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埋林
5 years ago
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1 43 综述牙龈卟啉单胞菌菌体表面毒力因子及其致病性研究进展张宇, 艾丽思综述, 林莉审校文章编号 : (2015) 中图分类号 :R78 文献标志码 :A 摘要 : 牙周炎是以牙槽骨吸收和牙周袋形成为主要病理改变和临床体征的慢性感染性疾病, 菌斑微生物是其主要的始动因子大量研究证实, 牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis,p.gingivalis) 是各种牙周炎, 尤其是慢性牙周炎最主要的病原菌本文主要对 P.gingivalis 外膜的致病结构及其理化特征做一综述, 以期对牙周炎的治疗防治及相关疫苗研发有所裨益关键词 : 牙周炎 ; 牙龈卟啉单胞菌 ; 外膜 ; 毒力因子 Research progress in thallus surface virulence factors and pathogenesis of Porphyromonas gingivalis. ZHANG Yu,AI Li-si,LIN Li. Department of Periodontology,Hospital of Stomatology,China Medical University, Shenyang ,China Abstract:Alveolar resorption and periodontal pocket formation are the main pathologic change and clinical sign of peri odontitis,which is a chronic infectious disease. Dental plaque is the main pathogenic factor. Multiple researches have proved that Porphyromonas gingivalis(p.gingivalis)is the main pathogenic bacteria of a variety of periodontitis,especial ly the chronic periodontitis. This article describes the structure and physiochemical characteristics of outer membrane protein of P.gingivalis,in order to be helpful to the prevention and treatment of periodontitis and the vaccine research and development. Keywords:periodontitis;Porphyromonas gingivalis;outer membrane;virulence factors 牙周炎是一种慢性感染性疾病, 可导致牙龈炎症牙周袋形成牙槽骨吸收和牙齿脱落牙周炎的始动因子是堆积在牙面和龈沟内的菌斑微生物, 它们可引起牙龈的肿胀和炎症, 从而使局部微生态环境更有利于一些厌氧致病菌滋生, 形成致病性较强的生物膜其中, 牙龈卟啉单胞菌 (Por phyromonas gingivalis,p.gingivalis) 是牙周炎发生的主要致病因子, 属于产黑色素的革兰阴性专性厌氧短杆菌, 有菌毛但无芽孢, 可引起牙周支持组织破坏和炎症性反应通过对其致病性的研究发现,P.gingivalis 具有一系列逃避宿主防御机制 DOI: /kq 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ); 沈阳市科技计划项目 (F ) 作者单位 : 中国医科大学附属口腔医院牙周科, 沈阳通讯作者 : 林莉, 电子信箱 :linli_74k@yahoo.com.cn 和破坏宿主的能力, 其通过附着于宿主组织细胞抵抗宿主先天性免疫系统分泌大量的毒力因子而导致牙周组织的破坏近年来, 随着研究不断深入,P.gingivalis 的外膜结构也随之逐渐清晰研究表明, 这些外膜结构对细菌的侵袭力黏附力毒力生物膜形成激发或逃避宿主免疫能力 [1] 等会造成严重的影响研究 P.gingivalis 菌体表面致病因子及功能对牙周炎的诊断疗效判断和疾病预防等方面有着重要的意义 P.gingivalis 表面结构的毒力因子包括菌毛 (fimbriae) 脂多糖 (li popolysaccharide,lps) 外膜蛋白 (outer membrane protein,omp) 红细胞凝集素 (hemagglutinin, HA) 蛋白酶 ( 牙龈素,gingipains) 被膜纤毛多糖荚膜毒性代谢产物外膜膜泡短链脂肪酸 [2] 等其中, 菌毛 LPS OMP HA 牙龈素为 P.gin givalis 表面最重要的致病因子

2 44 Chinese Journal of Practical Stomatology Jan Vol. 8 No. 1 1 菌毛目前对于菌毛的研究已相当深入, 其在细菌致病过程中的重要作用已被公认菌毛与 P. gingivalis 的毒力和致病性密切相关菌毛位于 P. gingivalis 的表面, 并伸向细胞外, 是 P.gingivalis 表面卷曲的丝状蛋白附属器, 同时也是 P.gingivalis 的重要致病因子菌毛的作用大致可分为以下 5 个方面 :(1) 介导 P.gingivalis 黏附或定植于微生物或宿主组织表面 ;(2) 协助 P.gingivalis 侵袭牙周上皮细胞和结缔组织 ;(3) 与其他细菌共聚 ;(4) 促进破骨细胞的分化和成熟 ;(5) 刺激内皮细胞产生炎性细胞因子如白细胞介素 -1(interleukin-1, IL-1) 白细胞介素 -6(interleukin-6,IL-6) 白细胞介素 -8(interleukin-8,IL-8) 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor-α,tnf-α) 和集落刺激因子 (colony stmulating factor,csf) [3] 胸腺因子等, 进而诱导牙槽骨吸收或导致炎症反应 Umemoto [4] 等构建了不能表达菌毛的 P.gingivalis 突变株, 结果发现, 其对人口腔上皮 KB 细胞的黏附性和侵袭性均有所降低, 接种小鼠后引起牙槽骨丧失量减少, 从而说明菌毛在 P.gingivalis 与宿主组织细胞之间的相互黏附过程中起了关键作用其中, 菌毛的主要亚单位菌毛蛋白 (fim brilline,fima) 是 P.gingivalis 表面的抗原成分, 具有良好的免疫反应性, 可使 P.gingivalis 黏附并侵入牙龈上皮细胞在介导细菌的黏附入侵以及 LPS 的刺激效应中发挥重要作用有研究显示, FimA 可被纯化重组, 纯化重组后的 FimA 能刺激机体产生保护性的抗体 [5] 有实验证实, 用 FimA 免疫大鼠后, 能产生针对 P.gingivalis 的免疫保护 [6] 作用,Evans 等通过使用高度纯化的 43 ku FimA 免疫 P.gingivalis 感染的无菌大鼠, 从而能够保护和对抗大鼠的牙周破坏 ; 而使用高度纯化的 75 ku 细胞表面成分却没有提供保护作用该结果提示, 菌毛可作为防治牙周炎构建牙周疫苗的有效抗原根据 P.gingivalis 菌毛蛋白编码基因 FimA 的核苷酸序列差异, 将 FimA 基因分为 5 型 (Ⅰ ~ Ⅴ 型 ) 其中, 牙周健康者龈下菌斑中 P.gingivalis 以 FimA Ⅰ 型为主 ; 中重度牙周炎和慢性牙周炎的病变部位以 FimA Ⅱ 和 FimA Ⅳ 型感染为主郭永华 [7] 等研究分析不同 FimA 基因型 P.gingivalis 在慢性牙周炎患者中的分布状况, 在大部分受检者的龈下菌斑中只检测出 1 种 FimA 基因型菌株 ; 而在各 FimA 基因型的总检出率中,FimA Ⅱ 和 FimA Ⅳ 基因型检出率最高, 分别为 43.8% 和 40.4% 从而推断,FimA Ⅱ 型菌株比其他基因型菌株对上皮细胞的黏附和侵袭能力更强因此, 以 FimA 作为抗原进行研究时, 需要考虑到各菌株间的个体差异与区别 2 LPS LPS 位于 P.gingivalis 细胞壁的最外层, 是细胞壁外膜的主要成分 [8] 由多糖 O 抗原脂质 A 和核心多糖构成, 被认为是最重要的毒力因子之一 [9] 其致病机制为 LPS 可激活牙周组织中的多种靶细胞, 如免疫反应细胞 ( 巨噬细胞和淋巴细胞 ) 具有防御作用的中性粒细胞牙周细胞的肢体细胞 ( 成纤维细胞 ) 成骨细胞破骨细胞等 [10] ; 刺激巨噬细胞合成并分泌多种细胞因子和炎症介质, 最具代表性的有 TNF-α IL-1β IL-6 IL-8 [11] 这些细胞因子与炎症介质对牙周组织有很高的毒性和抗原性, 可导致组织损伤和破坏, 在牙周炎的发生发展过程中起重要作用其中,TNF-α 可导致牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收 ;IL-6 可抑制成骨细胞碱性磷酸酶的活性及胶原和非胶原蛋白的合成, 刺激破骨细胞前体细胞分化成熟 ;IL-8 可参与局部的炎症反应和牙周组织的破坏, 其表达水平与牙周炎的严重程度密切相关, 被认为是炎症应答与免疫调节的激活剂所以,IL-8 在中性粒细胞的激活及聚集中起重要作用,IL-8 的过表达会导致慢性炎症组织的破坏 [12], 其表达量反映了慢性牙周炎的严重程度,IL-8 浓度越低, 牙周状况越健康由此推断, 降低 IL-8 的表达量可能是治疗牙周炎的有效途径之一 LPS 具有与细菌内毒素相似的化学组成和毒性, 可与巨噬细胞内皮细胞等多种效应细胞膜上相应受体结合并作用 [13] 已有研究表明,LPS 是最强的巨噬细胞激活因子, 其与巨噬细胞膜表面受体相结合是巨噬细胞激活并发挥生物学功能的第一步 ; 然后启动胞内信号转导途径, 引起核因子 κb

3 45 (NF-κB) P38 有丝分裂原蛋白激酶 (MAPK) 活化, 启动基因转录, 最终促进多种细胞因子和炎症介质的表达和释放, 发挥相应的生物学效应 [14] 目前, 已在巨噬细胞表面发现多种膜蛋白分子, 如 CD14 Toll- 样受体 (toll-like receptor,tlr) 清道夫受体 (scavenger receptor,sr) 和 β2- 整合素等, 这些分子被称为模式识别受体 (pattern recognition receptors,prr), 最早由 Janeway [15] 提出这些受体相互协同或相互竞争传导 LPS 信号, 既决定着巨噬细胞对 LPS 的识别和反应, 也决定着机体对 LPS 炎症反应的调控, 是巨噬细胞发挥生物学作用的始动环节 [16] 因此,LPS 被认为是牙周炎症的重要病因之一, 在牙周病的发生发展过程中起重要作用 3 OMP P.gingivalis 的外膜是细菌与外环境间的一种物理和化学屏障, 具有运输选择通透性合成和分泌的功能 OMP 为其主要成分,50% 以上由蛋白组成, 且种类较多 OMP 作为菌体表面的主要成分, 暴露于细菌细胞表面, 带有多种抗原表位, 参与细菌的黏附和聚集, 易与宿主免疫系统接触, 可诱发机体的免疫应答, 且在序列结构上非常保守, 因此很有可能作为牙周病免疫疫苗的候选抗 [17] [18] 原李昂等利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选不同菌株共同的 OMP, 认为 OMP 可作为牙周病新型有效疫苗的靶抗原免疫疫苗 OMP 是由 rag 位点的两个主要基因 raga 和 ragb 编码, 即一种 TonB 依赖外膜受体 RagA 和一种具有免疫原性的外膜蛋白 RagB [19] Zhang [20] 等实验证明, 在鼠动物模型上,40 ku OMP 抗体能够阻止 P.gingivalis 的定植, 并可显著减少因感染 P.gingivalis 引起的牙槽骨丧失这种复杂的 OMP 结构及其分布显示 P.gingivalis 各菌株有独特的生物学特性, 对细菌在宿主体内的生存能力和独立变化都有明显影响因此, 我们可以探索寻找 P.gingivalis OMP 的致病性蛋白, 为牙周炎免疫防治奠定基础 P.gingivalis 的外膜蛋白 A(P.gingivalis outer membrane protein A,PgmA) 基因 ( 过去称之为 ORF5) 存在于细菌染色体基因组 DNA 中, 在所有已被检测的 P.gingivalis 菌株中均存在, 是较为保守的与菌毛相关的 OMP 基因 PgmA 位于菌毛主要亚单位结构基因 FimA 的上游, 全长 1473 bp, 序列相对保守, 编码分子质量约 60 ku, 与菌毛形成有关 [21] PgmA 也可能是 P.gingivalis 的气孔通道, 与细菌同外界的物质和能量交换有关 Hong [22] 等研究发现,PgmA 破坏的 P.gingivalis 变异菌株产生菌毛少而稀疏, 其红细胞凝集反应的滴度不及正常菌株的 1/10 从而推断, 若 PgmA 基因缺失, 则菌毛蛋白合成受阻因此, 了解其结构从而设计针对 P.gingivalis 的细菌疫苗对牙周炎进行免疫治疗, 可在牙周炎防治方面发挥积极的作用 4 HA HA 又称血凝素, 是一类能与糖基结合并导致红细胞凝集的蛋白质 HA 蛋白有 3 个功能 :(1) 与细胞表面病毒特异性受体结合 ;(2) 介导病毒外膜与细胞内膜融合释放病毒进入胞浆 ;(3) 刺激机体产生中和性抗体由于 HA 能黏附于红细胞使红细胞发生凝集作用, 所以被高度怀疑参与了 P. [23] gingivalis 黏附和入侵过程 Shibata 等已证实, HA 在 P.gingivalis 黏附宿主组织中起重要作用, 并能够凝集裂解红细胞以获取 P.gingivalis 生长必须的亚铁血红素 P.gingivalis 的高致病性菌株之一是 Pg381, 其 HA 基因是目前 P.gingivalis 中惟一的序列已被完 [24] [25] 全确认的一组基因宋红等通过对红细胞凝集素 A(hemagglutinin A,HagA) 在黏附和入侵过程中的功能检测发现,HagA 参与了细菌黏附和入侵细胞过程, 从而推断 HagA 也许是导致细胞感染的 [26] 重要蛋白之一 Abiko 等纯化了 HagA 中相对分子质量为的血凝素蛋白, 并利用转基因小鼠产生人单克隆抗体这种抗体对相对分子质量为的血凝素蛋白有高度特异性和亲和力, 能显著抑制 P.gingivalis 的血细胞凝集作用和囊泡 [27], 因此可能在牙周病的被动免疫中起作用 5 牙龈素牙龈素最初称为胰酶样蛋白酶 (trypsin-like, TLP), 又称卟啉素 (porphypains), 是 P.gingivalis 产生的胞外蛋白酶, 已被证实是半胱氨酸蛋白酶, 能

4 46 Chinese Journal of Practical Stomatology Jan Vol. 8 No. 1 降解蛋白质和多肽底物, 有助于细菌摄取营养, 清除炎症因子牙龈素为存在于细菌的外膜膜泡或胞外的一组蛋白酶, 是 P.gingivalis 重要的致病因子之一, 可通过大量的蛋白水解活动侵袭破坏 [28] 宿主组织近年来, 许多学者试图通过寻找牙龈素抑制剂, 来探索牙周病治疗的新方法有学者通过亲和层析及质谱分析的方法, 发现在大米 [29] 蛋白组分中存在这些半胱氨酸蛋白酶抑制剂这表明大米蛋白可能在牙周疾病的治疗和预防过程中起到营养保健的作用, 从而对牙龈素的研究又深入了一层牙龈素包括精氨酸牙龈素 (arginine gin gipains,rgp) 和赖氨酸牙龈素 (lysine gingipain, kgp) rgp 产生的毒素可吞入细胞周围物质 rgp 由 rgpa 和 rgpb 两个基因编码, 二者基因结构相似,rgpA 比 rgpb 基因相对保守 ;rgpb 可破坏宿主细胞基质, 使宿主免疫调节失衡, 增强血管通透性, [30] 促进炎症发展, 导致牙槽骨吸收 kgp 的相对分子质量为 , 结构与 rgpa 相似, 由前肽区蛋白酶区和黏附区组成 (rgpb 无黏附区 ) 研究表明,rgpA rgpb 和 kgp 能够直接参与牙周组织的破坏并使 P.gingivalis 逃避宿主的免疫防御机制, 在 [31] P.gingivalis 致病过程中起重要作用 6 小结 P.gingivalis 是目前公认的牙周致病菌, 同时也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一近年来, 随着基因遗传工程微生物学分子免疫学分子生物学的发展, 已对 P.gingivalis 外膜结构进行了深入研究, 涉及到临床和基础的许多方面, 方法也在不断更新我们可以通过对 P.gingivalis 外膜结构的毒力因子进行重组提取分离鉴定等, 分析其毒力因子的致病性, 从而为牙周病的预防和治疗方法的改进开辟新途径参考文献 [1] 张玉杰, 郭杨, 张瑾, 等. 多重 PCR 技术用于检测牙龈卟啉单胞菌致病岛 rag 基因的研究 [J].,2011,4 (9): [2] Bostanci N,Belibasakis GN. Porphyromonas gingivalis:an inva sive and evasive opportunistic oral pathogen[j]. FEMS Microbi ol Lett,2012,333(1):1-9. [3] Ogawa T,Uchida H,Hamada S. Porphyromonas gingivalis fimbri ae and their synthetic peptides induce proinflammatory cytokines in human peripheral blood monocyte cultures[j]. FEMS Micro biol Lett,1994,116(2): [4] Umemoto T,Hamada N. Characterization of biologically active cell surface components of a periodontal pathogen:the roles of major and minor fimbriae of Porphyromonas gingivalis [J]. J Periodontol,2003,74(1): [5] Fan Q,Sims T,Sojar H,et al. Fimbriae of Porphyromonas gingi valis induce opsonic antibodies that significantly enhance phago cytosis and killing by human polymorphonuclear leukocytes[j]. Oral Microbiol Immunol,2001,16(3): [6] Evans RT,Klausen B,Sojar HT,et al. Immunization with Porphy romonas(bacteroides)gingivalis fimbriae protects against peri odontal destruction[j]. Infect Immun,1992,60(7): [7] 郭永华, 吴亚菲, 刘天佳, 等. 不同 FimA 基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布 [J]. 华西口腔医学杂志,2005, 23(2): [8] Jenkinson HF,Dymock D. The microbiology of periodontal dis ease[j]. Dent Update,1999,269(5): [9] Tonetti MS. Molecular factors associated with compartmentaliza tion of gingival immune responses and transepithelial neutrophil migration[j]. J Periodontal Res,1997,32(1): [10] 陈云芳. 牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导不同细胞分泌炎性因子的差异 [D]. 杭州 : 浙江大学,2007. [11] Paik YH,Schwabe RF,Bataller R,et al. Toll-like receptor 4 mediates inflammatory signalling by bacterial lipopolysaccha ride in human hepatic stellate cells[j]. Hepatology,2003,37: [12] Mahanonda R,Sa-Ard-Iam N,Montreekachon P,et al. IL-8 and IDO expression by human gingival fibroblasts via TLRs[J]. J Immunol,2007,178(2): [13] Bainbridge BW,Darveau RP. Porphyromonas gingival is lipo polysaccharide:an unusual pattern recognition receptor ligand for the innate host defense system[j]. Acta Odontol Scand, 2001,59(3): [14] 吴春芳. 牙周致病菌 Pg-LPS 对组织特异性单核 / 巨噬细胞膜表面受体表达影响的研究 [D]. 福州 : 福建医科大学,2011. [15] Janeway CA. The immune system evolved to discriminate infec tious nonself from noninfectious self [J]. Immunol Today, 1992,13(1): [16] 丁宁, 姜勇. 巨噬细胞 LPS 相关模式识别受体的研究进展 [J]. 中国病理生理杂志,2008,24(8): [17] Imai M,Murakami Y,Nagano K,et al. Major outer membrane proteins from Porphyromonas gingivalis:strain variation,distri bution,and clinical significance in periradicular lesions [J]. Eur J Oral Sci,2005,113(5):

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7 北京大学学报医学版 # +94* 4 ' % 论著!! "# $ #% %"&!%'!! $ "( )& * $ +,-.)/ ) 01 " * ). " 2")3 )01 ( /" 433% /1 " 0 "51 " -.)/$ 6',)") 4.))%) 0

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