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仆履扶李
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1 中国农学通报 2012,28(13): Chinese Agricultural Science Bulletin 萼脊兰 Actin 基因片段的克隆及序列分析袁秀云, 田云芳, 蒋素华, 崔波 ( 郑州师范学院生物工程研究所, 郑州 ) 摘要 : 从萼脊兰叶片中克隆 Actin 基因, 为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础根据 GenBank 中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计简并引物, 以萼脊兰叶片总 RNA 为模板, 利用 RT-PCR 技术得到了 3 个 Actin 基因片段序列分析结果表明,3 个 Actin 基因片段长度均为 1062 bp, 编码 354 个氨基酸, 具有 Actin 基因的功能位点 ; 与其他植物同源序列进行分析表明, 其核苷酸序列的同源性在 80% 以上, 氨基酸序列的同源性在 96% 以上本研究中得到的 3 个基因序列是 Actin 基因的同源片段, 分别命名为 SeACT1 SeACT2 和 SeACT3, 并在 GenBank 注册, 登录号分别为 JN JN 和 JN 关键词 : 萼脊兰 ; 肌动蛋白基因 ; 克隆 ; 序列分析中图分类号 :S 文献标志码 :A 论文编号 : Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene Fragment from Sedirea japonica Yuan Xiuyun, Tian Yunfang, Jiang Suhua, Cui Bo (Institute of Bioengineering, Zhengzhou normal university, Zhengzhou ) Abstract: The aim was to clone Actin gene from leaf of Sedirea japonica, the results would provide an important basis to study the function of Actin and to research the molecular regulatory mechanisms of other genes as a reference gene. Degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the Actin genes from other plants. Total RNA was extracted from the leaves of Sedirea japonica. Three Actin gene fragments were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The sequencing result revealed that each of three Actin gene fragments from Sedirea japonica contains 1062 bp, encoding a protein of 354 amino acids. Homology comparison with other plants Actin gene sequences in the GenBank showed that they shared over 80% nucleotide sequence homology and 96% amino acid sequence homology with other plants Actins. The cloned genes were Actin gene fragments, were named as SeACT1, SeACT2 and SeACT3 respectively. They were registered into GenBank (respective accession number: JN981138, JN and JN981140). Key words: Sedirea japonica; Actin gene; cloning; sequence analysis 0 引言肌动蛋白 (actin) 是真核生物中普遍存在的一种由多基因家族编码的重要蛋白质, 在动植物中执行重要的生理功能在植物中, 以肌动蛋白和微管蛋白为基础的细胞骨架, 涉及植物细胞的分裂机制细胞运动细胞器运动细胞的极性细胞空间形状的维持, 物质 [1-3] 运输等另外, 肌动蛋白在分子水平上还有其他重要的生理过程, 包括基因转录控制 mrna 加工和运输等, 因此具有重要的研究价值, 也是植物细胞学研究 [4-5] 的热点众多研究表明,Actin 基因不论在核苷酸还是氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性, 在各种组织中恒定表达, 因而常被作为研究其他基因的表达模式及调控机制的分子内标, 以比较不同来源的目 [6] 的基因表达量的差异迄今为止, 已在许多高等植基金项目 : 郑州科技计划项目兰花花期调控的研究及应用 (112PPTGY250-3) 第一作者简介 : 袁秀云, 女,1970 年出生, 河南许昌人, 教授, 博士, 主要从事兰花花期的分子调控机理研究通信地址 : 郑州市英才街 6 号郑州师范学院生物工程研究所,Tel: , yuanxiuyun@163.com 收稿日期 : , 修回日期 :

对萼脊兰开花调控机理的研究也刚刚起步 Actin 基因作为研究其他基因或外源基因表达的内标基因之一, 是萼脊兰相关基因表达研究的基础, 而 Actin 基因在萼脊兰中的研究还未见报道笔者以萼脊兰的叶片为试验材料, 根据其他植物中已克隆的植物肌动蛋白基因序列设计简并引物, 用 RT-PCR 方法克隆了 Actin 基因片段, 以此基因为内标参照,

2 244 中国农学通报物如水稻拟南芥小麦大麦大豆豌豆白杨玉兰花生地黄碱蓬枣树向日葵桑树等克隆到了 Actin [7] 基因萼脊兰 (Sedirea japonica) 为兰科萼脊兰属植物, 因其花色清丽, 香味芬芳, 养护简单且耐寒, 深受人们的喜爱近年来随着分子生物学在花卉相关研究及育种中的应用, 兰科植物相关基因特别是开花相关基因及 [8-9] 其表达成为当今研究的热点, 对萼脊兰开花调控机理的研究也刚刚起步 Actin 基因作为研究其他基因或外源基因表达的内标基因之一, 是萼脊兰相关基因表达研究的基础, 而 Actin 基因在萼脊兰中的研究还未见报道笔者以萼脊兰的叶片为试验材料, 根据其他植物中已克隆的植物肌动蛋白基因序列设计简并引物, 用 RT-PCR 方法克隆了 Actin 基因片段, 以此基因为内标参照, 为研究其生理功能及其他基因在萼脊兰中的表达和调控奠定基础 1 材料与方法 1.1 试验材料萼脊兰来自郑州师范学院智能温室取萼脊兰未开花期的叶片在液氮中速冻后, 存于 -80 冰箱保存备用 1.2 试验方法萼脊兰叶片总 RNA 的提取将萼脊兰叶片在液氮中研磨至粉状, 用 Trizol(Invitroigen 公司 ) 试剂提取其总 RNA 用琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA 的完整性 ; 用 DU800 核酸蛋白分析仪 ( 美国 Beckman 公司 ) 测定其 OD 260 OD 280 值, 计算 RNA 浓度和纯度引物设计与合成根据小麦 (AB181991) 甘蔗 (AY742219) 番木瓜 (FJ696416) 白玉兰 (AF281323) 结缕草 (GU290545) 玉米 (NM_ ) 油菜 (AF111812) 向日葵 (FJ487621) 拟南芥 (NM_179953) 蝴蝶兰 (AF AF AF246714) 等几种植物 Actin 基因的核苷酸序列进行同源性比较, 找出高度保守的区段, 利用 DNAMAN 和 Primer 5.0 生物软件设计一对简并引物 P1:5'-ACT GGA ATG GTC AAG GCC G-3' 和 P2:5'-CGG ACC AGT TTC(G/A)TCA TAC TC-3', 用于扩增萼脊兰 Actin 基因片段, 推测目的片段的长度为 1062 bp 引物由上海英骏生物技术公司合成 RT-PCR 扩增用 M-MLV 反转录酶 (TaKaRa 公司 ) 合成 cdna 第一链, 具体方法参照试剂盒说明书 ; PCR 扩增体系为 20 μl, 含 10 buffer 2 μl,taq DNA 聚合酶 1 U,4 种 dntp 各 150 μmol/l, 每条引物 0.5 μmol/l, cdna 模板 1000~2000 ng PCR 扩增程序为 :95 变性 5 min;95 40 s,58 40 min,72 40 min,35 个循环 ;72 延伸 10 min 目的片段的回收克隆和测序 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶分离并回收 ( 采用 TIANgel Midi Purification Kit), 回收的 PCR 产物连接到 pmd19-t 载体, 转化感受态大肠杆菌 DH5α(pMD19-T 和 DH5α 均购自 TaKaRa), 用含有 50 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 固体培养基进行蓝白斑筛选, 阳性克隆通过摇菌扩增提取质粒 ( 采用 TIANprep Mini Plasmid Kit), 质粒经 PCR 鉴定确认后, 送至上海英骏生物技术公司测序序列的生物信息学分析序列多重的比较翻译等在 DNAMAN 生物软件上进行, 使用 expasy.org/ 进行蛋白结构域预测, 同源性分析在 NCBI ( 网站上进行 Blast 搜索 2 结果与分析 2.1 总 RNA 的提取以萼脊兰叶片为材料提取的总 RNA 经凝胶电泳检测结果显示 28S rrna 18S rrna 条带清晰 ( 图 1), 紫外测定 OD 260/OD 280 平均值为 1.95, 表明所提取的 RNA 完整性好纯度高, 可以用于 RT-PCR 扩增图 1 总 RNA 的提取 2.2 RT-PCR 扩增和克隆以总 RNA 反转录所得到的第一链 cdna 为模板, 用 Actin 基因的简并性引物 P1 P2 进行 PCR 扩增扩增产物经凝胶电泳检测发现约在 1000 bp 处有一条亮带, 且上下无杂带, 与目的片断的大小一致 ( 图 2), 推测可能是 Actin 基因片段, 有待进一步鉴定 bp 1000 bp 图 2 目的基因的扩增

袁秀云等 : 萼脊兰 Actin 基因片段的克隆及序列分析 245 将回收纯化的目的片段连接到 pmd19-t 并转化 E. coli.dh5α, 随机挑取 5 个阳性克隆摇菌, 提取质粒进行 PCR 扩增, 得到的扩增片段大小约为 1062 bp, 与 RT-PCR 结果一致, 表明这些克隆为阳性克隆, 其中送 4 个阳性克隆进行测序 2.

3 袁秀云等 : 萼脊兰 Actin 基因片段的克隆及序列分析 245 将回收纯化的目的片段连接到 pmd19-t 并转化 E. coli.dh5α, 随机挑取 5 个阳性克隆摇菌, 提取质粒进行 PCR 扩增, 得到的扩增片段大小约为 1062 bp, 与 RT-PCR 结果一致, 表明这些克隆为阳性克隆, 其中送 4 个阳性克隆进行测序 2.3 测序结果及序列分析经过对 4 个阳性克隆测序结果分析, 其中 2 条序列完全相同, 即得到 3 条 1062 bp 的序列, 均编码 354 个氨基酸将这些片段进行 Blast 比较, 结果显示 :3 条序列与其他植物的 Actin 基因核苷酸序列的同源性均在 80%~91% 之间, 其中同源性最高的是蕙兰的肌动蛋白基因 ACT3(91%); 而氨基酸序列的同源性达 96% 以上表明所克隆到的片段为 Actin 基因片段, 均为未登录的序列将 3 个基因分别命名为 SeACT1 SeACT2 和 SeACT3, 并在 GenBank 注册, 登录号分别为 JN JN 和 JN 对 3 条 cdna 序列分析发现,SeACT1 和 SeACT3 之间的相似性为 94.73%,SeACT2 和 SeACT3 之间的相似性为 95.76%, 而 SeACT1 和 SeACT2 的相似性为 98.87%, 仅有 12 个碱基的差异 ; 对 3 条序列推导的氨基酸序列进行分析发现,3 个氨基酸序列同源性 99.72%, 相互之间仅有 2~3 个氨基酸不同 ( 图 3) 通过在线分析,3 条氨基酸序列均在相同的位置有 3 个 Actin 基因标记位点 ( 图 4) 将 3 条推导的氨基酸序列在 GenBank 中进行 Blastp 搜索, 发现三者均相似地具有 Actin 基因家族典型的结构域, 即均含有 6 个 ATP 结合位点 9 个纤维蛋白结合位点和 9 个凝溶胶蛋白结合位点 ( 图 5)

4 246 中国农学通报图 3 萼脊兰 Actin 基因序列比对分析图 4 肌动蛋白基因氨基酸序列及其功能结构域图 5 肌动蛋白基因推导的氨基酸序列的保守结构域

5 袁秀云等 : 萼脊兰 Actin 基因片段的克隆及序列分析 247 通过对萼脊兰与其他兰科植物 Actin 基因序列的聚类分析发现, 萼脊兰 3 个 Actin 基因与蕙兰的肌动蛋白基因 ACT1 和 ACT2 同源性最高 (90%), 与蝴蝶兰肌动蛋白基因 ACT2 和蕙兰 ACT5 的同源性次之 (84%), 而与蝴蝶兰 ACT1 的同源性最低 (80%)( 图 6) 而氨基酸序列聚类分析表明,SeACT2 和 SeACT3 与蕙兰 ACT1 和 ACT2 的氨基酸序列同源性达 100%, SeACT2 SeACT3 蕙兰 ACT1 和 ACT2 与 SeACT1 同源性为 99%,3 个萼脊兰 Actin 基因氨基酸序列与蕙兰 ACT5 和蝴蝶兰 ACT2 氨基酸序列同源性为 97%, 而与蝴蝶兰 ACT1 同源性为 96%( 图 7) 图 6 兰科植物 Actin 基因序列的聚类分析图 7 兰科植物 Actin 基因氨基酸序列的聚类分析 3 结论与讨论笔者克隆了萼脊兰 3 个 Actin 基因片段, 均编码 354 个氨基酸, 通过比对分析,3 个基因序列片段与兰科植物蕙兰和蝴蝶兰的 Actin 基因同源性在 80% 以上, 其氨基酸序列同源性达 96% 以上, 再次证明高等植物的 Actin 基因是一种高度保守的看家基因在植物细胞中, 肌动蛋白由多基因家族编码, 会产 [10] 生多种肌动蛋白异型体, 拟南芥中的肌动蛋白异性体可分为营养型和生殖型, 分为 5 个亚类很明显本试验中克隆的萼脊兰的 3 个 Actin 基因也是肌动蛋白异型体不同肌动蛋白异型体具有不同的生物功能, [11] 在植物生命活动过程中起着非常重要的作用如拟南芥 ACT2 对根尖根毛凸出的位点选择和根尖的生长 [12] 和发育中具有重要意义 ; 而在豌豆中的肌动蛋白异型体至少分为 3 类, 其中,I 类 (PEAcI) 和 II 类 (PEAcII) 在根茎叶中都有表达, 但存在发育时间上的表达特异性, 尤其在叶中的差异较明显而 III 类 (PEAcIII) 与前二者的差别更大, 说明 3 类异型体基因的表达存在 [13] 组织特异性在本研究中, 虽然已经得到 3 个 Actin 基因片段, 由于肌动蛋白基因由多基因家族编码, 在萼脊兰中可能还有未克隆到的肌动蛋白基因, 而萼脊兰中的肌动蛋白异型体有多少个, 以及这些异型体的表达模式和执行的功能是什么, 哪一个最适用于作为内标基因, 及适应于哪些研究的内标基因, 还需要进一步研究本研究中 Actin 基因的克隆和序列分析不但填补

6 248 中国农学通报了萼脊兰内标基因克隆的空白, 同时丰富了肌动蛋白研究的资料库然而由于异型体的存在及表达存在组织特异性, 当作为内标基因研究其他基因的表达及调控时, 还需要对内标基因的稳定性及适用性做出选择近年来看家基因作为相对定量内标基因的稳定性 [14-15] 已经引起很多人的重视, 因此对这些基因的克隆和分析还只是初步研究结果随着萼脊兰相关基因的克 [16] 隆及遗传转化研究的逐步开展, 为了研究结果的科学性和精确性, 深入研究萼脊兰的肌动蛋白基因及其他看家基因表达的组织特异性及稳定性也迫在眉睫参考文献 [1] 陈颖, 王刚, 赵俊霞. 高等植物体内的肌动蛋白 [J]. 生物学通报,2003, 38(1): [2] Kandasamy M K, McKinney E C, Meagher R B. Functional nonequivalency of actinisovariants in Arabidopsis[J]. Mol Biol Cell, 2002,13: [3] Collings D A, Harper J D I, Marc J, et al. Life in the fast lane: actin-based motility of plant peroxisomes[j]. Can J Bot,2002,80(4): [4] 朱筱娟, 曾宪录, 宋朝霞, 等. 细胞核内肌动蛋白及其功能研究进展 [J]. 科学通报,2004,49(11): [5] 赵丽辉, 姜革强, 邓国忠, 等. 肌动蛋白与染色体改构复合物 BAF 和转录因子 NF1/CTF 之间的联系 [J]. 东北师大学报 : 自然科学版, 2006,38(4): [6] Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, et al. Housekeeping genes as internal standards: use and limits[j]. J Biotechnol,1999,75: [7] 张少斌, 刘国琴. 植物肌动蛋白异型体研究进展 [J]. 植物学通报, 2006,23(3): [8] Mondragón-Palomino M, Theißen G. Why are orchid flowers so diverse? Reduction of evolutionary constraints by paralogues of class B floral homeotic genes[j]. Ann. Bot,2009,104: [9] Chang Y Y, Kao N H, Li J Y, et al. Characterization of the Possible Roles for B Class MADS Box Genes in Regulation of Perianth Formation in Orchid (Oncidium Gower Ramsey). Plant Physiology, 2010,152: [10] Meagher R B, McKinney E C, Kandasamy M K. Isovariant dynamics expands and buffers the responses of complex systems: The diverse plant actin family[j]. Plant Cell,1999,11,1-12. [11] Kandasamy M K, McKinney E C, Meagher R B. A Single Vegetative Actin Isovariant Overexpressed under the Control of Multiple Regulatory Sequences Is Sufficient for Normal Arabidopsis Development[J]. Plant cell,2009,21: [12] Ringli C, Baumberger N, Diet A, et al. ACTIN2 is essential for bulge site selection and tip growth during root hair development of Arabidopsis[J]. Plant Physiol,2002,129, [13] 凌毅, 赵武玲. 豌豆肌动蛋白异型体基因的特异性表达 [J]. 植物学通报,2001,18(1): [14] 胡瑞波, 范成明, 傅永福. 植物实时荧光定量 PCR 内参基因的选择 [J]. 中国农业科技导报,2009,1l(6): [15] 朱芷葳, 董常生. 持家基因作为相对定量内标物的稳定性比较 [J]. 生物技术通讯,2006,17(5): [16] 崔波, 李长看, 马杰, 等. 萼脊兰 ACC 氧化酶基因片段的克隆及其反义基因表达载体的构建 [J]. 生物技术通报,2009,12:68-71.

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌