S02.FIT)

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1 第 21 卷第 4 期 生命科学研究 灾燥造援 21 晕燥援 4 圆园 17 年 8 月 蕴蚤枣藻杂糟蚤藻灶糟藻砸藻泽藻葬则糟澡 Aug. 圆园 17 间充质干细胞恶性转化相关关键基因的生物信息学分析 骆亚莉 a,b, 刘永琦 b*, 安方玉 b, 任春贞 b, 李玲 b, 李程豪 b, 赵娜 c, 赵枫 c ( 甘肃中医药大学 a. 基础医学院病理教研室 ;b. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室 ; 摘 c. 公共卫生学院, 中国甘肃兰州 ) 要 : 筛选间充质干细胞发生恶性转化相关的关键基因, 可为进一步的相关性研究提供参考和依据遥研究首 先基于文献挖掘的方法, 从已公开发表的研究中统计出间充质干细胞发生恶性转化的相关基因, 随后运用生物 信息学方法对上述基因进行分析, 同时用在线软件构建基因所表达蛋白质的相互作用网络, 并将相应网络进一 步可视化处理, 计算网络及各个节点的拓扑特性遥结果显示, 近年内的文献共涉及 187 个基因或其表达产物, 有 1253 种 GO 分类,KEGG 通路分析显示, 主要参与信号转导通路尧细胞粘附尧周期调节等 ; 此外, 共筛选出关键 节点 21 个遥生物信息学筛选的关键基因可用于提示间充质干细胞可能发生恶性转化的趋向, 也有助于分析间 充质干细胞恶性转化的可能机制遥 关键词 : 间充质干细胞 (MSCs); 恶性转化 ; 风险关键基因 ; 生物信息学 ; 文献数据挖掘 中图分类号 : R34 文献标识码 : A 文章编号 : (2017) Bioinformatic Analysis of Related Key Genes in Malignant Transformation of Mesenchymal Stem Cells LUO Ya-li a,b,liu Yong-qi b*,an Fang-yu b,ren Chun-zhen b,li Ling b, LI Cheng-hao b,zhao Na c,zhao Feng c (a. Department of Pathology, Basic Medical College; b. Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Colleges and Universities; c. School of Public Health, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou , Gansu, China) Abstract: The key genes associated with malignant transformation of mesenchymal stem cells were screened to provide reference and basis for further research. Techniques in bioinformatics were applied for the malignant transformation risk genes of mesenchymal stem cells, which were obtained from published studies. Then, the complex protein-protein network was built by nodes expressed by those genes through online STRING software. The network was visualized and quantified using the Cytoscape software for analysis. Results showed that there were 187 related genes and atotal of 1253 functional classifications by the Gene Ontolo 原 gy (GO) and 100 pathways by the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), mainly involved in the signal transduction, cell adhesion, cell cycle regulation and so on. Among the genes only 23 GO classifica 原 tions and 32 KEGG pathways were significant. Finally 21 key risk genes were selected from the proteinprotein network. The related key genes screened by bioinformatics could be used in indicating the tendency for malignant transformation of mesenchymal stem cells, and also help analyze the possible mechanism. Key words: mesenchymal stem cells ics; literature data mining DOI: /j.cnki (MSCs); malignant transformation; risk-related key genes; bioinformat 原 (Life Science Research,2017,21(4):329 耀 336) 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( , ) 作者简介 : 骆亚莉 (1979-), 女, 甘肃临洮人, 副教授, 主要从事干细胞防治疾病与遗传稳定性研究 ; * 通讯作者 : 刘永琦 (1973-), 男, 甘肃秦 安人, 博士, 甘肃中医药大学教授, 主要从事干细胞防治疾病与遗传稳定性研究,Tel: , liuyongqi73@163.com

2 330 生命科学研究圆园 17 年 间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 的优良特性使其在组织工程 细胞替代治疗等方 [1] 面具有很好的临床应用前景, 但是仍然存在移植后作用机制不清楚 可能产生细胞异常分化甚至不可控制的增殖等问题 当 MSCs 所属微环境 ( 如炎症 肿瘤 ) 发生改变时, 其是否发生恶性转化从 [2,3] 而促进肿瘤的发生还存在分歧 生物信息学将 [4, 5] 生物学与计算机科学及应用数学等交叉融合, 目前已有的对于干细胞临床应用现状的文献计量 [6] 分析显示, 干细胞的临床应用安全性不容忽视 已有研究发现了一些与间充质干细胞恶性转化相 [7, 8] 关的易感基因 位点等, 如能在众多基因中预测出关键风险基因, 对于进一步明确间充质干细胞的恶性转化趋向 研究其发生恶性转化的可能机制具有重要意义, 同时也可为规避或降低间充质干细胞发生恶性转化的风险从而提高临床应用安全性提供思路 1 材料与方法 1.1 文献检索从 PubMed 数据库和 Springer Link 数据库进行扩展检索, 辅以自由词的题目及摘要字段的检索 检索 2016 年 6 月之前公开发表的与 MSCs 恶性转化相关的研究文献 检索词 : 间充质干细胞恶性转化 (malignant transformation of mesenchymal stem cells); 检索时间 : ; 物种限定为人类 ; 语种不限 文献形式包括 : 临床试验 (Clinical trial) 评论 (Editorial) 实践指南(Practice guideline) 随机对照试验 (Randomized controlled trial) 综述(Review) 病例报告 (Case reports) 系统综述(Systematic re 原 views) 等 文献纳入标准 : 与 MSCs 恶性转化有关的基因及基因产物的临床研究 论著 随机对照试验 综述或系统评价文献 纳入文献需包括能提供足够信息的摘要或可以获取全文资料 排除标准 : 无法获取摘要的文献 ; 重复文献 ; 其他与研究目的不符的文献 不同数据库来源且作者 题目及出版年相同的文献按一篇统计 1.2 文献分类及统计分析运用 GoPubMed ( 在线统计发表文献最多的主题词或关键词 发表相关文献最多的期刊 发表文献的年度分布 文献最多的国家 同时, 运用 GoPubMed 可视化地在世 界地图上标示发表相关文献的国家 1.3 基因统计及名称标准化对 1.1 中纳入文献所研究的基因或基因产物进行统计, 其中统计的基因主要指的是基因本身多态性位点 放大 过表达 突变 重排等 基因产物包含基因转录 microrna mrna 及其翻译的蛋白质 对于基因名称的标准化处理, 一方面通过基因名称转换工具 Clone/Gene ID Converter ( idconverter.bioinfo.cnio.es/) 识别基因官方名 ; 另一方面, 针对此工具未能识别的基因则在 PubMed 的 Gene 数据库内手工逐一检索其官方名 质控贯穿文献检索 纳入全过程,3 名研究人员独立进行并交叉核对, 若有不同意见则交给由分子生物学相关专业高级职称研究成员组成的小组进行讨论决定 1.4 生物信息学分析 GO 分类和 KEGG 通路分析利用在线软件 GATHER ( duke.edu/) 将统计的相关基因进行基因本体论 (Gene Ontology, GO) 分类和京都基因与基因组百科全书数据库 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 通路分析 基因所表达蛋白质相互作用网络的构建将统计所得 MSCs 恶性转化有关基因上传至在线 STRING 10.0 软件 ( 构建由导入基因所表达产物组成的蛋白质相互作用网络 网络可视化及关键基因的筛选将在线 STRING 10.0 软件中所得网络数据导入软件 Cytoscape, 并将相应网络进一步可视化处理 网络图中的节点是指基因 蛋白质或分子, 其中的连接则代表这些分子间的相互作用关系 同时利用其插件 Centiscape, 计算网络及各个节点的拓扑特性, 并筛选出关键节点 2 结果 2.1 文献检索及入选情况 PubMed 数据库检索文献 218 篇,Springer Link 数据库检索文献 369 篇 合并两数据库检索结果, 去重后共检出 270 篇文献, 按照纳入标准进一步筛选, 最终筛选出符合要求文献 62 篇 2.2 文献信息学分析 研究主题分布情况排名在前 10 位的研究主题词或关键词为 :

3 第 4 期 骆亚莉等 : 间充质干细胞恶性转化相关关键基因的生物信息学分析 331 humans, mesoderm, stem cells, stem cell develop 原 ment, stem cell differentiation, neoplasms, mensenchymal cell development, mensenchymal cell differentiation,mensenchymalcell proliferation,celltrans 原 formation 其中,humans 和 mesoderm 相关研究文章均超过 200 篇, 涉及 stem cells stem cell devel 原 opment stem cell differentiation neoplasms 方面的研究文章均超过 170 篇 ( 图 1) Top terms 图 1 不同研究主题的文献数量 Fig.1 The publication number according to top terms 文献所发表年度的分布情况 从 2000 年至今, 发表文献数量基本呈现逐 年递增趋势 2010 年之后文献数量明显增多, 其中 年相关研究文章均超过 30 篇 ( 图 2) Publication number 图 2 不同年度的文献数量 Fig.2 The publication number according to years 高影响力期刊分布情况 发表文献数量最多的前 10 名高影响力期刊 依次为 :Cancer Research, PLoS ONE, Journal of Pathology, Cytotherapy, Stem Cells, Cancer Letters, American Journal of Pathology, Cell Cycle, Oncolo 原 gy Reports, International Journal of Cancer 其中 Cancer Research 和 PLoS ONE 发表的文献数量分 别位居第一和第二 ( 图 3) Top journals 图 3 高影响力期刊的文献数量 Fig.3 The publication number in top journals 文献数量较多的国家分布情况 发表文献数量最多的前 10 名国家依次为 : 美国 (United States of America) 中国 (China) 日本 (Japan) 德国 (Germany) 意大利 (Italy) 荷兰 (Nether 原 lands) 瑞士 (Switzerland) 法国 (France) 加拿大 (Canada) 巴西 (Brazil) 位居第一的美国著者文献 数量高达 70 余篇, 远远领先于分别位居第二 第 三的中国 (46 篇 ) 及日本 (23 篇 ) 具体分析结果见 图 4 和图 图 4 不同国家的文献数量 Fig.4 The publication number in main countries 图 5 文献数量分布可视化地图 Fig.5 The visualized distribution map of publication number 2.3 基因统计结果 Countries 基因 GO 分类和通路分析结果 187 个基因或其表达产物有 1253 种分类,

4 332 生 命 科 学 研 圆园17 年 究 其中, 贝叶斯因子(In)>10 且 P<0.01 的分类有 23 种 这些基因主要与细胞增殖 周期调节 生理过 程调节 生物过程调节 细胞趋向性 细胞周期 发 育 信号转导 细胞联络等有关(表 1) 进一步对这些基因进行 KEGG 通路分析, 发 现共涉及 KEGG 通路 100 种, 其中 In>0 的通路有 32 种, 主要是参与细胞信号转导通路(Toll-like re- ceptor, Wnt, MAPK, TGF-beta, Hedgehog, Jak-STAT 等) 细胞粘附(focal adhesion, adherens junction等) 细胞周期调节等(表 2) 蛋白质相互作用网络 文献分析共获得 187 个目标基因, 其中 HO原 TA IR V A SH2 Hippo mir200 mir429 mir1 mir194 mir93 这 8 个未找到相应名称 将统计所 得基因上传至在线软件 STRING 10.0, 对间充质 干细胞恶性转化相关基因表达的蛋白质进行网络 图 6 蛋白质相互作用网络 Fig.6 The network of interaction of the related proteins 经 过 该 节 点 的 数 量 比 例, 为 0 ~475.94, 平 均 为 构建 结果显示: 共 171 个节点(自动剔除图 6中的 节点的度数越高, 表示与该基因相互作用 相互作用关系网络; 这些节点大部分存在着密切 大 而节点的中介性值越大, 说明该基因对于整 的相互作用关系, 且有多个节点处于网络的中心, 个网络的调控影响越大 孤立蛋白质) 条相互作用参与构建蛋白质 属于整个通路的核心位置; 网络外围有 8 个基因 的基因越多, 在恶性转化发生过程中起的作用越 在基因调控网络中, 关键基因的调控变化可 产物与其他蛋白质或主网络无联系, 提示该 8 个 以引起下游大量基因的表达变化, 这样的基因在 Ckap4 Opn1sw Rbm Sar1a Taz 和 Aspa (图 6) 网络可视化及关键基因的筛选 络的稳定具有重要作用 如果敲除这个关键基 节点对整个网络无影响, 它们分别是 Crlf1 Eral1 网络可视化处理可见, 此网络是由 171 个节 点蛋白质和 条边组成(图 7) 直径为 7, 网络 的平均距离为 节点的度数为节点连接的 边 的 总 数 目, 节 点 度 数 为 1.00 ~93.00, 平 均 为 节点中介性为网络中所有的最短路径中 Table 1 网络中与很多其他的基因具有调控关系, 对于网 因, 网络可能会崩溃 网络中节点度数值高且中 介性值大的节点在整个网络中的作用和影响力较 大, 它们的功能改变可能对于整个网络来说是至 关重要的 因此可参考节点度数及中介性的值来 筛选关键基因 本研究发现网络中节点度数与中介性同时大 表 1 与间充质干细胞恶性转化相关基因的 GO 分类 GO classification of the related genes in malignant transformation of mesenchymal stem cells GO classification Cell proliferation Regulation of cell cycle Regulation of physiological process Regulation of biological process Regulation of cellular physiological process Regulation of cellular process Cell cycle Taxis Chemotaxis Development Morphogenesis Negative regulation of physiological process Signal transduction Cell communication Protein amino acid phosphorylation Gene number Bayes factor

5 第 4 期 骆亚莉等 : 间充质干细胞恶性转化相关关键基因的生物信息学分析 333 Table 2 表 2 与间充质干细胞恶性转化关联密切的基因 KEGG 主要通路分析 KEGG pathway analysis of the related genes in malignant transformation of mesenchymal stem cells Pathway Path: mmu04620: Toll-like receptor signaling pathway Path: hsa04110: Cell cycle Path: hsa04510: Focal adhesion Path: mmu04510: Focal adhesion Path: mmu04060: Cytokinecytokine receptor interaction Path: mmu04540: Gap junction Path: rno04310: Wnt signaling pathway Path: hsa04540: Gap junction Path: rno04510: Focal adhesion Path: hsa04310: Wnt signaling pathway Path: hsa04520: Adherens junction Path: mmu04010: MAPK signaling pathway Path: hsa04010: MAPK signaling pathway Path: mmu04520: Adherens junction Path: hsa04350: TGF-beta signaling pathway Gene number Bayes factor Gene Fos, Ifna1, Ifna12, Ifna, Ifna5, Ifna6, Ifna7, Ifna9, Ifnab, Ikbkb, Il6, LOC242517, Ly96, Mapk, Nfkb1, Nfkb2, Pik3ca, Stat1, Tnf ABL1, CCNB1, CND1, CCND2, CDC2, CDK2, CDK4, CDK6, CDKN1A, CDKN2A, GSK3B, HDAC1, HDAC2, PRKDC, RB1, MAD3, TGFB1, TP53 ABL1, BRAF, CCND1, CCND2, COL1A1, COL1A2, COL5A2, CTNNB1, EGF, EGFR, GSK3B, HRAS, IGF1, ITGAV, MAPK1, MAPK3, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PDGFRB, PIK3CA, PTEN, PTK2, RHOA, SRC, TNC, VEGF Braf, Catnb, Ccnd1, Ccnd2, Col1a1, Col1a2, Col5a2, Egf, Egfr, Gsk3b, Hras1, Igf1, Itgav, Mapk1, Mapk3, Pdgfa, Pdgfb, Pdgfc, Pdgfd, Pdgfrb, Pik3ca, Pten, Ptk2, Rhoa, Src, Tnc, Vegfa Ccl12, Csf2, Cxcl1, Cxcl12, Cxcl5, Egf, Egfr, Ifna1, Ifna12, Ifna, Ifna5, Ifna6, Ifna7, Ifna9, Ifnab, Il4, Il6, Il6st, LOC242517, Pdgfa, Pdgfb, Pdgfc, Pdgfd, Pdgfrb, Tgfb1, Tnf, Vegfa Cdc2a, Csnk1a1, Egf, Egfr, Hras1, Map2k2, Mapk1, Mapk3, Pdgfa, Pdgfb, Pdgfc, Pdgfd, Pdgfrb, Src, Tjp1 Apc, Axin1, Axin2, Catnb, Ccnd1, Csnk1a1, Fosl1, Gsk3b, Madh2, Madh3, Myc, Rhoa, Sfrp1, Tp53, Wnt3 CDC2, CSNK1A1, EGF, EGFR, HRAS, MAP2K2, MAPK1, MAPK3, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PDGFRB, SRC, TJP1 Braf, COLIA1, Catnb, Ccnd1, Col1a2, Col5a2, Egf, Gsk3b, Igf1, Itgav, LOC367013, Mapk1, Mapk3, Pdgfa, Pdgfb, Pdgfc, Pten, Ptk2, Rhoa, Src, Vegf APC, AXIN1, AXIN2, CCND1, CCND2, CSNK1A1, CTNNB1, FOSL1, GSK3B, MYC, RHOA, SFRP1, SMAD2, SMAD3, TP53, WNT3, WNT3A CDH1, CTNNB1, EGFR, MAPK1, MAPK3, RHOA, SMAD2, SMAD3, SNAI1, SNAI2, SRC, TJP1 Braf, Casp3, Ddit3, Egf, Egfr, Fgf2, Fgf7, Fos, Hras1, Ikbkb, Map2k2, Mapk1, Mapk, Mapk3, Myc, Nfkb1, Nfkb2, Pdgfa, Pdgfb, Pdgfrb, Tgfb1, Tnf, Trp53 BRAF, CASP3, DDIT3, EGF, EGFR, FGF2, FGF7, FOS, HRAS, IKBKB, MAP2K2, MAPK1, MAPK, MAPK3, MYC, NFKB1, NFKB2, PDGFB, PDGFRB, TGFB1, TNF, TP53 Catnb, Cdh1, Egfr, Mapk1, Mapk3, Rhoa, Smad2, Smad3, Snai1, Snai2, Src, Tjp1 BMP4, MAPK1, MAPK3, MYC, NODAL, RHOA, SMAD2, SMAD3, SMAD7, TGFB1, TNF, ZFYVE9 于或等于平均值 (x) 的节点有 37 个, 节点度数大于或等于平均值 + 标准差 (x+s) 的节点有 31 个, 而中介性大于或等于平均值 + 标准差 (x+s) 的节点有 23 个 具体分析这 3 种方法筛选出的节点后, 本 研究筛选关键基因的标准设定为节点度数与中介性同时大于或等于平均值 + 标准差 (x+s) [9], 共 21 个, 见表 3 和图 8 这些关键基因可能为该领域未来的主要研究方向 表 3 Table 3 筛选所得关键基因 Screening of key genes Filtering condition Degree 逸 mean and Betweenness 逸 mean Degree 逸 mean+standard deviation Betweenness 逸 mean+standard deviation Degree 逸 mean+standard deviation and Betweenness 逸 mean+standard deviation Genes Myc, Mmp2, Notch1, Stat1, Pdgfrb, Tnf, Src, Ccnd1, Snai1, Bmp4, Kras, Il6, Nfkb1, Smad2, Trp53, Smad3, Cdh2, Gsk3b, Fgf2, Pou5f1, Foxo3, Mapk1, Fos, Col1a2, Cxcl12, Mapk3, Cdk2, Cdkn1a, Alk, Serpine2, Snai2, Hdac1, Axin1, Abl1, Igf1, Mmp, Gli1 Trp53, Src, Ccnd1, Stat1, Fgf2, Bmp4, Hdac1, Abl1, Mmp2, Kras, Mapk3, Smad3, Mmp, Notch1, Snai1, Nfkb1, Foxo3, Cxcl12, Smad2, Myc, Axin1, Pdgfrb, Igf1, Tnf, Mapk1, Pou5f1, Cdk2, Il6, Gsk3b, Cdkn1a, Gli1 Myc, Mmp2, Notch1, Stat1, Pdgfrb, Tnf, Src, Ccnd1, Snai1, Bmp4, Kras, Il6, Nfkb1, Smad2, Trp53, Smad3, Cdh2, Gsk3b, Fgf2, Pou5f1, Foxo3, Mapk1, Fos Trp53, Src, Ccnd1, Stat1, Fgf2, Bmp4, Mmp2, Kras, Smad3, Notch1, Snai1, Nfkb1, Foxo3, Smad2, Myc, Pdgfrb, Tnf, Mapk1, Pou5f1, Il6, Gsk3b Number

6 334 生 命 科 学 研 究 圆园17 年 相关的节点共有 20 个, 条相互作用中有 48 条(图 9D) 讨论 间充质干细胞恶性转化相关基因研究特点 基于干细胞的临床应用前景非常广泛但存在 不容忽视的潜在危险 [13], 如何最大限度地保证其 应用安全性是当务之急 从近十几年研究的主题 内容(图 1) 年度分布(图 2) 高影响力期刊的文献 数量(图 3)以及著者地域分布(图 4, 5)来看, 对此 方面的研究越来越引起欧美 东亚国家等的广泛 重视, 包括机制在内的研究也在逐步深入 综合 分析间充质干细胞恶性转化相关基因研究现状, 图 7 蛋白质相互作用网络可视化处理 Fig.7 The visualization of the protein interaction 发现目前研究以体外实验方法或临床报道为主, 利用转染 基因敲除, 或者通过模拟间充质干细 胞与肿瘤的非直接接触的共培养环境或特定微环 境等方法, 来检验某个(些)特定的基因及其表达 产物的存在与否对于恶性转化的影响, 从而揭示 目的基因及其表达产物与间充质干细胞发生恶性 转化之间的密切关联性 [~16] 但利用生物信息学 技术对此方面研究的综合分析较少 本研究整体 揭示出特定基因与间充质干细胞发生恶性转化之 间的相关性, 且为针对性规避某些关键基因(及其 通路)从而维持间充质干细胞遗传稳定性 降低恶 性转化风险提供了一定的理论依据 3.2 间充质干细胞恶性转化相关基因分类及通 路分析 GO 数据库包含了 个基因, 分为生物 过程 细胞组分 分子功能 3 个方面的信息 [17] 基 因 GO 分类是最先出现的芯片数据基因功能分析 图 8 关键节点(黄色)筛选 Fig.8 The screening of key nodes 与关键节点 trp53尧src尧tnf尧il6 有直接相互 作用的节点 近年的研究表明, trp53 Src tnf IL6 等与肿 法 利用各种 GO 数据库相关分析工具可将分类 与具体基因联系起来, 从而对该基因的功能进行 描述 基因通路分析是目前常用的芯片数据基因功 能分析法, 其利用的资源是许多已经研究清楚的 生物学通路 通过把表达发生变化的基因列表导 瘤的发生发展之间关联密切, 并且在促发间充质干 入通路分析软件, 得到这些基因所属的通路, 然 细胞的恶性转化过程中发挥着重要的作用 [10~12] 后运用统计学方法检验与基因表达变化最为相关 的通路 KEGG 是系统分析基因功能 基因组信息 分别选择以上节点, 筛选出与其直接相互作用的 蛋白质 结果显示在 171 个节点中, 与 trp53 相关 的数据库, 可以将基因及表达信息作为一个整体 (图 9A); 与 Src 相关的节点共有 76 个, 条相 时, 如果某分类的贝叶斯因子远大于 1, 则该分类 的节点共有 94 个, 条相互作用中有 99 条 互作用中有 86 条(图 9B); 与 tnf 相关的节点共有 25 个, 条相互作用中有 67 条(图 9C); 与 IL6 网络进行研究[18] 采用贝叶斯统计方法进行检验 比其他功能分类更优, 分类中所包含基因与该分 类拟合度更强[19] 本研究应用在线软件 GATHER,

7 第 4 期 骆亚莉等 : 间充质干细胞恶性转化相关关键基因的生物信息学分析 335 (A) (B) (C) (D) 图 9 与 trp53\src\tnf\il6 有直接相互作用的节点 (A) 与 trp53 互作的节点 ;(B) 与 Src 互作的节点 ;(C) 与 tnf 互作的节点 ;(D) 与 IL6 互作的节点遥 Fig.9 The interacted nodes with trp53\src\tnf\il6 (A) The interacted nodes with trp53; (B) The interacted nodes with Src; (C) The interacted nodes with tnf; (D) The interacted nodes with IL6. 联合两种检验方法, 便于更加科学 全面地理解间充质干细胞发生恶性转化过程中相关基因及其表达产物的功能协同机制, 同时为关键基因的筛选提供了一定的参考范围 3.3 相应蛋白质网络可视化及关键基因筛选的分析从相关基因表达产物之间的互相作用图分析可见, 大部分节点之间关联较密切, 部分节点处于网络中心位置 ( 图 6, 7) 有 8 个基因的表达产物是孤立的, 没有参与整个蛋白质网络构建, 提示目前尚未发现此类基因与其他基因的编码产物参与共同的信号通路, 其功能或所参与的信号通路调节尚待进一步研究 构成网络的蛋白质之间相互作用关系错综复杂, 存在多个蛋白质参与同一信号通路调节, 或同一蛋白质参与多个信号通路的调节 蛋白质网络构建图虽然直观且形象, 但涉及的节点和边数数目众多, 存在交叉重叠, 不便于进一步筛选关键基因, 所以需要进一步对该网络进行可视化和量化分析 结合 GO 分类 ( 表 1) 和 KEGG 通路 ( 表 2) 分析结果, 可视化和量化分析蛋白质相互作用后共筛选出 21 个关键节点 ( 图 8 和表 3), 它们主要参与细胞周期调节 信号转导 增殖 发育 细胞联络等功能通路 当间充质干细胞所属的周围微环境发生改变时, 会导致细胞周期调节 信号转导 增殖等受到影响, 原有稳态平衡被打破, 可能会引起异常分化甚至不可控的增殖 肿瘤的发生 因此, 对于关键节点的筛选不仅可提示间充质干细胞可能发生恶性转化的趋向, 而且也有助于分析间充质干细胞恶性转化的可能机制 个关键节点的基因与 MSCs 的相关研究 p53 基因是人类癌症中最容易发生突变的基 因, 其突变可促进细胞生长, 诱导 VEGF 分泌, 使 [10] 肿瘤细胞对顺铂等抗瘤药物产生耐受性 当 p53 失活时, 肿瘤细胞不易凋亡, 且肿瘤的免疫逃逸 [20] 功能加强, 从而促进肿瘤的进展 肿瘤细胞及肿 [21] 瘤基质中的非肿瘤细胞都会发生 p53 突变, 从而影响肿瘤微环境 p53 对 MSCs 的增殖 定型 分化以及成熟过程发挥决定性的作用 缺失 p53 功能的 MSCs 通过调节免疫特性 生长以及增殖可以促进自身发生恶性转化 研究表明, Sca-1 低表达的真皮来源的 MSCs 是 p53 和 Rb 缺陷时发生恶性 [22] 转化的优先目标 原癌基因 c-src 在调控细胞的生长 分化等方面具有重要作用 c-src 基因和磷酸化 Src 蛋白的表达水平与癌症的临床分期 远处转移 生存期有 [23] 关 c-src 通过包括信号转导及转录激活因子 (signal transducers and activators of transcription, STATs) 在内的多条复杂的信号通路对细胞行为进 [11] 行调控, 发挥枢纽作用 STAT3 是信号转导与转录激活因子家族的成员, 可以被多种细胞因子及其他刺激所激活, 参与调节细胞生长 免疫反应 内环境稳定以及肿瘤形成等 实验证实,Src 蛋白可能通过磷酸化 STAT3 蛋白影响大鼠精原干细 [24] 胞的活性 研究认为, 慢性炎症促进细胞的恶性转化甚至肿瘤发生 TNF- 琢 IL-6 TGF- 茁和 IL-10 等炎 [12] 性因子参与肿瘤的发生发展 多种细胞(T 细胞 NK 细胞 肿瘤相关巨噬细胞 间充质细胞等 ) 及相关因子 (MMP VEGF TGF- 茁 IL-6 等 ) 组成了肿瘤 [25, 26] 微环境 在肿瘤微环境中,MSCs 被肿瘤细胞及巨噬细胞等分泌的促炎因子 IFN TNF IL 等激活, 进而产生免疫调节因子如 IDO PGE2 IL-6 [27] IL-10 等 有报道显示, 致炎因子 IL-10 TGF- 茁

8 336 生命科学研究圆园 17 年 IL-4 IFN- 酌和 TNF- 琢等能够增强 MSCs 在细胞疗 法中对于退行性 炎症及自身免疫性疾病的疗效 [28] 目前也有报道,IL-6/STAT 等信号通路可能参与 肿瘤微环境中 MSCs 的恶性转化并发挥关键作用, 其机制与 SIL-6R/GP130 的过表达及激活有关 [16,29] 炎性因子 IFN- 酌和 TNF- 琢可通过 NF- 资 B/ SMAD7 信号通路协同诱导 MSCs 发生缺陷, 并通 过激活 NF- 资 B 介导的致癌基因促进肿瘤的发生 [30] TNF- 琢和 TGF- 茁信号通路的协同可以加速高度 排列有序的结肠上皮细胞向间质细胞的转化 ERK 通路的激活导致肿瘤细胞自分泌 TNF- 琢增 多, 也参与结肠癌的上皮间质转化过程 [31] 与 trp53 Src tnf IL6 有直接相互作用的节点 数目较多, 作用途经广泛 ( 图 9), 揭示众多节点之间 相互作用的复杂多样性, 也间接反映 MSCs 的恶 性转化发病机制的错综复杂性 MSCs 恶性转化 的发生并非仅与某单一因素有关, 而是与体内外 环境 移植受者免疫机能状态 受者所患疾病种类 等多因素密切关联 目前, 针对 MSCs 恶性转化的 相关研究的设计角度 层次水平均不相同, 且尚未 建成能诱发 MSCs 恶性转化的公认微环境模型 因此, 揭示其恶性转化的复杂机制还有很多工作 要做 对于此领域今后的研究方向, 一方面可以 通过生物信息技术对现有研究进行更加精密的分 析 [32], 提高对关联度较高的某些 ( 种 ) 基因的筛选准 确度 本课题组结合文献信息分析研究结果, 将进 一步通过对公开发表的数据库中芯片检测结果进 行分析, 以更加广泛 精确地筛选差异表达的相关 基因 另一方面研究者们应将环境 免疫 疾病等 因素考虑在内, 对多基因组合进行整合优化, 甚 至量化, 建立一种合理的恶性转化的风险预测模 型, 从而提高 MSCs 的临床应用安全性 参考文献 (References): [1] 朱厚毅, 王锋, 王运涛.MSCs 衰老的研究进展 [J]. 中国修复重建外科杂志 (Zhu Hou-yi, Wang Feng, Wang Yun-tao. Devel 原 opment progress of mesenchymal stem cells senescence[j]. Chi 原 nese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery), 20, 29(7): [2] 许鹏超, 李静, 赵春华. 体外共培养人骨髓间充质干细胞与乳腺癌细胞可促进癌细胞的侵袭和迁移能力 [J]. 基础医学与临床 (XuPeng-chao,Li Jing,ZhaoChun-hua.Human mesenchy 原 mal stem cells promote breast cancer cells migration and inva 原 sion by co-culture in vitro[j]. Basic &Clinical Medicine), 2016, 36(5): [3] Cammarota F, Laukkanen MO. Mesenchymal stem/stromal cells in stromal evolution and cancer progression[j]. Stem Cells In 原 ternational, 2016, 2016: [4] 王蕊, 胡德华. 生物信息学数据库研究文献引文与热点分析 [J]. 生物信息学 (Wang Rui,Hu De-hua.Analysisof citation features in bioinformatics database literature studies[j]. Chinese Journal of Bioinformatics), 20, 12(4): [5] 王兆松, 赵文铖, 周蒙, 等. 人 Latexin 基因及蛋白质的生物信息学分析 [J]. 生命科学研究 (Wang Zhao-song, Zhao Wencheng, Zhou Meng, et al. Bioinformatic analysis of human La 原 texin gene and protein[j]. Life Science Research), 2016, 20(2): [6] 单连慧, 李海存, 安新颖, 等. 基于文献计量学的中国干细胞治疗临床应用现状研究 [J]. 中华细胞与干细胞杂志 ( 电子版 ) (Shan Lian-hui, Li Hai-cun, An Xin-ying, et al. Overview of Chinese clinical studies of stem cell based on the bibliomet 原 rics[j]. Chinese Journal of Cell Stem Cell (Electronic Edition)), 2016, 6(1): [7] Nie X, Tang J, Liu Y, et al.fullerenol inhibitsthe cross-talk be 原 tween bone marrow-derived mesenchymal stem cells and tumor cellsbyregulatingmapksignaling[j].nanomedicine:nanotech 原 nology, Biology, and Medicine, 2017, 13(6): [8] Bharti R, Dey G, Mandal M. Cancer development, chemoresis 原 tance,epithelialtomesenchymaltransitionandstemcells:asnap 原 shot of IL-6 mediated involvement[j]. Cancer Letters, 2016, 375 (1): [9] 上官辉, 谭淑燕, 张积仁. 肝癌易感性相关基因的文献计量学与生物信息学分析 [J]. 中华肿瘤防治杂志 (Shangguan Hui, Tan Shu-yan, Zhang Ji-ren. Bioinformatics and bibliometrics analysis of the key risk genes in hepatocellular carcinoma[j]. Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment), 20, 22(4): [10] 张仁峰, 公蕾. p53 基因与肿瘤治疗研究进展 [J]. 现代免疫学 (Zhang Ren-feng, Gong Lei. Research progress of p53 gene and tumor therapy[j]. Current Immunology, 2016, 36(2): 0-4. [11] Zhao W, Chang CJ, Cui YY, et al. Steroid receptor coactiva 原 tor-3regulatesglucosemetabolisminbladdercancercellsthrough coactivation of hypoxia inducible-factor 1 琢 [J]. The Journal of Biological Chemistry, 20, 289(16): [12] Landskron G, De La Fuente M, Thuwajit P, et al. Chronic in 原 flammation and cytokines in the tumor microenvironment[j]. Research Journal of Immunology, 20, 20: [13] Lucarelli E, Bellotti C, Mantelli M, et al. In vitro biosafety pro 原 file evaluation of multipotent mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of sarcoma patients[j]. Journal of Trans 原 lational Medicine, 20, 12: 95. [] Lopatina T, Gai C, Deregibus MC, et al. Cross talk between cancer and mesenchymal stem cells through extracellular vesi 原 clescarryingnucleicacids[j].frontiersinoncology,2016,6:125. [] Calkoen F G, Vervat C, Eising E. Gene-expression and in vitro function of mesenchymal stromal cells are affected in juvenile myelomonocytic leukemia[j]. Haematologica, 20, 100(11): [16] Cui XR, Liu JP, Bai L, et al. Interleukin-6 induces malig 原 nant transformation of rat mesenchymal stem cells in associa 原 tion with enhanced signaling of signal transducer and activator of transcription 3[J]. Cancer Science, 20, 105(1): [17] Harris M, Clark J, Ireland A, et al. The Gene Ontology (GO) database and informatics resource[j]. Nucleic Acids Research, 2004, 32(suppl. 1): D258-D261. [18] 李向真, 刘子朋, 李娟, 等.KEGG 数据库的进展及其在生物信息学中的应用 [J]. 药物生物技术 (Li Xiang-zhen, Liu zi-peng, Li Juan, et al. Progress of KEGG database and its application inbioinformatics[j].pharmaceuticalbiotechnology),2012, 19(6): [19] Marden J I. Hypothesis testing: from p values to Bayes factors[j]. Journal of the American Statistical Association, 2000, 95(452): [20] Guo G, Marrero, Rodriguez P, et al. Trp53 inactivation in the tumor microenvironment promotes tumor progression by expand 原 ing the immunosuppressive lymphoid-like stromal network[j]. Cancer Research, 2013, 73(6): [21] Patocs A, Zhang L, Xu YM, et al. Breast-cancer stromal cells with TP53 mutations and nodal metastases[j]. The New England Journal of Medicine, 2007, 357: [22] Choi J, Curtis SJ, Roy DM, et al. Local mesenchymal stem/ progenitorcellsareapreferentialtargetforinitiationof adult soft tissue sarcomas associated with p53 and Rb deficiency[j]. The American Journal of Pathology, 2010, 177(5): [23] 杜芸, 左连富, 王小玲, 等. 食管癌中 Src 蛋白与相关因子的表达及其预后意义 [J]. 临床与实验病理学杂志 (Du Yun, Zuo Lian-fu, Wang Xiao-ling, et al. Expression of Src protein and related factorsin esophageal carcinoma and itsprognostic signif 原 icance[j]. Chinese Journal of Clinical and Experimental Pathol 原 ogy, 2006, 22(3): ( 下转第 369 页 )

9 第 4 期 陈淑敏等 : 循环肿瘤 DNA 检测技术的研究进展 369 [6] 胡琨, 向倩, 崔一民. 液体活检技术及在精准医疗中的应用 [J]. 临床药物治疗杂志 (Hu Kun, Xiang Qian, Cui Yi-min. Liquid biopsyanditsapplicationinprecisionmedicine[j].clinicalmed 原 ication Journal), 2016, (4): 1-7. [7] Gray ES, Rizos H, Reid AL, et al. Circulating tumor DNA to monitor treatment response and detect acquired resistance in patients with metastatic melanoma[j]. Oncotarget, 20, 6(39): [8] 张师前, 黄文倩. 循环肿瘤 DNA 液体活检对妇科肿瘤早期筛查意义 [J]. 中国实用妇科与产科杂志 (Zhang Shi-qian, Huang Wen-qian. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in early screening of gynecologic tumor[j]. Chinese Journal of Practical Gynecology and Obstetrics), 2016, 32(5): [9] 曾倩, 宋现让. 血液循环 DNA 与肿瘤基因突变检测研究现状 [J]. 中华肿瘤防治杂志 (Zeng Qian, Song Xian-rang. Research of blood circulating DNA in detecting tumor gene mutation[j]. Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment), 20, 22(18): [10] Murtaza M, Dawson SJ, Pogrebniak K, et al. Multifocal clonal evolutioncharacterizedusingcirculatingtumourdnainacaseof metastaticbreastcancer[j].naturecommunications,20,6:8760. [11] Kidess E,Heirich K,Wiggin M, et al.mutation profiling of tumor DNA from plasma and tumor tissue of colorectal cancer patients with anovel, high-sensitivity multiplexed mutation detection platform[j]. Oncotarget, 20, 6(4): [12] BettegowdaC,SausenM,LearyRJ, et al. Detectionof circulating tumordnainearly-andlate-stage humanmalignancies[j]. Sci 原 ence Translational Medicine, 20, 6(224): 224ra24. [13] Warton K, Mahon KL, Samimi G. Methylated circulating tu 原 mor DNA in blood: power in cancer prognosis and response[j]. Endocrine Related Cancer, 2016, 23(3): R7-R171. [] Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics[j]. Nature Medicine, 2008, (9): [] Ashida A,Sakaizawa K,Mikoshiba A, etal.quantitative analysis of the BRAF V600E mutation in circulating tumor-derived DNA in melanoma patients using competitive allele-specific TaqMan PCR[J]. International Journal of Clinical Oncology, 2016, 21(5): [16] Pereira E,Camacho-VanegasO,Anand S, et al.personalized cir 原 culating tumor DNA biomarkers dynamically predict treatment responseandsurvivalingynecologiccancers[j].plos One,20, 10(12): e [17] Qin Z, Ljubimov VA, Zhou C, et al. Cell-free circulating tumor DNA in cancer[j]. Chinese Journal of Cancer, 2016, 35(5): [18] OlssonE,WinterC,George A, etal.serial monitoringof circulat 原 ing tumor DNA in patients with primary breast cancer for detec 原 tion of occult metastatic disease[j]. EMBO Molecular Medicine, 20, 7(8): [19] Heitzer E, Auer M, Ulz P, et al. Circulating tumor cells and DNA as liquid biopsies[j]. Genome Medicine, 2013, 5(8): 73. [20] Martignetti JA, Camacho-Vanegas O, Priedigkeit N, et al. Per 原 sonalized ovarian cancer disease surveillance and detection of candidate therapeutic drug target in circulating tumor DNA[J]. Neoplasia, 20, 16(1): [21] Diaz LAJr, Williams RT, Wu J, et al. The molecular evolu 原 tion of acquired resistance to targeted EGFR blockade in col 原 orectal cancers[j]. Nature, 2012, 486(7404): [22] Saunders NA, Simpson F, Thompson EW, et al. Role of in 原 tratumoural heterogeneity in cancer drug resistance: molecular and clinical perspectives[j]. EMBO Molecular Medicine, 2012, 4(8): [23] 詹成, 燕丽, 王琳, 等. 数字 PCR 技术的发展和应用 [J]. 复旦学报医学版 (Zhan Cheng, Yan Li, Wang Lin, et al. The devel 原 opmentandapplicationof digital PCR[J].FudanUniversityJour 原 nal of Medical Sciences), 20, 42(6): [24] Takegawa N,YonesakaK,SakaiK, et al. HER2 genomic amplifi 原 cation in circulating tumor DNA from patients with cetuximabresistantcolorectalcancer[j].oncotarget,20,7(3): [25] Uchida J, Imamura F, Kukita Y, et al. Dynamics of circulating tumor DNA represented by the activating and resistant muta 原 tions in epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhi 原 bitor treatment[j]. Cancer Science, 2016, 107(3): [26] Tsao CH, Weiss J, Hudson C, et al. Monitoring response to therapy in melanoma by quantifying circulating tumor DNA with droplet digital PCR for BRAF and NRAS mutations[j]. Scien 原 tific Reports, 20, 5: [27] MetzCHD,ScheulenM,BornfeldN, et al.ultradeep sequencing detectsgnaqand GNA11 mutationsin cell-freednafromplasma of patients with uveal melanoma[j]. Cancer Medicine, 2013, 2(2): [28] Yang X, Zhuo M, Ye X, et al. Quantification of mutant alleles in circulating tumor DNA can predict survival in lung cancer[j]. Oncotarget, 2016, 7(): [29] Oxnard GR, Paweletz CP, Kuang Y, et al. Noninvasive detec 原 tion of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical Cancer Research, 20, 20(6): [30] Diehl F, Li M, He Y, et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions[j]. Nature Methods, 2006, 3(7): [31] Higgins MJ, Jelovac D, Barnathan E, et al. Detection of tumor PIK3CA status in metastatic breast cancer using peripheral blood[j]. Clinical Cancer Research, 2012, 18(12): [32] Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, et al. Noninvasive identi 原 fication and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA[J]. Science Translational Medicine, 2012, 4(136): 136ra68. [33] Sato KA, Hachiya T, Iwaya T, et al. Individualized mutation detection in circulating tumor DNA for monitoring colorectal tumor burden using acancer-associated gene sequencing pan 原 el[j]. PLoS One, 2016, 11(1): e [34] KukitaY,MatobaR,UchidaJ, etal.high-fidelitytargetsequenc 原 ing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detectionandabsolutequantitationof mutationsinplas 原 ma cell-free DNA fromcancer patients[j]. DNA Research, 20, 22(4): [35] Newman AM, Bratman S V, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad pa 原 tient coverage[j]. Nature Medicine, 20, 20(5): [36] Sun W, Yuan X, Tian Y, et al. Non-invasive approaches to monitor EGFR-TKI treatment in non-small-cell lung cancer[j]. Journal of Hematology &Oncology, 20, 8: 95. [37] Deakin CT, Deakin JJ, Ginn SL, et al. Impact of next-gen 原 eration sequencing error on analysis of barcoded plasmid li 原 brariesof known complexity and sequence[j]. Nucleic Acids Re 原 search, 20, 42(16): e129. [38] Kinde I, Wu J, Papadopoulos N, et al. Detection and quantifi 原 cation of rare mutations with massively parallel sequencing[j]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2011, 108(23): ( 上接第 336 页 ) [24] 陈加祥, 王新长, 王晶磊, 等. 原癌基因 c-src 通过磷酸化信号转导与转录激活子 -3 蛋白影响大鼠精原干细胞活性 [J]. 生理学报 (Chen Jia-xiang, Wang Xin-chang, Wang Jing-lei, et al. Proto-oncogene c-src regulates the viability of rat spermatogo 原 nial stem cells in vitro through phosphorylated signal transducer and activator of transcription-3[j]. Acta Physiologica Sinica), 2008, 60(3): [25] Blonska M, Agarwal NK,Vega F.Shaping of the tumor microen 原 vironment: stromal cells and vessels[j]. Seminars in Cancer Bi 原 ology, 20, 34: [26] Kessenbrock K, Plaks V, Werb Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment[j]. Cell, 2010, 1(1): [27] Voswinkel J, Francois S, Simon JM, etal. Use of mesenchymal stem cells (MSC) in chronic inflammatory fistulizing and fibrot 原 ic diseases: acomprehensive review[j]. Clinical Reviews in Allergy &Immunology, 2013, 45(2): [28] Pourgholaminejad A, Aghdami N, Baharvand H, et al. The ef 原 fect of pro-inflammatory cytokines on immune phenotype, dif 原 ferentiation capacity and immune modulatory functions of hu 原 man mesenchymal stem cells[j]. Cytokine, 2016, 85: [29] Hou ZY, Cui NQ, Cui YF, et al. Correlation and malignant transformation of MSCswith the overexpression of SIL-R/GP130 under the tumor microenvironment[j]. Medical Oncology, 20, 32: 328. [30] WangL,ZhaoYH,Liu Y, et al.ifn- 酌 and TNF- 琢 synergistical 原 ly induce mesenchymal stem cell impairment and tumorigene 原 sisvianf 资 Bsignaling[J].StemCells,2013,31(7): [31] Bates RC, Mercurio AM. Tumor necrosis factor- 琢 stimulates the epithelial-to-mesenchymal transition of human colonic organoids[j]. Molecular Biology of the Cell, 2003, : [32] 王科俊, 吕俊杰, 冯伟兴, 等. 可变剪接与疾病的生物信息学研究概况 [J]. 生命科学研究 (Wang Ke-jun, L 俟 Jun-jie, Feng Wei-xing, et al. Theapplicationofbioinformaticsintheresearch of alternative splicing and disease[j]. Life Science Resrarch), 2011, (1):