道的数据进行了区域选择之后才起作用 数据剪辑的操作步骤如下 : 1) 在整个反演数据中查找您需要剪辑的实验波形; 2) 将需要剪辑的实验波形进行区域选择, 可以同时选择多屏数据 ; 3) 按下工具条上的数据剪辑命令按钮, 或者在选择的区域上单击鼠标右键弹出快捷功能菜单并选择 数据剪辑 功能, 就完成了一段波形的数据剪辑 ; 4) 重复以上 3 步对不同波形段进行数据剪辑 ; 5) 在您停止反演时, 一个以 cut.tme 命名的数据剪辑文件将自动生成, 您可以按照自己的需要重命名剪辑文件, 但命名的文件不能与打开反演文件重名 数据剪辑的文件存贮在 \data 子目录下, 其文件扩展名为 tme 2 图形剪辑图形剪辑是指将您从通道显示窗口中选择的一段波形连同从这段波形中测出的数据一起以图形的方式发送到 Windows 操作系统的一个公共数据区内, 以后您可以将这块图形粘贴到 BL-410 软件的剪辑窗口中或任何可以显示图形的 Window 应用软件如 Word Excel 或画图中, 方法是选择这些软件 编辑 菜单中的 粘贴 命令即可 图形剪辑的目的有二, 一是为了实现不同软件之间的数据共享, 比如, 您正在 Word 字处理软件中将您的实验结果写成一篇论文, 现在您需要将典型的实验波形加入到您的论文中, 那么您使用 BL-410 系统中的图形剪辑功能即可实现 图形剪辑的另一个目的是将您感兴趣的多幅波形图剪辑在一起, 形成一张拼接图形 ( 您可以在 BL-410 生物机能实验系统软件的剪辑窗口中或 Windows 的画图软件中完成图形的拼接工作 ), 然后打印 图形剪辑的操作步骤如下 : 1) 在实时实验过程或数据反演中, 按下 暂停 按钮使实验处于暂停状态, 此时, 工具条上的图形剪辑按钮处于激活状态, 按下该按钮将使系统处于图形剪辑状态 ; 2) 对您感兴趣的一段波形进行区域选择, 您可以只选择一个通道的图形或同时选择多个通道的图形, 参见 节中关于 区域选择 的描述 ;

175 3) 当您进行了区域选择以后, 图形剪辑窗口出现, 您上一次选择的图形将自动粘贴进入到图形剪辑窗口中 ; 4) 选择图形剪辑窗口右边工具条上的退出按钮退出图形剪辑窗口 ; 5) 重复步骤 剪辑其它波形段的图形, 然后拼接成一幅整体图形, 此时您可以打印或存盘, 也可把这张整体图形复制到其它应用程序, 如 Word Excel 中 3 数据剪辑和图形剪辑的区别数据剪辑是针对数据进行剪辑, 剪辑后的数据与原始记录的数据在格式上没有任何差别, 它可以作为反演数据进行播放, 您也可以对其进行测量 分析, 再剪辑 ( 包括图形剪辑与数据剪辑 ), 实际上, 它还是一段数据, 是删除了无用数据段后剩下的有效数据 图形剪辑是为了把不同实验阶段所显示的波形粘贴在一起, 形成一张完整的实验图形 它剪辑的完全是图形, 正如 Windows 中显示的其它图形一样, 该图形不能进行测量 再剪辑, 只能作为实验结果打印出来进行存档 当然, 剪辑图形还有一个数据剪辑所不能达到的效果, 就是通过图形剪辑剪辑下来的图形可以被其它 Windows 的应用程序所共享 比如, 您正在进行一项科研, 您可能通过我们研制生产的 BL-410 系统得到了一个有用的生物波形, 您开始研究这个波形, 并用 Windows 提供的优秀字处理软件 Word 写一篇文章来阐述您的发现, 您想将这个波形毫无失真地粘贴在您的文章中, 以阐述您的观点, 现在数据共享为您提供了方便, 您可以将您感兴趣的图形剪辑在一起, 形成一张拼接图形, 然后打印

176 附录二实验动物及其主要生理学数据 动物是生理学实验的重要组成部分 生理学工作者应对常用实验动物的生物学特征 主要用途以及主要生理学数据有基本的了解, 才能正确地选择与使用动物, 获得可靠的实验结果 本附录选用几种实验动物较为常用的生理学数据, 这些数据是由不同作者在不同实验条件下所得到的, 把它们视为恒定不变的生理常数或正常值是欠妥当的 由于受到动物种类 品系 性别 年龄 动物数量 饲养条件 健康状况 实验条件及测定方法等多种因素的影响, 因此只能作参考 1. 家兔 (1) 生物学特征家兔属于哺乳纲, 兔形目, 兔科 是穴兔的变种, 品种甚多 最常见的品种有中国本兔 ( 耳短而厚 嘴较尖 白毛 红眼 ). 青紫蓝兔和大耳白兔 ( 日本大耳兔 ) 家兔的寿命约为 4--9 年 性成熟期 5--8 月, 第一次配种期 7--9 月, 交配期 1--5 天, 孕期 30 天 一年内产仔次数为 3--5 胎, 每胎产仔 1--5 只, 哺乳期 天 雌性生育期 4--5 年, 雄性生育期 2--3 年 家兔的年龄鉴定 : 家兔年龄主要依据趾爪和门齿而作大致的鉴别 白色家兔幼年趾爪呈白色, 爪根部呈粉红色, 隐于脚部被毛之中, 随着年龄的增长而露出毛外 一年生家兔趾爪的白色与红色部分长度相等 ; 一年以下, 红色长于白色 ; 一年以上, 白色长于红色 ; 老年趾爪长而弯曲, 色黄 深色兔的爪呈褐黑色 家兔的门齿随年龄而增长 幼兔门齿洁白而短小 排列整齐 ; 老年家兔的门齿呈暗黄色 厚而长齐, 且时有破损 家兔性别的鉴定 : 主要依据外生殖器, 方法是将家兔头部轻轻夹于左腋下, 左手按住动物腰背部, 右手拉开尾巴, 并用中指和环指夹住, 然后用拇指与示指扒开生殖器附近的皮毛 此时, 在雄兔即可见到在圆孔中露出圆锥形稍向下弯曲的阴茎 ( 注意 : 在幼兔看不到明显的阴茎, 只能看到圆孔中有一凸起物 ); 在雌兔, 此处则为一条朝向尾部的椭圆形间隙, 间隙越向下越窄. 此即阴道开口处 天热时, 睾丸可离开腹腔进入耻骨联合两旁的阴囊内 (2) 主要用途家兔易于繁殖与饲养, 在生理学实验中被广泛应用 如常用家兔进行血压 呼吸 泌尿等急性实验 ; 卵巢 胰岛等内分泌实验 离体兔耳和离体兔心常被选用作灌流实验的标本, 进行心血管方面的分析性研究 家兔颈部主动脉神经与迷走神经分离 自成一束, 便于观察主动脉神经的作用, 是研究减压反射的首选动物 在心肌细胞电生理学的研究中, 兔心的窦房结常用来进行心脏起搏电位的研究 需要注意的是 : 家兔心血管系统较为脆弱, 有时出现反射性衰竭 由于家兔是草食动物, 胃的排空时间较长, 另外, 家兔缺乏呕吐反射与咳嗽反射, 故研究此类问题时, 不宜选用 (3) 主要生理学数据

177 以下所列数据均为 ~ 平均值, 括号内为变化范围 血容量 : 占体重的 8.7%(7~10) 心率 :205 次 /min(123~304) 心输出量 :2.8 L/min 或 0.11 L/(kg 体重 min) 2. 大白鼠 (1) 生物学特征大白鼠属于哺乳纲, 啮齿目, 鼠科 我国实验用大白鼠系野生褐鼠的饲养变种 大白鼠的寿命一般为 2~3 年 性成熟期 2~3 月, 第一次配种期 3.5~4 月, 交配期 4~5 天 怀孕期为 30 天 一年内产仔 4~7 胎, 每胎产仔数约 5~9 只, 哺乳期 30 天 雌性大白鼠生育期 1.5~2 年, 雄性为 1~1.5 年 仔鼠初产时无毛, 不睁跟,28~35 天后即可断奶 年龄鉴定 : 可用两种方法判断年龄 1) 从生理特征鉴定年龄耳朵张开 :2.5~3.5 d 睁眼 :14~17 d 门齿长出 :8~12d 第一对臼齿长出 :19d 阴道张开 :72 d 第二对臼齿长出 :21d 睾丸下降 :40d 第三对臼齿长出 :35d 2) 从体重鉴别大致年龄 18 g:20 d 216g: 140d 40 g:40 d 228g: 160d 80 g:60 d 240g: 180d 130 g:80 d250g: 200d 165 g: 100 d 290g: 320d 196 g: 120 d 性别鉴定 : 对大白鼠性别的鉴定主要是观察肛门与生殖器之间的距离 雄性大白鼠的距离较大, 雌性的距离较小 此外, 天热时, 雄鼠的睾丸常从腹腔降到阴囊内 在雌鼠阴部可见肛门 尿道口与阴道口 3 个明显的腔道孔, 腹部有 12 对明显的乳头 (2) 主要用途大白鼠为生理学实验的常用动物, 广泛应用于内分泌与高级神经活动实验 大白鼠有功能完善的垂体 肾上腺系统, 常用作应激反应及肾上腺 垂体 卵巢等内分泌实验 大白鼠的循环系统反应良好, 常用它记录动脉血压, 肢体血管灌流或离体心脏灌流 在解剖上缺少胆囊, 可作胆管插管收集胆汁, 进行消化生理的研究 此外, 在医学上, 大白鼠是营养学 肿瘤 细菌学及关节炎等研究的常用实验动物 (3) 主要生理学数据

178 血容量 : 占体重的 7.4% 心率 :328 次 /min(216~600) 心输出量 :0.047 L/min 血压 : 收缩压 129 mmhg(88~184) 舒张压 91 mmhg(58 145) 红细胞 :890 万 /mm 3 (7.2~9.6) 血红蛋白 :14.8g/100m1 血液 (12~17.5) 红细胞压积 :46 ml/100 m1 血液 (39~53) 平均单个红细胞体积.55 µm 3 (52~58) 平均单个红细胞大小 :7.0µm(6.0~7.5) 红细胞沉降速度 :1 h3 mm 2 h4~5 mm 24 h 10 mm 红细胞比重 :1.090 血小板 : ~ /mm 3 白细胞 : /mm 3 (5~25) 白细胞分类 : 中性粒细胞数量 /mm 3 (1.1~6.0), 占 22%(9~34) 嗜酸性粒细胞数量 /mm 3 (0 0.7), 占 2.2%(0~6) 嗜碱性粒细胞数量 /mm 3 (0~0.2), 占 0.5%(0~1.5) 淋巴细胞数量 /mm 3,(7.0 16), 占 73%(65~84) 大单核细胞数量 /mm 3 (0~0.65), 占 2.3%(0~5) 血液 ph:7.35(7.26~7.44) 血浆比重 :1.029~1.034 呼吸频率 :85.5 次 /min(66~114) 潮气量 :0.86 m1(0.60~1.25) 每分通气量 :0.073 L/min(0.05~0.101) 排尿量 :10 15 ml/( 小 50g 大鼠 ) 体温 ( 直肠 ):39 C(38.5~39.5) 3. 小白鼠 (1) 生物学特征小白鼠属于哺乳纲, 啮齿目, 鼠科 我国实验用小白鼠系野生鼷鼠的变种 小白鼠的寿命一般为 2 年左右 性成熟期 : 雌性为 天 ; 雄性为 天 第一次配种期在生后 2~1.5 月, 交配期 4~5 天, 怀孕期 天 小白鼠一年产仔 4 9 胎, 每胎产仔 2~12 只不等 哺乳期 天 繁殖适龄期为 60~90 天, 生育期约一年 年龄鉴定

179 1) 根据生理特征鉴定年龄耳壳脱出表皮 :3d 脐带脱落 :4d 能翻身 :5 d 能爬出窝外游走 :8d 听觉发育, 能听到声音 :10 d 全身被上白毛, 门齿长出齿肉 :9 11 d 睁眼, 能跑跳 抓东西 :13 15 d 能自行采食 :20 d 雄性睾丸下降 :21 d 雌性阴道张开 :35 d 上述一般发育程序是固定的, 但时间长短视营养及健康状况而异 2) 根据体重鉴定年龄 4 g: 10 d 24g:60 d 8 g: 20 d 25g:70 d 14 g: 30 d 27g:80 d 18 g: 40 d 28g:90 d 22 g: 50 d 30g:100~120d 性别鉴定 : 与大白鼠鉴定方法相同 (2) 主要用途小白鼠繁殖力强, 周期短, 产仔多, 便于人工饲养, 是医学实验, 特别是在大样本的实验中应用最为广泛 如药物筛选 半数致死量的测定 药物的效价比较等 在生理学实验中, 小白鼠也是常用实验动物, 常用于神经系统高级机能的研究及内分泌和生殖生理实验中 (3) 主要生理学数据血容量 : 占体重的 8.3% 心率 :600 次 /min( ) 血压 : 收缩压 113 mmhg(95 125) 舒张压 81 mmhg(67-90) 红细胞 :930 万 /mm 3 (7.7~12.5) 血红蛋白 :14.8g/100m1 血液 (10~19) 红细胞压积 :41.5 mul00m1 血液平均单个红细胞体积 :491em3(48~51) 平均单个红细胞大小 :6.0,em 红细胞比重 :1.090 血小板 : /mm3

180 凝血时间 :24~40s 白细胞 : /mm 3 (4.0~12.0) 白细胞分类 : 中性粒细胞数量 /mm 3 (0.7~4.0), 占 25.5%(12~44) 嗜酸性粒细胞数量 /mm3(0 0.5), 占 2%(0~5) 嗜碱性粒细胞数量 /mm3(0 0.1), 占 0.5%(0~1) 淋巴细胞数量 /mm3(3~8.5), 占 68%(54 85) 大单核细胞数量 /mm3(0~1.3), 占 4%(0 15) 呼吸频率 :163 次 /min(84 230) 潮气量 :0.15m1(0.09~0.23) 每分通气量 :0.024 L/min(0.011~0.036) 排尿量 :1~3ml/d 体温 ( 直肠 ):38 (37 39) 4. 蟾蜍与青蛙 (1) 生物学特征蟾蜍与青蛙均属于两栖纲无尾目 前者属蟾蜍科, 后者属蛙科 蛙类品种甚多, 是脊椎动物由水生向陆生过渡的中间类型 1) 蟾蜍身体较大, 皮肤粗糙, 表面有许多突起, 眼的后方有一对毒腺, 所分泌的黏液为蟾酥 雌性背部突起上生有黑色小棘, 雄性则无 白天隐居于石块 落叶下或洞穴内阴湿处, 傍晚或夜间活动 觅食 以甲虫 蚊虫 蠕虫 多足类及软体动物为食 每年冬季潜伏在土壤中冬眠, 春季出土 3~4 月间在水中产卵 卵结成带状, 数目可达 6 千余枚 卵子体外受精, 受精后两周孵化 幼体形似小鱼, 用鳃呼吸, 有侧线, 称蝌蚪 蝌蚪经 77~91 天变态发育为成体, 转入陆地生活 蟾蜍的性成熟期为 4 年 2) 青蛙一般青蛙较小, 皮肤光滑, 背部有明显的侧褶, 后肢有发达的蹼 雄蛙头部两侧各有一个鸣囊, 是发声的共鸣器 前肢短, 后肢长, 适于跳跃 一般栖居于陆地, 常活动于河边 水田 池塘的草丛中, 以昆虫 蜘蛛 多足类等动物为食 青蛙 10 月以后于泥土中越冬,3 月中旬开始出现,4~6 月间产卵, 受精后 3 天孵化, 蝌蚪经 3~5 月变态发育为成体, 转入陆地生活 性别鉴定 : 蟾蜍性别的鉴定主要靠前肢 2~4 趾侧部的黑疣, 此为黑色的色素突起, 雄性蟾蜍有此黑疣, 雌体则无 此黑疣是在交配时, 雄体用来拥抱雌体的 雄蛙生殖季节在前肢第 1~3 趾有类似的椭圆形抱雌疣 此外, 雄蛙有鸣囊, 可呜叫, 雌蛙则无 另外, 把动物提起时, 前肢作环抱状者为雄性, 前肢呈垂直状者为雌性 (2) 主要用途

181 蛙类虽然较为低等, 但在生理学实验中应用非常广泛 其循环系统 神经系统以及肌肉均为生理学常用的实验材料 诸如离体心脏灌流 下肢血管灌流 微循环的观察 心电图 ; 脊髓休克 脊髓反射 谢切诺夫抑制 反射弧的分析实验以及坐骨神经 腓肠 ~ 肌 坐骨神经 缝匠肌 腹直肌等均为生理学的重要实验用标本 (3) 主要生理学数据蛙类虽为常用实验动物, 但生理学数据并非完善 现以蟾蜍为例加以说明 血容量 : 占体重 5% 心率 :36~70 次 /min 血压 :30~60mmHg( 颈动脉弓 ) 红细胞 :487 万 /mm3(400~600) 血红蛋白 :8g/100m1 血液红细胞脆性 :0.13%NaCl 红细胞比重 :1.090 血小板 : /mm 3 凝血时间 :5 min 白细胞 : /rnm 3 血液比重 :1.014 血浆比重 :1.029~1.034

182 附录三常用生理溶液的配制 自 1886 年任氏溶液 (Ringer solution) 问世以后, 许多生理学者以此为基础, 进行研究 调整和改良, 制备出多种动物的多种组织器官的生理溶液 为了较长时间地维持离体组织器官的正常生命活动, 作为代替体液的生理溶液, 必须具备 4 个条件 :1 应含有该组织器官维持正常机能所需的各类盐离子, 并具有适当的比例 ;2 渗透压应与该动物组织液相等 ;3 酸碱度应与该动物血浆的相同, 并具有充分的缓冲能力 ;4 应含有足够的 O2 与营养物质 在生理学实验中, 常用的生理溶液有生理盐水 任氏液 洛氏液 (Locke) 及台氏液 (Tyrode) 其成分如表 1 表 1 常用生理溶液成分表 (g) 成分 任氏液洛氏液台氏液体生理盐水 两栖类用哺乳类用哺乳类用两栖类哺乳类 NaCl ~ KCl CaCl NaHCO NaH2P MgCl2 0.1 葡萄糖 ~ 蒸馏水 均加至 1 000m1 生理溶液的配制方法 : 一般先将各成分分别配制成一定浓度的母液 ( 表 2), 而后依表中所示容量混合 需要注意的是 :CaCl2 应在其他母液混合并加入蒸馏水后, 再边搅拌边逐滴加入, 以防钙盐沉淀生成 另外, 葡萄糖应在用前临时加入, 否则不宜久置 对于低等动物, 包括海水与淡水无脊椎动物等, 由于其生活环境不同, 所需生理溶液的成分与比例也有差别 表 3 列出低等动物生理溶液成分

183 表 2 配制生理溶液所需的母液及其容量 * 成分 母液浓度 /% 任氏液 洛氏液 台氏液 NaCl KCl CaCl NaH2P MgCl NaHCO 葡萄糖 ~ 蒸馏水 均加至 m1 * 表内务成分除葡萄糖以 g 为单位外, 均以 m1 为单位 表 3 低等动物生理溶液成分表 成分 人工海水 人工海水 Van thoff 海水无脊椎 动物 ( 蟹 ) 淡水无脊椎 动物 ( 砂蟹 ) 淡水无脊椎动物 ( 贝类 淡水无脊 椎动物 ( 鱼 ) NaCl KCl CaCl MgCl MgSO H3BO NaOH 0.02 NaHCO Na2SO

184 普通遗传学实验指导 邵爱华叶亚新 编 苏州科技学院生物与化学工程学院 2010 年 2 月 1

185 目录 实验须知 实验一有丝分裂过程的观察 1 实验二减数分裂与配子形成 5 实验三植物染色体的组型分析..10 实验四果蝇唾腺染色体标本的制备和观察 13 实验五植物多倍体诱导及其细胞学鉴定 19 实验六诱变物质的微核测试及其应用 实验七人体 X 染色质观察 26 实验八小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 29 实验九人类若干性状的遗传特性及其调查分析 33 实验十粗糙链孢霉的分离和交换 38 实验十一果蝇的杂交试验 实验十二同功酶遗传标记分析 42 2

186 实验须知 遗传学实验 是生物学各专业的必修专业课之一, 是遗传学教学中不可缺少的一个重要环节, 为了配合 遗传学 的理论教学而开设, 其发展奠定和巩固了遗传学的核心与前沿学科地位 1. 实验室是进行科学实验 培养严谨求实作风 启迪思维 探索创新的场所 进入实验室工作学习的所有人员必须持严肃科学的态度 2. 实验室必须经常处于整齐 清洁 规范 有序 安全的良好工作状态 禁止在室内吸烟 嬉戏 喧哗 3. 凡进入实验室工作 学习的人员必须服从本室工作人员的管理, 遵守实验室的规章制度, 不准在实验室和利用实验室仪器设备进行与教学 科研实验无关的活动 实验结束后, 如数清点归还 ; 若有损坏 丢失者, 按 仪器设备损坏丢失处理办法 处理 4. 实验前需进行认真预习和准备, 明确实验目的, 掌握实验的基本要求 原理 方法 步骤 ; 了解有关仪器设备的性能 配置 ; 熟悉操作规程及安全注意事项 5. 科学实验中, 应科学操作 细致观察 如实记录 及时整理实验现象和数据记录, 写出有质量的实验报告 6. 爱护实验材料和仪器设备 设施及其它物品 严格按操作规程使用实验室及实验室内的仪器设备 必须按要求做好使用登记和记录 7. 实验结束后, 离室前物品归还原处 清洁室内卫生, 废弃物倒入指定地点 仔细进行水电等安全检查 3

187 实验一有丝分裂过程的观察 一 实验目的学习植物根尖压片方法的基本技术 熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化, 并学会染色体简易永久片的制片技术 二 实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式, 一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中 在有丝分裂时, 细胞核与细胞质有很大的变化, 但以细胞核内染色体的变化最为明显, 而且是有规律地进行 各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的, 并随科属种的不同而具有一定的特征 洋葱体细胞中有 8 对共 16 条染色体, 在有丝分裂过程中, 每个染色体能复制一份, 然后分配到两个子细胞中, 所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目 形态和性质上都是相同的 在细胞遗传学研究中, 人们常常需要了解某一物种的染色体数目, 而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期, 这样能得到较为准确的结果 三 实验材料洋葱 (Aillum cepa) 根尖 ; 蚕豆 (Vicia faba) 根尖四 实验器具和药品试剂显微镜 培养箱 恒温水浴锅 温度计 镊子 解剖针 刀片 载玻片 盖玻片 烧杯 量筒 滴瓶 切片架 切片盒 凹面玻片 青霉素瓶 大培养皿 纱布 吸水纸 铅笔 吸管 卡诺氏固定液 ( 甲醇或 95% 乙醇 3 份, 冰醋酸 1 份 ) 改良苯酚品红染色液 ( 见附录 : 实验试剂的配制 ) 0.002M8- 羟基喹啉水溶液 % 秋水仙素溶液 对二氯苯饱和水溶液 1N HCl 95% 乙醇 正丁醇 加拿大树胶 五 实验方法和步骤 ( 一 ) 材料准备选取蚕豆 ( 或小麦 玉米等 ) 种子放在烧杯中, 放清水浸泡过夜, 使种子吸水胀大后倒出, 再用清水洗几次, 用多层纱布包好种子, 放进 20~25 培养箱内培养 当根尖长 1~3cm 时, 即可以进行预处理 ( 二 ) 预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数, 在固定之前应用理化因素进行预处理, 这样可以改变细胞质的粘度, 抑制或破坏纺锤丝的形成, 促使染色体缩短和分散等 一般是在分裂高峰前处理 1.5h 以上 处理的方法如下 : 1. 秋水仙素水溶液常用浓度为 0.05~0.2%, 室温下处理 2~4h 对抑制纺锤体活动的效果明显, 易于获得较多的中期分裂相, 并且染色体收缩较直, 有利于对染色体结构的研究 4

188 2. 对二氯苯饱和水溶液室温下处理 3~5h, 对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好, 对染色体小而多的植物中, 计数染色体制片效果最好 3.8- 羟基喹啉水溶液使用浓度为 M, 一般认为它将引起细胞粘滞度的改变, 进而导致纺锤体活动受阻 通常处理 2~4h, 可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置, 另一优点是处理后的缢痕区较为清晰 4. 低温处理将材料如小麦, 浸入蒸馏水内, 放置到 1~4 冰箱中 ( 玉米及水稻 6~8 ) 处理 20~24h, 也起到良好的效果 # 下表为不同材料采用不同预处理方法获得的效果, 供参考 (* +++ 优 ++ 良 ) 植物名称染色体数 (2n) 处理因素处理时间温度效果 * 小麦 % 秋水仙素水溶液 9:00-11: 小麦 42 对二氯苯饱和水溶液 10:00-14:00 室温 +++ 小麦 42 1~4 冰箱 20-24h 1~4 +++ 小黑麦 56 对二氯苯饱和水溶液 10:00-14:00 室温 +++ 豌豆 14 对二氯苯饱和水溶液 10:00-11:30 室温 +++ 烟草 48 对二氯苯饱和水溶液 8:30-11:30 室温 +++ 蚕豆 ~0.1% 秋水仙素水溶液 20:00-23:00 室温 +++ 蚕豆 ~0.1% 秋水仙素水溶液 14:30-17: 洋葱 ~0.1% 秋水仙素水溶液 7:30-11: 茄子 M 8- 羟基喹啉 9:00-13: 大麦 ~0.1% 秋水仙素水溶液 8:00-11: ( 三 ) 固定通常采用的是卡诺氏固定液 固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死, 使蛋白质变性, 并尽量保持原来的分裂状态, 同时更易于着色 固定时, 将根尖投入固定液中室温处理 3~24h 材料若不及时用, 可经过 90% 酒精和 70% 酒精浸洗一次, 再换入新的 70% 酒精中, 置于冰箱内 0~4 保存备用 经过较长时间保存的材料, 在进行观察前可用固定液再处理一次, 效果较好 ( 四 ) 解离目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉, 并使细胞壁软化, 便于压片 解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异 方法是 : 将固定后 ( 或保存后 ) 的根尖分装到青霉素小瓶子内, 用清水洗几次, 吸干水, 加入 1N HCl 溶液, 在 60 下水解 8~20min( 洋 5

189 葱用 8min, 蚕豆侧根用 10min, 玉米用 20min), 解离成功的根尖, 分生组织发白, 伸长区已呈半透明, 似烂状 解离后的根尖用水轻洗 2~3 次, 以利于着色 ( 五 ) 染色 压片将解离后的根尖放在凹面玻片内 ( 根尖较长的切除伸长区部位 ), 滴加改良苯酚品红染色液染色 10min 左右 制片时, 取一根尖放在洁净的载玻片上, 用刀片切取 1mm 左右的生长区, 其余部分弃掉, 加半滴染色液, 加盖玻片 用镊子在材料的地方轻压几下, 使生长区的细胞分散开来, 再在盖玻片上覆盖一层吸水纸, 用解剖针或铅笔上的橡皮头敲击根尖部位, 重复几次, 力一次比一次大, 以盖玻片不破裂为准 ( 六 ) 观察将制好的标本片, 置于显微镜下先作低倍观察, 选取不同分裂时期的典型细胞, 换高倍镜观察, 注意核及染色体的动态变化 ( 七 ) 永久装片由临时压片材料做成永久玻片标本, 一般以正丁醇法最为简单可靠 步骤如下, 取四个大培养皿, 分别装入下列溶液 : 1 3/4 95% 酒精 +1/4 冰醋酸 5~10min 2 2/3 95% 酒精 +1/3 正丁醇 3min 3 1/3 95% 酒精 +2/3 正丁醇 3min 4 纯正丁醇 3min 最后用加拿大树胶封片 前期中期后期末期 六 作业及思考题 1 固定液的作用是什么? 在使用固定液时应注意哪些问题? 2 在你观察的细胞分裂过程中, 哪些分裂时期最多? 3 选择各期的典型细胞, 绘图示意 6

190 附 : 孚尔根 [Feulgen] 核反应染色法一 实验目的 学习和掌握孚尔根反应染色法, 鉴定植物细胞核内染色体上 DNA 的存在 二 实验原理 DNA 是主要的遗传物质, 集中于染色体上 1924 年孚尔根首先用席夫试剂 (Schiff) 作试 验, 鉴定了染色体上 DNA 的存在, 故称为孚尔根染色法 孚尔根染色法的反应原理主要与 席夫试剂的化学性质有关, 此试剂的基本成分是碱性品红, 偏亚硫酸氢钠 (NaHSO3) 和盐酸. 碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物 碱性品红原为桃红色, 当与亚硫酸作用时还原, 使醌型变为苯型, 由桃红色变为无色透明的 N- 亚磺酸亚硫酸副品红碱, 当它与醛基作用时, 其分子式又恢复为醌型结构, 呈现紫红色 利用 1N HCl 60 下水解时, 可将 DNA 分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打 断, 使嘌呤脱下, 并使去氧核糖 C-1 位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色 细胞中只有 DNA 才具有这种专一的孚尔根反应, 因此利用孚尔根反应, 可以鉴定 DNA 的存在 并广 泛应用于核及染色体的研究中 三 实验材料植物根尖 减数分裂期的花药 叶片表皮 愈伤组织等 四 实验器具和药品试剂 显微镜 恒温水浴锅 温度计 镊子 解剖针 刀片 冰箱 温箱 天平 载玻片 盖玻片 吸水纸 青霉素瓶 吸管 烧杯 量筒 切片架 切片盒 小口瓶 95% 乙醇 冰醋酸 碱性品红 偏亚硫酸氢钠 盐酸 活性炭 亮绿 五 实验方法和步骤 ( 一 ) 材料准备取一洋葱鳞茎, 置于盛满水的小烧杯上使其长出新根 待根尖长 1cm 时, 于上午 8 时剪下根尖进行预处理 固定 保存 ( 请参考实验一 ) ( 二 ) 水解实验时, 从冰箱取出预先准备好的洋葱根尖, 分装到若干个青霉素瓶中, 用清 水洗三次, 换 1N HCl 洗一次, 倾去, 换入预热 60 的 1N HCl 3ml, 放入恒温水浴锅中在 60±0.5 下水解 10min( 视材料而定, 水解时间可以从 10min 延长至 30min) 然后吸去热 1N HCl, 换入冷 1N HCl 洗一次, 再用清水将根尖洗三次 水解是本实验成败的关键之一 重要的是温度, 应保持在 60±0.5 之间 如果温度过高或 时间过长, 造成水解过度, 醣与醛基之间的键被破坏, 醛基流失到水解液中, 反之, 不能出 现潜在的醛基, 都不能呈现颜色反应 ( 三 ) 染色吸净水分, 加入 Schiff 试剂避光染色 30min, 然后用漂洗液漂洗 2~3 次, 经 水洗后准备压片 ( 四 ) 压片观察取一根尖置于载玻片上, 切下生长区部位 ( 染成紫红色 ), 加一滴 0.1% 亮 绿水溶液对染一 min, 吸去亮绿液, 加一滴清水或 45% 醋酸水溶液压片镜检 ( 五 ) 试剂配制称 1g 碱性品红于 200ml 煮沸的重蒸馏水中,5min 后断电使其冷却至 55~ 50, 过滤到一个棕色的试剂瓶中, 加入 1N HCl 20ml, 继续冷却至 25, 加入 1g 偏亚 硫酸氢钠, 摇动瓶子使其溶解 密闭瓶口, 置黑暗低温处或冰箱内 (4 左右 ),18~24h 后 检查, 试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用, 这就是 Schiff 试剂溶液 如有不同程度的红 色未褪, 可加入 1g 活性炭, 强烈震荡一 min, 仍在低温下静置过夜, 然后用滤纸过滤后使 用 密封瓶口, 包以黑纸, 在 5 以下冰箱内可以保存半年 漂洗液在 200ml 蒸馏水中, 加入 10ml 1N HCl 和 10ml 10% 偏亚硫酸氢钠水溶液 ( 或 1.0g 固体 ) 此液在临用前配制 1N HCl 准确量取 86.2ml 浓盐酸 ( 比重 1.18) 加入到 913.8ml 蒸馏水中 7

191 实验二减数分裂与配子形成 一 实验目的通过植物花粉母细胞的制片和观察, 了解小孢子的形成过程以及减数分裂中染色体的变化情况, 并进一步掌握细胞染色体制片的基本技能 二 实验原理在高等生物里雌雄性细胞形成的过程中, 都是先由有性组织 ( 如花药和胚珠 精巢和卵巢 ) 中的某些细胞分化为孢母细胞 (2n) 以及精母与卵母细胞 (2 n) 进一步由这些细胞进行连续二次的减数分裂, 即减数第一分裂和减数第二分裂, 最终各自产生 4 个小孢子或精细胞, 或是分别产生一个大孢子或卵细胞与三个退化的极体 (1 n) 在分裂过程中, 可以辩认染色体形态和数量上的动态变化, 从而为遗传学研究中远缘杂种的分析 染色体工程中的异系鉴别 常规的组型分析以及三个基本规律的论证, 提出了直接与间接的依据 三 实验材料 蚕豆 水稻 玉米等花药 四 实验器具和药品试剂显微镜 镊子 解剖针 刀片 载玻片 盖玻片 量筒 滴瓶 切片架 切片盒 15cm 培养皿 小培养皿 广口瓶 吸水纸 甲醇 冰醋酸 95% 乙醇 无水乙醇 树胶 改良苯酚品红染色液 五 实验方法和步骤 ( 一 ) 取材固定取材的时间及材料大小必须十分恰当, 才能获得更多的花粉母细胞分裂相, 以供观察 1. 蚕豆蚕豆现蕾后, 于上午 7~9 时摘取茎顶幼小花序, 将周围小叶和苞叶去掉, 留长约 1mm 左右的花苞, 放入内装有卡诺氏固定液的广口瓶中, 固定 3~24h, 转入 70% 酒精中置冰箱内保存 2. 水稻剑叶与其下一叶的叶枕平齐, 即叶枕距为零时取材, 早熟品种应适当提前, 叶枕距可为负 ; 晚熟品种应延迟, 叶枕距应为正 通常穗长 6~8cm, 颖花长 3mm 为花粉母细胞分裂始期 ; 穗长 13~15cm, 颖花长 4mm 为减数分裂盛期 ; 穗长达全长, 颖花长 6mm 时为减数分裂终期 于上午 6~9 时依上述标准取材, 固定保存方法同上 3. 玉米玉米孕穗初期, 早熟品种约 10 片完全展开叶, 中熟品种约 12~14 片展开叶, 晚熟品种约 14~16 片展开叶时取材 从喇叭口往下捏叶鞘, 有松软感觉, 即为雄花序所在部位, 用刀片纵向划一切口, 剖开取出数条花序分枝检查, 如果先端小颖花长 3~4mm, 花药长 2~3mm 时, 花粉母细胞减数分裂相较多, 即可取用 取材时间一般为上午 7~9 时, 固定保存方法同上 ( 二 ) 制片方法先将玉米幼穗置于培养皿内, 加进少许 70% 酒精, 以防材料变干 实验 8

192 时, 取某一分枝, 从不同部位剥离出颖花放在载玻片上 用解剖针或镊子剥开颖壳, 取出花药, 把颖壳清理干净后, 用刀片把花药横切二至三段, 滴一滴染液, 用镊子将花粉母细胞从花药中挤压出来 先用低倍镜检查, 如有所需时期的细胞, 即可将花药移到另一块载玻片上, 滴上染液, 再次将花粉母细胞挤出来, 可重复做二至三张片 待把空的花药壁清除干净后, 再盖上盖玻片, 换至高倍镜观察 ( 三 ) 制作永久切片 ( 一 ) 玉米减数分裂观察 一 实验目的 1. 学习并掌握植物减数分裂玻片标本的制作方法和技术 ; 2. 了解高等植物花粉形成过程中的减数分裂过程, 观察染色体的动态变化规律 二 实验原理减数分裂 (meiosis) 是生物在形成性细胞过程中的一种特殊的细胞分裂方式 在此过程中, 二倍体 (2n) 的性母细胞, 连续进行 2 次细胞分裂, 而染色体仅分裂 1 次 结果, 在 1 个性母细胞所形成的 4 个子细胞中, 染色体数目减少 - 半 也就是说每个子细胞中只具有单倍的染色体 (n) 减数分裂在遗传上具有重要的意义 性母细胞(2n) 经过减数分裂, 形成染色体数目减半的配子 (n) 经受精作用, 雌 雄配子融合为合子, 染色体数目恢复为 2n 这样, 在物种延续的过程中, 确保了染色体数目的恒定, 从而使物种在遗传上具有相对的稳定性 另外, 在减数分裂过程中, 包含有同源染色体的配对 交换 分离和非同源染色体的自由组合, 这些都为遗传学上的分离 自由组合和连锁互换规律提供了细胞学基础, 并导致了各种遗传重组的发生, 为生物的进化提供了物质基础 减数分裂过程, 包括第一次减数分裂 MⅠ 和第二次减数分裂 MⅡ 在玉米的两次分裂之间, 有一短暂的间期 ( 有些生物则没有间期 ) 三 实验材料玉米雄花序四 实验器具和药品显微镜 解剖针 镊子 刀片 载玻片 盖玻片 吸水纸 小广口瓶等 ; 固定液 改良苯酚品红等 五 实验过程 : 1. 材料的采集和存放当玉米雄穗尖端露出以前 7-10 天时, 先以手指挤摸穗尖的外部, 觉得松软时, 用刀片划开 9

193 茎叶, 取下幼穗分枝若干条, 固定于新鲜卡诺氏固定液中 24h 后, 依次换入 90%,80%, 70% 乙醇溶液, 最后于 70% 乙醇溶液中存放于 4 冰箱中待用 2. 玉米雄穗上的分裂时期除太老的分枝以外, 在每一个分枝中, 以中部偏上区域为比较成熟的部分, 从此往尖端或基部, 小穗逐渐幼嫩 通常在一个分枝上从幼嫩的部位向较为成熟的区域混合制片, 可以在一个片子中看到小孢子形成过程中的各个时期 玉米小穗是成对存在的, 无柄小穗的发育时期比邻近的有柄小穗的发育时期要早, 每小穗中有两朵小花, 各有花药 3 个, 第一朵小花比第二朵小花幼嫩, 第一朵小花的分裂时期依各小穗着生部位不同有一定的顺序性, 而同一朵小花的三个花药几乎处于同一发育时期 据此可以进行适当选材 3. 涂抹制片的方法和步骤先将少量雄穗分枝取出置于培养皿内, 加进少许固定液, 以防干去 然后用弯头解剖针从适当大小的小花内挑出花药 3-4 个, 以蒸馏水冲洗干净, 置于载玻片上 加上一滴改良苯酚品红染液, 以刀片切断花药, 再用解剖针尖轻压, 或用小镊子轻轻挤压, 挤出花粉母细胞, 尽量挤净, 然后除去杂质, 微微捣开成堆的花粉母细胞, 染色十 min, 盖上盖玻片, 置于显微镜下进行观察 如果染色效果不甚理想, 可以置于酒精灯火焰上烘烤加强染色效果 4. 观察 ( 注意区分小孢子母细胞与花粉壁细胞的区别 ) # 为观察减数分裂过程, 现把减数分裂各时期最主要的特点介绍如下 : 1. 间期 Ⅰ: 玉米的减数分裂中, 间期细胞染色质松散, 核内染色较为均匀 2. 减数第一次分裂 2.1 前期 Ⅰ: 整个前期, 持续时间长 染色体变化较为复杂, 它可分为五个亚期 (1) 细线期 : 染色体呈现细丝状, 首尾不分地绕成一团 核仁明显 (2) 偶线期 : 同源染色体开始配对联会 (3) 粗线期 : 染色体逐渐变粗变短 在良好的制片中, 可以数出染色体的对数 由于每条染色体已经复制为二, 而着丝点还未分开, 这样的染色体称二价体 (4) 双线期 : 染色体更为缩短 配对的染色体无始互相排斥而分开, 此时可以看到染色体的交叉现象 (5) 浓缩期 ( 终变期 ): 染色体最为粗短, 是染色体计数的最好时期 2.2 中期 Ⅰ: 核仁 核膜消失, 纺锤体 (spindle) 形成, 染色体排列在细胞的赤道面上 但每对同源染色体的着丝点分 处在赤道面的两侧 10

194 2.3 后期 Ⅰ: 同源染色体彼此分开, 移向细胞两极 由于此时着丝点未分开, 所以细胞两极的染色体数是性母细胞的一半, 但每条染色体中依然含有两条单体 2.4 末期 Ⅰ: 染色体到达细胞两极后逐渐解旋 核仁 核膜重新出现, 在赤道面处形成新的细胞板 1 个性母细胞分裂为 2 个子细胞 每个子细胞中含有单倍的染色体 (n) 3. 减数第二次分裂 3.1 前期 Ⅱ: 前期 Ⅱ 与有丝分裂的前期一样, 每条染色体都具有两条单体, 不同的是前期 Ⅱ 的细胞仅有半数的染色体 (n), 而有丝分裂的前期, 染色体数为 2n 3.2 中期 Ⅱ: 染色体浓缩变短, 着丝粒排列在细胞赤道面上, 纺锤体出现, 每条染色体的姐妹染色体呈分离状态, 但着丝点仍未分开 3.3 后期 Ⅱ: 着丝点完成复制, 彼此分开 每一染色体纵裂为二, 姐妹染色单体开始移向细胞的两极 3.4 末期 Ⅱ: 移向细胞两极的染色体逐渐解旋, 核仁 核膜出现 在细胞的赤道面出现细胞板, 每个细胞分为两个子细胞 经过这样的减数分裂, 一个性母细胞分裂形成 4 个子细胞, 即四分孢子, 四分孢子在花粉囊中进一步发育成为花粉粒 图示 : 玉米花粉母细胞减数分裂过程 ( 自 Willian 等 ) 六 注意事项 : 1. 取材时间的早晚是实验成功与否的关键步骤之一, 必须适时取材 ; 2. 注意区分性母细胞及小孢子形成过程中各时期细胞的特点, 并与花药壁细胞进行区分 : 七 附录 : 在实验过程中, 取材的时间对实验效果影响很大, 除玉米以外, 常用来进行减数分裂过程观察的植物有蚕豆 小麦 棉花等, 其取材时间分别为 : 蚕豆 : 从现蕾开始, 可以选取 2-3mm 大小的花蕾或一段小花序进行固定 11

195 小麦 : 从开始挑旗, 到旗叶与下一片的叶耳间距约为 1-2cm 时进行固定较为适宜 一般花药长约 2mm 左右, 表现黄绿色时, 为减数分裂观察的最适时期 棉花 : 棉花现蕾不久就开始进行减数分裂, 由于花序分节着生, 连续生长, 所以常常按照花蕾的长度进行取材 例如 : 陆地棉, 一般当三角苞长到 1cm 左右, 花萼与花瓣等长, 整个花蕾长约 3-5mm 时取样较好 八 作业及思考题 1 叙述有丝分裂和减数分裂的异同点 2 绘图示意观察到的植物细胞减数分裂不同时期的典型细胞( 示染色体动态特征 ) ( 二 ) 蝗虫减数分裂过程观察 一实验目的 1. 通过实验了解高等动物精子形成中的减数分裂过程, 观察其染色体的动态变化 ; 2. 学习并掌握制备蝗虫减数分裂玻片标本的方法 二实验原理在高等生物的雌雄性细胞形成的过程中, 由有性组织 ( 如花药和胚珠 精巢和卵巢 ) 中的某些细胞分化为孢母细胞 (2n), 以及精母与卵母细胞 (2n) 进一步由这些细胞进行减数分裂, 最终各自产生 4 个小孢子或精细胞, 或是分别产生一个大孢子或卵细胞与三个退化的极体 (1n) 在减数分裂过程中, 可以辨认染色体形态和数量上的动态变化, 从而为遗传学研究中远缘杂种的分析 染色体工程中的异系鉴别, 常规的组型分析以及三个基本规律的论证, 提出直接与间接的实验依据 三实验仪器和药品 1. 实验仪器 : 显微镜 解剖用具 2. 药品 : 卡诺固定液 改良苯酚品红染色液, 蒸馏水等 四实验材料的采集在每年 9 月底到 10 月初于稻田中采集雄蝗虫, 并用卡诺固定液进行固定, 然后依次经 90%,80%, 以及 70% 的乙醇溶液处理 30min, 最后保存于 70% 酒精溶液中,4 储存 如果长期保存, 可定时更换酒精储存液 五实验过程 1. 取材 : 从雄性蝗虫腹部背面剖开, 靠近胸节处有桔黄色团状结构, 为精巢 如材料经长期将精巢放于培养皿中, 用蒸馏水冲洗可见每条精细小管的一端连于输精管, 另一端为分散的盲端 ( 如材料经长期保存其颜色发暗 ) 换水再次清洗 每次清洗用时 2-3min 取一个或两个精细小管放于载玻片上, 用刀片在精细小管上横切两到三次 2. 取一个或两个精细小管放于载玻片上, 用刀片在精细小管上横切两到三次 3. 以改良苯酚品红染液染色 10-15min, 同时以小镊子轻轻挤压精细小管外壁, 以使性母细胞或减数分裂中各时期的细胞流出精细小管管壁, 以利于观察, 压片后进行观察, 可以见到减数分裂的各个时期 12

196 实验三植物染色体的组型分析 一 实验目的 1. 学会染色体组型的分析方法 2. 学会显微摄影技术 二 实验原理各种生物的染色体数目是恒定的 大多数高等动植物是二倍体 也就是说, 每一个体细胞含有两组同样的染色体, 用 2n 表示 其中与性别直接有关的染色体, 即性染色体, 在体细胞中可以不成对 每一个配子带有一组染色体, 叫做单倍体细胞, 用 n 表示 两性配子结合后, 具有两组染色体, 成为二倍体的体细胞 如蚕豆的体细胞 2n=12, 它的配子,n =6, 玉米的体细胞 2n=20, 配子 n=10 水稻 2n=24,n=12 有些高等植物还是多倍体, 即在体细胞中含有三个或三个以上的染色体组 正常细胞中的染色体染色体在复制以后, 纵向并列的两个染色单体, 往往通过着丝粒联在一起 着丝粒在染色体上的位置是固定的 由于着丝粒位置的不同, 可以把染色体分成相等或不等的两臂, 各染色体的长臂与短臂之比称为臂率 造成中间着丝粒染色体, 亚中间着丝粒染色体 亚端部着丝粒染色体和端部着丝粒染色体等形态不同的染色体类型 此外, 有的染色体还含有随体或次级缢痕 所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型 染色体组型分析就是对各物种细胞内的形态特征, 染色体数目等进行综合分析的实验方法 是细胞遗传学 现代分类学和进化理论的重要研究手段 植物染色体组型分析方法分为两大类, 类是分析体细胞有丝分裂时期的染色体数目和形态 另一类是分析减数分裂时期的染色体数目和形态, 这两种方法均能得到染色体组型 臂率为 1.0~1.7 的染色体归为中部着丝粒染色体, 用 (M) 表示 1.7~3.0 的染色体归为亚中间着丝粒染色体, 用 (SM) 表示 3.0~7.0 的染色体归为亚端部着丝粒染色体. 用 (St) 表示 7.0~ 更大的染色体归为端部着丝粒染色体, 用 (T) 表示 用 SAT 代表具随体的染色体, 计算染色体长度时, 可以包括随体也可以不包括, 但均要注明 三 实验材料 1. 植物根尖 茎尖, 或幼嫩花蕾 ;2. 或由实验室提供染色体制片或放大照片 ; 3. 显微摄影仪器, 及相关分析软件 13

197 四 实验器具和药品显微镜, 测微尺, 毫米尺, 镊子, 剪刀 如无现成的染色体照片则需经过制片, 进行显微摄影, 所以需摄影显微镜以及有关摄影冲洗器材和相关药品或以电脑核型分析软件进行分析 五 实验过程 : 1. 根尖的培养及制片要求 : 选用黑麦或蚕豆种子作为实验材料, 用酶解法进行解离效果为好, 通过固定 染色 压片等可以进行组型分析, 但当染色体分散程度差而且形状不固定时, 需要制备较多的片子, 才能得到满意的结果 优质的染色体制片, 是获得高质量显微照片的基础 可供显微摄影的优质染色体制片, 应具有以下基本条件 : (1) 具有典型性 : 细胞完整, 分散良好, 缢痕清晰可辨, 分带制片时应带纹清晰可数 ; (2) 染色体平整 : 在高度放大条件下, 其焦深度很小, 染色体铺展稍有不平, 便会出现部分染色体清晰, 部分染色体模糊现象, 而降低放大倍数, 可加大焦深, 但染色体一些细微结构会模糊不清 ; (3) 染色体清晰 : 染色体与背景对比分明, 染色体着色适度 ; (4) 要选用标准厚度的载片和盖片 2. 测量 : 进行显微摄影, 冲洗照片, 供核型分析之用 若用染色体制片标本进行直接测量时, 必须利用显微镜与测微尺, 事先要用台微尺对目微尺的单位长度进行标定后再进行工作 ; 此方法仅对染色体长度较大的标本适合 一般标本还是先行拍照放大, 然后进行测量, 这样可以得到较好的实验数据 先将各染色体进行编号然后根据放大照片测量 记录染色体形态测量数据如下 : 长臂 短臂 着丝粒指数 总染色体长度 绝对长度 相对长度等 同时注意记录染色体是否具有随体, 填于学生实验报告中 3. 配对 : 根据测量数据, 即染色体相对长度 臂率 着丝粒指数 次溢痕的有无及位置 随体的形状和大小等进行同源染色体的剪贴配对 4. 染色体排列 : 染色体对从大到小, 短臂向上 长臂向下, 各染色体的着丝粒排在一条直线上 如果染色体长度相同, 则以短臂长度为标准, 从大到小排列 有特殊标记的染色体 ( 如含有随体的 ) 以及性染色体等可单独排列 5. 翻拍或绘图 完成上述步骤的染色体剪贴, 可以通过翻拍摄影或描图成为染色体组型图 高等植物属异源多倍体种类的较多, 进行组型分析时, 不完全根据染色体的大小进行排列, 而事先要根据系统发育的来源进行分组, 然后各组按大小进行编排 例如, 人工培育的小黑 14

198 麦 来自小麦的染色体组是 AA BB DD, 来自于黑麦的染色体组是 RR, 组型分析时不仅应将 R 组分开, 而且小麦本身是个天然的异源多倍体, 又应分成 A B D 几组进行分析 经常见到的植物如棉花 烟草 马铃薯以及许多果树 花卉均具有多倍体品种, 分析时应特别注意 此外, 电脑分析软件的应用为准确快速进行核型分析提供了先进的实验技术手段 染色体核型分析系统拥有专业级数字图像处理能力, 可以迅速滤除核型周边杂质, 处理完成多达 20 余种不同类型的核型图像, 呈现精确核型, 同时可以运用背景综合处理技术, 自动增强染色体带纹识别能力 提供自动与人工参与两种分析模式, 染色体全自动识别, 配对 六 实验流程 : 培养 ( 根部遮光培养 ) 预处理 ( 这一步是实验成功与否的关键, 一定注意!) 取材 固定 制片 : 水洗酶解水洗染色压片 观察 ( 注意寻找处于分裂期染色体分散的细胞 ) 七 注意事项 : (1) 实验材料选用黑麦等染色体数目较少 染色体较大的材料为佳 (2) 手工进行分析时注意测量前应进行染色体编号, 以免造成混乱 (3) 组型分析模式图应注明显微摄影及照片冲洗过程中的放大倍数 15

199 实验四果蝇唾腺染色体标本的制备和观察 一 实验目的 1. 练习果蝇唾液腺分离技术 ; 2. 学习果蝇唾腺染色体制片的技术 ; 3. 观察果蝇唾腺染色体, 了解唾腺染色体的特征及在遗传学研究中的意义 二 实验原理 (1) 体细胞配对 ; (2) 细胞周期中着丝粒的不分裂和细胞的不分裂 ; (3) 横纹与膨突 多线染色体 polytenicchromosome 又称巨型染色体 giant chromosome 唾腺染色体 salivary chromosome 染色体中的染色线连续复制, 染色体不分裂, 同源染色体配对 ( 一 ) 果蝇的采集和饲养 ( 一 ) 实验目的 : 了解果蝇的生活史 学会果蝇的采集饲养和管理方法 区别果蝇的雌雄及某些性状, 为做果蝇的遗传实验练好基本功 ( 二 ) 实验材料及用具 : 放大镜培养瓶 ( 可用纱布包裹的棉花球塞与牛奶瓶或大 中型指管做成 ) 三角瓶软木塞火柴大头针酒精灯三角架石棉网烧杯托盘天平砝码量筒玻璃棒白纸牛角杓滤纸硬纸片废洋铁罐头盒标签纸胶水乙醚红糖或白糖琼脂玉米粉 ( 或面粉 ) 95%( 或 70~75 %) 酒精酵母菌液 ( 用量极少, 勿须另行培养, 可向附近酒厂索取 ) ( 三 ) 果蝇的观察 : 1 果蝇的生活史果蝇是完全变态发育的昆虫 它的生活史包括卵 幼虫 蛹及成虫四个发育时期 图果蝇的生活史 1. 卵 2. 一龄幼虫 3. 二龄幼虫 4. 三龄幼虫 5. 蛹 6. 成虫 16

200 果蝇生活周期及各个发育阶段的时间长短与温度关系十分密切 超过 30, 能使果蝇不育和死亡 温度降低, 会使果蝇生活周期延长, 生活力降低 一般在 20 ~25 下培养最为合适 在适宜的温度下, 大约经过 10~14 天即可繁殖一代 2 雌雄果蝇的鉴别果蝇的幼虫时期, 区别雌雄较难 成虫很容易从其外部形态来区别 雄果蝇个体较小, 腹部有五道黑色的环纹, 末端较圆, 颜色较深 第一对脚的跗节前端表面, 有黑色坚硬的鬃毛称性梳 雌果蝇个体较大, 腹部有七道黑色环纹, 末端较尖, 颜色浅, 没有性梳 ( 四 ) 果蝇的采集与饲养 : 1 果蝇的采集果蝇主要以酵母为食, 腐烂的水果, 是酵母的天然培养基, 所以在葡萄架下, 花坛里, 樱桃树上, 甚至水果店里, 只要有烂水果的地方, 都能采集到大批果蝇 采集时, 将诱饵 ( 烂水果 ) 放在已用过的洋铁罐头盒里 再插入一块硬纸片以防果蝇被食物黏住而淹死, 然后将此罐置于选好的采集地点, 隔一天再去收集果蝇 收集时, 先将一个有活叶门的硬纸盖, 盖在罐头盒上, 然后用右手拿住广口瓶, 并将瓶口对准活叶门, 堵好盖, 一手轻轻地打开活叶门, 这时罐内的果蝇由于趋光性而陆续飞入广口瓶 再将广口瓶内的果蝇换入饲养瓶 ( 换瓶操作技术可参看下节 ), 塞好瓶口, 带回实验室做进一步分类鉴别 收集果蝇的装置如图 2 果蝇的饲养管理 ( 甲 ) 培养基制作取 1.5 克琼脂, 放在 50 毫升水中煮沸, 直到琼脂完全溶解为止 加入 13.5 克红糖或白糖, 边调和边加热, 再把 10 克玉米粉 ( 或面粉 ) 与 25 毫升水混合调匀后, 倒入正在加热的琼脂糖溶液 另外, 称取 0.2 克苯甲酸, 溶解于少量 95% 的乙醇以后, 也倒入该溶液, 不断搅拌煮沸 2~3min, 做成糊状, 趁热分别注入消过毒的干燥培养瓶中 ( 勿使瓶口及瓶壁沾污 ) 17

201 倒入培养基的厚度约 2 厘米, 在培养基中插入一张消过毒的干燥硬纸片, 以扩大果蝇的活动场所 待培养基冷却后, 用酒精棉花擦去瓶壁上的水珠 因为瓶里有了积水, 移入的果蝇容易淹死或粘住 然后滴入酵母菌液数滴, 摇动瓶子, 使其散开 最后在瓶口塞上用纱布包棉花做成的 消过毒的棉塞 注意棉塞不可太紧, 否则空气不易流通 饲养果蝇的用具, 一般都必须经过消毒, 若无高压消毒器, 可放在蒸锅中消毒 ( 乙 ) 果蝇的检查和培养对果蝇进行检查时, 可用乙醚麻醉 方法是取一个与培养瓶口径大小相一致的干燥三角瓶 ( 或牛奶瓶 ), 配上一个合适的软木塞, 软木塞的瓶口一端, 用大头针牢牢固定上少许棉花, 做为麻醉瓶 操作时, 先把麻醉瓶的瓶塞打开, 取盛有待检果蝇的培养瓶一只, 把瓶口倒转朝下, 瓶底向强光源, 因为果蝇有趋光性, 所以大多数都集中于瓶底, 此时迅速打开培养瓶塞, 将瓶口对准麻醉瓶口, 轻轻敲击培养瓶, 使果蝇震落入麻醉瓶后, 在麻醉瓶塞的棉花上滴几滴乙醚, 立即把麻醉瓶盖好 由于果蝇对乙醚特别敏感, 过半 min 后便被麻醉 然后把它倒在白纸 ( 或白瓷板 ) 上, 用放大镜仔细检查其性别 眼睛及身体的颜色, 翅的长短残缺 如果在性状上有差异, 则应该把它们分别放入到几个培养瓶中进行培养 ( 注意! 麻醉的果蝇放入培养瓶时, 应将培养瓶横卧放置, 待果蝇清醒过来后, 再将瓶直立起来, 这样可避免果蝇粘在培养基上 培养瓶应该编上号数, 注明名称, 培养日期, 并且登记在记录本上 ) 麻醉果蝇时, 麻醉的时间不宜过长, 否则会致死 如果麻醉的目的只是作观察, 不需要保留, 麻醉致死也无妨 如果需要留作种蝇, 只宜轻度麻醉 假若果蝇身体与翅呈 45 角翘起, 说明已经致死 死果蝇应扔入煤油瓶或酒精瓶收集处理 ( 五 ) 实验记录 : 采集日期 : 采集地点及温度 : 18

202 ( 六 ) 讨论 : 生物实验的成败, 与所选用的实验材料关系十分密切 由于果蝇具有易于培养, 个体小, 繁殖率高 ( 一个受精雌蝇能产生 400~500 个后代 ), 繁殖世代快 ( 在适宜的温度下, 一般经过 10~14 天即可繁殖一代 ), 染色体数量少 [ 普通果蝇 (Drosophila melanogaster) 只有四对染色体, 故只有较少的基因 ], 性状差别明显, 突变性状多, 而且多数是形态突变, 易于观察等特点, 所以是最方便的遗传实验材料 另外, 果蝇的唾液腺细胞中还有巨大的染色体, 易于观察, 所以有可能把遗传学的研究和细胞学的研究结合起来 饲养果蝇的培养基配方, 研究的很多, 下面仅举几例可供选择, 也可以因地制宜, 就地取材, 创造更合适的配方 配方一 : 配方二 : 配方三 : 甘薯煮熟捣碎, 加酵母少许 配方四 : 配方五 : 为了防止霉菌生长, 在配制培养基时, 可加入少量霉菌抑制剂 ( 如苯甲酸 ), 也可以在使用前向瓶中注入一薄层 70~75% 酒精, 等一会倒出酒精, 把瓶倒置, 等到酒精完全蒸发后, 再加棉塞 使用时接种几滴酵母菌液 ( 二 ) 果蝇唾腺染色体制片一 实验目的 : 了解果蝇唾液腺染色体的形态学及遗传学特征 ; 学习分离果蝇幼虫唾液腺的技术 二 实验材料 : 野生型果蝇三龄幼虫三 实验原理 : 果蝇唾腺染色体特点 : 巨大, 是多线染色体 ; 正常 : 间期 DNA 复制两条染色单体着丝点裂开子染色体核分裂胞质分裂果蝇 : 有丝分裂停止在分裂间期,DNA 不断自我复制, 着丝点不裂开 同源染色体紧密配对 : 体细胞联会, 所以染色体只呈现单倍数 ; 形成染色中心, 从染色体中心处伸出 5 条长臂,1 条短臂 ; 染色后, 出现一系列宽窄不同 染色深浅不一的横纹 ; 19

203 果蝇唾腺染色体模式核型 果蝇唾腺染色体 四 实验用品 1. 仪器用具 : 显微镜 双目解剖镜 培养瓶 载玻片 盖玻片 镊子 解剖针 吸水纸 酒精灯 火柴等 2. 药品试剂 : 无水乙醇 冰醋酸 改良苯酚品红 生理盐水 1N 盐酸 蒸馏水 3. 培养基 : 玉米琼脂培养基 五 实验步骤 1 选取幼虫: 取三龄幼虫, 置于载玻片上, 并滴加一滴生理盐水, 观察幼虫结构 : 具一钝尾和带黑色口器的尖头端 2 腺体剖取: 取两支解剖针, 一针压住幼虫身体的近头端 1/3 处, 固定幼虫, 另一针压住幼虫头部, 压点尽可能靠头部口器处 将解剖针平稳前移, 使头部与身体拉开, 口器 部分断开, 体内各器官从切口挤出, 一对唾腺也随之而出 解剖针 唾腺 脂肪体 3 腺体解离 : 剥离脂肪体及其他杂物, 分离出纯净的唾腺, 用吸水纸小心吸去生理盐水 加 1 滴 1N HCl, 浸 2 3 分钟, 使组织疏松, 以便压片时细胞分散, 染色体散开 20

204 4 染色: 用吸水纸吸去盐酸, 加 1 滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干, 重复 3~4 次, 洗净残留的盐酸 加 2 滴石炭酸品红染液, 染色 分钟 ( 此过程应保持腺体一直处于染液的浸泡中 ) 5 压片: 换上新鲜染液或 45% 醋酸, 取盖玻片和双面刀片, 双面刀片放于盖玻片和载玻片间, 吸去多余染液, 进行压片 在盖玻片上用解剖针柄轻轻敲压, 将染色体完全压散 将刀片取出, 再用中指轻轻压片, 使细胞充分分散 6 观察: 将制片置低倍镜下找到分散好的标本, 移至视野中心, 然后转到高倍镜下观察 对分散良好 染色体臂充分伸展的片子, 应仔细观察染色体的横纹数量 形状和排列顺序, 对照模式照片辨认出不同的染色体臂 六 作业及思考题 1 什么是深染中心(chromocenter)? 通过巨大染色体可以进行哪些遗传学研究? 2 检查你制作的制片, 寻找形态良好 分散适中的图象仔细观察各条臂的特点 画图示意 3 根据实验的观察可以确定果蝇的染色体数目吗? 为什么? 21

205 实验五植物多倍体诱导及其细胞学鉴定 一 教学目的 : 1. 了解人工诱导多倍体的原理, 初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的方法 2. 了解植物多倍体细胞染色体加倍的特点 二 实验原理 : 自然界各种生物的染色体数目是相对恒定的, 这是物种的重要特征 遗传学上把一个配子的染色体数, 称为染色体组 ( 或称基因组 ), 用 n 表示 一个染色体组内每个染色体的形态和功能各不相同, 但又互相协调, 共同控制生物的生长和发育 遗传和变异 由于各种生物的来源不同, 细胞核内可能具有一个或一个以上的染色体组, 凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体, 也用 n 表示 具有两套染色体组的生物体称为二倍体, 以 2n 表示 细胞内多于两套染色体组的生物体称为多倍体, 这类生物细胞内染色体数目的变化是以染色体组为单位进行增减的, 所以称作整倍体 多倍体普遍存在于植物界, 目前已知道被子植物中约有 l/3 或更多的物种是多倍体, 除了自然发生的多倍体物种之外, 还可采用高温 低温 X 射线照射 嫁接和切断等物理方法人工诱发多倍体植物 在诱发多倍体方法中以应用化学药剂更为有效 如秋水仙素 异生长素, 富民农等, 都可以诱发多倍体, 其中以秋水仙素溶液效果最好, 使用最为广泛 秋水仙素溶液的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成, 使染色体向两极的移动被阻止, 而停留在分裂中期的分布, 这样细胞不能继续分裂, 从而产生染色体数目加倍的核 若染色体加倍的细胞继续分裂, 就形成多倍性的组织. 由多倍性组织分化产生的性细胞, 可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去 如果将种子用秋水仙素浸渍, 也可诱导多倍体植株产生 多倍体已成功地应用于植物育种 用人工方法诱导的多倍体, 可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状, 如粒大 穗长 抗病性强等 三倍体西瓜 三倍体甜菜 八倍体小黑麦已在生产上得到广泛的应用 染色体加倍后必须进行鉴别, 同源多倍体主要是根据形态特性来判断, 如叶色 叶形及气孔和花粉粒的大小 最为可靠的方法, 是待收获大粒种子后, 再将这些大粒种子萌发, 制备根尖压片, 然后检查细胞内的染色体数目, 只有染色体数目加倍了, 才能证明植株已诱变成为多倍体 三 实验材料 : 玉米 (2n=20), 大麦 (2n=18) 水稻(2n=24) 的种子, 或洋葱的鳞茎 四 实验器具和药品 : l. 用具 : 显微镜 载玻片 盖玻片 培养皿 镊子 刀片 滴管, 吸水纸和测微尺 22

206 2. 药品 : 秋水仙素溶液 ( 取秋水仙素 1g, 先用少量 95% 乙醇助溶, 溶于 250~500ml 蒸馏水中, 配成浓度为 0.2~0.4% 的溶液, 冰箱中保存 ) 1mol/L HCl 溶液 改良苯酚品红溶液 五. 实验步骤 1. 先剪去洋葱的老根, 然后置于盛满水的烧杯口上, 等新长出的不定根长约 1.5-2mm 左右时, 移到盛有 % 浓度的秋水仙素中, 直到根尖膨大为止 诱导后细胞为多倍体细胞 也可以采用种子浸渍法 处理种子时, 可先在 定浓度秋水仙素溶液中浸种 24h 左右, 在铺有滤纸的器皿上浸渍种子 再注入 0.1%-0.025% 浓度的秋水仙素溶液, 为避免蒸发宜加盖并置于暗处, 放入 20 培养箱中, 保持适宜的发芽温度, 干燥种子处理的天数应比浸种多 l 天左右 一般发芽种子处理数 h 至三天或多至十天左右 对于种皮厚发芽慢的种子, 应先催芽后再行处理 已发芽的种子用较低的浓度处理较短的时间, 秋水仙素能阻碍根系的发育, 因而最好能在发根以前处理完毕 处理后用清水冲洗, 移栽于盆钵或田间 所诱导种子长成的植株为多倍体植株 蚕豆根尖端处理时, 秋水仙素浓度比洋葱根尖高, 在 1% 以上 也可在植株的芽原基处进行处理, 诱导芽变, 形成多倍体枝条, 再将其进行扦插以获得多倍体植株 2. 取下已膨大的根尖或幼芽, 水洗后进行常规制片 ( 固定, 保存, 水洗, 酸解, 水洗, 制片, 染色, 压片等过程 ), 染色时滴上一 二滴改良苯酚品红染液,10-15min 以后压片 3. 观察多倍体细胞染色体的形态并统计其染色体数目 六 注意事项 : 1. 秋水仙素处理时间应根据供试材料的细胞周期而定, 当处理时间介于供试材料细胞周期的一倍到两倍之间时, 可观察到细胞由二倍体变为四倍体, 当处理时间多于供试材料细胞周期的两倍以上时, 供试材料的细胞可从四倍体变为八倍体, 因此, 在培养多倍体细胞时, 应注意用秋水仙素的处理时间 ; 此外, 秋水仙素的浓度对处理效果也有影响, 应注意掌握 2. 多倍体细胞中染色体的形态有两种, 一种为一条染色体含有一条单体, 另一种为一条染色体含有两条单体, 应注意观察, 并思考其形成原因 3. 秋水仙素是从百合科秋水仙属的一个种 -- 秋水仙 (Colchicum autumnale. L.) 的器官和种子内提炼出来的一种植物碱 它的化学分子式为 C22H25O6N 因有剧毒, 故使用时要特别 23

207 注意, 切勿使药液进入眼内或口中 秋水仙素为剧毒药品, 实验中应注意不要将药品沾到皮 肤上, 眼睛中 如果沾到皮肤上, 应用大量自来水冲洗 二倍体 (2n=2x=16) 多倍体 (2n=4x=32) 七 作业及思考题 1 与对照植物相比, 处理后的植物有哪些不同特征? 2 你观察的被鉴定的物种的染色体数目是多少? 绘图示意所观察到的典型多倍体细胞 3 为什么多倍体植物对环境具有更强的适应性? 4 使用秋水仙素诱导多倍体应注意哪些问题? 24

208 实验六诱变物质的微核测试及其应用 一 实验目的 1. 了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义 2. 学习蚕豆根尖的微核测试技术 寻找新的测试系统或测定更多的环境因素 二 实验原理微核简称 (MCN), 是真核生物细胞中的一种异常结构, 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生 在细胞间期微核呈圆形或椭圆形, 游离于主核之外 大小应在主核 1/3 以下 微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样 一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的, 但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核 这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关, 这一点和染色体畸变的情况一样 所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数 由于大量新的化合物的合成, 原子能应用, 各种各样工业废物的排出, 使人们很需要有一套高度灵敏, 技术简单的测试系统来监视环境的变化 只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害, 在这方面, 微核测试是一种比较理想的方法 且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达 99% 以上 目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤 辐射防护 化学诱变剂 新药试验 染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面 现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞 缺点是需要一定培养条件与时间 细胞同步化困难 微核率低, 一般只在 0.2% 左右 利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试, 可准确的显示各种处理诱发畸变的效果, 并可用于污染程度的监测 近年来, 有人采用高等植物花粉孢子利用它们天然的同步性作微核测试材料, 取得良好的效果 其中马德修用一种原产于美洲的鸭跖草 (Tradescantiapaludosa)( 一种叶子狭长形的鸭跖草, 目前我国许多地方已经引种 ), 建立四分孢子期微核率计数 (MCN-in-Tetrad) 的测试系统, 是近年来报导的较好系统之一 该系统用低剂量的化学药物处理或辐射处理, 其微核率可达 10% 67% 三 实验材料松滋青皮豆 ( 蚕豆 ) 种子 具有幼嫩花序的鸭跖草 ( 长在温室中的鸭跖草都能现蕾开花, 大田栽培花期也很长 ), 剪取 25

209 花序, 每种处理重复 3 根 其他植物 : 洋葱 大葱 大蒜等根尖四 实验器具和药品实验器具 : 显微镜 载玻片 盖玻片 培养皿 滤纸各种化学 物理等诱变因素的选择和确定 五 实验过程 1. 实验材料的培育蚕豆根尖细胞的染色体大,DNA 含量高. 因而对诱变因子反应敏感 松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中筛选出来的一种较为敏感的品种 本品种引入后在栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起, 不喷洒农药 以保持该品种较低的本底微核值 也可用其它蚕豆品种, 但是必须设置对照组 种子成熟后, 晒干贮藏于干燥器内或 4 冰箱内备用 2. 浸种催芽将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯中, 在 25 下浸泡 24h, 此间至少换水两次. 所换水应 25 预温 种子吸胀后 ; 用纱布松散包裹置白磁盘中, 保持湿度, 在 25 温箱中催芽 12-24h, 待初生根长出 2 3mm 时, 再取发芽良好的种子, 放入铺满滤纸的磁盘中,25 继续催芽, 经约 36~48h. 大部分初生根长至 1~2cm 左右, 根毛发育良好, 这时即可用来进行检测了 3. 处理用被检测液处理根尖, 每一处理选取 6-8 粒初生根尖生长良好 根长一致的种子, 放入盛有被检测液的培养皿中, 被检测液浸泡根尖 同时, 取另一培养皿以蒸馏水处理根尖, 作为对照 处理时间约为 6h( 此时间可根据实验要求和被检测液的浓度等情况而定 ) 4. 根尖细胞恢复培养将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次, 每次 2-3min 将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内 25 温箱中恢复培养 22-24h 5. 固定根尖细胞将恢复后的种子从根尖顶端切下 1cm 长的幼根放入广口瓶中, 以卡纳氏固定液进行固定 2-24h 后, 保存于 70% 乙醇溶液中 6. 镜检及微核识别标准常规制片后, 将玻片标本放在显微镜的低倍镜下观察, 找到分生组织区细胞分散良好 26

210 核膨大 分裂相多的部分转到高倍镜下进行观察 微核识别标准 : (1) 在主核大小的 1/3 以下, 并与主核分离的小核 (2) 小核着色与主核相当或稍浅 (3) 小核形态为圆形 椭圆形或不规则型 每一处理观察 3 个根尖, 每个根尖计数 1000 个细胞中的微核数并进行记录蚕豆根尖微核检测记录表六 实验数据的统计处理和污染程度划分将实验数据按一下步骤进行统计学分析处理 : 1. 计算各测试样品 ( 包括对照组 ) 微核千分率 (MCN ) 如果对照本底 MCN 为 10 以下, 可采用如下标准进行分析以确定样品的污染程度 : MCN 在 10 以下, 表示基本没有污染 ; MCN 在 区间, 则表示有轻度污染 ; MCN 在 区间, 则表示有中度污染 ; MCN 在 30 以上, 则表示有重度污染 ; 2. 也可以采用 污染指数 判别 : 此方法可避免因实验条件等因素带来的 MCN 本底的波动, 方法如下 : 污染指数在 区间为基本没有污染 ; 污染指数在 区间为轻度污染 ; 污染指数在 区间为中度污染 ; 污染指数在 3.5 以上为重度污染 ; 3. 如果对照本底 MCN 为 10 以上, 可采用 t 检验 ( 被测样品较少时 ) 检测处理液致畸效果是否明显, 或以 F 检验 ( 被测样品较多时 ) 检测各处理之间是否具有显著的差异 七 注意事项 : 1. 凡数值在上下限时, 定为上一级污染 2. 对严重污染的水环境进行检测时, 检测处理会造成根尖死亡, 应稀释后再作测试 ; 27

211 3. 在没有空调恒温设备时, 如室温超过 30,MCN 本底可能有升高现象, 但可经污染指数 法数据处理, 不会影响检测结果 # 蚕豆根尖微核检测记录表 试验号镜检日期镜检者 片号第一片第二片第三片 各自观察的细胞数和微 核数 细胞数微核数细胞数微核数细胞数微核数 总计 平均微核千分率 八 作业及思考题 1 什么是微核? 微核产生的原因和物质基础是什么? 2 微核率与处理药物的浓度有何关系? 3 统计 MCN 并说明意义 绘制典型的微核细胞示意图 4 小组自组选题 设计实验方案并实施 全班汇报交流 28

212 实验七 人体 X 染色质观察 ( 体细胞 Barr 小体观察 ) 一 实验目的 1. 学习人类 X 染色体的检测方法 ; 2. 认识雌性哺乳动物 X 染色体失活假说和剂量补偿效应的机制 二 实验原理在 XY 型性决定的生物个体中, 雌性个体的细胞中有两条 X 染色体, 而雄性个体的细胞中仅有一条 X 染色体 由于两种个体在 X 染色体的数量上是不相等的, 因而雌 雄个体 X 染色体上的基因产物也可能是不相等的 针对这一现象,Muller 于 1932 年提出剂量补偿效应, 说明可以使具有两份基因的个体和具有一份基因的个体表现出相同表型的一种遗传机制的观点 1949 年,M.L.Barr 等人发现, 在猫的雌性个体内, 神经细胞核膜内缘有一染色很深的小体 ( 后来定名为 x 小体或 Barr 氏小体 ), 而雄性个体细胞中则没有 以后在人类女性口腔上皮细胞中, 也发现了类似的结构 经研究认为这是失活的异固缩状态的 x 染色质, 并发现它属于延迟复制的染色体 X 小体的数目在正常女性中是 X 染色体数目减去一 经观察,X 小体一般 微米, 呈三角形或卵圆形 20 世纪 60 年代以来, 不少学者曾提出了一些假说来解释这一现象 其中比较著名的假说是由 M.F.Lyon 于 1961 年提出的 Lyon 假说 (Lyon hypothesis): 1. 正常雌性哺乳动物的体细胞中, 两条 X 染色体中只有一条在遗传上有活性, 另一条在遗传上无活性 2.X 染色体的失活是随机的 3. 失活发生在胚胎发育早期,X 染色体一经失活, 其后代细胞中该染色体均处于失活状态 4. 杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体 一些学者以另一些事实来反对 Lyon 的假说 因为 X 染色体的失活是个比较复杂的生物学问题, 目前对这一现象仍然存在着一些难以解释的疑点 例如, 是否所有组织的全部细胞中, 在任何时间都存在这种 X 小体, 失活的 X 小体是如何进行复制的等等 虽然对 X 小体存在着一些不同看法, 但目前 X 染色质的检查, 在医学遗传的研究中, 临床和法医诊断上仍具有一定的意义 29

213 三 实验材料人体口腔上皮细胞或毛囊细胞四 实验器具和药品实验器具 : 显微镜 载片 盖片 无菌牙签等 实验药品 : (1) 1N 或 5N 盐酸或浓盐酸和 95% 乙醇 1:1 的混合液 (2) 改良苯酚品红染色液五 实验过程 1. 口腔粘膜细胞 Barr 氏小体显示方法 (1) 取材与固定实验前用可食用水漱口, 然后以无菌牙签刮取口腔颊部粘膜 ( 第一次的刮取物弃去 ), 将刮取物均匀涂于载玻片上, 放在空气中干燥 或以酒精灯外焰烤干, 注意材料不可过热加温 (2) 染色与观察 : 用改良苯酚品红染液染色 10-15min, 倾斜载玻片, 倒掉染液 用吸水纸轻轻擦拭干载玻片上的染液 放于显微镜下观察 ** 注意事项 : 在制作的玻片标本中, 选择细胞轮廓清楚 染色清晰, 核大, 核质呈均匀细网状的细胞 100 个, 统计巴氏小体的频率 ( 可与男性细胞对照观察 ) 2. 发根毛囊细胞 Barr 氏小体显色方法取材和染色取带有发根的头发, 长 2 3cm, 围绕发根部的 1 圈长 2 3mm 的白色物体, 即是毛囊细胞团, 将其放置于载片上 在毛囊细胞处滴加一滴浓盐酸和 95% 乙醇 1:1 的混合液 约 10min 以后, 可使毛囊细胞得到充分软化 以清水冲洗 2-3 遍, 将酸解液冲洗干净 拿起上述发根的梢部, 将其上毛囊细胞轻轻蹭于另一干净载片上即可达到转移的目的 若用刀片或镊子将毛囊细胞刮下, 可造成细胞的堆积, 同样会出现多层细胞的现象 另外,l 根发根的毛囊细胞可以转移到 3 4 张载片上, 以达到充分利用实验材料的目的 观察时又可以看到清晰的单层涂布细胞, 便于观察统计 此时, 可滴加 1 滴染液于待测细胞上, 注意染液不可过多, 以免细胞流失 约 10min 后, 加盖玻片即可进行观察 3. 观察巴氏小体为女性细胞中所特有的染色体结构, 是 l 条 X 染色体呈异固缩状态所形成, 各实验室所统计的观察率不尽相同, 从 30% 一 50% 不等, 有些实验室中在男性的细胞中发现 30

214 X 小体有 2% 的出现率, 但小体结构不规范 典型 巴氏小体常位于核膜内侧 直径为 lμm 左右, 其形状有微凸形 三角形 卵形 短棒形和双球形等 观察时需注意巴氏小体与细胞的比例 正常女性细胞中仅可观察到 1 个巴氏小体, 而正常男性细胞中无巴氏小体或仅在个别细胞中有不典型的巴氏小体存在 六 注意事项 1. 在实验中取材时应该注意安全 ; 2. 如果用毛囊细胞进行试验, 采样前应清洗头发, 因出油后拔取毛发时不易带出毛囊细胞 七 作业及思考题 1. 你统计的 X 小体的频率如何? 为什么不是所有的细胞都可观查到 X 小体? 统计 X 小体的频率, 绘制 4-5 个典型细胞示意 X 小体的形态部位 2. 请根据所学知识及观察结果填写下表 : X 小体数目性别表现性染色体组成体细胞中染色体总数 正常男性 正常女性 0 有缺陷的男性 XXY 2 有缺陷的女性 有缺陷的男性 有缺陷的女性 XXX 3 有缺陷的男性 3 有缺陷的女性 31

215 实验八小白鼠骨髓细胞染色体标本的制备 一 实验目的 1. 了解动物染色体标本制备的基本原理 2. 掌握滴片法制备染色体标本的一般步骤 3. 通过实验, 掌握空气干燥法制片技术 二 实验原理在骨髓细胞中, 有丝分裂的指数是相当高的, 因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养 通过骨髓得到染色体是比较简便的, 一般也无需无菌操作 在临床上多用于白血病的研究, 在实验条件下, 这种染色体是机体内真实情况的反映, 而且用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响 直接制片法, 是直接从骨髓中取出细胞, 经压片法或空气干燥法制片 所谓空气干燥法, 实际上是将细胞经过秋水仙素处理 低渗处理 充分的固定 滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术 有时, 有人把滴片的步骤叫做染色体分散, 也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法 空气干燥 就是滴片后, 不加热或任何处理, 使载片在室温下自然干燥的方法 空气干燥法是一个十分有用的基本技术, 要熟练掌握 三 实验材料小白鼠 ( Mus musculus 2n=40 ) 20g 左右,30-65 天, 雌雄均可 四 实验器具和药品试剂冰箱 离心机 恒温水浴锅 显微镜 分析天平 药物天平 试管架 离心管 吸管 烧杯 量筒 注射器 (1ml 5ml) 5 号针头 载玻片 解剖盘 解剖刀 剪刀 镊子 酒精灯 切片盒 切片架 纱布 秋水仙素 柠檬酸钠 氯化钾 冰醋酸 甲醇 磷酸缓冲液 Giemsa 甘油 硫酸 重铬酸钾 五 实验方法和步骤 ( 一 ) 秋水仙素处理取骨髓前 3~4h 先给小白鼠经腹腔注入 0. 1% 的秋水仙素, 注射剂量为 4 毫克 / 每公斤动物体重 ( 二 ) 取骨髓经秋水仙素处理的小白鼠, 可用损伤脊髓法 ( 断颈法 ) 迅速处死, 然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉, 取出大腿骨和胫骨, 用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉 32

216 碎渣 剪掉股骨两端膨大的关节头, 然后将股骨剪碎投入小烧杯中, 用 2 毫升 1% 柠檬酸钠溶液搅烂碎骨, 使骨髓细胞游离出来 静止片刻, 用吸管把悬浮液吸到离心管中, 可重复冲洗一次 此时离心管中的细胞悬浮液可达 4~5 毫升 ( 三 ) 低渗将所获得的细胞悬浮液先进行平衡 ( 注意 : 每次离心前都要平衡 ), 然后以 1000rpm 离心 10min, 吸去上清液, 留 0.2ml 沉淀物, 加 0.075M KCL 溶液至 8 毫升刻度, 将细胞沉淀物吹散打匀, 在水浴 37 低渗 20~30min ( 四 ) 固定低渗处理后的材料, 以 1000rpm 离心 10min, 吸去上清液, 留 0.2ml 沉淀物, 用吸管吹散沉淀物, 沿管壁加固定液至 6 毫升, 冲匀后静止固定 20min, 即第一次固定 按上述条件离心, 去上清液, 再次加入固定液至 6ml, 进行第二次固定 20min 后离心吸去上清液, 留 0.2ml 沉淀物, 再往沉淀物中滴加 4 滴固定液, 冲匀制成细胞悬液 ( 五 ) 滴片取事先在冰箱中预冷的载玻片 ( 载玻片须经硫酸洗液浸泡 10 天以上, 经清水冲洗, 用蒸馏水浸泡 ), 滴 2~3 滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上, 用嘴吹气, 使细胞迅速分散 将载片插放在切片架上晾干 ( 六 ) 染色取 2 张制片平放在玻璃板上, 用 10:1 Giemsa 染液染色 20min, 流水冲洗后晾干即可镜检 ( 也可以使用苯酚品红溶液染色 ) ( 七 ) 观察用中倍镜选择分散适度, 不重迭的染色体分裂相, 转高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特征, 并计算 2n 的染色体数目 ** 观察细胞的标准细胞完整, 轮廓清晰, 染色体分布在同一水平面上 染色体形态和分布良好 最好无重叠, 即使有个别重叠, 也要能明确辩认, 以免差错 所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段, 即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样 在所观察的细胞周围, 没有离散的单个或多个染色体存在, 以免影响计数 视野中大部分骨髓细胞应已破裂, 释放出染色体, 全部染色体较集中, 而各个染色体分散 互不重叠 长短收缩适中 两条单体分开 清楚地显示出着丝点位置 染色体呈蓝紫色 ( 或红紫色 ) 在高倍显微镜下观察小鼠骨髓细胞的染色体 我们可看到有?? 对 (2n=2X=??) 中部或亚中部着丝粒的染色体, 其中有? 对大型染色体和? 对小型染色体 33

217 六 作业及思考题 1. 简述染色体标本制备的方法步骤 制备理想的染色体标本, 应注意哪些关键步骤? 2 找到一个分裂相良好的区域, 统计小鼠 2n 染色体的数目, 仔细观察其形态特征, 可进行显微照相 3 绘制小鼠骨髓细胞染色体示意图 完成实验报告 4 每人上交 1-2 片染色体制片, 要求附说明 ( 主要包括 : 制片人 同组人 时间 制片的内容 过程等基本情况 ; 细胞破碎率 染色体形态和数目清晰程度 实验中的得失分析等制片质量评价 ) 附 : 两栖类骨髓细胞染色体制作方法一 实验目的 : 了解和掌握动物染色体涂片标本的制作过程, 为今后开展有关这方面的科研打下基础 二 实验原理 : 请参阅实验八 小白鼠骨髓细胞染色体的制备与观察 三 实验材料 : 青蛙或蟾蜍四 实验器具和药品试剂 : 冰箱 离心机 恒温水浴锅 显微镜 分析天平 药物天平 台称 试管架 离心管 吸管 烧杯 量筒 注射器 (1ml 5ml) 5 号针头 载玻片 解剖盘 解剖刀 剪刀 镊子 酒精 34

218 灯 切片盒 切片架 纱布 黑白胶卷 0.1% 秋水仙素溶液 0.046M KCL 溶液 1% 柠檬酸钠溶液 甲醇 冰醋酸 磷酸缓冲液 Giemsa 原液 冲洗底片的药液 五 实验方法和步骤 : ( 一 ) 前处理用台称称量青蛙或蟾蜍的体重, 然后按 10 微克 / 克动物体重的剂量, 腹腔注射秋水仙素 ( 二 ) 取材注射 4h 后, 将动物处死, 用剪刀剪开皮肤和肌肉, 取出大腿骨和胫骨, 剔净股骨上的肌肉, 然后用一小块纱布来回搓干净 剪开两端股骨, 用注射器 ( 内装 5ml 1% 柠檬酸钠溶液 ) 缓慢冲洗骨髓细胞到离心管中, 经平衡后离心 8min, 速度为 1000 转 /min ( 三 ) 低渗吸去上清液, 留沉淀物 0.2ml, 加 0.046M KCL 溶液至 8 ml 刻度, 用吸管冲匀沉淀物, 在恒温水浴 (28 ) 处理 20min 或更长一点时间 ( 四 ) 固定低渗后, 以每 min1000 转速度离心 10min 用吸管小心吸去上清液, 留 0.2ml 沉淀物, 冲散后沿管壁慢慢加入 6ml 固定液 冲匀后静止固定 20min 重复固定 1~2 次, 离心的速度与时间以上述相同 ( 五 ) 滴片吸去上清液, 留 0.2ml 沉淀物, 加 4 滴新配的固定液, 冲匀沉淀物 从冰箱取出预先冷冻的载片, 每片滴 3 滴细胞悬液, 立即用嘴向载片上吹气, 使细胞均匀分散, 在酒精灯火焰上来回烤一下, 以助染色体更好分散和展开 ( 六 ) 染色用 10:1 Giemsa 染液染色 20min(Giemsa 原液用 PH=6.8 磷酸缓冲液稀释 ), 然后用水冲洗, 片干后镜检 ( 七 ) 镜检在中倍镜下找染色体分散好的中期分裂相, 转至高倍镜详细观察两栖类染色体的数目, 属于大 中 小染色体各有多少条 牛蛙 (2n=26) 骨髓细胞 C- 中期分裂相和染色体组型图 蟾蜍骨髓细胞分裂相和染色体组型 35

219 实验九人类若干性状的遗传特性及其调查分析 一 实验目的 1. 了解人类一些常见遗传特性及其遗传方式 ; 2. 学会系谱调查及分析的基本方法 二 实验原理人是最重要的遗传学研究对象之一, 由于许多实验方法受到限制, 更不能控制人的生活条件和环境, 况且人类世代时间较长, 后代个体数很少, 以及许多性状遗传的机制也很复杂, 人类遗传学的发展相对比较缓慢, 对人类许多遗传性状的遗传特征尚不甚了解 利用系谱方法进展较慢, 由于人类基因组计划的实施加速了人类性状的研究进展 不过, 利用系谱分析仍是在一定程度上研究决定人类性状或疾病的基因的传递规律的重要方法 所谓系谱, 或称家系图, 即是指某一家族各世代成员数目 亲属关系与某基因表达的性状或疾病在该家系成员中分布情况的示意图 系谱的调查一般都从最先发现的具有某 性状或症状的先证者入手, 进而追溯其直系和旁系的亲属 系谱分析法常用于单基因遗传性状和单基因疾病遗传方式的研究, 包括常染色体显性和隐性以及性连锁显性和隐性遗传方式的分析 本实验将调查一些已知的人类遗传性状, 初步了解这些性状的遗传特性, 并在可能的情况下, 学生可对自己家庭的某些性状作相应的系谱分析, 从而学习基本的系谱分析方法 同时, 根据所测得数据可进行群体遗传结构分析, 判断供试群体是否处于群体平衡状态 三 实验过程 1. 人类血型的遗传血型是人体的一种遗传性状, 是产生抗原抗体的遗传特征 根据血型之间的相互关系, 可划分为各种系或组别 血型从狭义上讲是指红细胞抗原的差异, 广以上来说包括白细胞 血小板和血浆等血液各成分的抗原的差异 随着临床输血 组织和器官移植, 以及血液免疫学的发展, 人们发现了许多新的血型系统, 并逐渐了解和掌握了血型抗原和抗体的化学结构及其相互作用, 血型在人类学 遗传学 法医学 考古学和临床医学等各方面的应用日趋广泛 人类血型的发现早在 1900 年就由 Karl Landsteiner 博士报道 这个重要的发现建立了人类 ABO 血型系统 Landsteiner 并因此获得诺贝尔奖 ABO 血型的划分基础即红血球细胞膜上抗原存在的性质 这种抗原刺激淋巴细胞产生相应的抗体, 抗体与红血球表面抗原结合发 36

220 生凝聚, 随之由巨噬细胞清除 ABO 血型系统的抗原有两种, 分别记为 A 和 B 红血球表面抗原为 A 的即为 A 血型, 抗原为 B 的即为 B 血型, 同时具有 A B 两种抗原的为 AB 型, 而既没有 A, 也没有 B 抗原的为 0 血型 此外, 在相应的血清中,A 型者血清含抗 B 抗体称为 β 抗体,B 型者血清中含抗 A 抗体或称 α 抗体,O 型者血清中则同时含上述两种抗体, 而 AB 型者血清中没有这两种抗体 由于相应抗原抗体之间的凝聚反应, 在输血时对供血 受血者的血型有一定血型限制要求, 最好以同血型个体之间供血和受血为好 从遗传上来看,ABO 血型是由红血球抗原类型决定的, 而抗原的差别即在其糖基上 这是由相应的基因决定的, 即位于人类第九染色体上的 3 个等位基因 IAIB 和 IO 决定的 IA IB 基因为并显性, 而 IO 或记为 i 对 IA IB 为隐性 统计全班的血型, 并作纪录, 填入表中 : 血型 人数 百分比 (%) A B O AB 2. 几种身体特征的遗传针对以下性状进行调查, 统计数据, 记录各性状在本班的百分比 不过, 这个百分比不能说明这一性状是否遗传, 更不能确定是隐性还是显性 要了解这些性状是否是遗传性状, 可以通过系谱分析法确定, 每个同学调查自己的家庭成员, 或别的家庭的成员, 画出家庭系谱图, 从一个或几个家庭的系谱结果分析并确定这一性状的遗传特性 (1) 卷舌许多人可以将舌尖两侧卷起 在班级里检测每个人能否卷舌, 并记录数据, 算出卷舌和不能卷舌的百分比 (2) 发涡旋转方向在每个人头顶, 头发都有一发涡, 有的呈顺时针方向, 有的呈逆时针方向 同学之间可互相观察确定各自的发涡旋转方向, 记录全班的结果 看看哪种旋向占多数? (3) 达尔文耳点在耳廓外缘呈现一明显的凸点, 叫达尔文耳点, 这是一显性遗传性状 这一显性基因在表达方式上表现可变性 例如, 一些人仅在耳朵上表现 另外, 一些人尽管证明是隐性表型, 37

221 却能传递显性基因 (4) 美人尖前额正中发际线向下凸一尖, 称美人尖 观察统计全班同学具这一性状的百分比 (5) 反叠舌不用上齿帮助将舌头向上反折的能力, 在人群中较少具备, 一般比率低于干分之一 (6) 耳垂的形状不同的人耳垂的形状有可能不同, 有的肉质下垂, 有的沿耳廓与颊部连接 同学之间可相互观察这 性状, 统计全班具有这 性状的同学的百分比 (7) 环食指长 (8) 指甲类型 (9) 拇指端关节外展 : 这一性状的纯合隐性个体的拇指关节可向后卷曲 60o 检查全班同学表现这一性状的百分数 3. 几种生理特征的遗传 (1) 对苯硫脲的味觉感受能力苯硫脲, 又称苯基硫代碳酰二胺 (PTC) 是一种白色结晶状化合物 对一定浓度的 PTC, 有人感觉极苦, 有人却感觉甜, 还有人感觉完全无味 调查这一生理性状的特征 溶液检测时可滴小滴于舌上即可 检测全班同学的 PTC 味觉感受结果 学生可以自己调查该性状的家庭系谱, 以确定其遗传特性 称取 1.3 克的苯硫脲定溶于 1 升蒸馏水中 (20 2 天可完全溶解, 或加热溶解亦可 ) 该溶液浓度定为 1 号, 然后依次等量对半稀释至 l 4 号 溶液标号溶液配置感受者基因型 1 称取 1.3 克的苯硫脲定溶于 1 升蒸馏水 tt 2 取 1 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 tt 3 取 2 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 tt 4 取 3 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 tt 5 取 4 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 tt 6 取 5 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 tt 7 取 6 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 Tt 38

222 8 取 7 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 Tt 9 取 8 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 Tt 10 取 9 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 Tt 11 取 10 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 TT 12 取 11 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 TT 13 取 12 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 TT 14 取 13 号溶液 50ml, 以 50ml 蒸馏水稀释一倍 TT 受测者从低浓度的 14 号溶液依次尝味 用滴管向受测者舌根部滴 5 6 滴溶液, 然后记录受测者第一次尝到苦味时的溶液等级号 对尝味结果报告不确切或模棱两可者, 重复进行测试, 直至认为可靠后才记录其溶液等级号 尝味域值 >11 号为纯合尝味者 TT 尝味域值 10 一 7 号为杂合尝味者 Tt 尝味域值 <7 号为味盲 tt 将全部同学该性状的基因型做统计分析, 该群体是否为平衡群体, 如何解释结果? 注意 : 测试时一定要从低浓度到高浓度, 每换不同号溶浓时要用蒸馏水漱口 另外, 在测试时带用蒸馏水和 PTC 溶液交替测试, 以避免受测者的臆想和猜测 ** 注意事项 : 每次测试味觉后须用饮用水漱口 测试味觉的顺序应从低浓度到高浓度依次进行 (2) 嗅觉察觉阈和识别阈的测定操作方法 : 轻轻摇晃事试液瓶, 打开瓶塞, 将鼻子凑近瓶口, 依次从低浓度溶液向高浓度溶液闻过, 记住即号溶液感觉有味道 ( 即察觉阈 ), 然后继续闻下去, 直至正确判断所测物质的名称 ( 即识别阈 ) 最后记下所得数据 溶液配制 : 以 25% 某溶液为母液, 同样按 1/2 倍作倍比依次稀释成第 12-1 号溶液 察觉阈分两种类型 : 敏感型 (1-6) 不敏感型 (7-13) 识别阈分三种类型 : 高度敏感型 (1-6) 中度敏感型 (7-11) 不敏感型 (12-13) 39

223 嗅阈测量数据统计表 溶液编号 察觉人数 识别人数 四 附录 : 人的一些显 隐性性状表现显性性状皮肤毛发眼睛正常颜色黑色皮肤 ( 不完全显性 ) 黑色毛发非棕黄色毛发卷缩发头发中有一绺白发身体有相当大的部分多毛男人秃顶蓝色或黑色眼睛大眼睛长睫毛正常视力辨色能力正常下悬的耳垂正常听觉厚嘴唇舌头有卷成槽型的能力宽鼻孔高而窄的鼻梁大而凸的鼻子矮身量 ( 多基因决定 ) 多指 趾血型 A B AB 血液凝集正常高血压味觉有感觉苯硫尿的能力正常状态偏头痛 隐性性状白化现象白色皮肤浅色毛发棕黄色毛发直发同种颜色的头发身体只有一部分多毛头发正常褐色眼睛小眼睛短睫毛近视色盲长合的耳垂先天性耳聋薄嘴唇舌头无卷成槽型的能力窄鼻孔矮而宽的鼻梁笔直的鼻子高身量指趾数正常血型 O 血友病正常血压味觉无感觉苯硫尿的能力苯酮尿正常状态 五 作业与思考题 完成群体中人类遗传性状调查表, 并结合数量遗传 群体遗传的原理进行分析 40

224 实验十粗糙链孢霉的分离和交换 一 实验目的 1 学习粗糙链孢霉的培养方法和杂交技术 2 了解粗糙链孢霉的生活史 3 通过对链孢霉杂交产生的子囊孢子的统计分析, 验证遗传学的基本规律, 掌握有关基因的着丝粒距离的计算和作图 二 实验原理链孢霉的四分子 (ordered tetrad) 分析涉及到其减数分裂过程中的重组 交换的整个过程, 两种不同接合型 (mating type) 的个体产生的短暂二倍体进行的减数分裂形成了 4 个单倍体的细胞 根据在同源染色体联会时有无非姊妹染色体的交换, 带有基因标记的子囊孢子可以直接显现出来, 因此是遗传分析工作中的有用工具 三 实验材料粗糙链孢霉的野生型菌株 (Lys +, 接合型 A) 赖氨酸缺陷型菌株 ( Lys -, 接合型 a) 四 实验用具药品显微镜 镊子 解剖针 接种针 载玻片 试管 培养皿 50.0g/L 次氯酸钠 生理盐水等 五 实验方法及步骤 1. 制备培养基 野生型菌株的培养基 ( 土豆培养基 ) 培养缺陷型菌株的培养基 杂交用培养基 2. 菌株活化把野生型及缺陷型的菌株从冰箱中取出, 分别接种到相应的培养基上进行扩大培养, 通常 28 温箱培养 5 天左右 注意接种要严格在超净工作台上进行无菌操作, 以防细菌和其他真菌的感染 3. 接种杂交 无菌条件下取野生型和缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的杂交培养基上 在杂交培养基中放入一张灭菌的滤纸, 分别把两种菌株接在滤纸的两侧以便于杂交成功后 收获子囊果 41

225 接种结束后, 注意要贴上标签, 写明亲本菌株及杂交日期 将试管放在 25 下恒温培养 2~3 周 (30 以上即抑制原子囊果的形成 ), 当出现黑色的子囊果时, 及时进行镜检 野生型的子囊孢子成熟后为黑色, 赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较慢因而呈灰色或浅灰色 在此过程式中一定要经常取材镜检, 因为只有发育适中的子囊果便于解剖和观察 4. 结果分析 用解剖针从培养基中的滤纸上挑取颜色较深 个体较大的子囊孢子置于载玻片上 滴加一滴 50.0g/L 的次氯酸钠溶液, 用解剖针的针尖轻压子囊果, 使其破裂将子囊释放出来, 在低倍显微镜下进行观察, 即可观察到 个子囊, 观察子囊中子囊孢子的排列情况 注意不能使分生孢子散出 观察过的载玻片 用过的镊子和解剖针等物都需放入 50.0g/L 的次氯酸钠中浸泡后取出洗净, 以防止污染实验室 # 粗糙链孢霉的分离和交换 (a) 成熟的子囊果 ; (b) 散开的子囊 5. 着丝粒作图交换值 =( 交换型子囊数 / 观察到的子囊总数 ) 1/2 100% 五 作业及思考题 1. 高等动 植物的有性生殖和基因交换与粗糙链孢霉有什么异同? 2. 根据实验统计结果, 绘出粗糙链孢霉 lys 基因与着丝粒的连锁图 3. 什么是极化子模型? 在粗糙链孢霉的杂交过程中应主意哪些问题? 42

226 实验十一果蝇的杂交试验 一 实验目的 1 了解伴性遗传和常染色体遗传的区别; 2 进一步理解和验证伴性遗传和分离 连锁交换定律; 3 学习并掌握基因定位的方法 二 实验原理红眼与白眼是一对相对性状, 控制该对性状的基因 (W) 位于 X 染色体上, 且红眼 (W) 对白眼 (w) 为完全显性 当红眼雌蝇与白眼雄蝇杂交时, 无论雌雄均为红眼,F 2 中红眼 : 白眼 =3:1, 但雌蝇全为红眼, 雄蝇中红眼 : 白眼 =1:1; 反交时 F1 中雌蝇为红眼, 雄蝇为白眼, F 2 中红眼 : 白眼 =1:1, 雌蝇和雄蝇中的红眼与白眼的比例均为 1:1 正常翅 (Sn 3 ) 对小翅 (sn 3 ) 为显性, 正常刚毛 (M) 对焦刚毛 (m) 为显性, 与红眼 (W) 和白眼 (w) 一样, 均位于 (X) 染色体上 利用三点测交的方法只需通过一次杂交和一次测交就能同时确定三个基因在染色体上的位置顺序和基因的相对距离, 绘出连锁图 让白眼小翅焦刚毛 蝇与野生型 蝇杂交,F 1 雌蝇是三杂合体 : 表型为野生型 F 1 蝇是白眼焦刚毛小翅 F 1 代的雌雄蝇互交实际上相当于三杂合体雌蝇与三隐性雄蝇的测交 通过对互交后代中各种表型比例的分析, 就可进行 w sn 3 和 m 等基因的定位 三 实验材料野生型雄蝇 雌蝇 白眼焦刚毛小翅雌雄蝇 四 实验器具和药品 1. 器具 : 放大镜 显微镜 麻醉瓶 白瓷板 毛笔 记录本 2. 药品 : 乙醚 酒精棉球 培养基 五 实验步骤 1. 选处女蝇 选白眼焦刚毛小翅处女蝇 5~10 只, 同时选野生型处女蝇 5~10 只 方法 : 将野生型和白眼焦刚毛小翅果蝇培养瓶内的成蝇全部赶去,12 小时内将重新孵化出的雌雄果蝇分开, 即可得所需处女蝇和雄蝇 2. 杂交 将白眼焦刚毛小翅处女蝇麻醉, 并挑取野生型 蝇 5~10 只麻醉后放入培养瓶, 此杂交组 43

227 合可用作伴性遗传和基因定位的观察统计 将野生型处女蝇 5~10 只麻醉, 同时将同样数量的白眼焦刚毛小翅雄蝇麻醉, 放入培养瓶, 此组合用于分离定律和伴性遗传实验的反交 贴好标签 注明杂交组合和日期, 学生姓名 接种一天后检查成活情况, 死亡应及时补充 条件下培养 7~8 天后, 赶去亲本蝇 4. 观察 F 1 11~13 天后,F 1 代羽化, 用放大镜对正交组合的 F 1 进行观察, 看 F 1 雌蝇是否为野生型, 雄蝇是否全为三隐性, 若不是, 表明处女蝇是非处女蝇, 实验失败 5. F 1 互交 正 反交各选 5~10 对 F 1 雌雄蝇麻醉, 转入新的培养瓶, 贴好标签 6. 放飞 F 1 7~8 天后赶去 F 1 7. 观察 F 2 11~13 天后,F 2 羽化, 将其麻醉后于白瓷板上用放大镜观察, 或用解剖镜 显微镜观察各种表型的果蝇并统计数目, 每隔 2 天观察一次, 连续 3~4 次, 统计总数约 200~300 只 统计后的果蝇倒入死蝇盛留器中 六 实验结果 1. 分离定律 : 只观察一对相对性状的遗传情况, 并对观察结果进行遗传分析 2. 伴性遗传 : 只观察一对相对性状 ( 如红眼和白眼 ) 伴随性别的遗传情况, 并填表 3. 基因定位 : 同时观察三对相对性状, 但只用正交组合的 F 2 代数据, 并将观察结果填表 七 作业及思考题 1. 分析和解释分离规律的实验结果 2. 分析和解释伴性遗传的实验结果 3. 计算 X 染色体上三个基因之间的重组值, 确定它们的位置, 作出连锁图 4. 写出实验报告 5. 你在实验中有什么新的发现? 如何进行解释? 44

228 实验十二同功酶遗传标记分析 一 实验目的 1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的技术, 了解同工酶分析在遗传学研究中的意义 2. 了解同工酶遗传标记的分析的应用 二 实验原理同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶 同工酶分子的多种形式是由基因决定的, 也即同工酶是基因表达的直接产物 由同一基因座的不同等位基因编码的各种同工酶又称为等位酶, 它们从分子水平上反映了等位基因的相对差异 因此, 同工酶不仅是一种生理生化指标, 而且也是一种可靠的遗传标记 制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度 (100 毫升凝胶溶液中含有单体和交联剂总克数 ) 决定 当采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系时, 一般上层是大孔径的浓缩胶 (ph 6.8), 下层为小孔径的分离胶 (ph 8.9), 电泳缓冲液为 Tris- 甘氨酸缓冲液 (ph 8.3) 在这种不连续系统里, 存在着电荷效应, 分子筛效应和浓缩效应 蛋白质 ( 酶 ) 按其电荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上 用此凝胶板与酶反应底物进行催化反应, 再用生物染料染色便形成肉眼可见各种酶带 三 实验材料水稻 (Oryza Sativa): 二亲本 F 1 F 2 四种植株群体的幼苗 四 实验器具和药品 1. 用具 : 电泳仪, 电泳槽, 注射筒及针头, 微量注射器, 玻璃板, 离心机等 2. 药品 : 三羟甲基氨基甲烷 (Tris), 四甲基乙二胺 (TEMED), 丙烯酰胺 (Acr), 甲叉双丙烯酰胺 (Bis), 甘氨酸, 过硫酸铵, 蔗糖, 溴酚蓝, 联苯胺, 过氧化氢 五 实验步骤 1. 种子发芽 : 取各样品种子 100 粒, 分别置于培养皿内, 在 30 之恒温箱中催芽, 待芽长出 1-2 叶, 便可进行取样 2. 制备酶粗提液 : 一般取样 0.5 克, 置于研钵中, 加入 1.5mL 电极液研磨匀浆后, 将样品移至小离心管中离心 (3500rpm)15 分钟, 取上清液, 电泳前可在冰箱中保存 3. 聚丙烯酰胺凝胶系统的配制 * 分离胶的配制 ; * 浓缩胶的配制 4. 点样 : 取出样品解冻, 以微量注射器吸取样品上清液 50 微升加入样槽内 ( 注意要针头接近槽底慢慢注入, 防止扩散 ), 并在玻璃板上贴上样品编号 5. 电泳 45

229 电泳槽加电极缓冲液, 加一滴 0.2% 溴酚蓝, 接好电源, 在 4 冰箱中电泳 当溴酚蓝迁至凝胶下端 0.5-1cm 时停止电泳, 电泳时间约 3-4 小时 6. 染色 : 将完整的胶板, 加入染色液, 浸泡凝胶, 室温下染色 分钟, 呈现酶带后取出凝胶, 用水漂洗终止染色, 洗净后可仍浸于清水内 ( 注意经常换水 ), 亦可制成干片永久保存 7. 酶带的比较分析 : 酶带 ( 图示 ) 六 作业 1. 绘出各种样品中酯酶同工酶谱, 并说明酶谱差异 2. 分析 F 2 酯酶同工酶标记的遗传分布及其规律 46

230 附录 : 常用试剂的配制方法 1. 秋水仙碱水溶液在分析天平上准确称取秋水仙碱 0.1 克, 放进 50ml 容量瓶中, 滴入少许酒精导溶后加适量蒸镏水振摇使其全部溶解, 最后定量到 50ml 这样即配成 0.2% 浓度的母液, 将其转入棕色瓶中保存, 待具体使用时再按所需要浓度进行稀释 2. 对二氯苯一 а 一溴萘混合预处理液先将对二氯苯配制成饱和水溶液, 然后在约 100ml 的对二氯苯饱和水溶液中 ( 室温 ) 加入 1 小滴 а 一溴萘, 充分摇匀后静置, 待溶液澄清后即可使用 此液作用力强, 但稳定性稍差, 不宜配备后长期存放 ( 最好一周内使用 ) 3. 卡诺氏固定液 将冰乙酸与无水酒精按 1:3 混合即可 此液一般用于固定植物材料, 用于动物材料 时可将配方中的乙醇换成甲醇 4. 酒精百分比浓度稀释 ( 表 ) 母液浓度 目标浓度 取母液量 加蒸镏水量 (%) (%) (ml) (ml) 苯酚品红染色液 1 原液 A: 称取 3g 碱性品红结晶溶于 100ml 70% 的乙醇中 ( 此液可长期保存 ) 2 母液 B: 取 10ml 原液 A 加入到 90ml 5% 的苯酚水溶液中, 充分混匀, 置 37 温箱中温 液 2~4h( 此液不稳定, 限 2 周内使用 ) 47

231 3 C 4 D 液 ( 苯酚品红染色液 ): 取母液 B55ml, 加入冰乙酸和甲醛各 6ml, 充分混匀 液 ( 改良品红染色液 ): 取 10~20mlB 液加入 90 80ml45% 的冰醋酸和 0.5 克山 梨醇, 放置 2 周后再开始使用 ( 此液室温下可存放 2 年而保持稳定不变质 ) 6. 吉姆萨染色母液 配方一 :Giemsa 干粉 1g, 甘油 ( 分析纯 )66ml, 甲醇 ( 分析纯 )66ml 配时先将 Giemsa 干粉倒入研钵内, 加进少量甘油, 仔细研磨约半小时, 至无颗粒状 Giemsa 染料为止 ; 再把 剩余甘油全部倒入研钵内磨匀, 然后装入棕色试瓶中, 置约 56 温箱中保温 2 小时, 再加 入甲醇, 混匀后贮存备用 在没有优良 Giemsa 染料时, 可以采用配方二 : 天青 Ⅱ 一曙红盐 3.0g 天青 Ⅱ 0.8g, 甘油 250ml, 甲醇 250ml 配时取天青 Ⅱ 一曙红盐和天青 Ⅱ 结晶置于干燥器中充分干燥后倒入研 钵中加甘油充分研磨, 再加入甘油和甲醇, 过程要求如上法 7. 磷酸缓冲液 (Sorensen 液 )(PBS 液 ) (1) 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钾缓冲液 (1/15M)(Sorensen 液 ) ph 值 A 液 (KH2PO4) B 液 (Na2HPO4) Na2HPO4 2H2O 分子量 =178.05;1/15M 溶液为 克 / 升 KH2PO4 分子量 =136.09;1/15M 溶液为 克 / 升 48

232 N 一 KCl 水溶液 : 称取 克氯化钾 ( 分子量 74.6) 溶于 100ml 蒸镏水中 0.046M KCl 取 克 KCl 溶于 1000 毫升双蒸水中 9. 盐酸当量浓度配制 ( * 表中按定溶到 1000ml 的用量计算 ) 目的浓度 当 HCl 比重为 1.19 时 应取浓盐酸量 (ml) 当 HCl 比重为 1.16 时 1N N N 希夫试剂 (schiff 试剂 ) 将 0.5g 碱性品红结晶溶入 100ml 煮沸的无离子水中, 揽动使其充分溶解, 移离热源, 待冷却至 58 时将其过滤于一棕色瓶中 再待滤液冷至 26 时, 加入 10ml 1N HCl 和 0.5g 偏重亚硫酸钠 (Na2S2O5), 振摇使其溶解混匀, 密封瓶口, 置黑暗和低温 (10 ) 处, 4~12h 后捡查待染色液透明无色或呈淡茶色时即可使用 11. S02 漂洗液 先将亚硫酸钠配成 10% 水溶液 ( 母液 ), 使用时取 10ml 母液 200ml 蒸馏水, 再加 10ml 1N 一 HCl 即成工作液 % 二盐喹吖因水溶液 将 0.5 克二盐酸喹吖因加到 100 毫升蒸馏水中 用 0.1N 的 HCl 调节 ph 至 4.5 置深色 瓶中并放置冰箱内至少一周 SSC 溶液 (0.3mol/L NaCl+0.03mol/L 柠檬酸钠 ) 称取 NaCl 克和柠檬酸钠 克置于容量瓶中加蒸馏水至 1000 毫升 49

233 14. 磷酸氢二钠 - 柠檬酸钠缓冲液 (MacIlvaine) ph 0.2M Na2HPO4 ( 毫升 ) 0.1M 柠檬酸 ( 毫升 ) ph 0.2MNa2HPO4 ( 毫升 ) 0.1M 柠檬酸 ( 毫升 ) Na2HPO4 分子量 =141.98;0.2M 溶液为 克 / 升 Na2HPO4 2H2O 分子量 =178.05;0.2M 溶液含 克 / 升 C6H8O7 H2O=210.14;0.1M 溶液为 克 / 升 15. 磷酸缓冲液 (1/15 M ) Na2HPO4.2H2O 分子量 =178.05; 1/15M 溶液为 克 / 升 KH2PO4 分子量 =136.09; 1/15M 溶液为 克 / 升 P H M/15 Na 2 HPO 4 ( 毫升 ) M/15 KH 2 PO 4 ( 毫升 ) 清洁液 ( 专门清洗玻片 离心管 吸管等 ) 取 100 克重铬酸钾溶于 500 毫升水中, 慢慢 滴入 500 毫升硫酸, 使重铬酸钾发热溶解 50

234 遗传学 实验报告集 班级 学号 姓名 使用时间 至 组别 51

235 苏州科技学院生物与化学工程学院 实验室学生守则 一 严格遵守实验室各项规章制度和管理措施, 服从教师及实验技术人员的指导 二 严格按照实验要求, 做好实验预习, 实验之前 5 分钟进入实验室, 及时 准确地完成实验任务, 实事求是地完成实验报告, 杜绝弄虚作假 三 严格执行操作规定, 爱护仪器设备及工具 凡不按教师的指导擅自操作引起仪器设备损坏者, 应予赔偿 四 爱护实验室公共财物, 节约水电 材料和试剂 未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器, 不得随便拆装仪器或将仪器 工具等带至室外 五 保持实验室的严肃安静, 不得大声喧哗 嘻闹, 严禁在实验室内抽烟和吃东西 六 严防事故, 确保实验室安全, 发现异常情况, 应及时向有关教师和管理人员报告 七 每次实验结束后, 主动整理好仪器设备, 归还所借器材, 关闭电源 水源, 按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作, 经指导老师许可后, 方可离开 苏州科技学院生物与化学工程学院 52

236 预习报告 实验名称 实验目的 : 实验原理 : 操作步骤 : 注意事项和存在疑问 : 指导教师 日期 53

237 实验报告 实验名称 日期 实验原理 : 实验器材 : 主要的操作步骤 : 实验结果或观察结论 : 讨论和建议 : 评分 教师 日期 54

238 学期实验小结 55

239 细胞生物学实验指导 姚雪梅编 苏州科技学院 2009 年 8 月 1

240 ( 一 ) 细胞培养技术实验目的 : 1. 了解细胞培养的基本方法 2. 掌握通过聚乙二醇为介导物融合细胞的方法实验原理 : 动物机体的各种组织或器官从机体取出后, 经处理分散成单个细胞, 加入适量培养基, 置合适的培养容器中, 在一定的条件下培养, 使细胞得以生存 生长和繁殖 细胞借助于物理 化学或生物的方法可以实现两个或多个细胞间的融合 PEG 是一种常有的细胞融合剂 实验过程 : 细胞培养是指细胞在体外条件下的生长, 细胞培养技术是从事细胞与分子生物学研究最基本的工具之一 本实验的基本步骤是 : 细胞培养液的配制 原代培养 传代培养一 细胞培养液的配制许多生物技术公司将不同的培养基制成粉剂出售, 一般实验室只需购买相应的粉剂培养基即可 下面以 DMEM 培养基为例说明配制方法 首先将 DMEM 培养基放入 1000ml 烧杯中, 加入 80% 规定量的双蒸去离子水 800ml, 搅拌 5-10 分钟至完全溶解, 以 ph 计或 ph 试纸调整 ph 至 , 移入量筒, 补足双蒸去离子水至规定量 1000ml, 准备过滤除菌 培养基的过滤最好采用正压过滤系统 取滤膜加于两层滤纸之间, 装上滤膜及管道系统, 用纱布扎好出液口, 装入布袋, 与盛装培养基的瓶子一起于 15 磅,121 高压消毒 15 分钟 于超净台内接好充气球, 在储液瓶中加入配好的培养基, 向储液瓶中充气, 分装过滤后的培养基, 标记培养基名称及配制时间, 于 4 保存 如果少量过滤, 则可以使用一次性滤器, 用注射器吸取液体滤于盛装容器中 小牛血清使用前需先灭活,56 水浴 30 分钟, 不断振摇, 超净台内分装 10-20ml, 于 -20 保存 进行细胞培养时, 吸取除菌后的 DMEM 培养基, 并记下体积, 取灭活的小牛血清, 按 10% 浓度加入瓶中, 混匀后即可使用 加有血清的培养基称为完全培养基 有些培养基需补加抗生素 谷氨酰胺 碳酸氢钠等添加成分, 可以按要求配成高浓度储存液, 过滤除菌后分装小份, 每次使用前以加小牛血清类似的方式加入, 混匀后即可使用 二 原代培养新鲜组织来自无菌动物实验或手术无菌标本 取新鲜组织浸入无菌清洗液 Hanks 中清洗, 移入青霉素瓶, 用无菌眼科手术剪剪成 1-3mm 3 的小块, 用清洗液反复清洗, 弃去带血上清液, 用弯头吸管移小组织块于培养皿中, 注意组织块间应保留一定距离, 于 37,5% CO2 培养箱中静置 2-4 小时后, 组织块紧贴瓶皿底部, 轻轻加入少量培养基浸盖组织块, 于 37,5%CO2 培养箱中培养 7 天后, 细胞从组织块底部长出, 补足多量培养基, 继续培养 4 2

241 -6 天, 细胞逐渐增殖至长满后可以进行传代培养 这期间每 3-5 天更换一次培养基 另外还可以采用化学消解法即用胰蛋白酶 胶原蛋白酶等使组织中细胞连接被解除, 游离为单细胞悬液, 进行原代培养 三 传代培养根据细胞增殖速度不同, 可以进行 1:2 1:3 1:4 传代培养, 目前较常有的是胰蛋白酶消化法 取已长满细胞的培养瓶, 吸去培养液, 以 D-Hanks 液清洗, 加入 0.25% 胰蛋白酶消化液, 相差显微镜观察, 胰酶消化前, 细胞间隙较紧密, 消化后, 可见贴壁细胞变圆预脱落, 加入完全培养基, 以终止消化作用 用弯头吸管将细胞自瓶壁吹下, 移至 10ml 无菌离心管中, 将管塞紧, 以 1000rpm, 离心 5 分钟, 离心后可见细胞沉淀于离心管底部, 除去上清, 加入 1-2ml 完全培养基制成细胞悬液, 计数后按一定比例分于新的培养瓶中, 补足培养基, 于 37,5%CO2 培养箱中半开放式培养 正常细胞传至一定代数后即逐渐死亡, 一些肿瘤细胞可以在体外无限传代成为细胞系, 来自单细胞增殖的细胞群体又称为克隆 讨论问题 : 1.Hanks 液为何物? 2. 小牛血清的比例是否有其它的? 3. 为什么用相差显微镜观察? 4. 为什么消化后加入完全培养基即可终止消化? ( 二 ) 单克隆抗体技术实验目的 : 了解单克隆抗体的制备过程实验原理 : 根据肿瘤细胞可以无限增殖 B 细胞可以分泌抗体的特点将他们在体外融合, 通过一定的筛选方法得到既可以分泌特异抗体, 又可以无限增殖的融合细胞 实验过程 : 利用细胞培养和细胞融合技术, 使体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与具有抗体分泌能力的小鼠脾淋巴细胞进行融合, 形成的杂交细胞存活, 一方面保留了骨髓瘤细胞无限增殖的能力, 另一方面保留了脾脏细胞分泌抗体的能力 通过一定的筛选步骤使这些杂交细胞以单克隆的形式生长, 即可鉴定出分泌单一抗体的杂交瘤细胞系, 这一过程就是单克隆抗体技术 这项技术包括 1 抗体分泌细胞的分离 ;2 细胞融合 ;3 特异抗体分泌的检测 ;4 阳性孔进一步单克隆化等一系列连贯过程 一 抗体分泌细胞的分离以纯化抗原常规免疫小鼠, 每次 0.2ml, 多点注射, 融合前 3 天静脉注入抗原, 加强免 3

242 疫一次, 眼球取血, 回收血清作为阳性对照 两个无菌瓶皿中预先加有少量无血清培养基, 取小鼠脾脏浸于培养基中, 用注射器针栓研磨脾脏, 经 100 目铜网过滤, 去除组织块, 使成单个细胞 将细胞悬液悬浮于 6ml 无血清培养基中,1000rpm 离心 5 分钟, 弃上清液, 收集脾细胞沉淀, 重新悬浮于 6ml 无血清培养基中, 吹打混匀备用 在一个 50ml 无菌离心管中加入 11ml14%Ficoll400, 再加入 5ml33 % 的泛影葡胺, 混匀 取 6ml 加于离心管底部, 然后在其顶部轻轻加上脾细胞悬液,2000rpm 离心 20 分钟, 使形成液体界面 用弯头吸管吸取界面上的脾细胞移入新的试管, 以无血清培养基清洗脾细胞制成 5ml 脾细胞悬液, 存于 4 冰箱备用 二 细胞融合抗 8AG 的小鼠骨髓瘤细胞于融合前 2-3 天, 按 1:5 传代培养, 于 37,5%CO2 培养箱中培养 2-3 天 收集生长旺盛期细胞于 10ml 离心管,1000rpm, 离心 5 分钟, 弃上清 加入无血清培养基清洗, 重复离心清洗步骤 2-3 次 制成每毫升含有 个细胞的细胞悬液后, 将悬液滴于计数板上, 计数细胞 在一个 10ml 圆底离心管中加入骨髓瘤细胞, 再加入小鼠脾细胞悬液混匀,1000rpm 离心 5 分钟, 尽可能除去上清 轻轻弹击试管壁, 使细胞团松散 逐滴加入 37 预热的 PEG1ml, 边滴边轻弹离心管, 于 1 分钟内滴完 室温静置 1-2 分钟, 逐滴加入 10ml 完全培养基, 同时轻弹离心管,5 分钟内滴完,1000rpm 离心 5 分钟, 弃上清后, 将细胞轻轻悬浮于装有 50mlDMEM 完全培养基的试管中,37,5%CO2 培养箱中培养过夜,1000rpm 离心 5 分钟, 弃上清后, 将细胞重新悬浮于 50ml 含有 HAT 的完全培养基中, 混匀 分别接种于 5 个 96 孔培养板中, 每孔 100μl, 于 37,5%CO2 培养箱中培养, 每隔 4-5 天, 在每孔中补加 100μl 含有 HAT 的完全培养基,37,5%CO2 继续培养, 观察各孔细胞生长情况, 培养 天时, 采用酶连免疫吸附试验进行抗体分泌的检测 三 特异抗体分泌的检测取纯化抗原制成适当浓度, 加于 96 孔板底,4 冰箱过夜 每孔加入 PBS 液清洗, 弃去液体, 重复次清洗步骤 2-3 次, 加入 0.5% 戊二醛溶液, 每孔 50μl, 室温反应 15 分钟 以 PBS 清洗, 弃去液体, 重复次清洗步骤 2-3 次, 加入 5% 的脱酯奶粉, 室温封闭 30 分钟, 弃去封闭液, 用 PBS 洗一次, 弃去液体 取前述的待检测抗体, 按两板孔的对应位置逐孔加入 50μl,37 水浴保温 60 分钟 用 PT 液洗 3 次后, 甩干清洗液, 加入 PT 液稀释的辣根过氧化物酶 HPR 标记的二抗反应液, 每孔 50μl, 于 37 水浴中反应 1 小时 每孔加入底物液各 100μl( 底物液成分为 :0.1M 枸橼酸钠盐,pH4.5,10ml;10mg 邻苯二胺 ;4μl 过氧化氢 ), 与反应液混匀, 于 37 反应 分钟, 酶标仪读数分析, 与阳性血清对照, 确定阳性分泌的克隆孔 四 阳性孔进一步单克隆化通过上述检测可初步确定阳性抗体分泌的板孔, 吹打混匀阳性孔细胞, 取 1-2 滴, 加入 10ml 含有 HAT 的培养基中混匀 再次接种 96 孔板, 每孔约 2 滴, 标记混匀, 于 37,5 4

243 %CO2 培养 天 当 96 孔板中细胞充分增殖, 取上清液进行特异抗体的检测,Elisa 法确定阳性孔后进一步单克隆化 收集每个阳性孔的细胞, 悬浮于不含氨基喋呤的 HT 培养基中, 混匀, 计数细胞, 稀释至每孔 0.8 个细胞 接种于新的 96 孔板, 再用 Elisa 法检测阳性的孔, 可认为是单克隆化的杂交瘤细胞 培养后逐步移入 24 孔板进行扩增, 补足培养基, 标记混匀,37,5%CO2 培养箱中继续培养 酶标仪上检测抗体分泌仍为阳性的细胞, 将阳性孔细胞转入冻存管, 加冻存液, 放入液氮罐进行液氮冻存, 以保证抗体分泌能力的维持及不发生变异 讨论问题 : 1. 淋巴细胞分离液分离淋巴细胞的方法? 分离液的组成? 2. 为什么选择抗 8AG 的小鼠骨髓瘤细胞作为融合出发细胞株? 3. 酶联免疫吸附试验的原理 过程? 4. 骨髓瘤细胞和脾细胞分别于融合后什么时间开始大量死亡? 为什么? 5.8 氮鸟嘌呤的作用是什么? 6.HAT 培养基筛选融合细胞的原理是什么? ( 三 ) 转基因动物技术实验目的 : 了解转基因动物培育的基本过程 方法实验原理 : 指用人工方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞, 使外源基因与动物本身的基因组整合, 并随细胞的分裂而增殖, 从而将外源基因稳定的遗传给下一代的工程化动物 概念 : 转基因动物是指以试验的方法导入的外源基因, 在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物 制备转基因动物的主要过程包括 :(1) 外源基因导入动物胚胎 ;( 2 ) 动物胚胎在母体内发育 ;( 3 ) 转基因动物的获得 有三种方法常用来建立转基因动物, 分别是 :(1)DNA 显微注射入单细胞受精卵 ;( 2 ) 转移 DNA 的胚胎干细胞微注射入囊胚 ;( 3 ) 反转录病毒载体携带 DNA 转染四细胞至原肠胚 实验过程 : 显微注射法建立转基因鼠这一方法大致可以分为以下几个步骤 :(1)DNA 的制备 ;( 2 ) 受精卵的制备 ;( 3 ) 显微注射 ;( 4 ) 受精卵的转移 (5) 转基因鼠的确定 由于小鼠性激素分泌的周期性及小鼠受精卵发育的规律性, 因此, 该实验有较固定的时相 以卵供体母鼠与公鼠交配作为零日, 在交配前两天的中午给卵供体母鼠注射第一种激素孕马血清后, 就启动了整个实验程序 小时后, 注射第二种激素 hcg, 并与公鼠合笼, 次日即实验时相的第一日上午取出受精卵, 取卵当日下午 2-7 时进行显微注射, 与结 5

244 扎公鼠交配活动的假孕母鼠作为卵的受体 显微注射后的受精卵于当日或第二日转移至假孕母鼠的输卵管, 或将培养至第四日的鼠胚胎转移至子宫 一 DNA 的制备 :CsCl 离心法取 3 克 CsCl 加入到 1.3х5cm 离心管中, 然后加入 2.4ml 回收的 DNA 溶液, 轻轻摇动使其充分溶解, 加入矿物油使其充满离心管上部 20,4 万转 / 分离心 48 小时, 离心完毕, 把离心管固定在支架上, 去除部分矿物油, 用内插 2ml 注射器的橡皮塞塞紧管口, 在离心管底部用 8-9 号针尖刺一小孔, 分部收集流出液, 每管 5-6 滴, 从位于中间的 8 个管中各取 1-2μl, 凝胶电泳确定 DNA 所在的管, 然后集中这些管中的 DNA 溶液, 加入到透析袋中,4 将 DNA 溶液对 4L 微注射用缓冲液透析 48 小时, 中间换液 4 次 将不同稀释度透析后的 DNA 溶液和已知浓度的 DNA 溶液同时做琼脂糖凝胶电泳, 然后在紫外等下观察, 目测比较它们在紫外等下的荧光强度, 估计待测 DNA 溶液的浓度, 用缓冲液稀释样品到 1-3μg/ml, 分装后 -70 保存 二 受精卵的制备转基因动物实验所用各类鼠为 : 卵供体母鼠 (4-6 周 ) 公鼠 (>6 周 ) 受体母鼠 (>6 周 ) 阉割公鼠 (>6 周 ) 卵供体母鼠与公鼠交配, 提供用于注射的受精卵 ; 母鼠与阉割公鼠交配, 产生假孕母鼠, 作为微注射后受精卵的受体 所用各类鼠应置于明暗循环的饲养室内, 以保证小鼠性周期的稳定性 一般为早 6 点至晚 6 点照明, 晚 6 点至次日早 6 点黑暗 为了准确控制小鼠的排卵时相并得到较大数量的受精卵, 需要给小鼠注射性激素制造人工性周期 首先给卵供体母鼠注射孕马血清, 每只小鼠 5IU,46-48 小时后, 腹腔注射 hcg, 每只小鼠 5IU, 然后每只母鼠与一只公鼠合笼, 次日晨需检查卵供体母鼠有无精栓 用引颈法处死有精栓的母鼠, 用 70% 酒精喷施小鼠全身后, 在下腹部剪开皮肤, 向上撕开, 充分暴露腹部, 剪开腹肌 腹膜, 将内脏翻向上, 即暴露两侧卵巢与输卵管, 剪取两侧输卵管 剪断输卵管与卵巢和子宫间的连接, 即可得到输卵管 将取下的输卵管集中到盛有 M2 培养基的试管中, 在含透明质酸酶的 M2 培养基中使卵成单个细胞, 将卵转至含 M16 的培养皿内, 置 37, 二氧化碳孵箱中 三 显微注射 (1) 显微注射装置 (2) 持卵针和注射针的制备 (3) 显微注射将注射完的卵转入盛有 M16 的瓶皿内, 置 37, 二氧化碳孵箱中 每次转移的卵应在半小时内注射完毕 6

245 四 受精卵的转移 (1) 阉割公鼠的准备将公鼠结扎后, 需检测绝孕可靠性 方法是 : 用阉割公鼠与雌鼠交配获得三个以上精栓, 而获得精栓的三只雌鼠均不受孕后才能使用 (2) 受精卵的转移五 转基因鼠的确定对于需要尽快获得信息, 而暂不需要保留转基因鼠的实验, 可取鼠胚胎提取 DNA 和 RNA 用引颈法处死怀孕母鼠, 以 70% 酒精喷施全身后, 打开腹腔, 可见子宫内胎鼠 从子宫两端剪断, 取出子宫, 将胎鼠放于冰上的瓶皿内, 剪下一个胎鼠置于小瓶皿内, 小心拨开胎衣 用镊子夹住头部, 使胎鼠成直立状, 剪下头部, 延颅底中线剪开颅骨, 取出脑组织, 用 PBS 洗去脑组织上的血迹, 然后置于小离心管的 GIT 溶液中 剪开腹壁, 轻压挤出内脏, 剥离出肝脏置于小离心管的 GIT 溶液中 剪下胎鼠臀部及后肢肌肉, 置于小离心管中 肌肉组织用于提取 DNA, 而肝 脑组织需转入 -70, 低温保存 待转基因鼠确定后用于提取 RNA 从肌肉组织中提取 DNA 后, 用 southern 印记杂交或 PCR 方法确定转基因鼠, 可用 northern 杂交或 RNase 保护实验确定外源基因的表达 讨论问题 : 1. CsCl 离心法的原理? 2. M2 和 M16 培养基? 3. 放置组织的 GIT 溶液? 4. 显微注射装置? ( 四 ) 细胞融合实验目的 : 1. 了解聚乙二醇 (PEG) 诱导体外细胞融合的基本原理 2. 通过 PEG 诱导鸡血细胞之间的融合实验, 初步掌握细胞融合的基本方法 实验原理 : 细胞融合 (cell fusion) 又称体细胞杂交, 是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞, 随后, 异核体同步进入有丝分裂, 核膜崩溃, 来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞 (hybrid cell) 细胞融合技术是研究细胞遗传 基因定位 细胞免疫 病毒和肿瘤的重要手段 依据融合过程采用的助融剂的不同, 细胞融合可分为 :1 病毒诱导的细胞融合, 如仙台病毒 ;2 化学因子诱导的细胞融合, 如聚乙二醇 (polyethyleneglycol,peg);3 电场诱导的细胞融合 ;4 激光诱导的细胞融合 PEG 是乙二醇的多聚化合物, 存在一系列不同分子质量的多聚体 PEG 可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组, 引起细胞融合 该方法应用相对分 7

246 子质量为 的 PEG 溶液引起细胞的聚集和粘连, 产生高频率的细胞融合 融合的频率和活力与所用 PEG 的相对分子质量 浓度 作用时间 细胞的生理状态与密度等有关 实验仪器 材料和试剂 : ( 一 ) 仪器 用具注射器 刻度离心管 离心机 血细胞计数板 水浴锅 滴管 显微镜 烧杯 容量瓶 凹面载玻片 盖玻片 酒精灯等 ( 二 ) 材料成年家鸡 ( 三 ) 试剂 %NaCl 溶液 2.GKN 液 :8.0g NaCl,0.4g KCl,1.77g Na2HP04 2H20,0.69g NaH2P04 H20,2.0g 葡萄糖,0.01g 酚红, 溶于 l 000m1 重蒸水中 3.50%(m/V)PEG 溶液 :1 取 50gPEG( 相对分子质量 =4000) 放入 100m1 瓶中, 高压灭菌 20min 2 让 PEG 冷却至 50-60, 勿让其凝固 3 加入 50ml 预热至 50 的 GKN 液, 混匀, 置 37 备用 4.Hanks 原液 (10 ): NaCl 80.0g Na2HP04 2H20 1.2g KCl 4.0g KH2PO4 0.6g MgSO4 7H20 2.0g 葡萄糖 l0.0g CaCl2 1.4g 1 称取 1.4g 的 CaCl2, 融于 30-50m1 的重蒸水中 2 取 l000ml 的烧杯及容量瓶各一个, 先放重蒸水 800m1 于烧杯中, 然后按上述配方顺序逐一称取药品 必须在前一药品完全溶解后, 方可加入下一药品, 直到葡萄糖完全溶解后, 再将已溶解的 CaCl2 溶液加入, 最后加水至 1000ml 5.Hanks 液 : Hanks 原液 100ml 重蒸水 896ml 0.5% 酚红 4ml 配好的 Hanks 液, 分装包扎好贴上标签, 经过灭菌后,4 保存 6. 詹纳斯绿染液 方法与步骤 : 1. 鸡血细胞的获得从家鸡的翼根静脉用注射器采血, 注入试管后, 迅速加入肝素 (100U/5ml 全血 ) 混合, 制成抗凝全血 2. 鸡血细胞储备液的制备 8

247 在抗凝全血的试管中, 加入 4 倍体积的 0.85%NaCl 溶液, 制成红细胞储备液, 置于 4 冰箱内可供一周内使用 3. 鸡血细胞悬液的制备取鸡血细胞储备液 1m1, 加入 4m1 0.85%NaCl 溶液, 混匀后,l 200r/min 离心 5min, 弃去上清液, 再加入 5ml 0.85%NaCl 溶液按上述条件离心一次 最后, 弃去上清液, 加入 10m1 的 GKN 溶液制成鸡血细胞悬液 4. 计数取 0.5m1 鸡血细胞悬液, 加 3.5m1 的 GKN 溶液进行稀释, 在血细胞计数板上计数 若细胞浓度过大, 用 GKN 溶液稀释至 l 10 7 个 /m1 左右 5. 鸡血细胞的收集吸取 lml 鸡血细胞悬液放入离心管中, 加入 4ml Hanks 液混匀,l 000r/min 离心 5min, 弃去上清液, 用手指轻弹离心管底部, 使沉淀的血细胞团块松散 6.PEG 诱导细胞融合吸取 0.5ml 37 的 50%PEG 溶液, 慢慢沿着离心管壁逐滴加入, 边加边轻摇离心管, 使 PEG 与细胞混匀, 然后在 37 水浴中静置 2min 7. 终止 PEG 作用缓慢加入 5ml Hanks 液, 轻轻吹打混匀, 于 37 水浴于静置 5min 8. 制备细胞悬液用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散,1000r/min 离心 5min, 使细胞完全沉降 弃去上清液, 加 Hanks 液, 再离心一次, 弃多数上清, 留少许溶液, 混匀 9. 染色和镜检吸取细胞悬液, 在凹面载玻片上滴一滴, 加入詹纳斯绿染液混匀, 染色 3min 后盖上盖玻片, 在显微镜下观察细胞融合情况 10. 计算细胞融合率细胞融合率是指在显微镜的视野内, 已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞 ( 包括已融合细胞 ) 的细胞核总数之比, 通常以百分比表示, 而且要进行多个视野测定, 进行统计分析 作业 : 画出观察到的融合细胞, 并计算融合率 ( 五 ) 细胞形态结构的观察实验目的 : 1. 熟悉人体及植物细胞的基本形态结构 2. 掌握临时玻片标本的制备方法 9

248 3. 初步掌握光镜下所见细胞 组织结构的绘图记录方法 4. 进一步掌握光学显微镜的使用方法 实验原理 : 细胞是生物体的结构和功能的基本单位 构成人体或其他高等动物体的细胞种类繁多, 形态各异, 而且这些细胞的形态与其功能往往相适应, 如血液中的红细胞为双凹圆盘状, 便于在血管中流动 ; 具有感受刺激 传导冲动功能的神经细胞一般附有长短不一的树枝状突起 ; 精子细胞具有一根长长的鞭毛, 故很善于运动 ; 巨嗜细胞呈不规则形状, 能伸出伪足, 吞噬和消灭外源的病原微生物 细胞的体积差别很大, 一般来讲, 真核细胞的体积要大于原核细胞, 高等动物的卵细胞大于体细胞 ( 卵细胞含有较多的营养物质 - 卵黄 ) 大多数的细胞必须借助于光学显微镜才能被观察到 由于细胞体积微小, 而且含有较多的水, 故大多是透明的, 如果不经染色处理, 在显微镜下难以看清细胞结构 因此, 要观察某种细胞结构时, 通常进行染色处理 在普通光镜下, 一般可见人体及动植物细胞的基本结构分为细胞膜 细胞质和细胞核 3 个部分 实验材料 : 人体口腔上皮细胞 洋葱 番茄 苹果 实验器具与药品 : ( 一 ) 器具显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 牙签 纱布 棉花 吸水纸 剪刀 玻璃缸 ( 二 ) 试剂 1% 碘液 1% 甲苯胺蓝 瑞特染液 酒精 0.9% 生理盐水 龙胆紫溶液或紫药水 ( 三 ) 试剂的配制 1. 1% 碘液称取 1g 碘片 2g 碘化钾溶于 100ml 80% 的乙醇或蒸馏水中即可 2. 1% 甲苯胺蓝称取 lg 甲苯胺蓝染料粉末加蒸馏水 100ml 溶解即可 3. 瑞特染液称取 0.1g 瑞特染料 (wright s stain) 粉末放入研钵中研细, 从 60ml 甲醇中取少许加入研钵中反复研磨, 最后加入全部甲醇混匀, 装入棕色瓶中保存备用 4. 龙胆紫溶液把龙胆紫溶解在 2% 醋酸溶液中, 直到溶液不变成深紫色为止 实验内容与方法 : ( 一 ) 细胞标本的制备及细胞基本形态结构的观察所有需观察的细胞都应放置到载玻片上制备成临时或永久玻片标本后才适于在光镜下观察, 在很多情况下, 在细胞或组织上还需加盖盖玻片, 以起到保护标本的作用 1. 洋葱鳞茎表皮细胞的标本制备与观察 10

249 (1) 表皮细胞装片标本的制备取一干净载玻片, 在其中央滴一滴 2% 的碘液 ; 将洋葱鳞茎用小刀分为几块, 取一块肉质鳞叶, 用镊子在其内表面轻轻撕下一小块膜质表皮, 剪成 3-4mm 的小块, 置于载玻片的碘液滴中, 铺平, 用小镊夹取一干净的盖玻片, 将其一侧先接触标本旁的碘液, 再缓缓的盖上盖玻片, 尽量避免产生气泡, 用滤纸吸去盖玻片周围的液体 (2) 观察将制备好的装片标本放到显微镜下, 先用低倍镜观察, 可见许多长柱状排列整齐 彼此相连的细胞, 选择其中一个典型的细胞移至视野中央, 再转换高倍镜仔细观察以下结构 :1 细胞壁 ;2 细胞核 ;3 细胞质 2. 人口腔粘膜上皮细胞标本的制备与观察 (1) 口腔粘膜细胞涂片标本的制备吸取一滴碘液滴在一张洁净的载玻片中央, 用一根事先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取粘膜上皮细胞 ( 或在舌头表面刮取细胞 ), 然后将其放入载玻片上的染液中并来回搅动使细胞散开 ; 染色 1min 左右后小心加盖玻片 ( 尽量避免产生气泡 ) 用滤纸吸去盖玻片周围的液体 (2) 观察将自制的口腔上皮细胞标本片置于显微镜下观察, 先用低倍镜观察较分散的, 轮廓清晰的上皮细胞 由于该细胞体积较小, 着色较淡, 观察寻找时应稍降低视野中的亮度以便于较快找到目标 可见用碘液染色的细胞呈黄色 ( 用甲苯胺蓝染色的细胞呈淡蓝色 ), 成群或分散分布, 形态大多呈扁平椭圆状 选择轮廓清晰的细胞移至视野中央, 转换至高倍镜下观察 (3) 实验结果高倍镜下可见人的口腔粘膜细胞外围有一层薄薄的细胞膜, 扁圆型的细胞核呈深黄色 ( 碘液染色 ) 或深蓝色 ( 甲苯胺蓝染色 ), 位于细胞中央, 细胞质染成浅黄色或浅蓝色 在核中有时能看见一致密的结构, 即核仁 3. 立体细胞的观察 (1) 立体细胞标本的制备 掰开番茄的果实, 用解剖针挑一些熟透的果肉放在载玻片上, 加 1 滴龙胆紫溶液或稀释的紫药水 (2-3 滴水加 1 滴紫药水 ), 盖上盖玻片, 在盖玻片上轻轻地压一下 (2) 观察 将自制的立体细胞装片置于显微镜下观察, 可看到一个个多角多面的立体形细胞 慢慢地推动一下盖玻片, 就能看到分离的果肉细胞在滚动着, 这样, 细胞的几个面就看得很清楚 如果水太多, 就用吸水纸在盖玻片的边上吸去, 否则细胞在水里移动, 推动盖玻片时看不到细胞的滚动 11

250 ( 六 ) 细胞膜的渗透性实验目的 : 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入红细胞的速度 实验原理 : 红细胞放置在数种等渗溶液中, 根据红细胞对各种溶质的透性不同, 有的溶质可渗入, 有的溶质不能渗入 渗入红细胞的溶质能提高红细胞渗透压, 使水进入红细胞, 引起溶血 由于溶质透入速度不同, 溶血时间也不同 实验用品 : 一 器材 50ml 小烧杯 10m1 移液管 试管 (1 10cm) 试管架 二 试剂 0.17mol/L 氯化钠 0.17mol/L 氯化钾 0.17mol/L 酯酸铵 0.17mol/L 硝酸钠 0.12mol/L 草酸铵 0.12mol/L 硫酸钠 0.32mol/L 葡萄糖 0.32mol/L 甘油 0.32mol/L 乙醇 0.32mol/L 丙醇 三 材料羊血 实验方法 : 一 羊红细胞悬液取 50m1 小烧杯一只, 加一份羊血和十份 0.17mol/L 氯化钠溶液, 形成一种不透明的红色液体, 此即稀释的羊血 二 低渗溶液取试管一支加入 10m1 蒸馏水, 然后再加入 1m1 稀释的羊血, 注意观察溶液的颜色变化, 由不透明的红色逐渐澄清, 红细胞发生破裂, 造成 l00% 红细胞溶血, 使光线比较容易透过溶液 三 羊红细胞的渗透性 1. 取试管一支, 加入 0.17mol/L 氯化钠溶液 10 m1, 再加入 1ml 稀释的羊血, 轻轻摇动, 注意是否有颜色变化? 是否有溶血现象? 为什么? 2. 取试管一支, 加入 0.17mol/L 氯化铵溶液 l0m1, 再加入 1ml 稀释羊血, 轻轻摇动, 注意是否有颜色变化? 是否有溶血现象? 若发生溶血, 记下时间 ( 自加入 1m1 稀释羊血到溶液变成红色透明澄清所需时间 ) 12

251 表 1 不同低渗溶液下的溶血现象 试管编号 是否溶血 时间 结果分析 (1)10ml 氯化钠十 lml 稀释羊血 (2)10m1 氯化铵十 1m1 稀释羊血 (3)10m1 醋酸铵十 1m1 稀释羊血 (4)10ml 硝酸钠十 1m1 稀释羊血 (5)10m1 草酸铵十 1ml 稀释羊血 (6)10m1 硫酸钠十 1m1 稀释羊血 (7)10m1 葡萄糖十 1m1 稀释羊血 (8)10m1 甘油十 1m1 稀释羊血 (9)10ml 乙醇十 1m1 稀释羊血 (10)10m1 丙醇十 1m1 稀释羊血 实验结果 : 将观察到的现象记录, 并进行分析和比较 ( 表 4 1) ( 七 ) 亚细胞组分的分离实验目的 : 掌握细胞匀浆和差速离心的方法了解细胞组分分级分离的原理和基本过程实验原理 : 细胞组分的分级分离是研究亚细胞组分的化学组成 理化特性及其功能的基本方法 细胞组分的分离是通过组织匀浆 分级离心等步骤完成的 细胞内各种结构的大小 形状和密度不同, 在同一离心场内的沉降速度也不同 因此在密度均一的介质中, 在不同大小的离心力场的作用下, 组分先后沉降而初步分离 差速离心只能将那些大小有显著差异的成分分离开, 更精细的分离则要采用密度梯度离心 实验过程 : 材料与试剂 : 1. 器材 : 玻璃匀浆器 台式高速冷冻离心机 普通离心机 普通光学显微镜 微量进样器 滴管 剪刀 镊子 小烧杯 离心管 tip 头 载玻片 盖玻片 eppendorf 管 滤纸 8 层纱布或尼龙网 (200 目 ) 冰块 2. 材料 : 大白鼠肝脏 3. 试剂 : 匀浆介质 (0.25mol/L 蔗糖水溶液, 含 0.003mol/LCaCl2) 生理盐水 中性红 - 詹纳斯绿 B 染液 13

252 4. 药品配制 : 中性红 - 詹纳斯绿 B 染液 : 1 将 3 滴詹纳斯绿 B 饱和水溶液 ( 溶解度 5.18%) 加到 5ml 无水乙醇中, 然后再加入 1ml 1:15000 中性红溶液 ( 中性红 10mg 溶于 150ml 水中 ), 瓶子用黑纸包好,4 冰箱保存 25ml 无水乙醇中加入 20~30 滴中性红饱和水溶液 ( 溶解度 5.64%) 临用时将 2 种溶液等体积混合 实验步骤 : 一 低速离心分离细胞核 1. 将饥饿 24 小时的大白鼠击昏, 用剪刀剪断颈部放血至鼠死亡, 立即剪开腹部取出肝脏, 去掉结缔组织, 将肝组织剪成数小块, 浸入预冷的生理盐水中反复洗涤除去血污, 用滤纸吸干表面的水分 2. 每组称取已洗净的肝组织 1g, 放在小烧杯中, 取 8ml 预冷的匀浆介质, 先加少量入小烧杯中, 尽量剪碎肝组织, 再将剩余的预冷的匀浆介质加入其中 将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中, 使匀浆器的下端浸入盛有冰块的器皿中, 垂直插入匀浆捣杆, 上下转动研磨数次使肝组织磨碎 用 8 层纱布 ( 先用少量匀浆介质湿润 ) 过滤匀浆液至离心管中 3. 将装有匀浆滤液的离心管配平后, 在普通离心机中以 2500r/ 分钟, 离心 15 分钟, 缓缓吸取上清液, 移入 eppendorf 管中, 配平, 在台式高速离心机上以 15000r/ 分钟, 离心 20 分钟, 缓缓吸去上清液, 留取沉淀物 如沉淀的表面有一浅色的疏松层时 ( 主要是一些损伤和肿胀的线粒体 ), 则应连同上清液一起小心吸去 4. 沉淀再加入预冷的勾浆介质悬浮, 用 tip 头吹打后再以 15000r/ 分钟离心 20 分钟 5. 将上清液吸入另一 eppendorf 管中, 留存沉淀物加入 0.lml 的匀浆介质混匀成悬液 ( 可用牙签 ),eppendorf 管同时置于冰浴中, 待制片鉴定时用 二 分离物的鉴定取步骤 5 中得到的沉淀物悬液和上清液分别均匀地涂布在 2 张干净载玻片上制备成涂片 A 和 B, 各滴 1 滴 0.02% 中性红 詹纳斯绿染液, 分别盖上盖玻片染色 5~20 分钟 在高倍镜下观察已染好色的玻片标本, 其中被染成亮绿色的颗粒是线粒体 比较观察和描述两张玻片的结果 问题讨论 : 1. 差速离心的原理? 2. 为什么用将老鼠饿 24 小时后再做实验? 3. 染色的时间不宜过长, 为什么? 4. 为什么实验过程中要保持低温? ( 八 ) 细胞器的光学显微镜观察 14

253 实验目的 : 1. 观察人 植物活细胞内线粒体和液泡系的形态 数量与分布 2. 学习一些细胞器的超活染色技术 实验原理 : 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法 它的目的是显示生活细胞内的某些结构, 而不影响细胞的生命活动和产生任何物理 化学变化以致引起细胞的死亡 活体染色技术可用来研究活状态下的细胞形态结构和生理 病理状态 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同, 通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类 体内活染是以胶体状的染料溶液注入动 植物体内, 染料的胶粒固定 堆积在细胞内某些特有结构里, 达到易于识别的目的 体外活染又称超活染色, 它是由活的动 植物分离出部分细胞或组织小块, 以染料溶液浸染, 染料被选择固定在生活细胞的某种结构上而显色 活体染色之所以能固定 堆积在细胞内某些特殊的部分, 主要是染料的 电化学 特性起重要作用 碱性染料的胶粒表面带阳离子, 酸性染料的胶粒表面带阴离子, 而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子, 这样, 它们彼此之间就发生了吸引作用 但并不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用, 应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料, 而且总是要配成稀淡的溶液来使用 一般是以碱性染料最为适用, 可能因为它具有溶解类脂质 ( 如卵磷脂 胆固醇等 ) 的特性, 易于被细胞吸收 詹纳斯绿 B(Janus green B) 和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料, 对于线粒体和液泡系的染色各有专一性 实验材料 : 人体口腔粘膜上皮细胞 洋葱鳞茎内表皮细胞 小麦根尖 实验器具与药品 : ( 一 ) 器具显微镜 恒温水浴锅 解剖盘 剪刀 镊子 双面刀片 载玻片 凹面载玻片 盖玻片 表面皿 吸管 牙签 吸水纸 ( 二 ) 试剂 Ringer 溶液 中性红溶液 詹纳斯绿 B 溶液 ( 三 ) 试剂的配制 1.Ringer 溶液 0.85g 氯化钠 ;0.25g 氯化钾 ;0.03g 氯化钙 ;100ml 蒸馏水 2.1% 和 1/3000 中性红溶液称取 0.5g 中性红溶于 50ml Ringer 液, 稍加热 (30-40 ) 使之很快溶解, 用滤纸过滤, 装入棕色瓶于暗处保存, 否则易氧化沉淀, 失去染色能力 临用前, 取已配制的 1% 中性红溶液 1ml, 加入 29ml Ringer 溶液混匀, 装人棕色瓶备用 3.1% 和 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5mlRinger 溶液中, 稍加微热 (30-40 ), 使之溶解, 用滤纸过滤后, 即为 1% 原液 取 1% 原液加入 49mlRinger 溶液, 即成 1/5000 工作液, 装入瓶中 15

254 备用 最好现用现配, 以保持它的充分氧化能力 内容与方法 : 线粒体是细胞进行呼吸作用的场所, 其形态和数量随不同物种 不同组织器官和不同的生理状态而发生变化 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法 詹纳斯绿 B 是对线粒体专一的活细胞染料, 毒性很小, 属于碱性染料, 解离后带正电, 由电性吸引堆积在线粒体膜上 线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色 ( 即有色状态 ), 而线粒体周围的细胞质中, 这些染料被还原为无色的色基 ( 即无色状态 ) 1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 (1) 取清洁载玻片放在 37 恒温水浴锅的金属板上, 滴 2 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 染液 (2) 实验者用牙签宽头在自己口腔颊膜处稍用力刮取上皮细胞, 将刮下的粘液状物放人载玻片的染液滴中, 染色 10-15min( 注意不可使染液干燥, 必要时可再加滴染液 ), 盖上盖玻片, 用吸水纸吸去四周溢出的染液, 置显微镜下观察 (3) 在低倍镜下, 选择平展的口腔上皮细胞, 换高倍镜或油镜进行观察 可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中, 分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构, 即是线粒体 2. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察 (1) 用吸管吸取 1/5000 的詹纳斯绿 B 染液, 滴一滴于干净的载玻片上, 然后, 撕取一片洋葱鳞茎内表皮, 置于染液中, 染色 10-15min (2) 用吸管吸去染液, 加一滴 Ringer 溶液, 注意使内表皮细胞展平, 盖上盖玻片进行观察 (3) 在高倍镜下, 可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据, 细胞核被挤至一侧靠近细胞壁处 仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布 ( 二 ) 液泡系的超活染色与观察 ( 小麦根尖细胞液泡系的中性红染色与观察 ) 1. 种子发芽实验前将小麦种子培养在培养皿内潮湿的滤纸上, 使种子发芽 2. 染色待胚根伸长到 1cm 以上用双面刀片把初生的小麦幼苗根尖 (1 2cm 长 ) 小心切一纵切面, 放入载玻片上的 1/3000 中性红染液滴中, 染色 5-10min 3. 压片吸去染液, 滴一滴 Rinqer 溶液, 盖上盖玻片, 并用镊子轻轻的下压盖玻片, 使根尖压扁, 利于观察 4. 镜检在高倍镜下, 先观察根尖部分的生长点细胞, 可见细胞质中分散着很多大小不等染成玫瑰红色的圆形小泡, 这是初生的幼小液泡 然后, 由生长点向延长观察, 在一些已分化长大的细胞内, 液泡的染色较浅, 体积增大, 数目变少 在成熟细胞中, 一般只有一个淡红色 16

255 的巨大液泡, 占据细胞的绝大部分, 将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处 思考题 1. 何谓活体染色和超活染色? 2. 如何鉴定细胞质中线粒体的存在? ( 九 ) 植物细胞骨架的显示与观察实验目的 : 1. 掌握细胞骨架的光镜标本片的制作方法 2. 了解植物细胞的细胞骨架基本形态 3. 了解细胞的超微结构特点 实验原理 : 细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构, 按组成成分和形态结构的不同可分为微管 微丝和中间纤维 它们对细胞形态的维持 细胞的生长 运动 分裂 分化和物质运输等起重要作用 观察和研究细胞骨架可用光镜 电镜 间接免疫荧光技术 细胞化学技术等方法 对光镜下细胞骨架的形态学观察多用 1%TritonX-100( 聚乙二醇辛基苯醚 ) 处理细胞, 使 95% 以上的可溶性蛋白质及全部脂质被抽提, 再以蛋白质染料考马斯亮蓝 R250 染色, 使细胞质中细胞骨架得以清晰显现 实验材料 : 洋葱 实验器具与药品 : ( 一 ) 器材恒温水浴箱 普通光学显微镜 直径 35mm 的小培养皿 ( 二 ) 试剂及配制 1.M 缓冲液 (ph 值为 7.2) 称取咪唑 3.4g KCl 3.71g MgCl2 H mg EGTA( 乙二醇双醚四乙酸 )380.35mg EDTA( 乙二胺四乙酸 )29.22mg 巯基乙醇 0.07ml 甘油 292ml, 加蒸馏水至 1000ml( 用 1mol/L HCl 调 ph 值为 7.2) 2.1%Triton X-100 取 Triton X-100 1ml;M 缓冲液 99ml 3.3% 戊二醛取 25% 的戊二醛 12ml;6 mmol/lpbs 88ml 4.0.2% 考马斯亮蓝 R250 染液称取 0.2g 考马斯亮蓝 R250; 加入 46.5ml 甲醇 ; 冰醋酸 7ml; 蒸馏水 46.5ml 5.6mmol/L PBS (ph 值为 6.5) A 液 :NaH2PO4 2H20 936mol/L 17

256 B 液 :Na2HP04 12H mg/L 工作液 :A 液 68.5ml 十 B 液 31.5ml( 用 NaHC03 调 ph 值至 6.5) ( 三 ) 内容与方法 1. 取材切开洋葱鳞茎, 撕取小块内表皮 ( 约 0.5cm 2 ), 浸入装有 6 mmol/lpbs 的小烧杯中使其下沉, 处理 5-10min 2. 抽提弃掉 6mmol/LPBS, 加 2ml 1% 的 Triton X-100 于小烧杯, 置于 37 恒温水浴锅处理 30min 3. 冲洗弃掉 1% 的 Triton X-100, 用 M 缓冲液轻轻洗 3 次, 每次 5min 4. 固定加 3% 戊二醛固定 20min 5. 冲洗弃固定液后, 用 6mmol/L PBS 洗 3 次, 每次 5min 6. 染色弃掉 6mmol/L PBS, 滴 5 滴 0.2% 的考马斯亮蓝 R250 染液染色 10min 7. 制片倒去染液, 用蒸馏水洗 2-3 次, 将标本平铺在载玻片上, 加盖玻片 8. 观察光镜下可见表皮细胞的轮廓, 细胞内存在着被染成蓝色 粗细不等的纤维网络结构, 便是构成细胞骨架的微丝束, 选择染色较好的细胞, 转高倍镜观察, 若转动微调, 可见细胞骨架的立体结构 ( 十 ) 细胞内 DNA 和 RNA 的原位显示实验目的 : 1. 通过实验认识并掌握 Unna 法 ( 甲基绿 派洛宁法 ) 能够特异性地鉴定与区分细胞中的 DNA 和 RNA 2. 掌握 Unna 试剂的配制以及 Unna 染色法 实验原理 : 核酸是酸性的, 它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁具有亲和力, 可以形成盐键, 而呈现出特异的颜色反应 利用这两种染料的混合液处理细胞可使其中的 DNA 和 RNA 染成不同的颜色 这是因为 DNA 和 RNA 这两种核酸的聚合程度不同, 甲基绿与 DNA 的亲和力高 ; 派洛宁与 RNA 的亲和力高, 又因为甲基绿分子上有两个正电荷, 它与聚合程度较强的 DNA 分子有较 18

257 强的亲和力, 可将 DNA 分子延长, 核被染成蓝绿色 ; 而派洛宁只有一个正电荷, 所以竞争不过甲基绿而与低聚分子 RNA 分子结合, 细胞质被染为红色, 因此, 使细胞中两种核酸分别显示出来 实验材料 : 洋葱 实验器具与药品 : ( 一 ) 器材光学显微镜, 剪刀, 镊子, 解剖针, 解剖盘, 染色缸, 注射器, 载玻片, 盖玻片, 擦镜纸, 吸水纸, 恒温水浴箱,10ml 小烧杯 ( 二 ) 试剂及配制 mol/L 醋酸缓冲液 (ph 值 4.8) 取 1.2ml 冰醋酸加蒸馏水 100ml 混匀 再称取 2.72g 醋酸纳 (NaAc 2H20) 溶于 100ml 蒸馏水中, 使用时两种液体按 2:3 比例混合 2. 2% 甲基绿染液称取 2.0g 去杂质甲基绿粉溶于 100ml 0.2mol/L 的醋酸缓冲液中即可 甲基绿中往往混有影响染色效果的甲基紫, 应预先除去 方法是将甲基绿溶于蒸馏水中, 放在分液漏斗中加足量的氯仿用力震荡后静置, 弃去含有甲基紫的氯仿, 再加氯仿反复几次直到氯仿中无甲基紫为止, 最后放入 40 温箱中干燥备用 3. 1% 哌洛宁溶液称取 1g 派洛宁溶于 100ml 的 0.2mol/L 的醋酸缓冲液中混匀 4. 甲基绿一派洛宁混合染液将 2% 甲基绿和 1% 派洛宁以 5:2 的比例混合即可 实验方法与步骤 : 1. 取材用小镊子撕取一小块洋葱内表皮, 置于载玻片上 2. 染色用吸管吸取甲基绿一派洛宁混合液, 滴一滴在洋葱表皮上, 染色 30 40min 3. 冲洗吸一滴蒸馏水冲洗洋葱表皮, 并立即用吸水纸吸干以防派洛宁脱色 4. 观察盖上盖玻片后镜检, 可见富含 RNA 的细胞质被染成红色, 富含 DNA 的核染成绿色 19

258 生化技术 实验指导 王桃云 编 苏州科技院化学与生物工程学院 2009 年 7 月 0

259 目录 实验一蛋白质含量测定 -- 双缩脲法 1 实验二 实验五 植物多糖的提取 分离与鉴定 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 6 1

260 实验一蛋白质含量测定 -- 双缩脲法 一 目的学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量二 原理 : 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫红色复合物, 而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似, 也能与铜离子在在碱性环境中形成紫红色复合物, 其最大光吸收在 540nm 在一定浓度范围内, 蛋白质浓度与双缩脲反应所呈颜色深浅成正比, 可用比色法定量测定 三 仪器 : 容量瓶 10ml( 6) 试管 cm( 8) 吸管 5ml( 3),2ml( 1) 四 实验试剂 : 1. 双缩脲试剂 : 取 1.5g 硫酸 (CuSO4 5H2O) 和 6.0g 酒石酸钾钠 (NaKC4H406 4H2O) 溶于 500ml 蒸馏水中, 搅拌加入 300ml 的 10%NaOH 液 ( 可另加 1gKI 以防止 Cu2+ 自动还原成一价氧化亚铜沉淀 ), 用水释至 1000ml 此试剂可长期保存 若有黑色沉淀产生需重配 2. 标准蛋白溶液 :10mg/ml 的酪蛋白溶液可用 0.9%NaCl 溶液配制 3. 待测样品液 : 可用酪蛋白配制 五 实验操作 1. 标准曲线的绘制 : 将 6 只 10ml 容量瓶编号, 按下表加入试剂, 即得 6 种不同浓度的蛋白质溶液 取干净试管 7 支, 按 编号,1~6 号管分别加入上述不同浓度的蛋白溶液 3.0ml 0 号为对照管, 加入 3.0ml 蒸馏水 各管加入双缩尿试剂 2.0ml, 充分混匀, 即有紫红色出现, 用 540nm 光测定各管光密度, 绘制浓度 光密度曲线 2. 样液测定 : 取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内, 加入双缩尿试剂 2.0ml, 混匀, 测其 540nm 的光密度, 对照标准曲线求得未知液蛋白浓度 六思考题测定蛋白质浓度除本实验的方法外, 还有哪些方法, 各种方法的优缺点如何? 2

261 实验二植物多糖的提取 分离与鉴定 一. 实验目的了解热水提取多糖的过程与注意事项 并了解目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互关系 掌握 sevag 试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法与注意事项 并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质 二. 实验原理用热水提取真菌植物子实体中的多糖, 利用多糖类物质在热水中溶解度较高, 将其提取出来 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性物质, 经离心分离去除, 可达到去除杂蛋白的目的接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将多糖从溶液当中沉降出来 三 仪器中低速离心机 循环真空泵 布式漏斗 高速干粉粉碎机 恒温水浴锅 旋转蒸发仪, 可见分光光度计 250ml 烧杯 试管 移液管若干 1000mL 的磨口锥形瓶 1 个 / 组 四 试剂蒸馏水 1000ml 左右 / 组, 平菇干燥粉末 20 克 / 组 0.1mg/mL 的葡萄糖溶液 15ml/ 组 ; 蒽酮试剂 10ml/ 组,0.5mol/L NaOH10ml/ 组 ;5% 苯酚体积 15ml/ 组 五 操作 1 平菇多糖的提取取平菇干粉 10 克 / 每组,1000ml 的的磨口锥形瓶中, 按料液比 15ml/ 克原料加入蒸馏水, 轻轻摇匀 将该装有原料液的锥形瓶放置于 85 的水浴锅中进行恒温萃取 90min 萃取过程中, 每隔 15min 左右轻轻摇晃锥形瓶 萃取完成后, 将其放在离心管中, 在 4000r/min 条件下离心 15min, 得到平菇多糖提取液 2 平菇多糖的分离纯化在 250ml 分液漏斗中加入旋蒸仪中浓缩得到的 25ml 左右多糖提取液, 然后按提取液 : Sevag 试剂 [ 氯仿 : 正丁醇 =2:1(v:v) 的混合液 ]3:1 的比例加入 Sevag 试剂 混匀后于分液漏斗中振摇 10min, 用 50ml 离心管在 3500r/min 下离心然后静置到分层清晰, 弃去下层有机相以及中间蛋白质与 Sevag 试剂生成的凝聚物, 得上清液 将所得上清液, 倒入 250ml 烧杯中, 按多糖液体积 : 乙醇体积 l:3 的比例加入纯乙醇, 在 4 冷藏条件下下沉降 1h, 待沉降完全后, 将烧杯中的溶液放在离心管中, 在 4000r/min 条件下离心 15min, 得到平菇多糖沉淀 3 平菇多糖的鉴定离心得到的粗多糖充分溶解于 50mL 蒸馏水中, 备用 3

262 3.1 多糖定性鉴定 甲醇法 : 多糖样品配成 lmg/ml 水溶液, 取 lml0.5mol/lnaoh, 加入甲醇 lml, 出现白色混浊现象, 则判断为有多糖 ( 以蒸馏水作为对照 ) 蒽酮法 : 多糖样品配成 lmg/ml 水溶液, 取 0.lml, 加入 lml0.5molnaoh, 再加入蒽酮试剂几滴, 呈蓝色的反应, 则判断为有多糖 ( 以蒸馏水为对照 ) 3.2 定量测定 葡萄糖标准曲线的制作及回归方程的确定精密吸取标准葡萄糖溶液 mL 于 10mL 以上的试管中, 补加蒸馏水至 2mL; 另精密吸取 2mL 蒸馏水作空白对照, 分别加入 5% 苯酚溶液 1mL, 混合均匀后快速加入浓硫酸 5.0mL, 即刻摇匀, 室温静置 20min, 于分光光度计 490nm 处测定吸收度 以吸收度 A1 为纵坐标, 葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线, 可得回归方程 : 葡萄糖浓度在 10~60μg ml-1 范围内, 与吸光度呈良好的线性关系 样品浓度测定吸 1 ml 多糖液分别用蒸馏水稀释到 100 倍后, 再取 1mL 稀释到 100 倍, 待用 取 2mL 稀释后的多糖溶液, 加入 1 ml5% 苯酚混匀, 迅速加 5mL 浓硫酸, 振摇 5 min, 室温静止显色 20 min, 于 490 nm 处进行比色测定, 将所得的吸光度值代入回归方程, 得到多糖浓度 六计算多糖得率 = 葡萄糖浓度 稀释倍数 原液体积 / 子实体干重 100% 其中稀释到 倍是 : 葡萄糖浓度 (mg/ml) ( ) 50/( )mg 100 % 七注意事项 1 实验当中要用到浓硫酸, 大家一定要注意实验过程中的安全, 要认真细致, 不要打闹, 以免发生事故! 2 实验过程中有多次将硫酸加入到别的试剂中的过程, 加入试剂时是最后加硫酸的, 同时摇匀时要注意动作幅度要小, 千万不要将药品洒出来 3 进行分光光度测定时, 前面试剂混合均匀后, 要快速加入浓硫酸, 即刻轻轻摇匀 4 实验过程中有多次离心, 一定要注意要将离心管配平, 两管之间不能相差超过 0.1 克 5 测吸光度时, 比色杯中试液的量一定不能超过比色杯的 2/3, 否则可能导致待测液洒出来, 污染分光光度计 6 测完吸光度值后, 将所有溶液倒入分光光度计室的桶内, 然后由指定人员提到楼下指定地点倒掉 千万不要轻易倒入下水道 7 实验完毕后, 各组将自己所用的所有仪器设备清洗干净并整齐排放在桌子上 另外班干部留下来作统一整理 8 在确定标准曲线作图时, 用吸光度值做纵坐标, 以浓度值为横坐标 ( 即以,0.02/8 4

263 0.04/8 0.06/8 ), 单位是 mg/ml. 不要去算此时稀释的浓度, 因为后面的含量计算时, 已经乘以 8 倍了 9 实验过程中, 若发现打闹嬉笑可能导致危险事故的同学, 为了他人和自身安全着想, 则终止其实验, 劝其离开实验室 10 实验过程中, 要注意填写使用记录 5

264 实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一 目的要求 1. 学习电泳原理和技术 2. 学习和掌握 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术 二 原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 (acrylamide, 简称 Acr) 和交联剂 N,N- 甲叉双丙烯酰胺 (N,N methylene-bisacylamide, 简称 Bis) 在加速剂 N,N,N,N 四甲基乙二胺 (N,N,N,N tetramethyl ethylenedia mine, 简称 TEMED) 和催化剂过硫酸铵 (ammonium persulfate (NH4)2S2O8, 简称 AP) 或核黄素 (ribofavin 即 vita min B2, C17H20O6N4) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶, 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, 简称 PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性 : (1) 在一定浓度时, 凝胶透明, 有弹性, 机械性能好 ; (2) 化学性能稳定, 与被分离物不起化学反应, 在很多溶剂中不溶 ; (3) 对 ph 和温度变化较稳定 ; (4) 几乎无吸附和电渗作用, 只要 Acr 纯度高, 操作条件一致, 则样品分离重复性好 ; (5) 样品不易扩散, 且用量少, 其灵敏度可达 10-6g (6) 凝胶孔径可调节, 根据被分离物的分子量选择合适的浓度, 通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径 ; (7) 分辨率高, 尤其在不连续凝胶电泳中, 集浓缩 分子筛和电荷效应为一体 因而较醋酸纤维薄膜电泳 琼脂糖电泳等有更高的分辨率 凝胶浓度 (T) 的选择与被分离物质分子量密切相关 表 3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度 /(%) 蛋白质 < > 核酸 (RNA) 6

265 < 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类 目前常用的多为圆盘电泳 ( 如图 1) 和板状电泳 ( 如图 2), 两者电泳原理完全相同 不连续体系由电极缓冲液 浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是由 AP 催化聚合而成的大孔胶, 凝胶缓冲液为 ph6.7 的 Tris-HC1 分离胶是由 AP 催化聚合而成的小孔胶, 凝胶缓冲液为 ph8.9 Tris-HC1 电极缓冲液是 ph8.3 Tris- 甘氨酸缓冲液 2 种孔径的凝胶 2 种缓冲体系 3 种 ph 值使不连续体系形成了凝胶孔径 ph 值 缓冲液离子成分的不连续性, 这是样品浓缩的主要因素 (1) 样品浓缩效应 (a) 凝胶孔径不连续性 : (b) 缓冲体系离子成分及 ph 值的不连续性 ; 在 ph6.7 的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子 :HC1 解离出的氯根 (C1-) 尾随离子 (trailing ion) 或慢离子 : 甘氨酸根 mclαcl>mpαp>mgαg(cl 代表氯根,P 代表蛋白质,G 代表甘氨酸根 ) 有效迁移率 =mα,m 为迁移率,α 为解离度 ) 当进入 ph8.9 的分离胶时, 甘氨酸解离度增加, 其有效迁移率超过蛋白质 ; (c) 电位梯度的不连续性 : (2) 分子筛效应 (3) 电荷效应 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) : 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时, 它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate, 简称 SDS), 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量, 而与所带电荷和形状无关 因此可以利用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量 三 试剂与器材试剂 :10%SDS 凝胶贮液 (30%ACr-0.8%Bis) 分离胶缓冲液(3.0 mol/l ph8.9tris -HCl 缓冲液 ) 浓缩胶缓冲液 ( 0.5 mol/l ph6.7tris-hcl 缓冲液 ) 10% 过硫酸铵 10%TEMED ph8.3tris-gly 电极缓冲液 1% 琼脂糖溶液 0.05% 考马斯亮兰 R250 7% 醋酸 7

266 器材 : 垂直板电泳槽 稳压稳流电泳仪 脱色摇床 四 操作方法 1. 安装夹心式垂直板电泳槽 (1) 装上贮槽和固定螺丝销钉, 仰放在桌面上 (2) 将长 短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中, 注意勿用手接触灌胶面的玻璃 (3) 将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上, 短玻璃板应面对上贮槽 (4) 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽, 双手以对角线的方式旋紧螺丝帽 (5) 竖直电泳槽, 在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的 1% 琼脂 ( 糖 ) 其目的是封住空隙, 凝固后的琼脂 ( 糖 ) 中应避免有气泡 2. 试剂制备 : a. 分离胶缓冲液 (ph mol/l 的 Tris-HCl):18.17gTris, 先加水至 80ml, 用浓 HCl 调 ph, 再定容至 100ml. b. 浓缩胶缓冲液 (ph mol/l 的 Tris-HCl):6.57gTris, 先加水至 80ml, 用浓 HCl 调 ph, 再定容至 100ml. c 30% 丙烯酰胺 (ph 7.0):29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺, 溶于 60ml 水中, 加热至 37ºC 溶解, 补水至 100ml, 用棕色瓶贮存于室温, 几个月后重新配 d 10% 过硫酸铵 (W/V):1g 溶于 10ml 水中,4ºC 保存数周, 尽量现用现配 e 四甲基乙二胺 (TEMED) f 10%SDS 将 10gSDS 溶于 80ml 重蒸水中并轻缓搅拌 ( 室温低时需水浴加热溶解 ), 再定容至 100ml, 室温存放 g 样品缓冲液 :5ml 1mol/l 的 Tris-HCl(pH6.7), 2.5gSDS,1ml 巯基乙醇,0.05g 溴酚兰,10g 蔗糖, 加水定容至 100ml h 考马斯亮蓝染色液 :0.25g 考马斯亮蓝 R-250 用少量甲醇溶解后, 用甲醇 (40ml)- 乙酸 (10ml) 水溶液稀释至 100ml i 脱色液 :90ml 甲醇 : 水 (1:1) 和 10ml 冰醋酸配成 100ml 脱色液 j.tris- 甘氨酸电泳缓冲液 (ph8.3): 在 900ml 去离子水中溶解 15.1gTris 碱,94g 甘氨酸, 加入 50ml10%(W/V) 的电泳级 SDS 贮液, 用去离子水补至 1000ml 量则成 5 贮液 3. 制备凝胶板将混合后的分离胶溶液, 用细长头的滴管加至长 短玻璃板间的窄缝内, 加胶高度距样品模板梳齿下缘约 1 cm 用 1 ml 注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水 ( 约 3 4 mm), 用于隔绝空气, 使胶面平整 约 min 凝胶完全聚合, 则可看 8

267 到水与凝固的胶面有折射率不同的界线 将上 下贮槽的蒸馏水倒去, 将混合均匀后的浓缩胶溶液, 用细长头的滴管加到长 短玻璃板的窄缝内 ( 即分离胶上方 ), 距短玻璃上缘 0.5 cm 处, 轻轻加入样品槽模板. 在上 下贮槽中加入蒸馏水, 但不能超过短玻璃板上缘 静置电泳槽,10 min 左右, 上胶即可聚合, 再放置 min, 加入电极缓冲液, 使液面没过短玻璃板约 0.5 cm, 轻轻取出样品槽模板, 即可加样 4. 电泳 (1). 将电泳仪的正极与下槽连接, 负极与上槽连接, 接通冷却水, 打开电泳仪开关 以浓缩胶中 100V, 分离胶中 180V 电压进行电泳, 至距底线 1cm 时关闭电源 (2). 将电泳后的凝胶取出, 置于培养皿中, 用蒸馏水冲去残留缓冲液, 加入染色液将凝胶完全浸泡其中, 放入微波炉内, 高火档照射 20 秒, 停留 1min, 再照射 10 秒, 反复几次至凝胶上色后倒出染色液, 用蒸馏水冲去残留染色液, 加入脱色液, 高火档照射 20 秒, 倒出脱色液, 再加入新鲜脱色液照射 20 秒, 重复 5-6 次, 直至背景清晰透明, 于凝胶分析仪上成像分析 5. 结果处理量出加样端距细铜丝间的距离 (cm) 以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离 (cm), 按下式计算相对迁移率 m R: 相对迁移率 m R = 蛋白质样品距加样点中心距离 / 溴酚兰区中心离加样点中心距离 五 注意事项 (1) 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝, 避免缓冲液渗漏 (2) 用琼脂 ( 糖 ) 封底及灌胶时不能有气泡, 以免电泳时影响电流的通过 (3) 样品中应含一定浓度的蔗糖溶液, 目的是用以防止样品因对流而被稀释 (4) 加样时样品不能超出凹形样品槽 加样槽中不能有气泡, 如有气泡, 可用注射器针头挑除 六 思考题 (1) 为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液? 蔗糖及溴酚兰的作用分别 是什么? 9

268 生化工程实验指导 陈佳佳编 苏州科技学院 化学与生物工程学院 2011 年 7 月 1

269 实验一发酵罐的结构和使用 BIOTECH-7BG 型发酵罐结构及操作简介一 实验目的 1. 了解发酵罐的几大系统组成, 即空气系统 补料系统 进出料系统 温度系统 在线控制系统 2. 掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 3. 掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二 实验原理 BIOTECH-7BG 型发酵罐 ( 图 1) 系统为实际装料体积 5L 的实验室用小型发酵 罐系统, 它由仪表和罐体两部分组成 图 1 BIOTECH-7BG 型发酵罐外观 各种参数检测电极 : 包括 ph 电极 溶氧电极 温度传感器 泡沫传感器, 使微生物在最适环境条件下进行生长和分泌产物 罐体系统 ( 图 2): 罐体为圆柱形, 采用耐高温硅硼玻璃, 装液系数 70% 顶盖 ( 图 3) 上有孔口, 分别是加料及接种口 补料口 温度电极插口 溶氧电极插口 ph 电极插口 消泡电极插口 取样管口 取样平衡口 排气口 冷凝器出水口等 2

270 图 2 玻璃罐罐体结构 图 3 罐顶各接口分配 搅拌系统 : 由驱动马达 搅拌轴和涡轮式搅拌器组成, 采用上悬挂强磁力搅拌系统, 全自动设定控制范围 50~1000rpm±5 rpm 通气控制 : 主要由空气压缩器 油水分离器 滤膜空气除菌过滤器和空气分布器组成, 用来提供好氧性微生物发酵过程中所需要的氧 3

271 温度控制 : 夹套水浴电加热, 自动控制, 温度控制冷却水温度 +5 ~65 ±0.2, 用来带走由生物氧化及机械搅拌所产生的热量, 以保持菌种发酵在适宜的温度下进行 泡沫控制 : 由于发酵液中含有大量蛋白质, 在强烈的搅拌下将产生大量的泡沫, 严重的泡沫将导致发酵液的外溢和增加染菌的机会, 须用加入消泡剂的方法消去泡沫, 消泡剂通过蠕动泵自动添加 ph 控制 : 采用瑞士原装进口电极, 蠕动泵自动添加酸 碱, 精确控制 ph, 显示范围 :0.00~14.00±0.01, 全自动控制范围 :2.00~12.00±0.05 DO 控制 : 采用瑞士原装进口电极, 与转速 ( 空气流量 补料等可选 ) 关联控制, 0~150±3%, 显示精度 0.1% 压力控制 : 手动控制 ( 自动控制可选 ), 仪表显示 三 实验方法 ( 一 ) 发酵罐及培养基的灭菌 : 采用实罐离位灭菌, 步骤如下 : 1. 按发酵罐培养基配方配好培养基倒入罐体 2. 连接好公用管线及罐盖上的接管 : 取样管路连接, 补料管路连接, 过滤器用硅胶管与罐盖空气管连接并用弹簧夹夹紧, 在消毒过程中防止培养基倒流进入进气过滤器, 排气口与过滤器用硅胶管连接 3. 将 ph 电极装入电极插口并用闷帽盖紧电极上端口, 防止因电缆插口受潮导致电极故障 4. 将溶氧电极装入电极口并用铝箔纸包裹电极上端口, 防止因电缆插口受潮导致电极故障 5. 盖紧其它罐盖接口, 移去排气冷凝器冷却水进出口的水管 6. 提起玻璃罐体放入消毒锅, 盖好牛皮纸, 盖好消毒锅盖, 升温消毒, 消毒时间及温度按培养基性质确定 7. 消毒结束后尽快将罐放回原位并通入空气, 保持罐压 0.05MPa 按培养要求设定温度 搅拌转速 ph 及空气流量等控制参数及控制模式, 等待接种 ( 二 ) 电极的标定 1. ph 电极的标定零点的校正 : 将电极洗净擦干, 浸入 6.86 标准缓冲液, 并将零点标定值设于 6.86, 然后按开始标定键, 待 ph 值显示稳定后可按零点标定结束键 斜率的校正 : 洗净擦干电极后, 浸入 4.00 标准缓冲液中, 并将斜率标定值设于 4.00, 然后按开始标定键, 待 ph 值显示稳定后可按斜率标定结束键 4

272 2. 溶氧电极的标定零点的校正 : 将电极拔出浸没于饱和的无水硫酸钠溶液中, 待电极显示值稳定后标零点 斜率的校正 : 此步要当发酵培养基消毒冷却后温度 罐压 通气量均已正常情况下进行, 一般以 100% 标定 ( 三 ) 发酵操作 1. 接种当罐温达到培养温度后, 调节进气量至 3-5L/min, 迅速在接种口放置一酒精棉花圈, 旋松接种盖, 点燃棉花圈, 打开接种口, 将二级种子倒入罐内, 倒完后旋紧接种盖, 移走火焰圈 2. 把流量开到控制值, 保持罐压, 当仪表显示温度与培养温度一致时, 立即调节溶氧饱和度, 按 span 旋钮使 OD 值显示为 在控制器的初始化菜单上按 F1 设定发酵批号并确认, 再按 F2 发酵开始并确认 4. 取样培养到一定时间后需取样分析 可先打开弹簧夹 J2, 用无菌空气将取样罐内残液排出, 再夹紧 J2, 将出料管放入接料瓶, 松开 J3, 发酵液被压入接料瓶 5. 发酵结束, 必须在控制器初始化菜单中确认发酵结束, 关闭空气压缩机 6. 培养结束后对发酵罐进行清洗及维修 5

273 实验二发酵过程主要生化指标的测定 ( 一 ) 发酵液中还原糖的测定 直接滴定法 一 实验目的 1. 学习并了解发酵过程中主要生化指标 2. 掌握发酵液中还原糖的测定方法 二 实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类, 单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖, 其中乳糖和麦芽糖是还原糖, 蔗糖和淀粉是非还原糖 随着发酵过程的进行, 发酵培养液中的还原糖被菌体消耗利用, 转化成菌体组织或代谢产物 因此, 通过定时取样检测发酵液中的还原糖浓度, 可以更好的了解发酵进程, 以便优化控制发酵生产过程 将一定量的碱性酒石酸铜甲 乙液等量混合, 立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀, 这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应, 生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物 在加热条件下, 以次甲基蓝作为指示剂, 用样液滴定, 样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应, 生成红色的氧化亚铜沉淀, 待二价铜全部被还原后, 稍过量的还原糖把次甲基蓝还原, 溶液由蓝色变为无色, 即为滴定终点 根据样品消耗量即可计算求得还原糖的含量 三 实验材料 费林氏甲液 : 称取分析纯硫酸铜 (CuSO 4 5H 2O)15g 及四甲基蓝 ( 次甲基蓝 ) 0.05g, 用蒸馏水溶解, 定容至 1000mL 费林氏乙液 : 称取分析纯酒石酸钾钠 50g, 分析纯氢氧化钠 54g 及分析纯亚铁氰化钾 4g 用蒸馏水溶解, 定容至 1000mL 0.1% 葡萄糖标准溶液 : 精确称取在 105 烘 2~3h 至恒重的分析纯无水葡萄糖 1.000g, 放入 100mL 烧杯中, 用蒸馏水溶解, 定容至 1000mL, 为防染菌, 可加 5mL 浓盐酸后再定容 四 实验方法 定时取样用费林快速定糖法测定培养液中还原糖的含量 测定步骤如下 : 6

274 1. 样品处理及吸取 2. 空白滴定 精确吸取稀释样品溶液 1mL 进行测定 精确吸取费林甲 乙液各 5mL 放入 150mL 锥形瓶中, 加蒸馏水 10mL 再 用滴定管加入 0.1% 葡萄糖标准液 10mL 左右 摇匀在电炉 ( 或煤气灯 ) 上快速 加热, 沸腾 15S 后, 匀速滴入 0.1% 葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点 记录 沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数 (A) 3. 预备滴定 精确吸取费林甲 乙液各 5mL, 放入 150mL 锥形瓶中, 加蒸馏水 10mL, 再加 1mL10% 待测样品液 根据样品含糖量的高低 ( 估计数 ), 可用糖液滴定管 先加入一定量的 0.1% 葡萄糖液, 摇匀加热, 沸腾 15S 后, 匀速滴入 0.1% 葡萄 糖液, 至蓝色消失即为终点, 记下沸腾前和沸腾后共耗用 0.1% 葡萄糖标准液 毫升数, 作正式滴定时参考用 4. 正式滴定 精确吸取费林甲 乙液各 5mL, 放入 150mL 锥形瓶内, 加蒸馏水 10mL 及 1mL10% 样品稀释液, 再用糖液滴定管加入预备滴定耗用糖标准液总量少 0.5mL 左右的 0.1% 葡萄糖标准液, 摇匀后加热, 使其迅速沸腾, 沸腾 15S 后 匀速滴入 0.1% 葡萄糖标准液至蓝色消失即为终点, 记下沸腾前后共耗用 0.1% 葡萄糖标准液的毫升数 (B) 做平行测定, 两次相差不得超过 0.1mL 5. 按下公式进行计算 : (A -B) C 还原糖 (g/100ml) = W 式中 : A 空白滴定耗用 0.1% 葡萄糖标准液数, ml; B 正式滴定耗用 0.1% 葡萄糖标准液数,mL; C 葡萄糖标准液浓度 (0.1g/100ml) W 参加反应样液量,mL 注意事项 1 每批试样测试前必须做空白滴定, 二次平行测定误差不得超过 0.1mL 2 空白滴定 预备滴定及正式滴定操作条件应保持一致 滴定速度应以每 秒 1~2 滴为宜 热源要稳定, 在正式滴定时, 待试样沸腾后, 标准糖液的 滴定量必须控制在 1.0mL 之内, 否则要重做 整个滴定过程必须始终保持沸 7

275 腾状态 8

276 实验三发酵过程主要生化指标的测定 ( 二 ) 一 实验目的 氨基氮测定 甲醛滴定法 1. 学习并了解发酵过程中主要生化指标 2. 掌握发酵液中氨基氮的测定方法 二 实验原理 + 蛋白质和氨基酸中的 -NH 3 基的 PK 值常在 9.0 以上, 不能用一般的酸碱指示剂 ( 包括酚酞 ), 以氢氧化钠作滴定测量 但可以用甲醛滴定法测量 在甲醛滴定法中, 甲醛可以与氨基酸中的氨基相互作用, 使滴定终点移至 ph 9.0 左右, 在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用 PH 9.0 正是酚酞的变色范围, 因此, 可 + 以用酚酞作指示剂, 以氢氧化钠来滴定 -NH 3 基上的 H + 反应如下: R-NH + 3 H + +RNH 2 R-NH 2+2HCHO R-N(CH 2OH) 2\ 如果样品中只含有某一种已知的氨基酸, 从甲醛滴定的结果可算出该氨基酸的含量 如果样品是多种氨基酸的混合物 ( 如蛋白水解液 ), 则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据 但一般常用此法测定蛋白质水解程度, 随水解程度的增加滴定值增加, 当水解作用完成后, 滴定值不再增加 三 实验材料 [ 试剂和药品 ] (1) 中性甲醛溶液 : 将试剂级甲醛 (36-37%) 调到 PH7 用 ph 计检查或在 50ml36-37% 甲醛中加入几滴 0.5% 酚酞乙醇水溶液, 然后用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液滴定到微红 ( 需临用前配制, 若放置一些时间后, 在使用前要重新中和 ) ( 2 ) 酚酞指示剂 :0.5% 酚酞的 50% 乙醇溶液 (3) 标准碱溶液 :0.1mol/L 氢氧化钠溶液, 使用前应标定 (4) 溴酚兰指示剂 :0.05% 溴酚兰的 20% 乙醇溶液 [ 仪器和设备 ] (1) 吸量管 (2ml,5ml) (2) 碱式滴定管 (3) 滴定台和蝴蝶夹 9

277 四 实验方法 1. 分别吸取待测样品液 2.0ml 于两个磨口具塞锥形瓶中, 各加蒸馏水 5ml 向另一磨口具塞锥形瓶中加入 7ml 蒸馏水, 做空白对照 2. 向上述三个瓶中各加中性甲醛溶液 5.0ml, 混匀, 加溴酚兰指示剂 2 滴, 加酚酞指示剂 4 滴 3. 用标准 0.1mol/LNaOH 溶液滴定至红色, 分别纪录消耗的 NaOH 毫升数 4. 按下式计算 : V 为滴定发酵液时消耗 NaOH 溶液的毫升数 V 0 为滴定空白时消耗 NaOH 溶液 的毫升数 为 1ml0.1mol/LNaOH 溶液相当的氮毫克数, 氨基氮的含量是 每毫升中的含量 思考题 1. 还原糖测定的整个滴定过程为什么必须始终保持沸腾状态? 2. 甲醛滴定时, 加入氢氧化钠溶液滴定的是氨基, 而不是羧基, 为什么? 3. 为什么不能用一般的酸碱指示剂来指示氢氧化钠溶液滴定的 NH 3 + 基? 10

278 实验四 大肠杆菌的发酵 一 实验目的 1. 学会制备一级种子 二级种子 2. 掌握发酵液中菌体生物量 ph 等参数的测定方法 3. 掌握镜检方法 二 实验原理当我们得到一个由工业价值的工业用生产菌之后, 为了更接近于工业生产的实际情况, 应在实验室规模进行微生物扩大培养和目的产物生成量的实验, 以期掌握该生产菌的发酵调控规律, 尽快的应用于工业生产 E.coli 是遗传工程研究过程中常用的受体菌种 本实验学习用 E. coli 在小型发酵罐内进行发酵的方法 通过控制合适的培养条件 可使 E.coli 迅速持续地生长, 获得所要求的高产培养物 为了解发酵过程中培养菌的生长及对培养基的利用情况, 需在发酵过程中定时地取样测定, 绘制代谢曲线 代谢曲线是指发酵过程中发酵参数随时间变化的曲线, 通过代谢曲线的测定, 能够准确地掌握发酵过程中各参数的变化状况, 并通过采取一定的措施对部分发酵参数进行调整以满足发酵合成代谢产物的需要 通过与典型代谢曲线的比较, 通常也可以判断发酵进行是否正常 例如, 溶氧可以作为了解菌对 O 2 的利用规律, 了解发酵是否异常, 供 O 2 与产物合成关系等的重要指标 本实验通过测定发酵过程中 ph 溶氧及菌含量绘出上述各参数与发酵时间的关系图 即发酵代谢曲线 溶氧的变化, 理论上为 : 发酵初期, 耗 O 2 量大, 菌体摄 O 2 量达高峰 ; 发酵中期, 耗 O 2 较恒定,[O] 变化应较小 ; 对数生长期发酵后期溶氧最低, 呼吸强度,[O] ph 的变化, 理论上为 : 初期, 菌体生长期, 菌体利用营养物质释放酸, 使 ph 中期, 生物合成期,pH 相对稳定后期, 菌体自溶期, 氨基氮,pH 11

279 三 实验器材 [ 材料与试剂 ] 1. 菌种 :E. coli 2. 培养基 :LB 液体培养基 肉膏蛋白胨培养基 3. 试剂 : 氨水 牛肉膏 蛋白胨 葡萄糖等 ; [ 仪器设备 ] 1. 旋转式摇床 2. 显微镜 3. 分光光度计 四 实验方法 本实验采用下列工艺路线 菌种 斜面 一级种子 (250ml 摇瓶 ) 二级种子 (250ml 摇瓶 ) ( 一 ) 培养基配制 1. 种子斜面培养基配制 : 肉膏蛋白胨培养基 ( 蛋白胨 1% 牛肉膏 1% NaCl0.5% 琼脂 2% ph7.0~7.2) 配制牛肉膏蛋白胨固体培养基 100ml, 分装 试管, 灭菌后摆成斜面 2. 一级种子培养基配制 : 按下列培养基配方配制 1000ml 一级种子培养基 按 20% 装液量分装后, 于 121 灭菌 30min 冷却备用 胰化蛋白胨 1%, 酵母提取物 0.5%,NaCl 1%,pH 二级种子培养基配制 : 按下列培养基配方配制 1000ml 二级种子培养基, 并按 20% 装液量分装于三角瓶中后, 于 121 灭菌 30min 冷却备用 水解糖 2.5% 玉米浆 2.5~3.5% K 2HPO % MgSO 尿素 0.4% FeSO 4 2ppm MnSO 4 2ppm ph 6.8~7.0 ( 二 ) 接种与培养 1. 斜面种子培养 : 30 培养 18h, 培养好后置于 4 冰箱保存备用 2. 一级种子培养 : 将斜面菌种接入已灭菌冷却的种子培养基中 (250ml 三角 12

280 瓶内接入 1~2 环 ) 于 32 ±1 250r.p.m 条件下培养 12h 一级种子质量要求 : 种龄 12h ph6.4±0.1 光密度 : 净增 OD 值 0.5 以上 3. 二级种子培养 : 在已灭菌的二级种子培养基中, 按 0.5~1.0% 接入上述已培养好的一级种子, 于 32 ±1 250r.p.m 条件下培养 7~8h 二级种子质量要求 : 种龄 7~8h ph 6.0±0.1 OD 值净 ( 稀释 5 倍 ) 增 0.5 左右镜检生长旺盛, 排列整齐,G + ( 三 ) 绘制代谢曲线 1. 取样 : 自接种后 0 小时开始, 每隔 4h 时取样一次进行测定 2. 测定 : (1) 生物量测定 : 取 0.5ml 发酵液, 用 ddh 2O 稀释 20 倍, 用分光光度计测光密度 (OD) 值, 波长 650nm, 以蒸馏水为对照 (2) 镜检观察形态 3. 记录 : 将数据填入发酵批报表 大肠杆菌发酵批报 接种时间 年 月 日 时 放罐时间 年 月 日 时 取样时刻培养时间 ph 罐温转速 rpm 光密度稀释倍数菌体形态 值班签名 13

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282 微生物学实验指导 汪金莲金萍钱玮 苏州科技学院化生学院生技教研室 二 0 一 0 年十月

283 前 言 微生物学实验 是生物科学, 生物技术, 生物工程, 环境保护和许多相关专业的重要专业基础课, 也是培养未来生命科学工作者掌握微生物学的基本方法和研究技术的必修课 它涉及面广, 应用性强, 收益面宽, 发展迅速, 既是生命科学理论研究的核心, 又是一门实践性和应用性很强的学科, 良好的教材直接影响学生的培养质量, 为了更好地配合微生物学实验教学, 按照 微生物学实验教学大纲, 并根据多年来从事微生物教学和科研的实践经验, 我们编写了这本 微生物学实验指导 按照微生物学实验技术和知识结构层次, 考虑到学生实验操作的阶段性与递进性, 突出学生自主思考与动手能力的培养, 全书分四个模块的实验内容 : 基础性实验模块, 包括细菌 放线菌 真菌的形态观察, 细菌的革兰氏和芽孢染色 ; 应用性实验模块, 包括微生物显微镜直接计数法和显微测微尺的使用和微生物大小的测定, 细菌鉴定中常规生理生化反应 ; 综合性实验模块, 这部分内容是在验证性试验开设的基础上, 学生具备了微生物实验的基础知识和基本操作技能, 有选择性地开设有一定难度的综合性实验, 培养学生的实验设计 实验准备 相互协作 分析问题 解决问题 综合应用知识及创新的能力 此部分实验包括 : 化学和物理因素对微生物的影响, 微生物生理生化反应及不同类群的土壤微生物分离等 考试模块包括实验理论和实验操作 ( 此略 ) 为了方便教学, 每一个实验都按实验目的 基本原理 实验器材 操作步骤 注意事项 实验报告六个部分编写, 实验报告又分为实验结果和思考题 实验结果尽量采用图表形式, 便于学生填写 附录部分, 包括实验教学用到的培养基和染色液 试剂的配制方法, 可作为实验教学过程的主要参考资料 由于编者水平有限, 加上编写时间仓促, 书中错误和不足之处在所难免, 诚恳希望读者批评指正 编者 2010 年 10 月

284 目录 实验须知 1 实验一显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察 2 实验二细菌革兰氏染色和芽孢染色法 5 实验三放线菌和真菌的形态观察 9 实验四微生物显微镜直接计数法 12 实验五显微测微尺的使用和微生物大小的测定 15 实验六化学和物理因素对微生物的影响 19 实验七细菌鉴定中常规生理生化反应 27 实验八不同类群的土壤微生物分离 29 附录 Ⅰ 染色液和试剂的配制 32 附录 Ⅱ 培养基的配制 34

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286 实验须知 微生物学实验是微生物学教学的重要组成部分 目的使学生掌握微生物学技术的基本操作技能, 验证和补充课堂讲授中的一些重要基础知识, 加深对课堂知识的理解 ; 同时培养学生观察问题 分析问题 解决问题和综合应用知识的能力, 使学生养成实事求是 严肃认真的科学态度以及勤俭节约 爱护公物的良好习惯 为保证微生物实验课的顺利进行, 并得到理想的实验结果, 特提出以下注意事项 1 每次实验前, 必须预习 微生物学实验 的有关内容, 写出本次实验的预习报告, 包括实验目的 原理 操作步骤 注意事项及疑问 实验课开始, 要认真听取指导教师的讲解, 进一步明确实验目的 原理 器材 操作步骤 注意事项 实验报告及疑问解答 2 在实验室内, 不要高声谈话和随意走动, 保持实验室安静 不准携带食物和饮料进入实验室 个人的衣物 书包不要放在实验台上, 以免影响操作 3 实验时要认真仔细, 严格操作规程, 操作中万一出现意外事故, 如打破盛菌器皿 破伤皮肤 菌液吸入口中等, 要立即报告指导教师, 及时处理, 切勿隐瞒 4 实验过程中, 要始终注意安全, 使用易燃物品 ( 如酒精 乙醚等 ) 要特别小心, 切勿接近火焰 出现火险, 要保持冷静, 先关闭火源 电源, 再用湿布或沙土灭火 必要时使用灭火器 5 实验操作中所用器皿, 按指导教师要求标明班次 组别 姓名 项目日期 若需要培养, 按指定地方放置, 以免放乱弄错 6 实验用过的培养基 培养物及污染材料都要放入指定的污物桶内, 不得随意丢弃 7 实验结束后, 应将台面擦拭干净, 废纸 废物投入垃圾桶内 清理所用物品, 摆放整齐, 如有损坏或丢失, 及时报告指导教师, 填写登记表 8 每次实验都要及时 实事求是地做好记录或绘制草图, 认真完成作业 实验报告力求规范 简明 准确 字体工整 9 对显微镜及其他贵重仪器应特别爱护, 不得随意拆卸 使用前后都要仔细检查, 使用完毕要填写仪器使用记录 10 实验室中的菌种和物品, 不经教师同意不得随意带出实验室 11 离开实验室前, 要用肥皂洗手 值日人员做好实验室内台面和地板的清洁工作, 负责关好水 电 火 煤气 门 窗等 1

287 实验一显微镜油镜的使用和细菌三种基本形态观察一 实验目的 1. 学习并掌握油镜的基本原理和使用方法 2. 观察和识别细菌的三种基本形态 二 基本原理油镜是显微镜物镜中重要的镜头, 其上刻有 OI 或 HI 字样, 也有以刻一圈红线或白线为标记, 用于区别其它物镜 油镜的使用比较特殊, 需在玻片与镜头之间加滴镜油, 其原理如下 : 1. 增加照明强度油镜的放大倍数可达 100, 其镜头焦距很短, 直径很小, 但所需要的光照强度却最大 需在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率 (n=1.55) 相仿的镜油 ( 通常用香柏油, 其折射率 n=1.52), 目的是使进入物镜的光线不会由折射或反射造成损失, 基本上全进入镜头, 因此提高了照明强度, 使图像更加清晰 不同介质的折射率是不同的, 用空气作介质, 折射率为 (n=1); 用水作介质, 折射率为 (n =1.33), 它们的折射率都比香柏油低, 其光线通过玻片后会发生折射或全反射, 不能完全进入物镜, 造成光的损失, 结果降低了视场亮度, 使图像不清晰 由此可见, 提高介质的折射率, 就可提高图像的清晰度 2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离 (D) 的能力 D 值愈小则表明分辨率愈强 D 值可用如下下公式表示 : D = 0.61 λ N A 式中入 = 光波波长 ; N A= 物镜的数值孔径值 分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长, 即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比, 与光波波长成反比 波长愈短, 数值孔径愈大, 分辨距离愈短, 则分辨能力就愈强 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围 (400~770nm), 虽然利用紫外线作光源可提高分辨率, 但应用范围有限, 只适用于显微镜摄影而不适用直接观察 数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率, 即指介质的折射率与镜口角 1/2 正弦的乘积, 可表示为 : NA= n. sin a 2 式中 n= 物镜与标本间介质的折射率 ;a= 镜口角 ( 通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成 2

288 的夹角图 1-1) 图 1-1 物镜的镜口角影响数值孔径的因素之一是镜角口 式中 a 为光线最大入射角的半数 它取决于物镜的直径和焦距 当 Sin(a/2) 增到最大时,a/2=90, 就是说, 进入透视镜的光线与光轴成 90 角, 这是不可能的, 所以 Sin(a/2) 的最大值总是小于 1 现在所用的油镜其 a/2 为 60 左右 影响数值孔径的另一因素是介质的折射率, 前面已说到, 不同介质的折射率是不同的, 空气的折射率为 1.0, 水的折射率为 1.33, 香柏油的折射率为 1.52, 玻璃的折射率为 1.55 因此, 在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时, 数值孔径就可以增大到 人们肉眼所能感受的光波平均长度为 0.55μm, 假如数值孔径 NA=0.65 高倍物镜, 能分辨两点之间的最小距离为 0.42μm, 而小于 0.42μm 的两点之间距离就分辨不出, 而使用数值孔径 NA=1.25 油镜, 能分辨两点之间的最小距离 = =0.22μm 因为不论总放大倍数多大, 用普通光学显微镜是无法观察到小于 0.2μm 的物体 但是大部分细菌直径在 0.5μm 左右, 故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构 显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积 但由于物镜和目镜搭配不同, 其分辨率也不同, 例如, 在总放大率相同情况下, 采用数值孔径大的 40 物镜和 10 目镜相搭配, 其分辨率就比数值孔径小的 20 物镜和 20 目镜相搭配的要高些, 效果也更好 三 实验器材 1. 标本 : 细菌三型玻片 2. 试剂 : 香柏油 显微镜清洗液 ( 酒精乙醚液 ) 3. 器具 : 显微镜 ( 有油镜 ) 擦镜纸等 四 操作步骤 ( 用油镜观察细菌 ) 显微镜观察时, 应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序, 因为低倍镜视野相对大, 易发现目标及确定检查的位置 1. 放置标本将染色的细菌三型玻片置于镜台上 2. 找合适的视野先用低倍镜寻找合适的视野, 并将欲观察的部位移到视野中央 3

289 3. 转换油镜将油镜转到工作位置 4. 调节聚光器与油镜数值孔径一致只要将聚光器上升到最高位置, 可变光阑开到最大, 此时两者的数值孔径即达到一致 5. 加香柏油取香柏油 1-2 滴加到欲观察部位涂片上, 从侧面注视然后将油镜转到工作位置, 下降镜筒或上升载物台, 使油镜浸入香柏油中 必须十分注意, 油镜头不能压在玻片标本上, 下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛, 否则不仅会压碎玻片, 还易损坏镜头 6. 调焦左眼从油镜中观察, 同时转动粗调节螺旋, 缓慢地提升油镜调焦, 至出现模糊的物象时, 再用细调节螺旋调节至物象清晰为止 如按上述操作还找不到目的物, 则可能是由于油镜下降不到位, 或因油镜上升太快, 以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象 遇此情况, 应重新操作 调焦时, 应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片 7. 观察仔细观察细菌的三种基本形态 8. 显微镜用毕后的处理上升镜筒, 取下玻片, 清洁油镜, 先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油, 再取擦镜纸蘸取酒精乙醚液, 擦去镜头上残留的油迹, 然后再用干净的擦镜纸擦去残留物 最后将镜头转至 八 字形, 并将载物台和聚光镜降至最低处, 将显微镜放入镜箱 五 注意事项 1. 油镜工作距离短, 故操作时要特别谨慎, 切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒, 而应从侧面注视, 不要使油镜镜头压在玻片标本上, 下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛, 还应特别注意误将粗调节器向相反方向转动而损坏镜头和玻片 2. 切忌用手或其他纸擦拭镜头, 以免使镜头沾上污渍或产生划痕, 影响观察 六 实验报告 1. 结果绘出在油镜下观察到的细菌三种基本形态 2. 思考题 (1) 用油镜观察时, 应注意哪些问题? 在玻片和镜头之间加滴什么油? 起什么作用? (2) 影响显微镜分辨率的因素有哪些? 4

290 实验二细菌革兰氏染色和芽孢染色法 一 实验目的 1. 学习掌握革兰氏染色和芽孢染色的原理和方法 2. 了解革兰氏染色和芽孢染色在细菌分类鉴定中的重要性 二 基本原理 1. 革兰氏染色法 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要鉴别染色法 1884 年由丹麦病理学家 C Gram 创 立, 用革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌 (G + ) 和革兰氏阴性菌 (G ) 两大类 一 般来说, 芽孢杆菌与绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都是革兰氏阳性反应 ; 弧菌, 螺旋体, 某些球菌和大多数致病性的无芽孢杆菌都是革兰氏阴性反应 革兰氏染色法的基本步骤是先用结晶紫进行初染, 再用碘液媒染 ( 以增加染料与细菌的亲和力, 使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的不溶于水的复合物, 然后用脱色剂 ( 乙醇或丙酮 ) 脱色, 最后用复染剂 ( 如番红 ) 复染 凡细菌不被脱色而保留初染剂 ( 蓝紫色 ) 者为革兰氏阳性菌 ; 如果细胞中初染剂被脱色后而使细菌染上复染剂的颜色 ( 红色 ) 者则为革兰氏阴性菌 革兰氏染色法之所以能将细菌分为 G + 菌和 G 菌, 是由这两类细菌的细胞壁成分和结构不同所决 定的 革兰氏阳性细菌的细胞壁中肽聚糖层较厚且交联度高, 类脂含量少, 用乙醇脱色时细胞壁脱 水, 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小, 通透性降低, 从而使结晶紫 碘的复合物不易被洗脱而保留 在细胞内, 经复染后, 仍保留初染剂的蓝紫色 而革兰氏阴性菌由于细胞璧中含有较高的类脂, 而 且肽聚糖层较薄, 且交联度低, 故用乙醇或丙酮脱色时, 溶解了类脂质, 增加了细胞壁的通透性, 使结晶紫和碘的复合物比较容易洗脱出来, 结果是细菌被脱成无色, 当用复染剂番红复染后, 细菌 就染成复染剂番红的红色 2. 芽孢染色法 芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体, 通常呈圆形或椭圆形, 细菌能否形成 芽孢以及芽孢的形状 大小和在菌体内的位置都是鉴定细菌的重要依据 细菌的芽孢具有厚而致密的壁, 透性低, 不易着色, 若用一般染色法只能是菌体着色而芽孢不 着色 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的 芽孢染色法的基本原理是 : 用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红, 在加热条件下, 延长染色 时间促进标本着色, 使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内, 进入菌体的染料经水洗后被脱色, 而 芽孢一经着色就难以被水洗脱, 当用对比度大的复染剂如番红复染后, 芽孢仍保留初染剂的绿色, 5

291 而菌体则被染成复染剂的红色, 使芽孢和菌体形成鲜明的对比, 因而更明显地衬托出芽孢, 易于辨 认 三 实验器材 1. 菌种 : 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli), 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus), 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis), 巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium), 丙酮丁醇梭菌 2. 试剂 : 草酸铵结晶紫染色液, 卢戈氏碘液,95% 乙醇, 番红复染液 ( 附录 Ⅰ);5% 孔雀绿 染色液,0.5% 番红水溶液 3. 器具 : 显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 镊子 木夹 香柏油 酒精乙醚液 擦镜纸 吸水纸等 四 操作步骤 ( 一 ) 革兰氏染色法 1. 涂片 常规涂片法 : 取两块载玻片, 各滴一小滴蒸馏水于玻片中央, 用接种环以无菌操作分别从大肠 杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中混匀后, 用接种环挑取 2-3 环菌悬液至另一载 片上涂片 2. 干燥 室温自然干燥 3. 固定 涂片朝上, 通过火焰 2-3 次, 进行热固定, 目的是使细胞质凝固, 以固定细胞形态, 并使之牢固附 着在载玻片上 4. 染色 (1) 初染 : 将玻片置于玻片搁架上, 滴加草酸铵结晶紫染液置涂片上染色 1-2min, 水洗 (2) 媒染 : 滴加卢戈氏碘液, 染色 1min, 水洗 (3) 脱色 : 用滴管流加 95% 乙醇脱色, 直至流出的乙醇无紫色时约 (30 秒 ), 立即水洗, 以终 止脱色 (4) 复染 : 滴加番红液复染约 2min, 水洗 5. 镜检 干燥后, 用油镜观察, 区分出 G + 菌和 G 菌的细菌形态和颜色 菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳 性菌, 被染成红色的为革兰氏阴性菌 6

292 6. 实验完毕后清洁显微镜, 按实验一方法进行 ( 二 ) 芽孢染色法(Schaeffer-Fulton 氏染色法 ) 1. 制片按常规方法涂片 干燥 固定 2. 染色滴加数滴孔雀绿染液于涂片上, 用木夹夹住载玻片一端, 用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间, 约维持 5min 加热过程中要及时添加染色液, 切勿让标本干涸 3. 水洗待玻片冷却后, 用缓流自来水冲洗, 直至流出的水无色为止 4. 复染用番红染色液复染 2min 5. 水洗用缓流自来水冲洗后, 吸干 6. 镜检干后用油镜观察 结果 : 芽孢为绿色, 菌体为红色 五 注意事项 1. 革兰氏染色成败关键是脱色时间, 如脱色过度, 革兰氏阳性菌也可被误认为是革兰氏阴性菌 如脱色时间过短, 革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌 2. 染色过程中勿使染色液干涸 用水冲洗后, 应吸干残水或用吹风机吹干, 以免染色液被稀释而影响染色效果 3. 革兰氏染色的菌种, 选用培养 18-24h 菌龄的细菌为宜 若菌龄太老, 由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 4. 芽孢染色的菌种的菌龄, 应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜 巨大芽孢杆菌在 37 下培养 12-14h 效果最佳 5. 在孔雀绿加热过程中, 要及时补充染液, 切勿让涂片干涸 六 实验报告 7

293 1. 结果 (1) 将革兰氏染色结果记录于下表中 菌种 菌体颜色 菌体形态 ( 图示 ) G + 或 G 大肠埃希氏菌金黄色葡萄球菌 (2) 将芽孢染色结果记录于下表中 菌名 染色法 芽孢和菌体的颜色 图示芽孢形态大小和着生位置 2. 思考题 (1) 你认为哪些环节影响革兰氏染色结果的正确性? 其中最关键的环节是什么? (2) 革兰氏染色时, 初染前能加碘液吗? 乙醇脱色后复染前, 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? (3) 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢, 很少看到营养细胞, 你认为这是什么原因? 8

294 实验三放线菌和真菌的形态观察 一 实验目的 1. 学习观察放线菌和真菌形态的基本方法 2. 观察放线菌和真菌的形态特征 二 基本原理放线菌是能形成分枝菌丝体的一类革兰氏阳性菌, 是产生抗生素的最重要的微生物 能否产生菌丝体及菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据 常见放线菌大多能形成菌丝体, 紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内丝菌, 基内丝菌向空气中生长出气生菌丝, 气生菌丝进一步分化产生孢子丝及孢子 有的放线菌只产生基丝而无气丝 基丝较细透明, 气丝较粗颜色较深, 孢子丝有直 波曲 各种螺旋或轮生, 孢子有球形, 椭圆形, 杆状或柱状, 一般着生在孢子丝的顶端 孢子丝和孢子的形态和排列方式是分类的重要依据 扦片法可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征 是一种常用和有效的方法 其主要原理是 : 将放线菌接种在琼脂平板上, 扦上灭菌盖玻片培养, 使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上 观察时, 轻轻取出盖玻片, 置载玻片上直接镜检, 就可观察到放线菌在自然状态下着生的各种形态特征, 也可用吕氏碱性美蓝染色后观察 真菌主要包括酵母菌和霉菌 真菌大小通常比细菌大几倍甚至几十倍 酵母菌是不运动的单细胞真核生物, 大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖, 有的分裂繁殖, 有性繁殖产生子囊孢子 而霉菌可产生复杂分枝的菌丝体, 分基内菌丝和气生菌丝, 气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝 ( 分生孢子梗 ), 由繁殖菌丝产生分生孢子 霉菌的菌丝体尤其是繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据 美蓝是一种无毒性的染料, 它可用来观察酵母菌的形态和出芽方式, 也可对酵母菌的死活细胞进行鉴别, 它的氧化型呈蓝色, 还原形呈无色, 由于细胞的新陈代谢作用, 细胞内具有较强还原能力, 能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型 因此, 具有还原能力的酵母菌细胞是无色的, 而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色 观察霉菌的形态主要有直接制片观察法和载片培养法 直接观察法是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染液中, 制成霉菌玻片镜检 用此方法制片能使细胞不变形, 具有防腐作用, 不易干燥, 保存时间较长, 防止孢子飞散 ; 染成蓝色增强反差, 便于观察 载片培养法见微生物实验教程 三 实验器材 1. 菌种 : 细黄链霉 (Streptomyces microflavus)5406, 红酵母 (Rhodotorula sp) 或酿酒 9

295 酵母 (Sacchromyces cerevisiae), 产黄青梅 (Penicillium chrysogenum), 黑曲霉 (Aspergillus niger), 黑机霉 (Rhizopus nigricans), 总状毛霉 (Mucor racemosds) 2. 培养基 : 高氏 1 号琼脂培养基 麦芽汁琼脂培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基或查氏培养基 3. 试剂 :0.1% 美蓝染色液 乳酸石炭酸棉蓝染色液 50% 乙醇 4. 器具 : 显微镜 培养皿 载玻片 盖玻片 镊子 擦镜纸 接种杯 解剖针等 四 操作步骤 ( 一 ) 放线菌形态观察 ( 扦片法 ) 1. 倒平板 : 取融化并冷至约 50 的高氏 1 号琼脂培养基约 20ml 倒平板, 凝固待用 2. 接种 : 用接种环挑取菌种斜面培养物 ( 孢子 ) 在琼脂平板上划线接种 划线要密些, 以到利扦片 3. 扦片 : 以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以约 45 角扦入琼脂内 ( 扦在接种线上 ), 扦片数量可根据需要而定 图 3-1 扦片法 4. 培养 : 将扦片平板倒置,28 培养 5-7 天 5. 镜检 : 用镊子小心拨出盖玻片, 擦去背面培养物, 然后将有菌的一面放在载玻片上, 直接镜检或用 0.1% 美蓝对培养后的盖玻片染色后镜检 ( 二 ) 真菌形态观察 1. 酵母菌形态观察 ( 美蓝浸片法 ): (1) 在载玻片中央加一滴 0.1% 美蓝染色液 (2) 用接种环取酵母菌苔少许, 置美蓝染色液中, 混合均匀 (3) 用镊子取一块盖玻片, 先将一边与菌液接触, 然后慢慢将盖玻片放下, 盖玻片不宜平着放下, 以免产生气泡影响观察 (4) 用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况, 同时根据是否染上颜色来鉴别死亡细胞 无色透明的为活细胞, 被染上蓝色的为死细胞 10

296 2. 霉菌形态观察 ( 直接制片法 ): 在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液, 用解剖针或镊子从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝, 先置于 50% 乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子, 再放在载玻片的染液中, 用解剖针小心将菌丝分散开, 盖上盖玻片, 置低倍镜下观察, 必要时换高倍镜观察 图 3-2 青霉形态图 3-3 曲霉形态图 3-4 根霉形态五 注意事项 1. 镜检时请特别注意放线菌的基内菌丝 气生菌丝的粗细和色泽差异 2. 染液不宜过多或过少, 否则, 在盖上盖片时, 过多染液会溢出, 过少会出现大量气泡而影响观察 3. 挑菌和制片要细心, 用镊子或解剖针小心将菌丝分开, 要尽可能保持霉菌自然生长状态和菌体的完整性 六 实验报告 1. 结果 (1) 比较放线菌 酵母菌 霉菌的菌落形态特征 (2) 绘图说明细黄链霉菌 红酵母菌 产黄青霉菌和黑曲霉菌形态特征 2. 思考题 (1) 镜检时, 如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝以及孢子丝 (2) 你主要根据哪些形态特征来区分青霉 曲霉 根霉 毛霉四种霉菌? (3) 你认为在显微镜下, 细菌 放线菌 酵母菌和霉菌的主要区别? (4) 什么是载片培养, 它适用哪几类微生物形态观察, 为什么? 11

297 实验四 微生物显微镜直接计数法 一 实验目的 1. 明确血细胞计数板计数的原理 2. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法 二 基本原理 利用血细胞计数板直接在显微镜下计数微生物的细胞 ( 或孢子 ) 的数目, 是一种常用的微生物 总菌数 ( 包括死菌体和活菌体 ) 的计数方法 它是有直观, 简便和快捷等优点, 常用于酵母 细菌 霉菌孢子等单细胞的微生物计数 但此法的缺点是所测的结果通常是死菌体和活菌体的总和, 要克 服这一缺点, 此法可与美蓝等特殊染料染色相结合, 也能达到分别计算活菌数和死菌数的目的 而 间接 ( 活菌 ) 计数常用液体稀释法或平板菌落 ( 因为样品中每个活细胞数能在平板培养基表面形成 一个菌落 ) 计数法两种, 它们是以最大稀释率或平板菌落法间接获得样品中的活细胞 ( 或孢子 ) 数 的一种计数法, 其所测结果通常是活菌体 利用血细胞计数板计数的原理是 : 将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液, 加至血细胞计数 板的计数室中, 在显微镜下逐格计数 由于计数室的容积是固定的 (0.1mm 3 ), 故可将显微镜下计得 的菌体细胞或孢子数换算成单位体积试样中的含菌量 血细胞计数板是一块特别的精密载玻片, 在载玻片上有 4 条长槽将玻片中间区域分隔成 3 个平 台, 中间较宽的平台有被一短横槽隔成两半, 每一边的平台上各刻有一个方格网, 每个方格网共分 为 9 个大方格, 中间的大方格即为计数室 血细胞计数室构造如图 ( ) 计数室的刻度一般 有两种规格, 一种是一个大方格分成 25 个中方格, 而每个中方格又分成 16 个小方格 ; 另一种是一 个大方格分成 16 个中方格而每个中方格又分成 25 个小方格, 但无论是哪一种规格的计数板, 每个 大方格中的小方格都是 400 个 每中格四周均有双线界限标志, 以便区分 计数室大方格的边长为 1mm, 则每一大方格的面积为 1mm 2, 计数室与盖玻片间的高度为 0.1mm, 所以计数室的体积为 0.1mm 3 ( 万分之一毫升 ) 计数时, 先计得若干 ( 一般为 5 个 ) 中方格的总菌数, 然后求得每个中方格的平 均值, 再乘以 25 或 16, 就得出一个大方格中 (0.1mm 3 ) 计数室中的总菌数, 最好再换算成 1ml 菌液 中的总菌数, 即再乘以 10 4 及菌液的稀释倍数, 即可算出 1ml 菌液中的总菌数 1ml=1cm 3 =1000mm 3 若要区分计数样品中的死菌和活菌值, 则可采用微生物的活体染色法 活体染色法就是利用对 微生物无毒性的染料 ( 如美蓝 刚果红 中性红等染料 ) 配成一定的浓度, 再与一定量的菌液混合, 经一段时间后, 死菌和活菌会呈现出不同的颜色, 这样便可在显微镜下区分活菌数与死菌数 美蓝是常用的活体染色染料, 当它处于氧化态时呈蓝色, 还原态度时为无色 用它进行活体染 12

298 色时, 由于活细胞代谢过程中的脱氧作用, 美蓝接受氢后就由氧化态转变成还原态, 因此活细胞呈 现无色, 而衰老或死亡的细胞由于代谢缓慢或停止, 不能使美蓝还原, 故细胞呈蓝色 图 4-1 血细胞计数板正面与侧面图 图 4-2 中央大方格为计数室 三 实验器材 1. 菌种 : 红酵母 (Rhodotorala sp) 或酿酒酵母 (Saccharomyces Cerevisiae) 2. 试剂 : 无菌生理盐水等 3. 器具 : 显微镜 血细胞计数板 吹风机 盖玻片 无菌滴瓶 ( 内装玻璃珠 ) 无菌毛细管 擦镜纸 吸水纸等 四 操作步骤 1. 菌悬液制备用无菌生理盐水将酵母菌稀释成浓度适当的菌悬液 ( 一般以计数室内每小格 5-10 酵母菌为宜 ) 2. 清洗计数板用自来水冲洗计数板, 再用吹风机吹干镜检计数室, 确证计数室无污物和微生物细胞后方可使用 3. 加菌液将计数板的盖玻片各放在计数室上面的两边平台上, 然后摇匀菌液, 用无菌毛细管, 取少量酵母菌悬液滴加在盖玻片与计数板边缘, 让菌液沿缝隙自动进入计数室至充满为止 ( 注意避免计数室内产生气泡和菌液过多而改变计数室的实际容积 ) 4. 显微镜计数先用低倍镜, 找到计数室, 并将计数室移至中央, 转用高倍镜观察计数 每个计数室选 5 个中格 ( 可选 4 个角和中央的一个中格 ) 中的菌体计数, 位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的 如遇酵母出芽, 芽体大小达到母细胞一半时, 可计为 2 个菌体 每个样品必须计数 2 个计数室中的平均含菌量值 13

299 5. 计算方法 总菌数 ( 个 /ml) = 6. 清洗血细胞计数板 X1 + X2 + X3 + X4 + X5 5 25( 或 16) 10 4 稀释倍数 计数完毕, 将血细胞计数板用水冲洗干净, 切勿用硬物洗刷, 再用吹风机吹干后放入计数板盒中 五 注意事项 1. 取样前, 必须将菌悬液摇匀 2. 计数室内不可有气泡 3. 凡压在中格线上的菌体, 切莫四边全计, 通常只计上方和右边两条线上的 4. 计数时, 遇出芽的酵母菌, 芽体大小达到母细胞的一半时才计为 2 个 六 实验报告 1. 结果将总菌数的结果填入下表中 中格菌数 X1 X2 X3 X4 X5 中格菌数 ( 平均值 ) 大格总菌数 稀释倍数 菌体 / ( 个 ml -1 ) 第一室 第二室 2. 思考题 (1) 为什么取样前要摇匀菌液, 加样时计数室又不可产生气泡? (2) 试分析影响本实验结果的误差来源及提出改进措施 14

300 实验五 显微测微尺的使用和微生物大小的测定 一 实验目的 1. 学习并掌握用显微测微尺测定微生物大小的方法 2. 增强微生物细胞大小的感性认识 二 基本原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征, 也是分类鉴定的依据之一 微生物大小的测定, 需要在显微镜下, 借助于特殊的测量工具 显微测微尺, 包括目镜测微尺和镜台测微尺 镜台测微尺 ( 图 5-1) 是中央部分刻有精确等分线的载玻片, 一般是将 1mm 等分为 100 格, 每格长 0.01mm( 即 10µm) 标尺的外围有一黑色的小环, 以便在显微镜下寻找标尺位置, 标尺的圆环上复有一圆形盖玻片以作保护 盖玻片是用树胶粘在在玻片上的, 因此避免二甲苯与其接触 镜台测微尺是显微长度测量的标准, 它并不被用来直接测量细胞的大小, 而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度, 故其质量对所测结果影响极大 目镜测微尺 ( 图 5-2) 是一块可放入接目镜内的圆形小玻片, 其中央有精确的等分刻度, 有等分为 50 小格和 100 小格两种 测量时, 需将其放在接目镜中的隔板上, 用以测量经显微镜放大后的细胞物象 由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同, 目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样 因此, 用目镜测微尺测量微生物大小时, 必须先用镜台测微尺进行校正, 以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下, 目镜测微尺每小格所代表的相对长度 然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数, 即可计算出细胞的实际大小 图 5-1 镜台测微尺及中间部分的放大 图 5-2 目镜测微尺 球菌用直径来表示其大小 ; 杆菌则用宽和长的范围来表示 如金黄色葡萄球菌直径约为 0.8μm, 枯草芽胞杆菌大小为 0.7~0.8 2~3µm 三 实验器材 1. 菌种 : 红酵母 48h 斜面培养物, 15

301 2. 器具 : 显微镜 目镜测微尺, 镜台测微尺, 接种环, 载玻片, 盖玻片, 等 四 操作步骤 1. 装目镜测微尺取出接目镜, 把目镜上的透镜旋下, 将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上, 然后旋上目镜透镜, 再将目镜插入镜筒内 2. 校正目镜测微尺 (1) 放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上 (2) 校正先用低倍镜观察, 将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央, 调节焦距, 当清晰地看到镜台测微尺的刻度后, 转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行 利用移动器移动镜台测微尺, 使两尺在某一区域内两线完全重合, 然后分别数出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数 ( 图 5-3) 图 5-3 镜台测微尺校正目镜测微尺时的情况用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正, 分别测出在高倍镜和油镜下, 两重合线之间两尺分别所占的格数 (3) 计算由于已知镜台测微尺每格长 10µm. 根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下, 目镜测微尺每格所代表的长度 目镜测微尺每格长度 (µm)= 两重合线间镜台测微尺格数 10 两重合线间目镜测微尺格数 3. 菌体大小测定目镜测微尺校正完毕后, 取下镜台测微尺, 换上红酵母清水浸片 先用低倍镜找到目标后, 然后用高倍镜测红酵母菌体的宽度和长度, 测定时, 通过转动目镜测微尺和移动载玻片, 测出菌体宽和长所占目镜测微尺的格数 然后将所测得的格数乘以目镜测微尺 ( 用高倍镜时 ) 每格所代表的长度. 即为酵母菌的实际大小 通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小 ; 可选择有代表性的 3-5 个细胞进行测定 ; 细菌的 16

302 大小需用油镜测定, 以减少误差 4. 测定完毕取出目镜测微尺后, 将接目镜放回镜筒, 再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用 擦镜纸擦拭干净, 放回盒内保存 五 注意事项 观察时光线不宜过强, 否则难以找到镜台测微尺的刻度 ; 换高倍镜校正时, 务必十分细心, 防止 接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头 六 实验报告 1. 结果 (1) 将目镜测微尺校正结果填入下表 : 接物镜 接物镜倍数 目镜测微尺格数 镜台测微尺格数 目镜测微尺每格长度 /μm 低倍镜高倍镜 接目镜放大倍数 : (2) 将菌体测定结果填入下表 : 菌体编号 目镜测微尺 格数 宽 宽度 (µm) 目镜测微尺 格数 长 长度 (µm) 菌体大小 宽 长 (µm µm) 平均 17

303 2. 思考题 (1) 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时, 必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正? (2) 在不改变目镜和目镜测微尺, 而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时, 其测定结果是否相同? 为什么? 18

304 实验六 化学和物理因素对微生物的影响 一 实验目的 1. 掌握培养基配制的一般方法和干热灭菌 高压蒸汽灭菌的原理和方法 2. 了解常用化学消毒剂和紫外线对微生物作用的原理 方法和杀 ( 抑 ) 菌能力 二 基本原理在微生物实验中, 需要进行纯培养, 不能有任何杂菌污染, 因此对所用器材 培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌 消毒与灭菌的方法很多, 一般可分为加热 过滤 照射和使用化学药品等方法 本书主要介绍干热灭菌和高压蒸汽灭菌法 1. 干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的 细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关, 在菌体受热时, 当环境和细胞内含水量越大, 则蛋白质凝固就越快, 反之含水量越小, 凝固越慢 因此, 与湿热灭菌相比, 干热灭菌所需温度高 (160~170 ), 时间长 (1~2h) 但干热灭菌温度不能超过 180, 否则, 包器皿的纸或棉塞会烧焦, 甚至引起燃烧 干热灭菌使用的电烘箱的结构如图 6 1 图 6-1 干燥箱的外观和结构 A 外观 B 结构 1 温度计 ; 2 排气阀 ; 3 温度显示屏 ; 4 箱门 ; 5 控温旋钮 ; 6 设温测温转换开关 ; 7 指示灯 ; 8 加热开关 ; 9 搁板 ; 10 散热板 ; 11 电热丝 ; 2. 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内, 通过加热, 使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽 待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气孔中驱尽, 然后关闭排气阀 继续加热, 19

305 此时由于蒸汽不能溢出, 而增加了灭菌器内的压力, 从而使沸点增高, 得到高于 100 的温度 导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的 在同一温度下, 湿热的杀菌效力比干热大 其原因有三 : 一是湿热中细菌菌体吸收水分, 蛋白质较易凝固, 因蛋白质含水量增加, 所需凝固温度降低 ( 表 6-1) 二是湿热的穿透力比干热大( 表 6-2), 三是湿热的蒸汽有潜热存在 1g 水在 100 时, 由气态变为液态时可放出 2.26KJ( 千焦 ) 的热量 这种潜热, 能迅速提高待灭菌物体的温度, 从而增加灭菌效力 表 6-1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵白蛋白含水量 /% 30 分钟内凝固所需湿度 / ~ ~ ~170 表 6-2 干热湿热穿透力及灭菌效果比较 温度 / 时间 /h 透过布层的温度 / 20 层 10 层 100 层 灭菌 130~ 不完全 湿热 完全 表 6-3 灭菌锅内有不同分量空气时, 压力与温度的关系 压力数 全部空气排 2/3 空气排 1/2 空气排 1/3 空气排 空气全不要 MPa Kg/cm 2 出时的温度 / 出时的温度 / 出时的温度 / 出时的温度 / 排出时的温度 /

306 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时, 灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要, 因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压, 所以, 当水蒸汽中合有空气时, 在同一压力下, 含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度 灭菌锅内留有不同分量空气时, 压力与温度的关系见 ( 表 6-3) 一般培养基用 0.1MPa( 相当于 1.05kg/cm 2 ),121.5,15~30min 可达到彻底灭菌的目的 灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变 例如含糖培养基用 0.06MPa(0.59 kg/cm 2 ) 灭菌 15min 实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式 ( 图 6-2) 二种 其结构和工作原理相同. 本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例, 介绍其使用方法 3. 化学消毒剂和紫外线杀 ( 抑 ) 菌作用微生物的生长繁殖是通过与外界环境进行物质和能量交换而实现的, 环境条件的改变对微生物的生长会造成不同程度的影响 环境因素从总体上可分为化学 物理 生物和营养等四大类 本实验主要通过化学 物理这两类环境因素对微生物影响的试验, 了解微生物与其所处环境之间的相互关系, 使学生初步了解 如何控制环境条件. 使有益微生物正常生长 有 图 6-2 手提式灭菌锅 1 安全阀 ; 2 压力表 ; 3 放气阀 ; 4 软管 ; 5 紧固螺栓 ; 6 灭菌桶 ; 7 筛架 ; 8 水 害微生物受到抑制或被杀死, 掌握微生物在环境中的分布规律, 使微生物能更好地为人类所利用 常用化学消毒剂主要有重金属及其盐类 有机溶剂 ( 酚 醇 醛等 ) 卤族元素及其化合物 有机染料和表面活性剂等 重金属离子可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基相结合而使酶失活, 重金属盐则是蛋白质沉淀剂, 或与代谢产物发生螯合作用而使之变为无效化合物 ; 有机溶剂可使蛋白质及核酸变性, 也可破坏细胞膜透性使内含物外溢 ; 碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活, 氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用 ; 染料在低浓度条件下可抑制细菌生长, 染料对细菌的作用具有选择性, 革兰氏阳性菌普遍比革兰氏阴性菌对染料更加敏感 ; 表面活性剂能降低溶液表面张力, 这类物质作用于微生物细胞膜, 改变其透性, 同时也能使蛋白质发生变性 紫外线主要改变微生物的 DNA 结构, 轻则使微生物发生突变不能繁殖后代, 重则造成微生物当 21