$ 水产学报卷酮和睾酮的水平最近在太平洋牡蛎的基因组中报道了!-! 和!-!! 等序列! 然而贝类中是否还存在其他的! #) 成员目前我们还知之甚少这无疑限制了人们对贝类性激素的合成和灭活途径性激素的运输靶组织定位以及调控等方面的理解栉孔扇贝 # 隶属软体动物门 )! 瓣

Size: px

Start display at page:

Download "$ 水产学报卷酮和睾酮的水平最近在太平洋牡蛎的基因组中报道了!-! 和!-!! 等序列! 然而贝类中是否还存在其他的! #) 成员目前我们还知之甚少这无疑限制了人们对贝类性激素的合成和灭活途径性激素的运输靶组织定位以及调控等方面的理解栉孔扇贝 # 隶属软体动物门 )! 瓣"

铠牲许
7 years ago
Views:

1 第卷第期! 年月水产学报!! 文章编号! # $!%! # $ # #! $ %!!! $ 栉孔扇贝 $ 基因的克隆和表达分析王丹李海龙毕颖刘建国张志峰中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室山东青岛 $$ 摘要为了研究! -! 基因在无脊椎动物生殖过程中的作用实验从栉孔扇贝转录组数据库中获得一个表达序列标签采用 # 末端快速扩增技术克隆得到! 条全长为! 的 # 序列其开放阅读框为编码个氨基酸推测的氨基酸序列含有! #) 特有的个保守区和! # 的个酶结构域且与人等脊椎动物的序列相似性均在 % - 以上半定量 % 显示该基因在栉孔扇贝精巢卵巢肌肉外套膜鳃肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达其中在肝胰腺和肾脏中表达量明显高于其他组织对不同发育时期性腺中该基因表达的 5 % 检测发现其在精卵巢发育周期的表达模式不同且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢由此推测栉孔扇贝多种组织中均可以合成! # 在精巢的发育和成熟的作用明显高于卵巢关键词栉孔扇贝!-! 基因克隆序列特征组织表达中图分类号. %! 文献标志码! #) 通过催化性激素! 位上的醇基和酮基之间的氧化还原反应使性激素在高活性形式和低活性形式之间相互转化! 从而调节相应的生物学功能在动物性别分化性腺发育和生殖调控中起重要作用! # 位于动物的过氧化物酶体中它可以催化高活性的雄烯二醇和雌二醇转化成低生物活性脱氢表雄酮和雌酮目前发现其广泛分布于动物各组织中并在人小鼠大鼠猪等的肝脏的肝细胞肾脏的近端小管上皮细胞卵巢的粒层细胞子宫的管腔和腺上皮精巢的睾丸间质细胞前列腺的上皮细胞骨骼肌的肌细胞视网膜色素细胞和脑的浦肯野氏细胞中均存在明显的特异性表达 % 1/ 等发现敲除该基因后小鼠的精巢支持细胞中大量累积中性脂质幼鼠出现痉挛症状成体雌鼠的生殖能力会降低雄鼠则完全不育人类!-! 基因突变则产生严重的 /8/ / 样综合征 $ 在人前列腺癌的上皮细胞中发现该基因在和蛋白水平均出现过表达性类固醇激素在软体动物中广泛存在目前已在紫贻贝! 砂海螂和巨扇贝 % 等双壳动物中检测到孕酮雌二醇睾酮等的存在并发现性激素对巨扇贝的排卵性腺发育! 和性别决定等有重要的影响软体动物中有!! 关! #) 家族的研究还较有限 1 等克隆获得了九孔鲍 *! %!-!! 全长 # 发现该基因在生殖期的性腺中表达量最高并证明该酶可使雌酮转化为雌二醇推测其在九孔鲍生殖阶段的类! 固醇合成中起着重要作用 1! 等克隆了九孔鲍的!-!!! 瞬时转染入人的胚肾细胞后发现该酶可以降低高活性雄性激素双氢睾收稿日期!! 修回日期!! 资助项目国家 * 八六三高技术研究发展计划! 青岛市科技计划基础研究项目!!!! 1 山东省自然科学重点基金 # 通信作者张志峰!! / *

2 $ 水产学报卷酮和睾酮的水平最近在太平洋牡蛎的基因组中报道了!-! 和!-!! 等序列! 然而贝类中是否还存在其他的! #) 成员目前我们还知之甚少这无疑限制了人们对贝类性激素的合成和灭活途径性激素的运输靶组织定位以及调控等方面的理解栉孔扇贝 # 隶属软体动物门 )! 瓣鳃纲! /!* 1! 其肉鲜味美营养丰富是我国重要的海水养殖贝类之一具有较高的经济价值! 本研究克隆了栉孔扇贝!-! 基因的全长 # 序列进一步对其组织表达以及不同发育时期性腺中的表达进行了分析旨在为贝类性激素合成以及!-! 在贝类中的作用途径等深入研究提供基础数据! 材料与方法实验材料实验所用龄栉孔扇贝购自青岛市海德发海产品市场过滤海水中暂养 1 选择健康的雌雄个体解剖并获取性腺肌肉外套膜鳃肝胰腺和肾脏等组织干液氮中速冻后存于 # 冰箱中用于总提取部分性腺样本于 * 氏液中固定 1 后存于 - 酒精中用于组织学观察以确定性腺的发育时期总提取及第一链的合成采用异硫氰酸胍法提取栉孔扇贝生长期卵巢的总!%!- 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测的质量和浓度使用 #! * */ 1 并按照操作指南合成 # 第一链将生成的 # 模板保存于 # 备用扩增和全长序列的获得从,/*!* 数据库获得人类小鼠野猪非洲爪蟾斑马鱼底等物种的! # 蛋白序列与已经构建的栉孔扇贝转录组数据库中的序列进行!) 比对筛选出同源性较高的数个基因片段根据期望值相似度得分等参数将基因片段进行筛选并将最优参数组合的基因片段再次在,/*!* 上进行!) 筛选出最符合栉孔扇贝!-! 基因的片段根据该片段序列设计 % 引物 %!% 和引物 % % 表! 采用已获得的 % 模板以引物组合! % $%!%$% 和! % $% %$% 进行目的基因的 % 和扩增 % 反应体系为 % 循环参数为 * )$ ) 延伸 * % 个循环! * 扩增产物经! - 琼脂糖凝胶检测胶回收后与 #! 载体连接然后转化到大肠杆菌 # % 感受态细胞中挑取阳性克隆进行菌落 % 和 * 酶切鉴定后送往华大基因进行测序序列特征同源比对及系统进化树构建利用 #)! 软件对所获序列进行全长拼接通过的!)% 程序在,/*!* 数据库中进行相似性搜索 #)! 软件预测其蛋白分子质量和等电点在线软件, )! * %/ 预测该基因糖基化位点氨基酸多重序列比对由 )! 和 #!* 软件完成系统发生树采用 )! 和, 程序中的邻接法 / 1 * * 构建半定量 % 分析根据目的基因全长 # 序列设计! 对特异引物 % 和 %$ 表! 以引物 % 和 % 表! 扩增栉孔扇贝 - 基因,/*!* 登录号 7 %! 的序列片段作为内参提取生长期栉孔扇贝的肾脏外套膜肝胰腺鳃闭壳肌精巢和卵巢的总并使用 % / /! /* 大连宝生物并按照说明书反转录获得 # 用做 % 的模板 % 反应体系为循环参数为 $ 退火 ) 延伸! * 个循环用于扩增!% 的目的基因片段 % 个循环用于扩增 % 的 - 基因片段 8 相对定量 % 分析取保存于 - 酒精中的性腺组织经系列酒精脱水二甲苯透明石蜡包埋切片厚度为 % 后染色于 * 显微镜下观察拍照根据组织学结构特征!$ 将性腺划分为个时期图 % 增殖期滤泡壁由! 层生殖细胞组成生长期滤泡壁由多层生殖细胞组成滤泡腔明显成熟期滤泡腔内充满生殖细胞精巢出现大量精子卵巢中成熟卵被挤压呈不规则形状和休止期滤泡壁由不成层的细胞组成滤泡腔极大每个时期雌雄各取个个体的性腺样本根据已获得的栉孔扇贝目的基因 # 全长序列设计! 对特异引物 % 和 %! 表! 依

3 期王丹等栉孔扇贝!-! 基因的克隆和表达分析 $ 据栉孔扇贝 - 基因序列设计! 对内参引物 %!! 和 %! 表! 以 - 的序列片段扩增片段长度为! 作为内参使用 % 型荧光定量 % 仪检测目的基因扩增片段长度为!% 在栉孔扇贝性腺组织中的相对表达每个性腺样本做个平行检测 % 反应体系为循环参数为 % % *%!% )$! * 个循环设定栉孔扇贝增殖期卵巢目的基因的表达量为! 采用 # 法计算目的基因的相对表达量以 %! 软件包中 */8! 进行显著性分析 # *!* 法进行多重比较 * 1 % 为显著水平用 ) / / 作图表实验中所用的引物序列 %# )-!,)!/ /,1 % 引物 /*! / * $ )1 $ % 序列 % /)/5 /* /,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, %!,,,,,,,, %,,,,, % %,,,,,,,,,,, %,,,,, %$,,,,,, %,, % %,,,,,,,,,,, %!,,,,, %!!,,,,, %!,,,,,,, 结果目的基因全长的克隆序列特征和系统进化分析利用 #)! 软件去除测序结果的载体序列后对其进行拼接获得的栉孔扇贝目的基因的 # 序列全长为!,/*!* 登录号 $! 其中 % 非编码区为! 非编码区为!% 含有的尾巴该序列开放阅读框为可编码个氨基酸预测其蛋白分子质量为等电点为该氨基酸序列含有个! # 家族保守区同时还含有!! 个糖基化位点图! 选择哺乳类鸟类两栖类鱼类和双壳贝类等物种的! # 氨基酸序列进行比对结果显示栉孔扇贝的! # 与人原鸡非洲爪蟾和亚东鲑等物种在端短链脱氢酶结构域 # 中心水解酶结构域 # 和端固醇载体蛋白结构域 % 的相似性分别为 $ - -%$- $ -%- %$- 在全长氨基酸序列的相似性分别为 % -$ - % - 和 $! - 图系统进化树显示根据本实验所获得的栉孔扇贝目的基因推导的氨基酸序列首先与太平洋牡蛎聚类之后与斑马

4 / 水产学报 / 卷鱼底和亚东鲑聚类然后与原鸡非洲爪蟾期的精卵巢中均有表达并且随着性腺成熟其表蜥蜴和东部菱背响尾蛇聚类最后依次与鸭嘴达量均有升高%其中生长期和成熟期精巢中目的兽野猪小鼠和人类聚类 # 图 / $ 基因的表达量显著性高于增殖期和休止期精巢 % $!6 #, 基因的时空表达 # B17 $ % 然而卵巢中的表达量在各发育时期半定量 $N8 7-$ 结果显示!E *9 $% 之间无显著性差异 # 17 $ % 在生长期和成熟分布广泛在所检测的栉孔扇贝各组织中均有表期精巢的表达量显著性高于同时期的卵巢均为达且以肾脏和肝胰腺中表达量最高 # 图 9 $ / 倍# B1 7$ # 图 6$ S$N8 7-$结果显示!E *9 $%在各发育时图 $栉孔扇贝 $!6 #, 全长 )*序列及推导的氨基酸序列小写字母代表 #N$序列大写字母代表编码区序列%双下划线代表翻译的起点和终点%括号区域代表预测的 %8 糖基化位点方框区域代表 $8 *5家族保守区由 %端向 -端依次为 NDXXXDXD辅酶结合位点%%D结构性保守序列%* N 酶活性中心和 7D>>>N S $)< D5DD D< D5E 5 D < FF < B J $!6 #, )*,B 1 NI /V BJ I#N$ S< B /!E *9 VI I<MM BJ I B /J BL S< B 1NI /J/B # ND$ BJ I /M /J/B# N$ J/<R <BJ B J17/ B %8 L / /B M B I Q J1-/B T J L /B /$8 *5 R/> J BJ BL # / %8 BJ / -8 BJ $ / BQ R BJ BL /NDXXXDXD1%D < < /B T J S< B 1,BQ T B /* N BJ 7D>>>N1! #!!$$$% )*, -%.

5 /期 / 王丹等!栉孔扇贝!E *9 基因的克隆和表达分析图不同物种的 $ ]P, 同源蛋白序列比对阴影区显示同源性的氨基酸其中黑色区代表氨基酸同源性为 E深灰色区代表氨基酸的同源性为 7 E 以上浅灰色区代表氨基酸的同源性为 7E 黑框示 $8 *59 氨基酸序列中的 / 个催化活性区域!%端短链脱氢酶结构域# *-5 >$ 中心水解酶结构域# 5,>$ 与 -端固醇载体蛋白结构域# *-71 >$ B.8. %7!人# %7D97 $ % O% 1->% 1!原鸡# %7D8819 $ % M.71- % /!非洲爪蟾# %7D66/ $ % <% 8. 1 % 5 %.!亚东鲑# -%661$ % $* %8, -5 %!栉孔扇贝#! X61 $ S *E 5 D < 5 BE F$ ]P, 5EB D F F > C *I J J L /B BJ J< I BL I// /LR P L /B E I// /L/< S< B L L /B 7 E LIL L /B 7E1NI T L /B R/> J1*-5! I/ I B /I/J IJ /L B % 5,! IJ 8 J IJ /L B M % *-71! / M / B 11! #!!$$$% )*, -%.

6 /1 水产学报 / 卷图基于 $ ]P, 氨基酸序列绘制的进化树 S -JI B > F$ ]P, 85 D JJE B<F J5E 5 D B.8. %7!人类 # %7D 97 1 $ % <1-).5 %! 野猪 # %7D $ % 1-81) 1 1! 小鼠 # $ % *. *, ) *1!鸭嘴兽 # X7D $ % M.71- % /! 非洲爪蟾 # %7D66/ 1 $ % O% 1->% 1! 原鸡 # %7D $ %!. %% 1! 蜥蜴 # X7D /11/71 $ % $. % 1-%%8% 1! 东部菱背响尾蛇 #! $ % D11 1-*.) 1!底 ) %. # $ % <% 8. 1 %5 %.!亚东鲑# -%661 1 $ % 9%..!斑马鱼# $ % <.>,.) % 1!紫海胆# X7D66611 / $ % $* %8, -5 %!栉孔扇贝#! X61 $ % $ %. % > >%-太平洋牡蛎#,O-91/99 1 $ % 7 >% *.-% %.!印 $ % $ %) % 1!库蚊# X7D6 1 $ 度跳蚁#,%81 1 图,$!6 #, E.)* 在生长期栉孔扇贝组织中的半定量表达 151 分子量标准% 1水% 11肾脏% /1外套膜% 9 1肝胰腺% 7 1鳃% 6 1闭壳肌% 1生长期精巢% 1生长期精巢% 8 1生长期卵巢% 1生长期卵巢 S,RUC> F$!6 #, E.)* D D8I.7 -#. < F,B 1 5B> O B 5B 151 P % 1V % 1 1P JB % / 1 B % 9 1I M /M B % 7 1L % 6 1 JJ< /< % 1 L /V BL L % 8 1 /T L /V BL L 1 图 /栉孔扇贝不同发育时期的性腺组织学观察 1卵巢# 增殖期$ % 11卵巢# 生长期$ % /1卵巢# 成熟期$ % 91卵巢# 休止期$ % 71精巢# 增殖期$ % 61精巢# 生长期$ % 1精巢# 成熟期$ % 1 精巢# 休止期$ L1卵原细胞% 1卵母细胞% 1成熟卵% *L1精原细胞% * 1精母细胞% * 1精细胞% *Q 1精子标尺 7! S /] B 58 > 5 B5DF,B 1 D F F > D CE 5CJ5 1/T # 7 / T L $ % 1 1/T # D /V BL L $ % / 1/T # < L $ % 9 1/T # $ BL L $ % 7 1 # 7 / T L $% 6 1 # D /V BL L$ % 1 # < L$ % 1 # $ BL L$ 1L1//L/B <% 1// % 1 < // % *L1 M /L/B <% * 1 M / % * 1 M J% *Q 1 M 19 7!1! #!!$$$% )*, -%.

7 期王丹等栉孔扇贝!-! 基因的克隆和表达分析图 8$ 在栉孔扇贝不同发育周期性腺中的定量表达不同的字母表示基因表达差异显著 * 1% 5)*87 )!.$ -,/ /,1 % )!/ * *!#,, )!*, /) 1 # //*//) *!/) *!* //* * 1% 讨论栉孔扇贝序列结构及同源性分析! #) 是一类参与类固醇激素合成和代谢活动的酶目前已经从脊椎动物中发现了!% 种! #) 除了! #% 属于醛酮还原酶! / /!)/ 超家族外其它成员均属于短链脱氢酶 $ 还原酶 )1 1! * /1 /*!)/)$/!)/) # 超家族尽管它们都有保守的超二级结构 ))!* 折叠辅酶结合位点和催化位点但是各种! #) 之间的序列同源性较低 %- - 尤其是末端的序列多样性可使! #) 分别催化不同的底物!! # 为该家族中一类 # 依赖的氧化酶类它是! #) 中最长的基因参与脂肪酸的氧化和雌二醇的灭活 //* /)! 等首次从猪的肾脏 # 文库中分离出!-! 的 # 全长之后陆续从人 * % 小鼠蜥蜴斑胸草雀 % 亚东鲑 # 紫海胆 %% 和库蚊 ))# 等多种物种中克隆获得该基因的 # 并且对其表达和相关的功能进行研究! 本实验从栉孔扇贝卵巢中获得一个全长为! 的 # 序列该序列不仅含有! #) 共有的保守区,,, 辅酶结合位点, 结构性保守序列 / ) 酶活性中心和 %, 还具有! # 特有的催化活性区域端短链脱氢酶结构域中心水解酶结构域和端固醇载体蛋白结构域系统进化分析表明该序列与太平洋牡蛎的! # 处于同一枝鉴于上述特点实验认为本研究所获得的目的序列为栉孔扇贝!-! 全长 # 序列栉孔扇贝 $ 的时空表达分析!-! 广泛分布于动物各组织中人类在肝脏中表达量最高其次是心脏前列腺和精巢在肺骨骼肌肾脏胰腺和卵巢中适量表达猪和小鼠等脊椎动物在肝脏和肾脏中表达量最高并认为这与此类器官中该酶催化长链脂肪酸的氧化! 本实验首次报道了贝类中!-! 基因的基因克隆和发育表达图式栉孔扇贝中该基因也是在肝胰腺和肾脏中表达量最高所以推测该酶在栉孔扇贝的肝胰腺和肾脏中可能也参与脂肪酸的代谢过程并且精巢卵巢鳃外套膜和肌肉等多种组织检测到其存在说明栉孔扇贝多种组织均可以合成! # 大鼠肝脏研究表明过氧化物酶体增殖因子可以增强!-! 的表达且其对雄鼠的诱导作用明显高于雌鼠栉孔扇贝 5 % 显示该基因在精巢中整体表达高于卵巢我们推测类似的诱导作用可能同样存在于栉孔扇贝精巢中进一步研究发现该基因敲除的小鼠出生! 细精管开始大量积累脂滴出生个月后雄鼠睾丸完全萎缩 % 个月后生精上皮萎缩生精作用完全停止丧失生育能力 % 本实验发现在精巢的成熟过程中该基因表达量迅速升高我们推测! # 在精巢的成熟过程中也具有一定的作用但具体作用机理及重要程度我们还不能确定目前贝类中关于! #) 的研究还很有限并且激素的合成灭活和运输以及生殖过程的进行是多基因共同调控的结果所以! # 在这些过程中的具体作用机制还需要更多的实验证据支持参考文献! )1 / /1/*) 6/!*! ) ) 1/ )*!!! //!/ 1!* /) * 1/ / /)) * )/ )//* /* /)!* )/ )/ / / ) * 1/!/!1! )

8 水产学报卷 * *!!%!! %% #% $ //* /)# / / / / 1/ /*/ 1/ 1!*!/!1 )/ /1 /*!)/ /!!!*,/* /!!! $ #!! 赵刚!% 型! 羟化类固醇脱氢酶和! 型 % 还原酶在乳腺癌和癌旁组织中的表达 # 长春吉林大学! 1/!**!/), %!/) %/ )! * *! / * 1//* / 1/! /*)!* 1/* )/ / 1! 1 )!! /!*/) $!$! # % 1/ 1! 1,/* # %/ )! * *! / * )/))/*! 1 / )!) ) * / /)!*!// * / * * $! % # $ $ *!**!/1! # * *! / * / /*!))!/ 8 1 /) )!* *!* /)!) )! * #/6/ /*! %! #%!)!1,! */,! /* %!! #! 6// /)) *!* * / /* /*!/! /*/ * )!/!* / /!!* /! * *!! # #$!*/, % / / )/ )!* /*! / 1!* ) ) * * /* /* */ ) * * *6//!/)!$!!% #!$,! 1 / / %// *! )!!/!!* /) )/ */ * /*! *) *!/!* /!/ )! 6!6! * 1/ / 6/ /,/*/!!*!! 6/ * * $!%! #!!!* % ) /* * * ) /) * 1/)/! )! 1!! /! *!* )) / *6 6/ /* * / 6/ /! *!! 6/ 1/ )!* %1 )%! 1/ )!* /!! #!!! 1,! 7 /*! *!* * *! 1!! /! *!! 6/!/! 1 )/ /1 /*!)/! *!! */ *!% /!!* /! 1/ )!! %! #! #!! 1! 1! * * 1!! /! *!* / /)) *!*! ) )!! 6/! /!1 )/ /1 /*!)/!! *!! */ *!% 1/ *! / 1/ )!* /!!!! # % #$! 1!*,!* # 1/ )/ /* / /6/!))/))!!! *!* / )1/! *! /!! #%! 杨凤影张弼不同地理种群栉孔扇贝营养成分的比较分析安徽农业科学 # %!%! ))/# 分子克隆实验指南北京科学出版社 %! #%!!$ 廖承义徐应馥王远隆栉孔扇贝的生殖周期水产学报!!! #!!! %!6!*! 1 /!** /!* * * 1!*!/!1 )/ /1 /*!)/) /!!* /! * * $! # $! #!! //* /)! ) )/* /! * *!*! *! )/5 /* / 1/ */! /!/)! /1 /*!)/ /!* *! 1/ )!!! #!!) 1! 1/! 1 )/ /1 /*!)/,/* /) /!* )/!) *! /*// /)) * * 1/ 6/ 8* #!! 6/ 1/ )!* %1 )%! 1/ )!* /!!%!% #!$ * ) /* %/ ) / /! )!/ 1/ / /)) * /) /* /! * /* /) 1 /! #!%! #!$

9 期王丹等栉孔扇贝!-! 基因的克隆和表达分析 %!)!* #!, 7 )!#!#1 ).$ *! )! *, #!*! * 7 *!*, 1 /* %#- # # #$ ) $.$,# #!#1 $# $$!# / # / ) 1/ /!-! * 1// 6/ /) *6//!/)1 ))!!! / /)) * )/5 /* /! 1/!*) *!!!)/ # 1/*! # 8!) */ ) *!! * # * / / /* 1 8!)! /* /! / /! *! )81 1 *! */ *)/6/! *)!* /* /)!! *)!* 1/! *! )/5 /* /1! /* /) 6/% /)/5 /* / 6//!/) /! / * % / 5!*! 6/ % /6/!/ 1/ 8!) // / 8 / * 1//) ) 6!! ) /!*/ 1/!!* /!)!* */ /) /! 1 1/ * 1/!!* /!)!* */ 5 % 8!)! /! //* /6/ /*)! /) *! * / /*// /))/ )1 8/ //* / /)) *!/*)/8//* /) )!* 6!!* 1/ /*// /) * * /) )! 8 * )! /!*! / )! /8!) 6 ) 1 1/1!* 1/ 6!!1/)! /)! /) * % / * / 1!! # /) *1/) / *!* ) /) 1#!* 1/ /*/ 1/ /!* * /! * 1/ /6/ /*!*! /) )1!* 6! 1, #!-! /*/ */ )/5 /* / 1!! /! * ) // /)) *!,)!* # /, 1 /*!! / *

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌