荧光素酶及其相关应用

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1 荧光素酶及其相关应用 原平皓生物 2010 年 6 月 4 日

2 主要内容 一 生物发光的概念二 荧光素酶三 荧光素酶报告基因技术四 荧光素酶在 ATP 检测中的应用五 荧光素酶的其他应用六 相关检测仪器

3 一 生物发光的概念 荧光 需要激发光源 荧光物质受激发后发射光子 发光 生物发光 化学发光 自发光能量由反应提供

4 荧光 荧光检测需要激发光源 发射光的能量来源于激发光 荧光反应为瞬时反应 E = h ν

5 发光 发光反应无需激发光源 发射光的能量来源于化学反应 发光有一定的持续时间

6 二 荧光素酶 自然界中的荧光素酶萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶 Gaussia 荧光素酶

7 自然界中的荧光素酶 发光真菌发光海星发光节虫 发光鱼 发光甲虫 荧光素酶 (Luciferase) 是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称

8 萤火虫荧光素酶 荧光素 目前常用的萤火虫荧光素酶来源于北美萤火虫 (Photinus pyralis) 是一个 61kDa 的单体酶 无需表达后修饰, 直接具有完全酶活 反应需要底物荧光素以及 ATP O 2 Mg 2+ 等的参与

9 海肾荧光素酶 腔肠素 海肾荧光素酶来源于海肾 (Renilla reniformis) 是一个 36kDa 的单体酶 表达后无需修饰, 即可具有完全酶活 反应只需要腔肠素 (Coelenterazine) 和 O 2 参与

10 Gussia 荧光素酶 腔肠素 Gussia 荧光素酶来源于海洋桡脚类动物 Gaussia princeps 是一个 19.9kDa 的单体酶, 只有 185 个氨基酸 具有一个 16aa 的分泌性信号肽 可以被细胞分泌到细胞外 反应只需要腔肠素 (Coelenterazine) 和 O 2 参与

11 三种荧光素酶 类型荧光素酶大小波长底物 ATP 依赖可分泌 北美萤火虫 Photinus pyralis FLUC 550aa 562nm D- 荧光素 D-Luciferin 是 - 海肾 Renilla reniformis RLUC 311aa 480nm 腔肠素 Coelenterazines - - Gaussia princeps GLUC 185aa 480nm 腔肠素 Coelenterazines - 是

12 三 荧光素酶报告基因 1 报告基因分析 2 荧光素酶报告基因 3 单荧光素酶报告基因 4 双荧光素酶报告基因

13 1 报告基因分析 报告基因 (report gene) 是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因, 可通过报告基因产物的表达来 报告 目的基因的表达调控 常见的报告基因 : β- 半乳糖苷酶 (β-gal) 葡萄糖醛酸酶 (GUS) 绿色荧光蛋白 (GFP) 分泌型碱性磷酸酶 (SEAP) 药物刺激信号转导转录因子 荧光素酶 (LUC) 启动子报告基因 检测 蛋白 转录翻译

14 报告基因简单实验流程 构建包含有报告基因的质粒 报告基因 启动子 报告基因 将构建好的质粒转染细胞 提供相应的刺激 检测报告基因 数据分析

15 2 荧光素酶报告基因 荧光素酶作为报告基因的优势 : 内源性低, 哺乳动物无内源性表达 荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响 发光检测, 检测方便 灵敏度高,10-20 摩尔荧光素酶分子 检测范围广, 大于 7 个数量级 以荧光素酶基因 (LUC) 为报告基因

16 其它报告基因 报告基因优点缺点 β - 半乳糖苷酶 (β -gal) 葡萄糖醛酸酶 (GUS) 简单 灵敏度好 植物中内源活性低 细菌, 血清等内源活性高 90% 的 E.coli, 人 / 动物细胞中有内源活性 酶的扩散可引起 过度报告 分泌性碱性磷酸酶 (SEAP) 氯霉素转乙酰基酶 (CAT) 绿色荧光蛋白 (GFP) 分泌性报告基因 ( 不需裂解 ) 真核细胞没有背景表达 显微镜 : 亚细胞定位 不需要底物 在 HeLa, 肿瘤和其它细胞类型中有内源活性 放射性 操作复杂 线性范围窄 背景荧光较高

17 3 单荧光素酶报告基因 萤火虫荧光素酶报告基因 研究最早, 应用最广 反应需要 ATP 参与, 可用于 ATP 检测 海肾荧光素酶报告基因 反应无需 ATP 参与, 影响因素较少 常作为双荧光素酶的内参基因 Gaussia 荧光素酶报告基因 反应无需 ATP 参与, 影响因素较少 分泌型荧光素酶, 可直接检测上清而无需裂解细胞

18 4 双荧光素酶报告基因 使用萤火虫荧光素酶基因作为受调控的报告基因 使用海肾荧光素酶基因作为内对照 在细胞中同时转染以上两个质粒 消除因细胞的数目和状态 转染和裂解效率等造成的差别

19 双荧光素酶报告基因 实验载体 萤火虫荧光素酶 内对照载体 海肾荧光素酶 归一反应 = 实验的 ( 萤火虫荧光素酶 ) 对照的 ( 海肾荧光素酶 )

20 Promega 的双荧光素酶检测试剂盒 细胞 + 培养基 去除培养基 PBS 清洗细胞去除 PBS 裂解细胞 Stop & Glo 试剂 : 一秒钟内淬灭萤火虫荧光素酶发光反应 同时开始海肾荧光素酶发光反应 标准反应体积 :20ul - 100ul - 100ul

21 双荧光素酶报告基因优势 传统双报告基因 使用 -Gal GUS CAT LUC 等组合 报告基因的内源活性 检测灵敏度不同 检测方法不同 需要分别检测 双荧光素酶报告基因 使用两种荧光素酶基因 灵敏度高, 都无内源活性 检测范围宽, 都大于 7 个数量级 检测速度快, 样品无需孵育等预处理 可在一管内完成两个荧光素酶检测

22 荧光素酶在 ATP 检测中的应用 1 ATP 检测原理 2 应用 ATP 检测细胞增殖 3 应用 ATP 检测细胞毒性 4 应用 ATP 检测环境微生物

23 1 ATP 检测原理 三磷酸腺苷 (ATP) 存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中, 是细胞能量的直接来源 当萤火虫荧光素酶反应中其他反应物过量时,ATP 的量与发光值线性相关 ATP 含量, 直接反应了细胞或微生物的含量

24 ATP 检测流程 待测的细胞等 ATP 标准品 裂解释放 ATP 梯度稀释 混合 待测样品 检测工作液 萤火虫荧光素酶 荧光素 缓冲液 检测发光

25 2 应用 ATP 检测细胞增殖 应用 ATP 检测细胞增殖优点 步骤简单, 一步反应 节省时间, 无需长时间的孵育 灵敏度高, 可检测到 50 个细胞 线性范围宽 其他 ATP 检测试剂盒 : 威格拉斯 -ATP 发光检测试剂盒 碧云天 - ATP 检测试剂盒 中科靓马 - ATP 测定试剂盒 使用 Promega 的 Celltiter-Glo 检测细胞增殖

26 3 应用 ATP 检测细胞毒性 肿瘤坏死因子 α (TNFα ) 介导的 L929 细胞毒性反应 使用 CellTiter-Glo Assay 和 CellTiter 96 AQueous One 并行检测

27 4 应用 ATP 检测环境微生物 应用范围 : 食品中微生物残留 餐具洁净度 消毒效果 水中微生物含量等 2005 年卫生部发布 卫生监督机构建设指导意见, 规定省 市 县三级卫生监督机构必须配备 ATP 荧光检测仪, 用于食品卫生和医疗卫生的现场检测 应用 Promega 的 ENLITEN ATP Assay 检测环境微生物残留

28 荧光素酶的其他应用 1 原理 2 基于 ATP 的应用 3 基于荧光素的应用

29 1 原理 基于荧光素的应用 : Caspase-Glo Protease-Glo DPPIV-Glo P450-Glo MAO-Glo GSH-Glo Calpain-Glo 基于 ATP 的应用 : Kinase-Glo PGP-Glo PDE-Glo camp-glo MycoAlert Mycoplasma Detection Kit 注 : 多数检测需要纯化的酶, 部分可用于细胞环境检测

30 2 基于 ATP 的应用 以 camp 检测为例 : camp 活化蛋白激酶 A 活化的蛋白激酶 A 参与磷酸化反应, 消耗 ATP 残留的 ATP 参与发光反应 发光强度与 camp 呈负相关

31 基于 ATP 的应用 Kinase-Glo 用于激酶含量检测 激酶在细胞的信号转导及生命过程中起着至关重要的作用 PGP-Glo P- 糖蛋白 (p-gp) 是细胞耐药性的关键因素 PDE-Glo 磷酸二酯酶 (PDEs) 具有水解细胞内第二信使的作用 camp-glo 环腺苷酸 (camp) 被称为为细胞内的第二信使, 在细胞信号转导中起着重要作用 MycoAlert Mycoplasma Detection Kit 用于检测支原体含量 支原体污染是细胞培养中常见的污染

32 3 基于荧光素的应用 以 caspase 检测为例 : Caspase 酶与底物反应, 生成产物 Z-DEVD 和荧光素 荧光素参与发光反应 发光强度与 caspase 酶呈正相关

33 基于荧光素的应用 Caspase-Glo Caspase 酶是细胞凋亡的核心成分, 在细胞凋亡中起到重要作用 Protease-Glo 蛋白酶体 (Protaesome) 是一种存在于细胞质和细胞核内的具有多种蛋白水解功能的大分子复合物, 是抗肿瘤药物的新靶点之一 DPPIV-Glo 二肽酶 IV(DPPIV) 是一种丝氨酸蛋白酶, 负责降解肠降血糖素 -GLP1 P450-Glo 细胞色素 P450 是药物代谢的最重要的酶 MAO-Glo 单胺氧化酶 (MAO) 是一种膜结合线粒体酶, 在多巴胺氧化代谢中起重要作用 其与多种精神性疾病 ( 如帕金森症 ) 有着密切关系, 是多种新药的靶点 GSH-Glo 谷胱苷肽 (GSH) 具有抗氧化 清除自由基 解毒等功能, 是重要的功能因子 GSH 含量改变可能诱发氧化应激, 可能导致细胞凋亡或死亡 Calpain-Glo Calpain 是一组钙激活的半胱氨酸蛋白酶的统称, 在多种蛋白质降解中发挥作用 它能引起细胞骨架及结构蛋白降解, 导致神经元的迟发性死亡

34 总结 优势 荧光素酶检测灵敏度高 荧光素酶无内源表达 应用 作为报告基因用于多种功能检测 基于 ATP 可用于多种环境卫生检测 通过偶联可用于多种酶活性及药物活性检测

35 Modulus 单管型多功能检测仪 发光检测模块 模块切换 : 荧光检测模块 只需简单插拔 吸收光检测模块 微量适配器 ( 将荧光检测体积降低至 ul) 触摸屏操作

36 Modulus 微孔板型多功能检测仪 双自动进样系统 触摸屏操作 USB 数据输出 独立的检测模块 : 发光检测模块荧光检测模块吸收光检测模块 适应多种板型

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