中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Nov;28(11) 1603 (NaHS) 对大鼠急性心肌缺血后心肌细胞凋亡率 caspase 3 Bcl 2 和 Bax 蛋白表达的影响, 旨在进一步探讨 H 2 S 对缺血受损心肌的作用及其可能机制 1 材料与
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- 芝菜 富
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1 1602 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Nov;28(11):1602~7 网络出版时间 : :58 网络出版地址 :htp:// 硫化氢对急性缺血所致心肌细胞凋亡的影响 张建新, 丁艳艳, 李兰芳, 刘芳, 张勤增, 解丽君, 郝娜 ( 河北省医学科学院, 河北石家庄 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2012) 中国图书分类号 :R 332;R322 11;R329 25;R 摘要 : 目的观察 H 2 S 对急性缺血所致大鼠心肌细胞凋亡的影响 方法健康成年 SD 大鼠 (270±20)g, 随机分为 : 假手术组 缺血组 缺血 +NaHS 低 中 高剂量组 麻醉大鼠, 结扎左冠状动脉前降支,NaHS 低 中 高剂量组分别于缺血 3h 时腹腔注射 和 3 12mg kg -1 的 NaHS, 缺血组注射等容量的生理盐水, 假手术组只穿线不结扎 各组大鼠均于缺血 6h 时经颈总动脉取血迅速开胸取心脏, 流式细胞术检测心肌组织细胞凋亡率,Westernblot 法检测 caspase 3 蛋白的表达, 免疫组化法检测 Bcl 2 和 Bax 蛋白的表达,HE 染色观察心肌组织学变化 结果大鼠心肌缺血 6h 后, 心肌细胞凋亡率 caspase 3 和 Bax 表达阳性细胞数百分率明显升高,Bcl 2 表达阳性细胞数百分率降低 缺血 3h 治疗 3h 时,NaHS3 个剂量组大鼠心肌细胞凋亡率 caspase 3 和 Bax 表达阳性细胞数百分率明显低于缺血组,Bcl 2 蛋白表达 Bcl 2/Bax 比值高于缺血组 组织形态学变化显示, 假收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 河北省自然科学基金资助项目 (NoC ) 作者简介 : 张建新 (1952-), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 心脑血管药理学,Tel: ,Fax: ,E mail:zhangjx100@163.com 手术组大鼠心肌细胞排列整齐, 着色均匀, 缺血组大鼠心脏部分区域心肌纤维横纹不齐或消失, 核偏移甚至裂解消失, 有炎性因子渗出,NaHS3 个剂量组大鼠心肌细胞损伤程度较缺血组明显减轻 结论硫化氢对大鼠急性缺血心肌具有一定的保护作用, 上调 Bcl 2 的表达, 下调 Bax 表达, 抑制细胞凋亡可能是其重要保护作用机制 关键词 : 硫化氢 ; 急性心肌缺血 ; 细胞凋亡 ; 大鼠 ;Bcl 2;Bax 研究显示, 急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有细胞凋亡现象存在 [1] 细胞凋亡是按细胞的固有基因程序进行的一种生理现象, 不同于一般病理情况下的细胞死亡, 是机体为维护内环境的稳定, 通过基因调控和酶促反应进行的细胞程序化死亡 近些年来研究发现, 硫化氢 (hydrogensulfide, H 2 S) 在机体内发挥着广泛的生物学效应, 本研究室前期实验表明, 大鼠在急性心肌缺血过程中内源性 H 2 S 的含量明显下降, 心肌组织 CSE 活性明显降低, 线粒体功能受损, 给予 H 2 S 可明显减轻心肌缺血损伤, 改善心功能和线粒体功能, 从而有效保护缺血的心肌 [2-3] 但是其对缺血心肌细胞凋亡的影响尚未见报道 本实验观察了 H 2 S 供体 硫氢化钠
2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Nov;28(11) 1603 (NaHS) 对大鼠急性心肌缺血后心肌细胞凋亡率 caspase 3 Bcl 2 和 Bax 蛋白表达的影响, 旨在进一步探讨 H 2 S 对缺血受损心肌的作用及其可能机制 1 材料与方法 1.1 药物和试剂 NaHS 溴化乙啶 (ethidium bro mide,eb), 美国 Sigma 公司 考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所 兔抗活化型 caspase 3 单抗, 武汉博士德 鼠抗 Bcl 2 单抗 鼠抗 Bax 单抗 丙烯酰胺 N,N 亚甲双丙烯酰胺, 美国 SantaCruz 公司 免疫组化检测试剂盒 DAB 试剂盒 辣根酶标记山羊抗兔购自北京中杉金桥生物技术公司 1.2 仪器电动匀浆器 (SilentcrusherM, 德国 Hei dolph 公司 ) 电泳仪 (DYY Ⅲ7B 型 ) 水浴式电转膜仪 (DYY Ⅲ 40B 型 ) 显微镜 (OlympusBX40 型 ) 低温高速离心机 ( 德国 Eppendorf) 流式细胞仪 (Epics XLⅡ 型 ) 1.3 实验动物健康 Sprague Dawley(SD) 大鼠, 8~10 周龄, 体质量 (270±20)g, 由河北省实验动物中心提供 1.4 模型制备及动物分组 大鼠急性心肌缺血模型制备将大鼠用 10% 水合氯醛 350mg kg -1 腹腔注射麻醉, 取仰卧位固定, 剪去胸前手术区毛, 碘酒消毒, 用血管钳沿第 4 肋间钝性分离肋间肌约 3cm 长, 打开胸腔, 撑开 4 5 肋骨剪开心包膜将心脏轻轻挤出, 在左心耳与肺动脉圆锥之间平左心耳下缘迅速结扎冠状动脉左前降支近段, 立即关闭胸腔挤出胸腔内的气体, 以恢复负压, 帮助大鼠恢复自主呼吸 将肌肉层和皮肤分别缝合, 制备急性心肌缺血模型 动物分组与给药健康成年 SD 大鼠 40 只随机分为 5 组, 每组 8 只, 分别为 :1 假手术组 ; 2 缺血组 ;3 缺血 +NaHS 低剂量组 ;4 缺血 + NaHS 中剂量组 ;5 缺血 +NaHS 高剂量组 缺血组结扎左冠状动脉前降支 3h 时腹腔注射 2ml kg -1 生理盐水, 缺血 +NaHS 低 中 高剂量组分别于结扎左冠状动脉前降支 3h 时腹腔注射 和 3 12mg kg -1 的 NaHS( 用时现用生理盐水配置, 均为 2ml kg -1 ), 假手术组只穿线不结扎, 各组大鼠均于结扎左冠状动脉前降支 6h 时处死, 取心脏备用 取心尖部分心肌置于 10% 甲醛溶液中固定用于免疫组化法检测 ; 置于 -80 冰箱保存, 进行 Westernblot 分析 ; 置于 70% 的乙醇溶液中固定用于 FCM 测定 1.5 检测指标和方法 流式细胞术 (flowcytometry,fcm) 检测心肌 细胞凋亡于实验结束后取心尖部, 剪碎,70% 冷乙醇固定 弃去固定组织的 70% 酒精, 生理盐水冲洗心肌组织块, 在 100 目的不锈钢网上研磨, 边研磨边用 PBS 冲洗于容器中, 用 200 目铜网过滤并收集悬液,1000r min -1, 离心 10min, 弃上清, 用 PBS 制成单细胞悬液 应用美国 Beckman Coulter 公司生产的 Epics XLⅡ 型流式细胞仪, 激发光源 300mW 氩离子激光器, 激发波长 488nm, 检测前调整仪器 CV 值在 2% 以内 每个样本检测 个细胞, 以 DNA 组方图出现低于 G 1 期 DNA 含量的亚 G 1 峰的大小代表凋亡细胞的多少, 用 Expo32ADC 软件分析处理免疫荧光数据, 计算凋亡百分率 Westernblot 检测 caspase 3 蛋白表达将裂解的心肌组织离心, 上清液与点样缓冲液热变性, 做聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转膜, 用吐温 PBS 洗涤, 5% 脱脂奶粉封闭, 加稀释的 caspase 3 一抗, 再加相应的二抗,DAB 显色后立即用水冲洗, 照相, 经扫描后用美国 UVP 公司 LabWorks4.5 软件处理, 确定相对吸光度值 ( 每次对照的吸光度值为相对值 1) 免疫组化法检测 Bcl 2 和 Bax 蛋白表达采用 ABC 法,DAB 显色 Bcl 2 Bax 阳性表达呈棕黄色颗粒 每张切片随机选取 10 个高倍视野, 分别计数阳性表达心肌细胞数和心肌细胞总数并进行汇总, 计算蛋白表达阳性心肌细胞数占心肌细胞总数的百分率 1.6 HE 染色观察心肌组织学变化于实验结束后摘取心脏, 冰生理盐水冲净血液, 取左心室前壁部分组织,4% 多聚甲醛固定, 用 70% ~100% 的酒精梯度脱水, 二甲苯中透明两次, 入石蜡内进行包埋, 将修好的石蜡块固定于石蜡切片机上切片, 厚度为 4μm, 将完全展开的石蜡片贴附于清洁载玻片上, 4 保存备用, 常规 HE 染色 1.7 统计学处理实验数据以 x±s 珋表示, 运用 SPSS13 0 进行单因素方差分析 (One WayANOVA) 及 Dunnet t 检验, 比较各组变量间的差异 2 结果 2.1 心肌缺血后细胞凋亡率的变化心肌缺血 6h 后缺血组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显高于假手术组 (P<0 01);NaHS3 个剂量组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显低于相应的缺血组 (P<0 05 或 P< 0 01,Tab1,Fig1) 2.2 心肌缺血后细胞 Bcl 2 Bax 蛋白表达及 Bcl 2/ Bax 比值的变化免疫组化结果显示,Bcl 2 和 Bax 蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒, 主要在心肌细胞和内皮细胞胞质表达, 假手术组大鼠心肌细胞可见少量
3 4 中国药理学通报 C n P m g Bu n N v T b E NHS n nd n b ndb ndb B 珋± nmy d um m n n G u A RD B B B B S m ± ± ± 5 9± 7 ± 5 I m 7± 94± 9 9 ± ± m N HS L m N HS M m N HS H 7± 4 5 ± 5 4± ± 5 ± 5± 5 9 4 ± 4 7 7 5± 9 7± 4± 4± 4 9 ± ± 5 ± 47 9 7± 7 7± 59 P v mg u P 5 P v m g u 结果显示 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐 着色均 匀 缺血组大鼠部分区域心肌纤维横纹不齐或消 HS 失 核偏移甚至裂解消失 有炎性因子渗出 N 低 中 高剂量治疗组大鼠心肌缺血损伤程度明显减 轻 F g4 4 心肌缺血后 蛋 白 表 达 的 变 化 W nb 检测结果显示 假手术组大鼠心肌细胞 仅有少量的 的表达 缺血后各组 表达量均明显增加 缺血 治疗 时 N HS低 表 中 高剂量组与缺血组比较 心肌细胞 达明显降低 P 5 T b F g5 讨论 细胞凋亡作为细胞主动死亡形式具有复杂的分 子生物学机制 受许多因素的影响 细胞凋亡的发生 主要受细胞内凋亡调节蛋白的调控 细胞凋亡的发 生是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间平衡丧失的结 果 B 家族在各类刺激信号引起的凋亡中起关 键作用 4 其中 B 和 B 是与凋亡密切相关的 基因 B 为凋亡抑制基因 是膜的整合蛋白 在线 粒体参与的凋亡途径中起调控作用 能控制线粒体 中细胞色素 C等凋亡因子的释放 抑制细胞凋亡 而 B 则介导细胞凋亡 当 B 过量时 形成 B 过量时 形成 同源二聚体 细胞受到保护 当 B F g C ng n my d um m n B 同源二聚体 细胞则趋向凋亡 B 的抗凋亡 作用是通过与 B 组成异源二聚体 从而阻止 B 介导凋亡的作用 因此 在凋亡刺激因子 如细胞色 的 B 和 B 蛋白阳性细胞 缺血组大鼠心肌细 素 C 凋亡诱导因子 核酸内切酶 G 等作用下 这两 胞可见少量的 B 和大量 B 蛋白阳性细胞 与 种蛋 白 的 比 例 决 定 了 细 胞 是 凋 亡 还 是 存 活 5 假手术组比较 缺血组大鼠心肌细胞 B 蛋白表达 家族是细胞凋亡的启动 者 和 执 行 者 其 中 明显升高 P B 蛋白表达无明显变化 P 是 级联下游一种与细胞凋亡密切 5 B B 比值明显降低 P 与 相关的蛋白酶 正常情况下 胞质中 以 缺血组比较 缺血 时给予 N HS低 中 高剂量 无活性的酶原形式存在 激活后可引起细胞凋亡 研 治疗大鼠心肌组织 B 蛋白表达明显升高 P 究表明 心肌缺血 再灌注损伤的心肌中存在大量的 B 蛋 白 表 达 明 显 降 低 P B 凋亡细胞 认为心肌缺血可通过诱导氧化应激状态 B 比值明显升高 P T b F g 引起 和促进死亡受体及配体的表达激活 心肌组织的形态学变化 心 肌 细 胞 凋 亡 7 9 B 可 通 过 干 扰 细 胞 色 素 C HE染色光镜观察
4 中国药理学通报 C n P m g Bu n N v 5 F g Cng nb nmy d um m n F g C ng nb nmy d um m n F g4 P g ng my d um by m m n 4 的释放而阻断上游 蛋白酶的激活 抑制细 蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成 胞凋亡 B 成分 使 细 胞 色 素 C 得 以 穿 过 线 粒 体 膜 激 活 9 进 一 步 激 活 导 致 细 胞 凋 亡 本实验结果显示 急性心肌缺血后 心肌损伤明 蛋白表达明显增加 B 蛋白表达降 显 F g5 C ng nc nmy d u n m b m m N HS L d m N HS M m N HS H 低 B 蛋白表达则明显升高 B B 比值降低 假手术组大鼠心肌细胞可见较弱的 表达 可能是 手 术 刺 激 所 致 缺 血 后 经 HS供 体 N HS治 疗 心 肌 缺 血 损 伤 明 显 减 轻 心 肌 细 胞
5 1606 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2012Nov;28(11) caspase 3 蛋白表达明显降低,Bcl 2 蛋白表达明显升高,Bax 蛋白表达明显降低,Bcl 2/Bax 比值明显升高 因此, 在心肌缺血后,H 2 S 减轻心肌缺血损伤 抑制急性心肌缺血损伤引起细胞凋亡的机制可能与上调 Bcl 2 蛋白表达, 下调 Bax caspase 3 蛋白表达, 升高 Bcl 2/Bax 比值有关, 但是对其他细胞凋亡相关蛋白是否也有影响以及相关的作用机制, 尚需进一步深入研究 参考文献 : [1] OlivetiG,QuainiF,SalaR,etal.Acutemyocardialinfarction inhumansisasociatedwithactivationofprogrammedmyocytecel deathinthesurvivingportionoftheheart[j].jmolcelcardiol, 1996,28(9): [2] 刘芳, 张建新, 李兰芳, 等. 硫化氢对急性心肌缺血大鼠心肌线粒体损伤的影响 [J]. 中国应用生理学杂志,2011,27(2): [2] LiuF,ZhangJX,LiLF,etal.Efectsofhydrogensulfideon myocardialmitochondrialinjuryduringacutemyocardialischemia inrats[j].chinjapplphysiol,2011,27(2): [3] 刘芳, 张建新, 李兰芳, 等. 硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤心肌功能的影响 [J]. 中国药理学通报,2010,26(10): [3] LiuF,ZhangJX,LiLF,etal.Efectsofhydrogensulfideon cardialfunctioninducedbyacutemyocardialischemiainrats[j]. ChinPharmacolBul,2010,26(10): [4] BabuPP,SuzukiG,OnoY,etal.Atenuationofischemiaand/ orreperfusioninjuryduringmyocardialinfarctionusingmildhypo thermiainrats:animmunohistochemicalstudyofbcl 2,bax,Bak andtunel[j].patholint,2004,54(12): [5] McCintockDS,SantoreMT,LeeVY,etal.Bcl 2familymem dersandfunctionalelectrontransportchainregulateoxygendepri vation inducedceldeath[j].molcelbiol,2002,22(1): [6] 李琴, 郭云良, 李霞, 等. 胡黄连苷对大鼠脑缺血 / 再灌注损伤 Caspase 3 和 PARP 表达的影响 [J]. 中国药理学通报, 2010,26(3): [6] LiQ,GuoYL,LiX,etal.TheinterferenceofpicrosideⅡ on theexpresionofcaspase 3andPARPfolowingcerebralischemia reperfusioninjuryinrats[j].chinpharmacolbul,2010,26 (3): [7] 尹瑞兴, 卡扎里, 刘唐威, 等. 普罗布考对缺血 / 再灌注心肌细胞凋亡的作用 [J]. 中国临床康复,2004,8(24): [7] YinRX,KaZL,LiuTW,etal,EfectofProbucolonthecar diomyocyteapoptosisduringischemiaandreperfusion[j].chinj ClinRehabil,2004,8(24): [8] 史婷婷, 白建平, 梁月琴, 等. 芹菜素对大鼠缺血 / 再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白 Bcl 2 Bax Caspase 3 表达的影响 [J]. 中国药理学通报,2011,27(5): [8] ShiTT,BaiJP,LiangYQ,etal.Efectofapigeninonthecar diomyocyteapoptosisinratswithischemiaandreperfusionandthe expresionofbcl 2,Bax,Caspase 3[J].ChinPharmacolBul, 2011,27(5): [9] 张羽冠, 宋宏宇, 李蓥, 等. 蒺藜皂苷预适应对大鼠心肌缺血 / 再灌注损伤的保护作用 [J]. 中国药理学通报,2010,26(6): [9] ZhangYG,SongHY,LiY,etal.ProtectiveefectofGSTTpre conditioningonmyocardialischemia reperfusioninjuryinrats[j]. ChinPharmacolBul,2010,26(6): [10] VoutsadakisIA.Apoptosisandthepathogenesisoflymphoma [J].ActaOncol,2000,39: [11] SchonEA,ManfrediG.Neuronaldegenerationandmitchondrial dysfunction[j].clininvest,2003,119(3): Efectsofhydrogensulfideoncardiomyocyteapoptosisinducedby acutemyocardialischemiainrats ZHANGJian xin,dingyan yan,lilan fang,liufang,zhangqin zeng,xieli jun,haona (HebeiAcademyofMedicalSciences,Shijiazhuang ) Abstract:Aim Toinvestigatetheefectofhydrogen sulfide(h 2 S)oncardiomyocyteapoptosisinratswith acutemyocardialischemiaandtoanalyzethepathologi caldamageofmyocardialtisue. Methods Forty maleratswererandomlydividedintofivegroups:sham group,ischemiagroup,ischemia+nahs(lowdose) group,ischemia+nahs(middledose)group,ische mia+nahs(highdose)group.theacutemyocardial ischemiamodelwasestablishedbyligatingtheleftan teriordescendingcoronary(lad)oftherats.lads werenotligatedbutonlythreadedinthesham opera tionrats.inischemia+nahslow,middleandhigh dosegroupsthenahs(0 78,1 56,3 12mg kg -1 ) were intraperitonealy administrated respectively 3 hoursafterischemia.theratswererespectivelykiled 6hoursafterischemia.Heartswerequicklyremoved, andtheapoptoticrateofcardiomyocyteswasevaluated byflowcytometry.thepositiveexpresionsofbcl 2 andbaxincardiomyocyteswererespectivelydetected byimmunohistochemistry.theexpresionofcaspase 3 proteinwasobservedwithwesternblotanalysis.re sults Acutemyocardialischemiasignificantlyin
6 creasedtheapoptoticrateofcardiomyocytesandthe expresionofbaxandcaspase 3protein,anddecreased theexpresionofbcl 2andtheratioofbcl 2/Bax.Ad ministrationofnahsreducedthepercentageofapop toticcels,theexpresionofcaspase 3andBaxpro tein,improvedtheexpresionofbcl 2protein,thera tioofbcl 2/Bax,andthepathologicalinjuryofthemy ocardialcelsinducedbyacuteischemiainrats.con clusion H 2 Satenuatesacuteischemiainduced apop tosisofmyocardialcels,whosemechanismsmaybe involvedintheincreasesintheexpresionofbcl 2and theratioofbcl 2/Baxandthedecreasesintheexpres sionsbaxandcleavedcapsase 3. Keywords:hydrogensulfide;acutemyocardialische mia;apoptosis;rat;bcl 2;Bax
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