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轸短尤
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1 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 22 期 2014 年 11 月 3219 化学成分狭基线纹香茶菜水溶性成分及其抗肿瘤活性研究唐海明 1 1,, 陈建南 2, 徐香琴 1 1,, 赖小平 2, 黄松 1. 广州中医药大学新药开发研究中心, 广东广州广州中医药大学中医药数理工程研究院, 广东东莞 , 2* 摘要 : 目的研究狭基线纹香茶菜 Isodon lophanthoides var. gerardianus 的水溶性成分及其抗肿瘤活性方法采用大孔吸附树脂 D-101 ODS Sephdex LH-20 等色谱技术和重结晶进行分离纯化, 通过 ESI-MS 1 H-NMR 13 C-NMR 等现代波谱技术进行结构鉴定 ; 以 HepG2 为供试细胞株, 采用 MTT 法对化合物进行体外抗肿瘤活性研究结果从狭基线纹香茶菜水提液中分离得到 12 个水溶性化合物, 分别鉴定为新西兰牡荆苷 II(1) 新西兰牡荆苷 III(2) 异夏佛塔苷 (3) 夏佛塔苷 (4) 牡荆苷 (5) 芹菜素 -6, 8- 二 -C-α-L- 吡喃阿拉伯糖苷 (6) 芹菜素 -7-O- 葡萄糖醛酸苷 (7) 芹菜素 -6-C-β-L- 吡喃阿拉伯糖 -8-C-α-L- 吡喃阿拉伯糖苷 (8) 芹菜素 -6-C-β-D- 木糖 -8-C-α-L- 阿拉伯糖苷 (9) 咖啡酸 (10) 迷迭香酸 (11) 芦丁 (12) 结论化合物 1~9 为首次从香茶菜属植物中分离得到 ; 其中化合物对 HepG2 细胞有较好的抑制作用关键词 : 狭基线纹香茶菜 ; 新西兰牡荆苷 II; 新西兰牡荆苷 III; 异夏佛塔苷 ; 夏佛塔苷 ; 迷迭香酸中图分类号 :R284.1 文献标志码 :A 文章编号 : (2014) DOI: /j.issn Water-soluble constituents from Isodon lophanthoides var. gerardianus and their antitumor activities TANG Hai-ming 1, CHEN Jian-nan 1, 2, XU Xiang-qin 1, LAI Xiao-ping 1, 2, HUANG Song 1, 2 1. New Drug Research & Development Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou , China 2. Dongguan Institution for Mathematics and Theoretics Engineering Research, Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan , China Abstract: Objective To investigate the water-soluble constituents of Isodon lophanthoides var. gerardianus. Methods Compouds were isolated and purified by D-101, Sephadex LH-20, and ODS column chromatographies. The chemical structures were elucidated on the basis of spectral data and physicochemical properties. Results Twelve compounds were isolated and identified as vitexin II (1), vicenin III (2), isoschaftoside (3), schaftoside (4), vitexin (5), 6, 8-di-C-α-L-arabinosylapigenin (6), apigenin-7-o-glucuronide (7), apigenin 6-C-β-L-arabin-osyl-8-C-α-L-arabinopyranoside (8), apigenin 6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside (9), caffeic acid (10), rosmarinic (11), and rutin (12). Conclusion Compounds 1 9 are separated from I. lophanthoides var. gerardianus for the first time, and constituents of the water-soluble parts of I. lophanthoides var. gerardianus are studied systematically for the first time. Compounds 1, 6, and 11 exert antiproliferative effects on HepG2 cells. Key words: Isodon lophanthoides var. gerardianus (Benth.) H. Hara; vitexin II; vicenin III; isoschaftoside; schaftoside; rosmarinic 狭基线纹香茶菜 Isodon lophanthoides var. gerardianus (Benth.) H. Hara 为唇形科香茶菜属植物, 是中药溪黄草广东地区的主流品种, 具有清利湿热退黄利胆凉血散瘀的功效, 民间常用于治疗急性黄疸型肝炎急性胆囊炎咽喉炎跌打瘀肿等疾病 [1], 为消炎利胆片胆石通胶囊以及复方胆通胶囊的主要组方药材之一近年来在化学和药理学领域对香茶菜属植物进行了大量的研究大量药理实验表明狭基线纹香茶菜的水提液具有良好的抗炎抗肿瘤保肝活性, 显示良好的开发前景 [2-4] 但狭基线纹香茶菜水溶性部位提出的报道虽较多, 药效物质基础不够明确, 有待进一步深入研究此收稿日期 : 基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2012BAI29B00) 作者简介 : 唐海明 (1988 ), 男, 硕士生, 主要从事中药新药筛选与研究 Tel: thm1835@qq.com * 通信作者黄松 (1973 ), 男, 研究员, 主要从事中药新药开发 Tel: huangnn421@163.com

2 3220 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 22 期 2014 年 11 月外, 溪黄草被载入中国药典 2010 年版, 溪黄草各品种来源成分差异及药理药效差异尚不明确, 质量标准缺乏, 与其化学成分研究滞后有一定的关系为进一步明确狭基线纹香茶菜的活性成分, 本实验对狭基线纹香茶菜水溶性成分进行了研究, 从中分离得到 12 个化合物, 分别鉴定为新西兰牡荆苷 II (vicenin II,1) 新西兰牡荆苷 III(vicenin III,2) 异夏佛塔苷 ( isoschaftoside, 3 ) 夏佛塔苷 (schaftoside,4) 牡荆苷(vitexin,5) 芹菜素-6, 8- 二 -C-α-L- 吡喃阿拉伯糖苷 ( 6, 8-di-C-α-Larabinosylapigenin,6) 芹菜素-7-O- 葡萄糖醛酸苷 (apigenin-7-o-glucuronide,7) 芹菜素-6-C-β-L- 吡喃阿拉伯糖 -8-C-α-L- 吡喃阿拉伯糖苷 (apigenin 6-Cβ-L-arabinopyranoside-8-C-α-L-arabinopyranoside,8) 芹菜素 -6-C-β-D- 木糖 -8-C-α-L- 阿拉伯糖苷 (apigenin 6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside, 9) 咖啡酸(caffeic acid,10) 迷迭香酸(rosmarinic, 11) 芦丁(rutin,12) 化合物 1~9 为首次从香茶菜属植物中分离得到, 对各水溶性化合物进行抗肿瘤活性初步筛选, 其中化合物对 HepG2 细胞有较好的抑制作用 1 仪器与材料 LCQ Deca XP 液 - 质联用仪 ;Bruker AVANCE III HD 500 超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪 Shimadzu LC 8A 型制备液相 ( 手动进样,SPD 20A 检测器,N2000 工作站 ); Shimadzu PRC-ODS 制备柱 (250 mm 4.6 mm,7 μm); Shimadzu 高效液相色谱仪 (LC 20AT 泵 ;SIL 20A 自动进样器 ; SPD 20A 二极管阵列检测器 ); Thermo Hypersil Gold C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm);cp225d 十万分之一电了天平 ( 德国 Sartorius 公司 );BP11OS 万分之一天平 ( 德国 Sartorius 公司 ); KQ3200DE 医用数控超声清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ); ODS-A(50 μm,ymc); Sephadex LH-20(General Electric Company); D-101 大孔吸附树脂 ( 安徽三星树脂科技有限公司 ); 80~100 目聚酰胺色谱粉 ( 台州路桥四甲生化塑料厂 ) 狭基线纹香茶菜 2012 年 10 月采于广东饶平基地, 由广州中医药大学新药开发研究中心陈建南研究员鉴定为香茶菜属植物狭基线纹香茶菜 Isodon lophanthoides var. gerardianus (Benth.) H. Hara 地上部分, 标本 ( ) 保存于广州中医药大学新药开发研究中心 2 提取与分离取狭基线纹香茶菜干燥药材 (7 kg), 水煎提 3 次, 每次 1.5 h, 趁热滤过, 合并滤液, 将滤液浓缩至小体积, 然后过 D-101 大孔吸附树脂, 水洗至颜色较淡,95% 乙醇洗脱, 收集 95% 乙醇洗脱液, 减压浓缩至无醇味, 加水稀释, 依次用石油醚醋酸乙酯充分萃取, 将剩下的水液减压回收除去少量的有机溶剂, 加水稀释混匀, 过 D-101 大孔树脂, 依次用水 95% 乙醇洗脱, 收集 95% 乙醇洗脱液, 浓缩回收乙醇, 加水稀释, 过聚酰胺 (80~100 目 ) 色谱, 依次用水及 10% 30% 50% 乙醇洗脱, 分别得到 4 部分溶剂的洗脱液水洗脱液 (A) 减压浓缩至小体积, 过 Sephdex LH-20 凝胶柱色谱, 甲醇 - 水 (1 1) 等度洗脱, 得到色素层和黄酮层, 黄酮层减压浓缩至小体积, 过 ODS, 甲醇 - 水 ( ) 梯度洗脱, 合并相同组分, 反复过 ODS 进一步纯化, 重结晶, 分离得化合物 1(88.2 mg) 2(16.3 mg) 3(125.6 mg) 4(98.1 mg) 5(24.9 mg) 同样的,10% 乙醇洗脱液 (B) 过 Sephdex LH-20 凝胶柱色谱和反复过 ODS, 分离得化合物 6(36.5 mg) 7(16.8 mg) 8(14.3 mg),30% 乙醇洗脱液 (C) 分离得化合物 9(12.0 mg) 10(8.3 mg) 醋酸乙酯萃取层, 回收醋酸乙酯, 加水, 超声, 80 水浴加热溶解, 过 D-101 大孔吸附树脂, 依次用水 30% 乙醇洗脱, 收集 30% 乙醇洗脱液, 回收乙醇, 过 Sephdex LH-20 凝胶柱色谱, 甲醇 - 水 ( 1 1) 洗脱, 得色素层和药液层 (E), E 部位回收甲醇, 过 ODS, 甲醇 - 水 ( ) 梯度洗脱, 合并相同组分, 反复过 ODS 进一步纯化, 得化合物 11(20.1 mg) 12(10.6 mg) 3 结构鉴定化合物 1: 淡黄色粉末三氯化铁反应呈阳性, 提示有酚羟基, 薄层色谱, 喷 10% AlCl 3 乙醇溶液, 365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 可能为黄酮 UV λ (nm): 271, 334 ESI-MS m/z: 593 [M-H], 473 [M-H-120], 503 [M-H-90] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), 8.03 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2, 6 ), 6.92 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5 ), 6.81 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [4], 故鉴定化合物 1 为新西兰牡荆苷 II 化合物 2: 淡黄色粉末, 常温下可在水中析出

3 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 22 期 2014 年 11 月 3221 絮状沉淀三氯化铁反应呈阳性, 提示有酚羟基, 薄层色谱, 喷 10% AlCl 3 乙醇溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄 (nm): 271, 334 ESI-MS m/z: 563 [M-H], 473 [M-H- 90], 443 [M - H - 120] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), 7.96 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2, 6 ), 6.96 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3, 5 ), 6.79 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [4], 故鉴定化合物 2 为新西兰牡荆苷 III 化合物 3: 黄色粉末, 溶于热水, 三氯化铁反应呈阳性, 提示有酚氢基, 聚酰胺薄层, 喷 10% AlCl 3 乙醇溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄 (nm): 271, 336 ESI-MS m/z: 563 [M-H], 503 [M-H-60], 473 [M-H-90], 443 [M-H-120] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), 8.03 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, 6 ), 6.90 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5 ), δ 6.81 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [5], 故鉴定化合物 3 为异夏佛塔苷化合物 4: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄 (nm): 271, 336 ESI-MS m/z: 563 [M-H], 503 [M-H-60], 473 [M-H-90], 443 [M-H-120] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), 8.11 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, 6 ), 6.91 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5 ), 6.82 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [4-5], 故鉴定化合物 4 为夏佛塔苷化合物 5: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄表 1 化合物 1~9 的 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据 (nm): 268, 336 ESI-MS m/z: 431 [M- Table 1 13 C-NMR data of aglycone moieties in compounds 1 9 (125 MHz, DMSO-d 6 ) 碳位

4 3222 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 22 期 2014 年 11 月 H], 373 [M-H-60], 341 [M-H-90], 311 [M- H-120] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), (1H, s, 7-OH), (1H, s, 4 -OH), 6.79 (1H, s, H-6), 8.03 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2, 6 ), 6.90 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5 ), 6.28 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [6], 故鉴定化合物 5 为牡荆苷化合物 6: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 可能为黄 (nm): 271, 335 ESI-MS m/z: 533 [M- H], 443 [M-H+90], 383 [M-H-90-60] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, OH-5), 8.15 (2H, brs, H-2, 6 ), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3, 5 ), 6.78 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [4], 故鉴定化合物 6 为芹菜素 -6, 8- 二 -C-α-L- 吡喃阿拉伯糖苷化合物 7: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 可能为黄 (nm): 268, 337 ESI-MS m/z: 445 [M- H], 361, 300, 269, 255, H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, 5-OH), 6.85 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-2, 6 ), 6.91 (2H, d, J = 8.2 Hz, H-3, 5 ), 7.89 (2H, d, J = 2.1 Hz, H-6, 8), 6.42 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [7], 故鉴定化合物 7 为芹菜素 -7-O- 葡萄糖醛酸苷化合物 8: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄 (nm): 271, 335 ESI-MS: m/z 533 [M- H], 443 [M-H-90], 383 [M-H-90-60] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, OH-5), (1H, s, H-4 ), (1H, s, H-7), 8.30 (2H, brs, H-2, 6 ), 6.88 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3, 5 ), 6.84 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [8], 故鉴定化合物 8 为芹菜素 -6-C-β-L- 吡喃阿拉伯糖 -8-C- α-l- 吡喃阿拉伯糖苷化合物 9: 黄色粉末, 三氯化铁反应呈阳性, 溶液,365 nm 紫外灯下检查, 亮黄色斑点, 推测为黄酮 UV λ (nm): 271, 337 ESI-MS m/z: 533 [M-H], 473 [M-H-60], 443 [M-H-90] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: (1H, s, OH-5), 8.15 (2H, brs, H-2, 6 ), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3, 5 ), 6.78 (1H, s, H-3) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) 数据见表 1 上述数据与文献报道基本一致 [4], 故鉴定化合物 9 为芹菜素 -6-C-β-D- 木糖 -8-C-α-L- 阿拉伯糖苷化合物 10: 白色针晶 ( 甲醇 ), 浓硫酸 - 香草醛显紫红色 UV λ (nm): 323 ESI-MS m/z: 179 [M- H], 163 [M - OH], 145, 135 [M - COOH] 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 7.49 (1H, J = 15.8 Hz, H-7), 7.02 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 6.23 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8) 以上数据 UV 及 HPLC 图谱与咖啡酸对照品比较基本一致, 故鉴定化合物 10 为咖啡酸化合物 11: 黄色油状物,TLC 对 5% 三氯化铁显蓝黑色 UV λ (nm): 329 UV 及 HPLC 图谱与迷迭香酸对照品一致, 故鉴定化合物 11 为迷迭香酸化合物 12: 黄色粉末, 盐酸镁粉反应显阳性, Molish 反应阳性 UV λ (nm): 255, 359 UV 及 HPLC 图谱与芦丁对照品比较一致, 故鉴定化合物 12 为芦丁 4 抗肿瘤活性测定 HepG2 细胞使用 RPMI 1640 完全培养基培养, 10% 胎牛血清,1% 抗生素 ( U/mL 青霉素 U/mL 链霉素 ), 在含 5% CO 2 孵箱中于 37 培养细胞生长至 80% 时传代, 使细胞保持在对数生长期取化合物 1~12 用 RPMI 1640 完全培养液配制成储备液 MTT 用 PBS 液配成 5 mg/ml 的母液, 于 4 避光保存将消化计数的单细胞悬液加入 96 孔板中, 细胞浓度为个 /ml, 每孔加入单细胞悬液 100 μl, 每组设 6 个复孔培养 24 h 后弃去培养液, 分别加入 200 μl 下述各培养液 :RPMI 1640 培养液 ( 阴性对照 ); 不同浓度的化合物培养液 ( 终浓度分别为 μmol/l) 给药 48 h 后, 弃去培养液, 每孔加入 100 μl 的 MTT 液, 继续培养 4 h 后弃去上清, 加入 DMSO 后震荡, 在酶标仪 (Molecular Devices 公司,Spoctra Max190 型 )490 nm 波长处读取吸光度 (A) 值重复实验 3 次, 按公式计算各

5 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 22 期 2014 年 11 月 3223 组的生长抑制率 (IR,IR=1-A 药物组 /A 对照组 ) 用 SPSS 20.0 软件计算 IC 50 值 5 结果及讨论狭基线纹香茶菜水提液具有抗炎保肝及抑制 HepG2 细胞增殖作用, 黄酮类及酚酸类均具有较强的抗炎活性本实验从传统中医药水煎提液出发, 分离水溶性单体成分, 并首次研究狭基线纹香茶菜水溶性单体成分体外对肿瘤细胞 HepG2 增殖的抑制作用结果显示化合物对 HepG2 有较强的增殖抑制作用,IC 50 分别为 (2.14±0.40) ( 1.55± 0.47) (1.49±0.49)μmol/L, 见图 1 抑制率 / % 浓度 / (μmol L 1 ) 图 1 水溶性单体化合物对 HepG2 细胞增殖的抑制作用 ( x ±s, n = 6) Fig. 1 Inhibitory effect of tested water-soluble compounds on proliferation of HepG2 cells ( x ±s, n = 6) 本实验通过对狭基线纹香茶菜水溶性成分分析, 发现其水溶性成分以水溶性黄酮苷和酚酸类为主, 尤其是水溶性黄酮碳苷类成分较多近年来, 溪黄草资源的开发与利用越来越引起人们的重视狭基线纹香茶菜水溶性总黄酮和总酚酸类有待进一步的药理药效研究本实验揭示了狭基线纹香茶菜水溶性化学成分, 为抗肿瘤抗炎保肝等天然药物的开发及溪黄草资源的开发利用提供了新的线索参考文献 [1] 广东省中药材标准 [S] [2] 廖雪珍, 廖惠芳, 叶木荣, 等. 线纹香茶菜狭基线纹香茶菜溪黄草水提物抗炎保肝作用初步研究 [J]. 中药材, 1996, 19(7): [3] 侯少贞, 梁颖敏, 张洁, 等. 狭基线纹香茶菜保肝利胆的实验研究 [J]. 中药新药与临床药理, 2010, 21(6): [4] Lin Y, Kong L. Sudies on the chemical constituents of Desmodium styracifolium (Osbeck) Merr [J]. Asian J Trad Med, 2006, 1(1): [5] Chen X, Nigel C V, Peter J H, et al. Flavone C-Glycosides from Viola yedoensis Makino [J]. Chem Pharm Bull, 2003, 51(10): [6] Hu Y M, Ye W C, Li Q, et al. C-glycosylflavones from Stellaria media [J]. Chin J Nat Med, 2006, 4(6): [7] 孙嘏. 撑篙竹竹叶化学成分及其生物活性的研究 [D]. 北京 : 中国林业科学研究院, [8] Dou H, Zhou Y, Chen C X, et al. Chenmical constituents of the aerial parts of Schnabelia tetradonta [J]. J Nat Prod, 2002, 65(12):

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Microsoft Word - 4期中文目次.doc 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷第 4 期 2014 年 2 月 509 UPLC-MS/MS 法快速检测减肥类保健品中 13 种非法添加化学成分朱健, 裘一婧, 沈国芳杭州市食品药品检验研究院, 浙江杭州 310017 摘要 : 目的建立保