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园坍经
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1 CRISPR/Cas9 在基因治疗中的应用研究进展黄佳杞黄秦特章国卫摘要常间回文重复序列丛集 / 常间回文重复序列丛集关联蛋白 9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)/(crispr-associated proteins 9,Cas 9) 改造的第 3 代人工核酸内切酶, 因其简单高效等优点, 已成为一种热门的基因编辑工具近年来一些研究成功应用 CRISPR /Cas 9 系统在体内外进行相关疾病基因的靶向修饰, 为基因编辑技术在临床的应用奠定了基础, 但其脱靶效应导入方式编辑效率等仍需改进本文将对 CRISPR/Cas9 在基因治疗中的应用进展作一综述关键词 CRISPR/Cas9 基因治疗应用研究精确的基因编辑可以通过敲除内源性的致病基因或插入新的保护基因以永久性地改变基因而起到治疗疾病的作用常间回文重复序列丛集 / 常间回文重复序列丛集关联蛋白 9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)/(crispr-associated pro 原 teins 9,Cas 9) 作为第 3 代基因组编辑工具, 与第 1 代锌指核糖核酸酶 (ZFN) 和第 2 代转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 相比,CRISPR/Cas 9 具有更易于操作编辑效率更高更容易得到纯合子突变体且可以在不同的位点同时引入多个突变等显著优势因此,CRISPR/ Cas 9 得到了广泛的关注和应用目前 CRISPR/Cas 9 在基因治疗中的应用研究主要集中于单基因遗传病病毒感染和肿瘤等疾病本文对 CRISPR/Cas9 在基因治疗中的应用研究进展综述如下 1 CRISPR/Cas9 工作原理 CRISPR/Cas 系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统, 通过序列特异的 RNA 介导, 切割降解外源性 DNA, 这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒 CRISPR/Cas 系统可分为 3 种类型, 其中类型域 CRISPR/Cas 系统由于其组成简单, 被改造成为荫综述基因组靶向编辑的工具类型域 CRISPR/Cas 系统只需要 Cas9 蛋白 crrna(crispr RNA) tracrrna(trans- doi: /j.issn 基金项目 : 国家自然科学基金面上项目 ( ); 浙江省自然科学基金一般项目 (LY17H080004) 作者单位 : 杭州师范大学医学院通信作者 : 章国卫, gzhang@hznu.edu.cn activating crrna) RNase 芋 4 种成分即可发挥作用 CRISPR 能够转录产生前体 crrna(pre-crrna), 与此同时 tracrrna 也转录出来,tracrRNA 结合 pre-crrna 并且激发 Cas9 和双链 RNA 特异性 RNase 芋核酸酶对 pre-crrna 进行加工, 产生成熟的 crrna,crrna 的 5 忆端区域能够与靶位点互补配对, 而其 3 忆端能够与 tracr 原 RNA 及 Cas9 蛋白形成复合物, 从而引导 Cas9 蛋白结合于靶位点进行特异性地切割 [1] 通过人工设计 crrna 与 tracrrna, 可以改造形成具有引导作用的 sgrna (short guide RNA),Cas9 内切酶在 sgrna 分子的引导下对特定位点的 DNA 进行切割, 形成双链 DNA 缺口, 然后细胞会借助同源重组机制 (HDR) 或者非同源末端 [2] 连接机制 (NHEJ) 对断裂的 DNA 进行修复不仅如此, Cas9 还要识别靶基因区长 2~5 个碱基的 PAM 序列, 这个短的 DNA 序列通常在靶 DNA 的 3 忆末端发现, 在 Cas9 的识别和切割中发挥重要作用, 同时也作为自我 [3] 识别系统防止 sgrna 本身被当作靶位点 2 CRISPR/Cas9 系统在单基因遗传病基因治疗中的应用对单基因遗传病的治疗是基因治疗研究中最主要的研究领域目前,CRISPR/Cas9 技术在杜氏肌营养不良综合征 (duchenne muscular dystrophy,dmd) 囊性纤维化地中海贫血血友病和酪氨酸血症等疾病的治疗研究中获得了显著的进展 2.1 DMD DMD 是一种 X 染色体隐性遗传疾病, 主要由编码抗肌萎缩蛋白 (Dystrophin) 的基因突变所致, 抗肌萎缩蛋白是一个细胞骨架蛋白, 负责在骨骼肌细胞的肌动蛋白和细胞外基质之间建立连接抗肌萎缩蛋白的缺失使肌肉细胞易受损伤, 导致患者肌肉退化与病变 1494

2 近年来已有多项研究将 CRISPR/Cas9 技术应用于 DMD 的治疗德克萨斯大学西南医学中心 Olson 实验室使用 CRISPR/Cas9 成功矫正了 DMD 小鼠模型中的抗肌萎缩蛋白基因他们以受精卵显微注射的方式将针对突变基因的 sgrna Cas9 mrna 和提供同源修复片段的单链寡核苷酸 DNA 共注入 DMD 小鼠受精卵中, 在新生的嵌合体小鼠中抗肌萎缩蛋白基因的矫正率可达到 2%~ [4] 100%, 小鼠的肌肉生理功能得到显著改善在另一项研究中, 杜克大学 Gersbach 实验室针对抗肌萎缩蛋白基因的突变热点第 45~55 外显子设计单个或多个 sgr 原 NA, 利用 Cas9 引进碱基插入或缺失, 成功地矫正了突变位点的蛋白阅读框, 纠正了 DMD 患者成肌细胞中的 DMD 基因突变, 基因编辑后的成肌细胞可以在体外及 [5] 体内条件下表达正常的抗肌萎缩蛋白在此基础上, 哈佛大学杜克大学和德克萨斯大学 3 家科研机构的研究团队同时成功地应用 CRISPR/Cas9 对 DMD 小鼠进行了体内基因编辑他们均以腺相关病毒为载体运载 CRISPR/Cas9 部件进入小鼠体内, 在治疗后小鼠中观察到了小鼠肌肉细胞膜上重新出现抗肌萎缩蛋白, 证实了治疗后小鼠肌肉力量的增加, 并且证实在全身治疗中, 包括心肌在内的全身各肌肉均见到抗肌萎缩蛋白重新表达 [6-8] 腺相关病毒已成功地应用于人体临床试验中, 是基因治疗中最成熟的病毒载体以上在 DMD 小鼠模型体内进行基因编辑研究为进一步将该技术应用于人体治疗奠定了基础, 可以预期该项技术将很快有望进入临床试验阶段 2.2 囊性纤维化囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传性疾病, 其突变基因是 CFTR 基因, 其中 90% 的基因突变集中于该基因第 11 外显子的 F508 缺失荷兰皇家科学院 Hubrecht 研究所的 Schwank 等 [9] 针对 CFTR 基因的 F508 缺失突变分别设计了靶向第 11 外显子和 11 内含子的 sgrna, 将这两个 sgrna 各自和编码野生型 CFTR 序列的同源重组供体 DNA 共转染患者肠干细胞, 可成功地矫正 F508 缺失对含有矫正后 CFTR 基因的细胞进行筛选扩增, 证明了这些细胞恢复了野生型细胞的功能这项研究表明了对囊性纤维化患者干细胞进行靶向编辑的可行性, 但是由于囊性纤维化涉及身体多处器官, 因此要实现对患者的治疗还需进一步发展对多脏器基因治疗的方法 2.3 茁地中海贫血茁地中海贫血是一种最常见的单基因遗传病, 是因血红蛋白茁 - 球蛋白 (HBB) 基因突变导致的一类贫血症目前唯一的治愈方法是进行造血干细胞移植, 然而组织相容造血干细胞的缺乏使许多患者难以获得有效治疗患者来源的诱导多功能干细胞 (ipscs) 分化产生的造血干细胞可为移植提供可靠的细胞资源, 若能将患者来源的 ipscs 进行突变基因矫正, 然后分化成为造血干细胞则可回输至患者体内发挥治疗作用不同的研究小组成功尝试了这种治疗途径美国简悦威实验室将茁地中海贫血患者来源的成纤维细胞诱导分化成 ipscs, 然后针对 HBB 基因突变位点设计了 CRISPR/Cas9 载体和同源重组 DNA 模板, 两者共转染患者 ipscs, 经筛选获得了 HBB 基因修复后的 ipscs 结果显示, 经基因修正后的细胞核型正常, 在向造血细胞分化的过程中, 可以高比例的生成各类造血祖细胞, 并恢复茁 - 球蛋白的表达 [10] 国内高绍荣实验室也成功地获得了茁地中海贫血患者来源的 ipscs, 并以 CRISPR/ Cas9 修正了细胞中的突变 [11] 2.4 血友病血友病是一种遗传性出血性疾病, 是因缺乏凝血因子导致的凝血障碍性疾病, 主要分为 A 和 B 两型, 分别由缺乏凝血因子峪和御导致临床上对血友病的治疗主要使用替代疗法, 即通过输注重组合成或从血浆中提取纯化的凝血因子以恢复患者血浆中的凝血因子水平达到治疗效果 [12] 替代疗法可以有效地治疗和防止急性出血, 可是仍然不能防止关节损伤的发生, 除非在儿童期即开始预防性治疗但是由于预防性治疗的高昂费用, 绝大多数血友病患者仍没有接受规范治疗基因治疗是有可能彻底治愈该疾病的唯一方法, CRISPR/Cas9 技术也被应用于血友病的基因治疗中 [13] Park 等通过 CRISPR/Cas9 技术对血友病 A 患者体细胞来源的 ipscs 中的凝血因子峪基因进行修正, 经过修正的 ipscs 分化成为可以表达凝血因子峪的成熟内皮细胞, 移植到血友病 A 小鼠体内后, 小鼠开始产生凝血 [14] 因子峪, 有效地抑制了出血症状 Guan 等分别通过注射裸露 DNA 和腺病毒载体的方式, 利用 CRISPR/Cas9 系统修正了血友病 B 小鼠肝脏细胞中 F9 基因的一个点突变, 部分恢复了小鼠的凝血功能, 证明了可直接通过对肝细胞的基因修复达到治疗目的但其基因修复效率仍然过低, 且凝血功能的改善还需进一步提高最近, Wilson 实验室采用腺相关病毒双载体系统成功地将金黄色葡萄球菌 Cas9 (SaCas9) sgrna 和 F9 基因 cdna 导入血友病 B 小鼠肝脏中, 矫正了突变的小鼠 F9 基因 [15] 并成功表达凝血因子御, 恢复了小鼠凝血功能 2.5 玉型酪氨酸血症玉型酪氨酸血症是由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶的失活致使酪氨酸代谢障碍而导致 [16] 的遗传性疾病最近 Yin 等成功地在玉型酪氨酸血症小鼠模型上实现了以 CRISPR/Cas9 技术进行该疾病的 1495

3 基因治疗他们以脂质纳米颗粒包裹运载 Cas9 mrna, 以腺相关病毒运载 sgrna 和修复 DNA, 在 6% 肝脏细胞中实现了突变基因的原位矫正, 治疗小鼠体重得到显著改善这项研究以脂质纳米颗粒直接包裹 Cas9 mrna 达到了 Cas9 在肝细胞中高效表达的目的, 同时避免了由于 Cas9 基因过大而难以在腺相关病毒中包装的问题这种脂质纳米颗粒和腺相关病毒联合介导 CRISPR/Cas9 的基因组编辑功能是靶向肝细胞基因治疗的一种有效手段 2.6 重症联合免疫缺陷 (SCID) Janus 家族激酶 JAK3 基因突变可导致 SCID,JAK3 的缺陷可表现为 T 细胞和 [17] NK 细胞的缺失,B 细胞数量正常但功能低下 Chang 等通过 SCID 患者来源的 ipsc 和 T 细胞体外分化系统证实, 在 JAK3 缺失情况下, 早期 T 细胞的发育受到阻碍随后, 他们通过 CRISPR/Cas9 矫正了 JAK3 突变, 并以矫正后的 ipsc 分化产生了具备生理功能的 NK 细胞和 T 细胞该项研究为 SCID 的基因治疗提出了新的方法, 可为 SCID 的治疗提供更安全的基因治疗策略 3 CRISPR/Cas9 系统在病毒感染类疾病治疗中的应用 CRISPR/Cas9 作为一种新的基因组编辑技术也为诸多病毒感染疾病的治疗提供了新的手段利用 CRISPR/Cas9 的靶向切割特性设计病毒 DNA 特异的 sgrna 以引导该核酸酶直接靶向清除细胞内的病毒是一条极具吸引力的治疗路线目前已有多项研究在实验室中证明了 CRISPR/Cas9 对病毒感染治疗的可能性 3.1 人乳头瘤病毒 (HPV) HPV 是宫颈癌的高风险诱发因子,Kennedy 等 [18] 针对 HPV 中的两个癌基因 E6 和 E7 设计了靶向 sgrna 和 CRISPR/Cas9 系统, 可有效作用于宫颈癌细胞中的 HPV 并杀死癌细胞此外, 相同的策略也可成功靶向切割 Burkitt 淋巴瘤细胞中的 EB 病毒基因组和细胞株中的人多瘤病毒, 均达到了抑制病毒复制的效果 [19-20] 3.2 艾滋病病毒 (HIV) HIV 通过逆转录成为双链 DNA 后整合到宿主细胞基因组中以原病毒形式长期潜伏, 难以清除通过设计针对 HIV-1 序列特异的 sgrna 使 CRISPR/Cas9 直接靶向作用于 HIV-1 病毒序列, 可直接 [21-23] 清除插入细胞基因组中的 HIV-1 原病毒, 并可同时清除存在于细胞质中的 HIV-1 病毒 DNA [23], 更使细胞 [22] 形成对 HIV-1 的免疫 CCR5 蛋白是人免疫缺陷病毒 (HIV) 入侵淋巴细胞的关键辅助受体,CCR5 基因发生 32bp 的删除 (CCR5 吟 32), 可使细胞形成对 HIV-1 感 [24] 染的抗性 Ye 等用 CRISPR/Cas9 技术对正常人诱导多能干细胞 (hipscs) 进行了 CCR5 吟 32 突变, 结果显示, 33% 的细胞发生了 CCR5 双等位基因的定向突变, 在将突变后的 hipscs 诱导分化为单核 / 巨噬细胞后, 这些细胞显示出对 HIV 感染的抗性此外, 将病毒激活蛋白与失去核酸酶活性的 Cas9 形成融合蛋白能够靶向识别的并且激活存在于细胞内的 HIV-1 原病毒, 结合高效抗逆转录病毒疗法 (HAART) 或可最终实现对 HIV-1 的彻底清除 [25] 3.3 乙型肝炎病毒 (HBV) HBV 在宿主细胞中可形成共价闭合环状 DNA, 这给抗病毒治疗带来困难, 但可成为 CRISPR/Cas9 的理想作用靶点有研究组通过小鼠尾静脉注射 HBV 表达载体质粒构建慢性 HBV 感染小鼠, 然后将靶向 HBV 基因组的 Cas9-sgRNA 质粒共注射到小鼠尾静脉, 检测发现小鼠血清表面抗原水平较对照组明显降低 [26] 有研究者设计了靶向 HBV 表面抗原 DNA 区域的 Cas9/gRNA 系统, 在体外实验和 HBV 转基因小鼠模型中都证明了可以有效地造成靶向位点的突变, 抑制病毒基因的复制与表达 [21] 这些研究初步探索了 CRISPR/Cas9 对 HBV 治疗的方法并证明了其可行性 4 CRISPR/Cas9 系统在肿瘤基因治疗中的应用 CRISPR/Cas9 首先在肿瘤模型的建立中得到了成功应用肿瘤模型的建立是研究肿瘤发生发展的机制和探索治疗方法的前提肿瘤通常伴随多基因突变, 传统的方式很难构建多基因共同突变的疾病模型, CRISPR/Cas9 可用来进行体内的多基因突变肿瘤模型的构建, 从而更好地模拟复杂的人类疾病如在一项对 [27] 肺腺癌的研究中,Platt 等采用 CRISPR-Cas9 系统实现了 Kras p53 Lkb1 基因在小鼠体内的共同突变, 最终 [28] 使小鼠体内出现肺腺癌的病理变化此外,Heckl 等构建了一个同时表达 Cas9 蛋白和多种 sgrna 的慢病毒表达载体, 成功地将多达 5 种 sgrna 和 Cas9 共同递送入单个小鼠造血干细胞中, 同时对 5 个靶基因进行编辑, 导致细胞的克隆化与恶性改变运用此技术, 研究中成功地在小鼠中制备出了多基因突变的急性粒细胞白血病模型更多的研究进一步证明了 CRISPR/Cas9 系统可 [29] 用于制备多种肿瘤模型不难预期如果以 CRISPR/Cas9 靶向修饰细胞内肿瘤相关基因则可能起到治疗肿瘤的作用, 体外研究也证 [30] 明了 CRISPR/Cas9 可有效抑制肿瘤细胞的生长但在体内情况下, 由于 CRISPR/Cas9 基因转移的效率仍然很低, 很难实现对大量肿瘤细胞的有效靶向清除, 因此这种策略的临床应用可行性不高目前情况下以 CRISPR/ 1496

4 Cas9 结合肿瘤免疫治疗是一种较为可行的肿瘤基因方法肿瘤免疫治疗在最近获得了巨大的突破, 通过基因工程改造的 T 细胞拥有了靶向肿瘤细胞的杀伤能力, 展现出了令人振奋的治疗效果以靶向 CD19 的嵌合抗原受体基因改造的 T 细胞成功地使 30 例急性淋巴细胞白 [31] 血病患者中的 27 例得到了完全缓解通过基因组编辑技术对 T 细胞进行精确的基因改造将可进一步提高嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法 (CAR-T) 的治疗效果和安全性, 而 CRISPR/Cas9 表现出了对 T 细胞更高效的基因修饰功能, 有可能对 T 细胞进行多重基因改造以满 [32] 足临床治疗的复杂需要程序性死亡分子 1(PD1) 是存在于活化的 T 细胞 B 细胞和 NK 细胞表面的膜蛋白,PD1 有两个配体,PDL1 和 PDL2 许多肿瘤细胞表面可表达 PDL1 和 PDL2, PDL1 和 PDL2 与 PD1 的结合可抑制 T 细胞对肿瘤细胞的免疫作用, 使肿瘤细胞逃避免疫系统的清除阻断 PD1 与其配体的作用可恢复 T 细胞对肿瘤细胞的免疫 [33-34] 作用, 这一点在 PD1 抗体的应用中已得到证实而采用 CRISPR/Cas9 靶向敲除 T 细胞中的 PD1 基因后, 可恢复 T 细胞对黑色素瘤细胞株的杀伤作用, 表明这可能是一种肿瘤基因治疗的有效方式, 为 CRISPR/Cas9 靶向基因改造 T 细胞进行肿瘤治疗提供了新的途径 [35] 5 CRISPR/Cas9 系统在其他疾病基因治疗中的应用 CRISPR/Cas9 技术的建立也为其他疾病的治疗提供了新的思路例如研究发现 PCSK9(proproteincon 原 vertasesubtilisin/kexin type 9) 基因编码的 PCSK9 蛋白被肝细胞分泌到血浆中, 作为低密度脂蛋白受体 (LDLR) 拮抗物, 它可以限制低密度脂蛋白的摄取, 从而增加血浆中 LDL-C 的水平 PCSK9 的失活或功能抑制可使血中 LDL-C 水平下降, 降低心血管疾病风险因此 PCSK9 成了新型降胆固醇药物研发的重要靶点 Ding 等 [36] 用腺病毒载体将靶向 PCSK9 的 sgrna 和 CRISPR/ Cas9 导入小鼠肝脏细胞中, 成功地实现了对 PCSK9 的靶向编辑, 编辑效率可达 50% 以上 PCSK9 表达水平显著下降,LDL-C 水平降低 35%~40% 该项技术为临床高胆固醇血症的治疗提供了新的基因治疗方法, 该方 [36] 法有望实现对疾病的长期预防和治疗效果此外, CRISPR/Cas9 也展现出了对耳聋及眼部疾病基因治疗 [37-39] 的应用价值 6 CRISPR/Cas9 系统的临床应用前景和展望 CRISPR/Cas9 技术自问世以来, 以其强大的基因编辑功能和易于操作的优点迅速成为了分子生物学研究的前沿领域, 极大地促进了生物医学研究的发展同时, 也在最短的时间内走出实验室迈向临床四川大学华西医院肿瘤学家卢铀领导的团队成为了最先开展 CRISPR/Cas9 临床试验的科学家, 他们将开展一项针对 [40] 非小细胞肺癌的临床治疗研究该治疗方案通过提取患者外周血的 T 淋巴细胞, 在体外以 CRISPR/Cas9 对其中的程序性死亡基因 PD-1 进行敲除, 然后将细胞回输患者体内以恢复其抗肿瘤能力该团队已于 2016 年 10 月对第 1 例患者实施了治疗来自北京大学的研究团队也将采用相同的策略开展对膀胱癌前列腺癌和肾细胞癌的临床试验在未来, 成熟的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术将为精准医疗和个体化医疗服务, 应用前景广阔但 CRISPR/Cas9 技术若要完全进入临床治疗仍然需要解决一些重要问题, 如仍需提高 Cas9 编辑基因的效率建立 Cas9 基因安全高效的导入方式增强编辑的基因特异性和避免脱靶效应等, 最终实现安全地将这项颠覆性的技术真正服务于患者 7 参考文献 [1] Deltcheva E, Chylinski K, SharmaC M, et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J]. Nature, 2011, 471(7340): [2] Cong L, Ran FA, CoxD, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[j]. Science, 2013, 339(6121): [3] Hsu PD, Lander ES,Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[j]. Cell, 2014, 157(6): [4] Long C, McAnally JR, Shelton JM, et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA[J]. Science, 2014, 345(6201): [5] Ousterout DG, Kabadi AM, Thakore PI, et al. Multiplex CRISPR/ Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy[j]. Nature communications, 2015, 6:6244. [6] Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells[j]. Science, 2016, 351(6271): [7] Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, et al. In vivo genome editing improves muscle function in amouse model of Duchenne muscular dystrophy[j]. Science, 2016, 351(6271): [8] Long C, Amoasii L, Mireault AA, et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy[j]. Science, 2016, 351(6271): [9] Schwank G, Koo BK, Sasselli V, et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients[j]. Cellstem cell, 2013, 13(6):

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未命名-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ss a c y e vg 13 14 15 16 17 18 19 H 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 发现生命的螺旋克里克在提出中心法则时曾指出遗传信息是沿ＤＮＡ - ＲＮＡ - 蛋白质的方向流动的遗传信息不可能从ＲＮＡ回到ＤＮ