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1 第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"#"$%% &'" #"))&* 镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究 梁媛媛 张海利 杨鲁萍 焦艳华 杭州师范大学材料与化学化工学院 浙江杭州 杭州师范大学生物医药与健康研究中心 浙江杭州 杭州师范大学医学院 浙江杭州 摘 要 以自制磁性琼脂糖微球为基质 环氧氯丙烷为活化剂 亚氨基乙二酸作为螯合剂 制备了表面螯合 " 的磁性凝胶微球!'-'!1)%"73 结果表明 " 成功螯合到了磁性凝琼脂糖胶微球上 : 结果显示在螯合 " 后!'-'!1)%" 形貌没有发生明显变化 且平均粒径为 原子吸收光谱结果表明!' -'!1)%" 表面螯合的 " 的量为 F ' 磁性能测试表明!'-'!1)%" 具有超顺磁性 其磁饱和强度为 % ' 具有良好的磁响应性 将!'-'!1)%" 用于六聚组氨酸融合蛋白 的纯化研究 :8:-2 结果表明!'-'!1)%" 较市售 "+- 对 具有更优的亲和分离效果 经 "& 的孵育后!'-'!1)%" 对 的吸附容量可达到 ' ' 关键词 琼脂糖 六聚组氨酸融合蛋白 金属螯合亲和分离中图分类号 文献标志码 - 文章编号 * 基于金属鳌合亲和介质的六聚组氨酸融合蛋白纯化方法已经得到了广泛的应用 国外公司已经推出了各种用于纯化六聚组氨酸融合蛋白的产品 但是售价昂贵 国内相应产品较为短缺 本文拟以自制的磁性琼脂糖凝胶微球为载体 亚氨基乙二胺为鳌合剂制备表面螯合 " 的金属鳌合亲和磁性微球 用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化 并与商品化镍鳌合次氨基三乙酸琼脂糖微球 +-" 的性能进行比较 本研究的开展为了寻求价廉物美的新型蛋白纯化试剂以代替价格昂贵的进口产品 具有重要的现实意义 实验部分 试剂氯化铁 氯化亚铁 /.!/+@%%&!.!/! / 等均为天津大茂化学试剂厂产品 分析纯 琼脂糖 二氧六环 环氧氯丙烷 亚氨基乙二酸 氯化镍 咪唑等均为阿拉丁试剂公司产品 分析纯 +-" 为,"!'%& 公司产品 六聚组氨酸融合蛋白 粗菌液由杭州师范大学生物医药与健康研究中心李海峰博士惠赠 * & 纳米粒子的制备称取 '6%. / 与 '6%. / 溶于 水中 氮气保护下机械搅拌 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金青年科学基金项目 浙江省自然科学基金青年科学基金项目, 杭州市科委项目 = 通信作者 梁媛媛 女 助理研究员 博士 主要从事多功能纳米复合材料研究!""!&'((&%&

2 杭州师范大学学报 自然科学版 年 1 "& 水浴加热至 5 滴加!/ 溶液 反应液由黄色变为黑色 滴加完毕后继续搅拌 再升温至 5 搅拌 后停止反应 磁分离合成好的 6% 并用纯水洗涤至 $/ 呈中性 冻干保存备用 磁性琼脂糖微球.'" 的制备及活化称取上述制备的 '6% 投于 水中 均匀分散 再加入 ' 琼脂糖 摇匀 再微波炉中加热至完全溶解 5 下加入甲苯 四氯化碳 和 :$!& 的混合溶液中 1 "& 搅拌 冷却至室温 用分液漏斗除去反应液中的油相 然后用磁分离方法除去反应液 最后用乙醇和纯水洗涤多次 然后采用布氏漏斗抽滤除去液相 称取 ' 上述固相产品 投于 纯水之中 搅拌分散均匀 加入 环氧氯丙烷 5 水浴加热 "& 滴加 的!/ 溶液 继续搅拌 "& 再升温至 5 反应 "& 停止反应后采用布氏漏斗抽滤除去反应液 水洗!'-'!1)% 至 $/ 中性 备用 &.'" 的环氧化将上一步得到的产品投入 的!/ 溶液之中 并加入 环氧氯丙烷和 9 的 二氧六环 于 5 恒温摇床中振荡反应 反应结束后 将反应液用布氏漏斗抽滤除去 固相产品水洗至 $/ 中性 获得表面含有环氧基团的磁性琼脂糖凝胶微球!'-'!1)%$ 1 环氧化.'" 的羧酸化将 ' 亚氨基乙二酸在冰浴下投入 的!. 溶液中 搅拌至完全溶解 用饱和!/ 溶液调节 $/ 至 再将上一步制好的环氧化磁性凝胶微球投入上述配好的溶液之中 5 水浴下反应过夜 反应液用布氏漏斗抽滤除去 水洗!'-'!1)% 至 $/ 中性 获得表面含有羧酸基团的磁性琼脂糖凝胶微球!'-'!1)%-" 羧酸化.'" 的镍化将上一步反应得到的羧酸化磁性琼脂糖微球投入 的氯化镍溶液之中 5 水浴下搅拌 停止反应 反应液用布氏漏斗抽滤 水洗除去残留的氯化镍 最后得到表面含有 " 的螯合磁性微球!'-'!1)%" 置于 9 乙醇溶液中保存备用 7 六聚组氨酸融合蛋白亲和层析纯化在 '!'-'!1)%" 中加入 酶粗菌液 5 振荡孵育 磁分离 加入 裂解缓冲液!/!. 咪唑 9 +@%%&$/ 振荡 "& 磁分离 再用 清洗液!/!. 咪唑 9 +@%%&$/ 清洗 振荡 "& 磁分离 收集未被吸附的物质 > 液 最后用 洗脱液!/!. 咪唑 9 +@%%&$/ 洗脱 次 磁分离 收集洗脱液 液 并将上述收集到的 > 液 液进行 :8:2- 电泳分析 纯化容量 取 '!'-'!1)%" 于离心管中 加入融合蛋白 的菌体裂解液 孵育 "& 磁性分离 测定上清中蛋白浓度 至上清液中蛋白浓度不再升高磁粒达到饱和为止 用清洗缓冲液洗去未吸附的杂蛋白后采用咪唑洗脱吸附的融合蛋白 通过 =1!C1 法测定洗脱的蛋白含量 并按式 对!'-'!1)%" 的纯化容量进行计算 纯化容量 ' ' 洗脱液中蛋白含量 ' 凝胶微球重量 ' 结果与讨论.'".5 的结构与表征表面含有 " 的螯合磁性微球!'-'!1)%" 的制备过程如图 所示 我们采用红外光谱对各反应步骤中的产物结构进行了表征 结果如图 所示 从图 中可以看出 经过环氧化处理后 琼脂糖凝胶微球在 处出现了环氧基团特振吸收峰 进一步经过羧酸化处理后 在图 中的

3 第 期 梁媛媛 等 镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究 图.'".5 的制备示意图 )##%"!#!"!"!"#$.'".5 处出现了羰基振动吸收峰 表明琼脂糖凝胶经过羧酸化处理后 表面成功引入了羧酸基团 图 为螯合了金属镍离子的琼脂糖凝胶红外光谱 从图中可以看出 由于羧酸基团通过吸附配位作用与金属镍离子作用 碳氧键上的 电子发生离域 故该处羰基的吸收振动峰消失 证实了镍离子已经成功地螯合在了磁性琼脂糖凝胶微球的表面 进一步通过原子吸收光谱测试测定了!'-'!1)% " 表面螯合的 " 的量为 F ' 金属鳌合亲和层析介质形貌以及表面粗糙程度直接影响介质的非特异性吸附的大小 介质表面越光滑 非特异性吸附越弱 分离效果就越好 图 为磁性琼脂糖磁性微球螯合 " 前后的 : 照片 从图中可以看出 磁性琼脂糖微球在螯合 " 后 其形貌上没有发生明显变化 说明在本实验条件下 磁性琼脂糖微球能很好地保持其原有形貌特征 微球表面依然比较光滑 可减小非特异 的吸附 图 磁性琼脂糖凝胶微球 环氧化磁性琼脂糖微球 羧酸化磁性琼脂糖微球 # 以及镍化磁性琼脂糖微球 的红外光谱图 8+!#"$.'".'".!.'".'##.'".5 图 磁性琼脂糖凝胶微球螯合 5 前后的 ) 照片 )!"!$.'".5$"$"5 #% 图 是!'-'!1)%" 在温度为 时的磁滞回线 从图中可以看出 外磁场从 % 到 % 的循环扫描中!'-'!1)%" 磁滞回线重合为一条曲线 说明!'-'!1)%" 具有超顺磁性!'-'!1)%" 饱和磁化强度为 % ' 具有良好的磁响应性

4 杭州师范大学学报 自然科学版 年 图 &.'".5 的磁滞回线 &#"$.'".5 用于六聚组氨酸融合蛋白亲和纯化用!'-'!1)%" 对 融合蛋白进行纯化 将 泳道 分子质量标准蛋白 泳道 洗脱液 泳道 未被吸附物质 图 1 纯化前后样品的 )).'3 分析 1)).'3%$$"#$"8'!"$#"#$ 得到的样品进行 :8:-2 分析 结果如图 所示 从图 中 泳道对比可以看出 经过!'-'!1)% " 吸附处理后 几乎所有的靶蛋白都结合在了!' -'!1)%" 上 经吸附后的残液中几乎没有靶蛋白条带出现 说明合成的!'-'!1)%" 对 的亲和性好 非特异性吸附很小 经高浓度的竞争吸附剂咪唑洗脱后 得到了单一的 融合蛋白条带 条带清晰 说明!'-'!1)%" 对六聚组氨酸融合蛋白具有很好的分离效果 图 是!'-'!1)%" 与市售的 +-" 对蛋白溶液的 :8:-2 分析 从图中 泳道的对比可以看出 经!'-'!1)%" 纯化得到的洗脱液中 蛋白条带清晰 且其他蛋白条带不明显 而经 "+- 纯化得到的洗脱液中 尽管出现了目标蛋白 的条带 但其他杂蛋白条带依然存在 进一步通过 =1! C1 法对 的纯化量进行了测试!'-'!1)%" 泳道 分子质量标准蛋白 泳道 经!'-'!1)%" 纯化处理后的洗脱液 泳道 经 "+- 纯化处理后的洗脱液 图 使用.'".5 和 5.5' 对 的纯化效果对比 )).'3%$$"#$"8'!"$#"#$ 和 "+- 对 的吸附容量分别为 ' ' 和 ' ' 以上结果说明!'-'!1)%" 对六聚组氨酸蛋白 有良好的纯化效果 选择性和纯化容量均优于市售的 "+- 且可通过磁分离技术进行洗脱操作 简化了纯化步骤 适用于蛋白的大规模纯化 结 论 以自制磁性琼脂糖微球为基质 环氧氯丙烷为活化剂 亚氨基乙二酸作为螯合剂 制备了表面螯合 " 的磁性凝胶微球!'-'!1)%"73 结果表明 " 成功螯合到了磁性凝琼脂糖胶微球上 : 结果显示在螯合 " 后!'-'!1)%" 形貌没有发生明显变化 且平均粒径为 原子吸收光谱显示!'-'!1)%" 表面螯合的 " 的量为 F ' 磁性能测试表明!'-'!1)%" 具有

5 第 期 梁媛媛 等 镍化磁性琼脂糖凝胶微球的制备及其在蛋白纯化中的应用研究 超顺磁性 其磁饱和强度为 % ' 具有良好的磁响应性 将!'-'!1)%" 用于六聚组氨酸融合蛋白 的纯化研究 :8:-2 结果表明!'-'!1 )%" 对 有很好的亲和作用 分离效果好 经 "& 的孵育后!'-'!1)%" 对 的吸附容量可达到 ' ' 参考文献 1!.!1))&))&7%!%!%!C"&"(1!'1!$(!&%@!$$1!$1%"&C1!"&!"&!1% /"8%"/:!%1-%@ %!%!%!)1%&)%%"<%C1$1%"&)!&$%$"%)&!"&"&'&%"'1"&'")""&%1%)" %)1&!C.1!'1!$(- "0"&&87"%18%<%$ %&C!'&%"%!)C11!$"!&%C""%& %!%!%!C"&"($1"C"!"&)1&!C.1!'1!$(- :!1!<!&!&-! :!12. $!1!"<%)(&%)(&%)")C6%!&6% &!&1()!))"&'"'% $%1!1% )"&$!)%%&"%1&!C!%1"!):"%&%%%1) "!"$#5 %'$$'"3%#"!" '!!%# ""$# 7-2 D!&(!& 0/-2 /!"" D-2$"&' 7- D!&!.%'%C!%1"!.% ")1(!&.% "!&'"&%%1"&'/!&'1!&"<%1)"(/!&'."&! 3%)%!1.%&1%C=" %""&%!&/%!/!&'1!&"<%1)"(/!&'."&! :C%""&%/!&'1!&"<%1)"(/!&'."&! '"#!'&%"" %!%!C"&"(!'!1)% "1)$%1%)!'-'!1)%"@%1%$1%$!1%("&1"&'&";% "&)"&%)1C!%C)%C!%!'&%"-'!1)%"1)$%1%)@"%!"C" "&"!%"!"!)%!"&'!'%&+% 1%))C61"%11!&)C1 "&C1!1% 6+73"&"!%!"!)%))C(%!%&%!'&%"!'!1)%'% "1)$%1%)+%!&!()")C)!&&"&'%%1& "1'1!$) :)@%!%)"%C!'-'!1)%"! & "!&%!<%1!'%$!1"%"! +%! "!)1$"& )$%1)$(&C"1 %%! &C%!%" &%)1C!%C!'&%"!'!1)% "1)$%1%)@!)F '+%!'&%" %!)1% '!'-'!1)%"@!))%!)!!'&%"!C"&"()%$!1!"&)$$1C1F /")!''% 1%"&)+%1%))C:8:-2)@%!!'-'!1)%"!%%1!C"&"(!& %1"!"+-!&%!)1$"&!$!"(C(!'-'!1)%"@!)' '!C%1 "&%)"&!"& "!'!1)%F/")!''%$1%"&) %!%!%!C"&"($1"C"!"&)

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