8 海外检验医学 ; 年 月第 卷第 期 5*' 5* ; < # ) 究发现 78 - 与冠心病有显著相关性 但 与冠心病无相关性 除了基因多态性 大量的环境因素如吸烟 致动脉粥样硬化饮食 多酚类物质和酒精等也会影响对氧磷酶的活性 从而可能改变大血管疾病的进程 我们假设更高的对氧磷酶活性可能与冠脉

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1 8 论著 不同种族年轻健康人群对氧磷酶基因型及其活性的相关因子 青年人冠状动脉危险因素进展 -4 的研究! " #" $%& '!% # "! $%& % #( )% 5!"# ( 5$%$&, 5'$! $ $ ($%$# 5)!! * + # 5$ %$,,$# 5! -!# 55 背景 5 对氧磷酶可以减轻氧化损伤 进而降低大血管疾病的风险 方法 5 对 名青年人冠状动脉危险因素进展 - 0 '# 6 $ # -4 受试者 ) 样本进行!*) 基因的 和 78 - 多态性分型 并测定其血清中对氧磷酶的活性 结果 58-9,: ' 8 9: 和 ; : ' ( ;: 等位基因在黑人中比白人常见 78 - 基因位点与对氧磷酶活性强相关 8 -- 基因型比 8 77 基因型高, # # 以 78 - 校正后 基因位点 和 相差 9 ## 和种族 黑人和白人相差 ## 均与对氧磷酶活性相关 ) 同样 胆固醇浓度 最高和最低五分位相差 ( 8 ## 甘油三脂 浓度 最高和最低五分位相差 ## 胆固醇浓度 最高和最低五分位相差 ; ## 吸烟状况 现在吸烟 支 和不吸烟者相差 ( ## 以及最高五分位血糖浓度 无糖尿病的受试者最高和最低五分位相差 ## 都与对氧磷酶活性相关 对氧磷酶活性与冠状动脉钙化 # 心血管疾病早期标志 发生或其 年内的进展不存在横向及纵向相关性 结论 5 心血管疾病的发病早期 对氧磷酶可能不起重要作用 但是与脂质和葡萄糖的相关性提示对氧磷酶可能对大血管疾病的发生起调节作用或者是由其引发 55 对氧磷酶是一种高密度脂蛋白微粒相关的酯酶 最初发现它能够水解有机磷酸盐 包括对氧磷杀虫剂等 后期研究表明对氧磷酶参与了心血管疾!" # $ #% " # &' # ' # $ #" % " #! # #" &' # ( ) &' * # * # ) +, ' - # $ %.- # $ % " # /0 1 &' /.%# ) " # " " ' # $ #" &' % " #! # #" ( % " % % % ( # ),, 1, (.#2 3 病的发生., 实验研究表明 对氧磷酶可以抑制有机磷酸盐和氧化脂质的有害作用 因此 除了参与胆固醇逆向转运 高密度脂蛋白微粒可能通过诸如对氧磷酶等蛋白质的作用阻止 的氧化作用 对氧磷酶家族!*)!*)!*)( 定位于人类 9 号染色体长臂 个编码区基因多态性 位密码子位点蛋氨酸取代亮氨酸 8 位密码子位点精氨酸取代谷氨酸和 个启动子区多态性 如!*) 基因中的. ; 以及!*) 基因编码区 个常见基因多态性 其中 78 - 与 基因多态性与对氧磷的水解作用强相关 (9; 与 8 - 等位基因频率黑人高于白种人 8 而中国人 等位基因频率最高 近期一项荟萃分析研

2 8 海外检验医学 ; 年 月第 卷第 期 5*' 5* ; < # ) 究发现 78 - 与冠心病有显著相关性 但 与冠心病无相关性 除了基因多态性 大量的环境因素如吸烟 致动脉粥样硬化饮食 多酚类物质和酒精等也会影响对氧磷酶的活性 从而可能改变大血管疾病的进程 我们假设更高的对氧磷酶活性可能与冠脉钙化 的存在和进展相关 因而高对氧磷酶活性也可能与早期亚临床心血管疾病的病理有关 我们在前瞻性 -4 队列研究及其补充研究 青年人抗氧化物质的纵向变化趋势 6 $ # $ # 6 中验证这种假设 我们也评估了对氧磷酶活性及它的 个编码区多态性与心血管疾病危险因子的相关性 材料与方法一 受试者 -4 研究在 8; 8; 年期间共入选 = 名黑人或白人男性和女性 年龄在 ; =( 岁之间 在种族 性别 受教育程度 高中及以下和高中以上 和年龄 ; =, 岁和 =( 岁 上均作了平衡 这些人员来自 >$" "$ 4 # ) 和 *0# 随访检查分别在 8;9 8;; 年 第 年 回访率 8 :88 88 年 第 年 ; :88 88( 年 第 9 年 ;: 年 第 年 98: 年 第 年 9,: 年 第 年 9 : 进行 收集数据包括血压 循环脂质 身高和体重 吸烟 饮酒 饮食 运动方式 心理变化 医疗及家族史 实验室检查 以身高和体重计算体重指数 > 4 0$ 另外 在随访第 和第 年采用 检查亚临床动脉粥样硬化疾病 的检查在 *0# 和 "$ 采用电子束断层描扫 > 技术 在 >$" 和 # 运用多层螺旋断层扫描 技术 放射科医生利用特定的 可鉴定钙化点的图像处理软件检查冠状动脉的进展 用 次扫描的平均 $ 积分计算出每位个体的总钙分 第 年 $# > #- " 4.& # 第 年 4$ /0 1 &' > # /.%# ) 每次扫描设置保证至少一个非零分结果 在所有零分的扫描检测结果中再随机抽取 份 由没有 $ 积分相关知识的专家仔细复核 以证实是否存在冠脉钙化 ( 为了进一步增加对于 进展判读的可信性 对于在第 年或第 年发现的冠脉钙化检测结果 同样全部进行再次的复核 同时也在相应的检测时间段选取 例无钙化的检测结果进行复核 在第 年和 年 检测对氧磷酶活性的随访者都进行了 扫描 另外 在第 年对 989 名受试者进行了单核苷酸多态性 %)! 检测 6 是 -4 的一项补充研究 始于 88 年 对 -4 在第 9 和 年采集的血清或血浆样本进行生物化学分析 包括 个!*) 基因多态性分析和对第 年收集标本的对氧磷酶活性分析 采集禁食过夜的血样本 收集血清和 抗凝血浆 整个处理过程在 8 内完成 9? 保存 用! ) 抽提试剂盒 % 提取第 年采集的血液中的 ) 9? 保存 第 年随访的 ( 9 名受试者中 名同时检测!*) 的基因型和对氧磷酶活性 除非特殊说明 所有检测都在明里苏达大学的分子流行病学和生物标志研究实验室 # # # $ > 0- " >- 完成 其中 名由于存在肾功能损害的可能 女性血清肌酐浓度 $ 男性 $ 被剔除,9 名由于接受糖尿病药物治疗 也被剔除 进一步排除其他可能的协同变异因素后 (9 名受试者入选本研究的分析 其中白人占 8: 男性,9: 女性 (: 和黑人占,: 男性, : 女性 ;: 二!*) 基因型检测运用! -.' 检测 个常见的!*) 编码区基因多态性 78 - 和 ;,,! - 采用的引物!*) - 混悬液含 #) $ # 9 # )! $ # # A # B 聚合酶 # 的引物 总量为 #! - 反应条件 变性 8,? 个循环扩增 8,? (? ( 9? ( 延伸 9? 9 蒸馏水 倍稀释! - 产物为模板用于 # 4' 基因多态性在? 孵育 后获得 而 78 - 基因多态性在? 孵育 后获得 三 质量控制

3 89 C 重复性 在, 个随机选择 盲法重新检测基因型的标本中 重复性为 8 : 78 - 为 : C 准确性 先前已用! -.-1! 方法鉴定基因型的 ( 个质控样本与每个样本同时测定 当所有质控样本检测为正确的基因型 样本结果才被接受 (C 生物化学测定 测定对氧磷酶活性方法同 1 # $ 等所述 稍做调整 简要概括如下 将 # 血清与 9; # 检测缓冲液 ( #. ; ( # # 混匀 (9? 孵育 加入 # # 新鲜配制的对氧磷酸底物液 分光光度计在, (9? 连续监测吸光度 在 ( 时开始检测读数 以后每分钟检测 次至 ; 用于计算活性的摩尔吸光系数为 ; A ( 单位的对氧磷酶活性定义为本检测环境中每分钟形成的 # 的. 硝基酚 # # 定期分析质控样本 每研究 个样本之后 的含量以确保其测定值在已建立均值的 个标准差范围之内 血浆采集 周之内 用酶法测定了 的含量 9 检测由华盛顿大学西北脂质研究实验室 %#/ 完成 用硫酸葡聚糖 氯化镁沉淀 ; 脂蛋白后测定, $ 的受 8 试者血浆 运用 1+# 等式计算 用!# 罗氏诊断系统 己糖激酶化学分析法测定血糖 血清 反应蛋白 -! 运用高敏感性 4% 方法测定 在佛蒙特大学病理科完成,,; 个盲法重复测定样本中 和 -! 的重测相关性为 8; = 88 在随访第 年和第 9 年测定类胡萝卜素 第 年和第 年测定抗坏血酸 在第 年采用基于 % 的方法测定血浆游离 1. 前列腺素 ( 四 数据分析使用单机版 % % 软件 8 版本完成所有数据分析 我们对 和 78 - 的基因多态性进行基因型频率列表 并运用 检验确定. / $ 平衡的种族特异性离散程度 运用 # '+ 评估 个基因多态性之间的连锁不平衡, 依托! % ' 软件辅助 利用 个 %)! 模拟单倍体的存在形式 分别分析 年和 年 的情况 第 年 1. 前列腺素和脂质浓度正态分布 而葡萄糖和 -! 浓度偏态分布 第 年 1. 前列腺素以及经对数转换的第 年的 -! 浓度均采用连续性统计描述 第 年的空腹血脂浓度 和第 年的葡萄糖浓度采用五分位数描述分析 第 年时的吸烟状态分为, 种 从不吸烟 既往吸烟 现在吸烟 支 现在吸烟 支 主要考虑到某些 天吸 包烟者掩饰的可能 在校正了种族 年龄 性别和临床中心之后 我们采用线性回归模型结合个人的基因型以确定 和 78 - 与对氧磷酶活性的相关性 另外 在调整了上述潜在混杂因素之后 我们运用线性回归评估对氧磷酶活性与第 年吸烟状态 空腹血脂 -!1. 前列腺素和葡萄糖的横向关联 在校正了种族 年龄 性别和临床中心之后 非条件 $ 回归被用来分析第 年和 年 的存在与第 年对氧磷酶活性及 与 78 - 基因多态性的相关性 结果第 年进行研究项目录入时 入选者平均年龄为 岁 黑人中吸烟者占 : 白人中吸烟者占 :) 表 黑人 -! 浓度 收缩压 舒张压和 > 4 显著高于白人 而白人 和 比黑人明显增高 ) ( 而空腹血糖浓度 前列腺素浓度 等无明显种族差异 一!*) 基因型和对氧磷酶活性白人与黑人两种!*) 基因多态性频率均有差异 ) 表 与白人相比 黑人中 等位基因少见而 8 - 等位基因常见 除了白人 78 - 基因型 个基因多态性均符合. / $ 平衡 )D 和 78 - 基因多态性存在弱的连锁不平衡 黑人 D ( ) 白人 D 8) 尽管在某些种族和基因型亚型中数值相对偏大 对氧磷酶活性的分布仍是正态的 其数值为 8( ; ( ## 均值 % 和 78 - 与对氧磷酶活性呈显著且独立的相关 均值 77, ## ' --, # # ## ' ( # # 两者均 )!*) 单倍体与对氧磷酶活性的相关性相似于 78 - 基因多态性新发现的情况 数据未给出 对 78 - 基因多态性进行校正后 表 ( 基因多态性中对氧磷酶活性的均值差异大大减小 ; # # ' 8; 9 # # ) 在未用 个基因多态

4 8; 海外检验医学 ; 年 月第 卷第 期 5*' 5* ; < # ) 性校正时 对氧磷酶活性黑人为 ## 白人为 9 ## 校正后 两者对氧磷酶活性差异显著缩小 黑人 89 # # ' 白人 8 ## ) 表 ( 二 对氧磷酶活性!*) 基因多态性和 随访第 年和第 年时 分别在 和 (8 名受试者中发现 $ 分 在第 年时 白人患 的比率明显高于黑人 : ' 9 : )D, 表 种族差异持续至第 年 白人 8 ;: ' 黑人, : 表, 随访第 年和 年时都接受 检查的 989 名受试者中 除少部分受试者以外 绝大部分受试者维持稳定状态或 进展至 $ 评分更高 具体来说, ;; 9: 名受试者在 年和 年的检查中没有明显的 8: 的受试者在 年时初次发现 ;: 的受试者 年里 加重 仅 : 受试者 $ 评分下降 甚至 消失 表, 第 年和 年 $ 评分中位数 & 范围 ; = 9 ' 9& 范围 = 均比较低 表明 -4 受试者处于动脉粥样硬化症的早期阶段 无论!*) 基因多态性还是 年时对氧磷酶活性都与 年和 年 无关 表!*) 单倍体也与 年和 年 无关 数据未给出 另外 第 年时对氧磷酶活性也与此后 年内 的进展 定义为 $ 分增加 & 无关 对氧

5 88 磷酶活性增加 ( # # 优势比为 ; &. 9 = )D 不同种族之间 上述对氧磷酶活性和!*) 基因多态性 第 年或 年 发生也无明显相关性 三 对氧磷酶活性!*) 基因多态性及其他心血管疾病的主要危险因子在校正了种族 年龄 性别 临床中心及 78 - 基因多态性后 空腹血糖和脂质浓度与对氧磷酶活性显著相关 第 年时 空腹血糖浓 度位于最高五分位内的受试者与位于第, 个五分位内受试者相比 其对氧磷酶活性升高 8; ; # # ' 8 ( # # ) D C 表 而在较低的, 个五分位中 受试者对氧磷酶活性水平无区别 ) 即便是剔除了未治疗的糖尿病患者 D, 他们的对氧磷酶活性为 88 ; ## 之后 这种相关性也没有变化 对氧磷酶活性在最高的 五分位比最低

6 海外检验医学 ; 年 月第 卷第 期 5*' 5* ; < # ) 五分位显著增高 且 78 - 与 有交互作用 在!*) 78 - 基因多态性的每个水平上 最高的 五分位内受试者对氧磷酶活性均显著高 于最低 五分位内受试者 在 8 -- 基因型中差别最大 ) 表 9 对 浓度校正之后 在 和 浓度最高的五分位 对氧磷酶活性也比他们最低五分位的显著增高 最低和最高 五分位 ;9, ## ' # # ) 最低和最高 五分位 ;8 # # ' 89 9 # # )D ( 表 对 以及它与对氧磷酶基因型的交互作用进行校正后发现 在评价对氧磷酶活性时 对氧磷酶基因型与 或 均没有交互作用 与现在吸烟 支 或以前吸烟者或从未吸烟者相比 目前吸烟 支 受试者的对氧磷酶活性显著降低 ;9 8 ## ' 8 # # 8 ( # # 8, ## )D 表 相反 对氧磷酶活性与其他心血管疾病的危险因子无关 包括第 年时的 -! 浓度 饮酒 > 4

7 体力活动等 数据未给出 而且 对氧磷酶活性与 年时类胡萝卜素 < 患者及 1. 前列腺素浓度也没有关联 数据未给出 在糖尿病病人和第 年 年时出现 患者中评估对氧磷酶活性与其他因素相关性时 其结论与前述无疾病个体中研究结果类似 数据未给出 无论 还是 78 -!*) 基因多态性都与心血管疾病的危险因子无关 这些危险因子包括 年时的类胡萝卜素浓度 > 4 脂质 葡萄糖 -! 1. 前列腺素和 < 数据未给出 讨论本研究中 78 - 基因多态性与对氧磷酶活性强相关 和种族差异则与对氧磷酶活性弱相关 对氧磷酶活性和!*) 基因多态性均与冠状动脉钙化. 早期的心血管疾病标志. 无关 对氧磷酶活性和!*) 基因多态性也与机体氧化应激标记物血浆 1. 前列腺素浓度 心血管疾病的危险因子 > 4 和 -! 浓度无相关性 然而 对氧磷酶活性与吸烟状态 升高的 的浓度以及最高五分位葡萄糖浓度都有相关 即便是在剔除了患糖尿病但尚未治疗的受试者以后 与其他研究结果类似 我们发现黑人 和 8 - 等位基因比白人更常见 9 两个种族中均发现 和 8 - 等位基因与对氧磷酶活性 对氧磷作为底物 相关 这与以往的研究结果一致 ; 基因多态性是目前已知的对氧磷酶活性最强的预示物 这项发现与先前的一项研究一致 该项研究表明 ;;: 不同个体间对氧磷酶活性变化可由, 个!*) 基因多态性来解释 而其中的 78 - 基因多态是导致变化的主要原因 ( 由于本研究表明 与 78 - 之间无高度相关性 且在校正了 78 - 基因多态性之后 与对氧磷酶活性的相关性显著减弱 这表明对于决定对氧磷酶活性水平 以对氧磷作为底物 78 - 基因多态性引起的对氧磷酶结构的变化可能比 基因多态性更为重要 黑人对氧磷酶活性比白人高 这与 8 - 和 等位基因 与对氧磷酶活性增加有关 在黑人中更为常见一致 然而 即便是在校正了 78 - 和 基因多态性之后 种族仍然是对氧磷酶活性的一个预示标志 据我们所知 这是对氧磷酶活性存在种族区别的首次研究报道 这项研究发现对氧磷酶活性与脂质浓度呈正相关 颗粒与对氧磷酶物理上的关联可能解释 了对氧磷酶活性与 颗粒的显著正相关性 最高和最低 五分位相差, ## 以及 78 - 基因型与 浓度在决定对氧磷酶的活性中重要的交互作用 这既与先前的研究结果一致 ( 也与心血管疾病危险增加时对氧磷酶活性下降的现象一致 致动脉粥样硬化的脂质成分 与对氧磷酶活性呈弱的正相关性 最高和最低 五分位相差 ## 这可能反映了对氧磷酶与其他因素也有关联 如 %- >!. 胆固醇转录因子 调控!*) 表达 (.(( 对氧磷酶活性和 最高和最低 五分位相差 ; ## 正相关性则提示对氧磷酶的酶由 参与转运 : (, 对氧磷酶活性水平和!*) 基因多态性与 或诸如 > 4 -!1. 前列腺素及循环系统中饮食来源的抗氧化物 随访第 年检测的抗坏血酸和第 9 年检测的类胡萝卜素 等其他心血管疾病的危险因素无关 这个发现与一项近期研究结果一致 该研究表明普通人群中 同型半胱氨酸浓度与对氧磷酶活性无相关性 ( 等心血管疾病的早期预测指标 可能并不能代表心血管疾病进展过程中发生的所有病理变化 在第 年我们检测了 (8 名受试者的 情况 不分种族 对氧磷酶活性和 发生的优势比为,; 以 D 为界值 其可能性为 ; : 如果将 78 - 与 两个!*) 基因多态性的杂合子和较小的纯合子变异体归为一类 与较大纯合子变异体比较 78 - 基因多态性与 发生或 基因多态性与 发生的优势比为,( 以 D 为界值 其可能性也为 ; : 这样 对氧磷酶活性 78 - 和 多态性与 低于,( 的中度相关性可能被掩盖了 本研究也首次发现 即使剔除了糖尿病患者以后 与其他较低五分位内葡萄糖浓度相比 高对氧磷酶活性与最高五分位葡萄糖浓度也显著相关 这个现象需要在其他人群中进一步证实 与我们设想一致的是低对氧磷酶活性与高氧化应激反应有关 目前吸烟 支 的人对氧磷酶活性比以前吸烟及不吸烟者活性更低 然而!*) 基因型和对氧磷酶活性与 1. 前列腺素 一种系统氧化标志 缺乏相关性却不支持我们的假设 有一种可能是当使用 1. 前列腺素作为衡量整体氧化应激指标时 对氧磷酶保护特定底物受到氧化应激损害的作用被掩盖了 使用对氧磷作为底物时 对氧磷酶酶活性和它的抗氧化作用相关性较差 可能解释了 1. 前列腺素和对氧磷酶

8 海外检验医学 ; 年 月第 卷第 期 5*' 5* ; < # ) 活性之间缺乏相关性的现象 然而 有些对氧磷酶活性与冠心病相关研究中也是用对氧磷作为其活性测定底物的 因此 尽管先前的研究表明 1. 前列腺素与 有关 但本项研究不能支持对氧磷酶在预报 和早期心血管疾病中的重要功能 对氧磷酶在加速或调节心血管疾病进程中的确切作用仍存在争议 -4 这项对健康年青人随访 年的研究 可理想地用于评价对氧磷酶在早期心血管疾病中致病机制中的作用 对 -4 队列进一步的随访 将为对氧磷酶活性与心血管危险因素纵向相关性提供有价值的信息 经费 资金支持 " + ) # $ ># 4 )..,;,9 )..,;,; )..,;,8 )..,; ) ( 6 财经说明 ) # 翻译 沈茜 第二军医大学附属长海医院检验科 审校 史红 参考文献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